Summary
本方案描述了实验室中Tortricid pest insects的饲养方法。区分昆虫性别和提取核酸以进行高通量测序的程序是使用两种tortricid害虫建立的。
Abstract
龟蛾科（鳞翅目），俗称枸杞蛾或卷叶蛾，包括许多农业和林业害虫，造成严重的农业损失。为了了解这种害虫飞蛾的生物学，基本技术的需求量很大。在这里，使用两种茶托特里克斯， Homona magnanima 和 Adoxoophyes honmai （鳞翅目：Tortricidae）开发了大规模饲养，观察和分子研究的方法。昆虫是用切片的人工饲料大规模饲养的，并通过考虑其生物学特征通过近亲繁殖来维持100多年。昆虫具有各种性别二态性;因此，在发育阶段很难区分性别，这阻碍了随后的测定。本研究强调，通过观察睾丸或乳酸醋酸睾丸染色来观察雌性特异性W染色体，可以确定tortricids幼虫的性别。此外，使用性别确定方法，本研究能够从性别确定的胚胎中提取核酸并应用于高通量测序。这些提示适用于其他害虫昆虫，将有助于进一步的形态学和遗传研究。
Introduction
鳞翅目昆虫占所有描述的生物物种10以上1，某些分类群物种对植物造成严重损害和严重农业损失2，3。虽然已经使用像蚕 Bombyx mori4，5这样的模型昆虫进行了分子和遗传研究，但害虫昆虫仍未得到调查，部分原因是饲养和处理6，7的困难。因此，有必要进行基础研究和技术来了解这种非模型害虫昆虫的生物学。
龟蛾科（鳞翅目），俗称桔梗蛾或卷叶蛾，包括许多农林害虫8。在昆虫分类群中，东方茶托特里克斯 Homona magnanima Diakonoff和夏季水果托特里克斯 Adoxophyes honmai Yasuda是严重的多食性害虫，已知会破坏东亚的茶树7。这两个物种产下扁平和椭圆形的鳞片状卵簇（或卵团），由由母体分泌物覆盖的薄，柔软和脆弱的卵组成。虽然胚胎发生阶段对昆虫发育和性别决定至关重要9，但卵的结构阻止了进一步分析昆虫的生物学。克服困难，进一步研究害虫排卵这种复杂的卵块是重要的。
在这里，为了了解Tortricids的生物学，已经使用 A. honmai 和 H. magnanima开发了大规模饲养，观察和分子研究的方法。首先，大规模饲养方法通过近交将两只托里克斯维持在100代以上。从连接的鳞片状卵块中分离卵有助于使用先前从苍蝇中使用的技术开发的碱性和有机溶剂对托里克斯的胚胎发生观察10。此外，本研究通过使用乳酸 - 醋酸睾丸激素11开发鳞翅目雌性性染色质染色质的染色方法，建立了小胚胎的性别歧视。通过结合这些方法，从性别决定的胚胎中提取高质量和大量的核酸，否则很难建立6。提取的RNA用于下一代测序。总的来说，这里介绍的方法适用于其他鳞翅目昆虫和其他昆虫分类群。
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Protocol
1. 昆虫收集和大规模饲养
- 按照先前发表的参考文献8，12从田地中收集Tortricid昆虫。
注意：从受损的茶叶中收集H. magnanima 和 A. honmai 幼虫（图1A）;使用4 W便携式紫外线（365nm波长，见 材料表， 图1B）吸引成年人。 - 将收集的幼虫（图1C，D）分别放在1/2盎司杯中的一块人造日粮上，持续2-3周，直到成虫复发（图1E，F）。通过形态学特征确认蛹和成虫的性别（图1G，I）。
- 将雄性和雌性在塑料盒（30厘米x 20厘米x 5厘米）中配对，以在石蜡纸上产卵（图1J-L）。将一名女性和两名男性放入装有一张石蜡纸的120 mL塑料杯中，以建立母系。
注意：在石蜡纸上做折痕很重要。对于 H. magnanima，石蜡纸需要在外壳的底部。同时，对于 A. honmai，在外壳天花板上放一张纸来收集卵（图1L），因为 H. magnanima 产卵在茶叶的上侧，但 A. honmai 在叶子的下面产卵8。这些程序在其他托里奇物种中也得到了验证，如果目标物种的生态和行为未被澄清，最好在两边都放置纸张。 - 用剪刀切出石蜡纸上的卵团（每个卵质量约100-200个卵 12，图1M）。将鸡蛋放入装有倒纸的1/2盎司杯中5-7天。
注意：成熟的胚胎表现出黑头胶囊（图1N）。胚胎发生期因托里奇菌种而异，但通常在产卵后5天（dpo）对于大花蕊花，在25°C，相对湿度为60%，光照16小时/8 h黑暗周期7。 - 将显示黑头胶囊的卵团在4-8°C下储存7天。
- 使用刨丝机将约60克人造日粮切片以进行大规模饲养。将充满成熟胚胎的卵块放在切片的人造日粮上，放入塑料容器（23 cm x 16 cm x 8 cm）中。将石蜡纸放在卵块上，切片日粮（图10）。
注意：低于30%的相对湿度被认为是过度干燥，而超过70%的相对湿度被认为是太潮湿。在塑料容器的盖子上打孔可以更好地通风。用棉花填充孔洞，以防止小幼虫逃逸。 - 为了消除鸡蛋的表面污染物，将鸡蛋块分别浸泡在3%福尔马林和0.2%苯扎氯铵溶液中5分钟，分别浸泡12。为了根除肠道或细胞内细菌，使用补充0.05%（w / w）盐酸四环素或0.06%（w / w）利福平的人造饮食代替正常的人工饮食（见 材料表）。
注意：此步骤是可选的。重要的是要均匀地揉捏Silk Mate 2S和0.05%（w / w）盐酸四环素或0.06%（w / w）利福平以获得一致性。 - 从塑料容器中收集蛹，并根据形态学12特征区分性别（图1G-I）。
注意：一般来说，存在 5 - 6 龄，直到化蛹 12 。 H. magnanima 和 A. honmai 幼虫在孵化后分别需要3周和2周，直到化蛹。 - 将15只雄性和10只雌性放入塑料盒（30厘米x 20厘米x 5厘米， 图1K）中，与25°C，16 L / 8 D交配。每5-7天收集卵并重复步骤1.4-1.9。对于每一代。
注意：如果需要收集新的产卵卵团以进行后续分析，请设置黑暗期的开始和结束，例如，从上午9点到下午5点。在这种情况下， H. magnanima 和 A. honami 通常在5小时（下午2点）后产卵。
2.将卵和鳞状幼虫从卵团中分离出来，进行固定、透化和染色
- 将卵质量浸泡在1，000μL1.2%次氯酸钠水溶液中10分钟或浸入1，000μL5M氢氧化钾水溶液中30分钟以分离卵。
- 按照先前发表的报告7，在1，000μLPBSt（137mM NaCl，8.1mM Na2HPO4，2.68 mM KCl，1.47 mM KH2PO4，0.05%聚氧乙烯（20）脱水山梨糖醇单月桂酸酯[Tween-20]pH 7.4，参见材料表）中洗涤分离的卵。
- 将鸡蛋浸泡在500μL100%庚烷和500μL4%多聚甲醛- PBSt溶液（w / v）的混合物中。使用涡流混合器以1，500rpm混合10分钟。
- 将鸡蛋浸泡在500μL100%庚烷和500μL100%甲醇的混合物中。以 1，500 rpm 搅拌 10 分钟。
- 用1，000μL100%甲醇洗涤鸡蛋两次，并在4°C下储存在100%甲醇中直到进一步的实验（图2A）。
注意：卵子可以在4°C下储存至少1年。 - 在先前发表的报告7之后，将卵依次浸泡在99%，70%，50%乙醇和PBSt中5分钟以进行水亲水处理。
- 用PBSt洗涤卵，将卵浸入1μg/ mL DAPI溶液中5分钟，然后用1x PBS洗涤卵两次。将卵浸泡在20μL1.25%（w / w）乳酸 - 乙酸有机质溶液中（见 材料表）11 以可视化异染色质，直到细胞核呈现出鲜红色（这从5-60分钟变化）（图2B，C）。
注意：乳酸 - 乙酸奥赛因染色期取决于温度和湿度。最好使用4x-10倍放大倍率的显微镜检查染色是否正确。 - 使用移液器将染色的卵转移到载玻片上。用抗淬灭试剂（见 材料表）和盖板玻璃7将染色的鸡蛋包裹起来。
- 使用镊子从卵块中提取噬菌体 H. magnanima 和 A. honmai 幼虫（产卵后4-5天（dpo））（图2D）。在载玻片上对幼虫进行二分切除（图2E）。
- 用1：3（v / v）99.7%乙酸/ 100%甲醇的混合物固定任何组织（例如，食管下神经节，胸神经节，malpighian小管等）5分钟。用1.25%（w / w）乳酸 - 醋酸有机体溶液11 染色，直到细胞核染色（这可能需要5-60分钟，具体取决于温度和湿度）。
- 通过在显微镜下观察异染色质（W染色体， 图2F，G）的存在（雌性）或不存在（雄性）来确定每个标本的性别。
注意：性别是通过可视化性染色质来确定的。每个细胞代表雌性11，12中的性染色质作为点，而噬菌体幼虫组织的剩余部分（未固定）应立即浸入细胞裂解缓冲液12 （10mM Tris-HCl，100 mM EDTA和1%SDS，pH 8.0）或含酚的RNA提取试剂中，用于DNA或RNA提取。在解剖之前，提前将20μL试剂分配到0.2mL PCR管中（图3A）。浸入样品并将其储存在-80°C直至进一步提取。样品可以储存至少3个月，但最好进行下游实验以防止核酸降解。
3. 从性别决定的噬菌体幼虫中提取DNA和RNA
- 将12个性别测定的雄性或雌性噬菌体幼虫（5 dpo胚胎）池中，并将细胞裂解缓冲液或RNA提取试剂（参见步骤2.11和 材料表）加入一个1.5mL管中。
注意：DNA提取遵循步骤3.2-3.7和RNA提取步骤3.8-3.11。 - 在600μL细胞裂解缓冲液（10mM Tris-HCl，100mM EDTA和1%SDS，pH 8.0）中匀浆组织，并在4°C下以10，000× g 离心样品5分钟。
- 使用移液器收集上清液（500μL），并在50°C下用1.5μL蛋白酶K（20mg / mL，参见 材料表）在加热块上孵育5小时。
- 在37°C下用1.0μL的10mg / mL RNase溶液（参见 材料表）处理样品30分钟。
- 向管7中加入200μL蛋白质沉淀溶液（参见材料表），然后在4°C下以17，000×g离心10分钟。
- 将上清液（500μL）与500μL100%异丙醇混合，然后在4°C下以20，400× g 离心10分钟。
- 用1，000μL70%乙醇洗涤造粒DNA两次。然后，风干（室温下5-10分钟），将DNA溶解在30μL的10mM Tris-Cl缓冲液（pH 8.5）中。
- 在600μLRNA提取试剂中匀浆组织，并向管中加入240μL超纯蒸馏水。在4°C下以12，000× g 离心管15分钟。
- 将上清液（600μL）与600μL100%异丙醇混合，并将混合物转移到二氧化硅离心柱中（参见 材料表）。在4°C下以17，900× g 离心管1分钟。
- 用750μL70%乙醇洗涤色谱柱，并在4°C下以17，900× g 离心柱两次，每次1分钟。
- 将15μL超纯蒸馏水装入塔中。将管在4°C下以17，900× g 离心1分钟以洗脱RNA。
- 使用基于紫外线的分光光度计计算和验证DNA和RNA的质量和数量。使用A260/A280（核酸/蛋白质）和A260/A230（核酸/盐和其他污染物）比值13评估核酸的纯度。
注意：对于RNA提取，遵循先前发表的程序12 ，这导致苯酚污染（表1）。从单个胚胎或相位幼虫中提取的DNA和RNA产生低量和低质量的样品。通常，从12个相位幼虫中提取DNA产生100-600ng，而使用当前方法提取RNA产生900-1，500ng，如 表1所示。
注意：步骤3.13-3.15是可选的，用于高通量测序的进一步测定。 - 使用基于荧光的分光光度计计算DNA和RNA的量。
注意：计算RNA量（基于紫外的浓度（ng / μL）/基于荧光的浓度（ng / μL））的比率以评估进一步实验应用的质量。例如，当基于紫外线和荧光的浓度分别为80 ng / uL和60 ng / uL时，该比率将为1.5（80/60）。通常，低于1.5的比率表示对于使用高通量测序的下游应用有足够的纯度13。 - 通过使用微芯片电泳分析RNA的质量14。
- 利用合格的RNA使用RNA文库制备试剂盒制备RNA文库（见 材料表）。使用适合于准备好的库的平台对库进行排序。
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Representative Results
建立东道主线及其维护
田间收集的幼虫的生存能力因田间位置，季节和饲养条件而异（例如，台湾桃园90%的生存能力，如Arai等人12所示）。大约30%-50%的货币对将像往常一样产生下一代。对于 H. magnanima 和 A. honmai，母系已经通过近交维持了100多代。
形态学观察和性别决定
用氢氧化钾（3或5M KOH）或次氯酸钠（1.2%Cl2 或NaClO）处理将卵与其连接的卵块分离（图2A）。较低浓度的试剂无法实现分离。所有的固定、透化和染色步骤都使DAPI溶液的细胞核可视化成为可能。仅使用KOH或NaClO（分离）处理的鸡蛋没有固定和透化步骤，没有用这些染料染色7。未经处理的 H. magnanima 卵块未染色。乳酸 - 乙酸orcein像往常一样将异染色质（W染色体）染成深红色，细胞核具有鲜红色（图3A）。这种染色可以简单快速地测定从4 dpo胚胎到六龄幼虫的性别。虽然在0-3 dpo胚胎中观察到细胞核，但很难以400倍放大率观察W染色体。
从性别决定和合并的胚胎中获得高质量的DNA和RNA
来自12个噬菌体幼虫，高质量DNA（A260 / A280 = 1.7-2.0;A260 / A230 = 1.7-2.4）以100-600ng的总量提取（表1）。尽管按照先前发表的方法提取的RNA12 产生500-1，000 ng的低质量产物：A260 / A280 = 1.7-2.1;A260/A230 = 0.1-0.5（表1），使用自旋柱的修饰方案改善了RNA的质量，产生了900-1，500 ng的产物，A260/A280 = 1.9-2.1和A260/A230 = 1.9-2.3（表1）。此外，修改方案的RNA浓度比（基于紫外/基于Qbit荧光的值）低于1.2，满足下一代测序的质量要求13。相反，从单个胚胎中提取的核酸的质量和数量太低而无法计算。使用修饰方案从性别测定的噬菌体幼虫中提取的RNA的完整性也使用微芯片电泳得到证实（图3B）。制备的文库被证实产生高Q30评分读数（表2）。
图1：海松和本麦的昆虫收集和大规模饲养概述（A）被幼虫破坏的茶叶和巢穴。（B）用紫外线遮光。（C，D）一只雌性（C）和一只雄性（D）6龄幼虫。橙色三角形表示睾丸。（英、华）将收集的幼虫单独饲养在1/2盎司的杯子中，并加入一块人工饲料。（G，H）H. magnanima（G）和A. honmai（H）的蛹。雌性显示在左侧，而雄性显示在右侧。（I） 大麦蚴（上图）和本麦蚴（下图）的成虫。男性和女性分别显示在右侧和左侧。（J，K）用于收集卵子质量的塑料袋（J）或塑料盒（K）。（L）本麦产卵在石蜡纸上放在盖子上，而H. magnanima在放在外壳底部的石蜡纸上产卵。（M，N）H. magnanima的卵质量。成熟的胚胎表现出黑色的头部胶囊，用白色箭头（N）表示。（O）用刨丝机切成薄片的人工日粮，用于大规模饲养。从卵中孵化的幼虫，放在切片的饮食上，将在25°C下孵化后3-4周形成蛹（在16小时光照/ 8小时黑暗循环下）。请点击此处查看此图的大图。
图2：胚胎的观察结果（A）使用5 N KOH，4%PFA /庚烷，甲醇/庚烷和甲醇的分离，固定和透化的鸡蛋。分离的鸡蛋用虚线突出显示。（B）将3 dpo胚胎用乳酸乙酸树脂染色。黑色箭头表示胚胎。（C）用DAPI染色4 dpo胚胎。白色箭头表示胚胎。（D，E）使用镊子解剖噬细胞幼虫（5 dpo）。从卵质量（D）中提取噬菌体幼虫，在载玻片（E）上一分为二。（F，G）使用解剖的噬细胞幼虫进行乳酸 - 乙酸奥赛尔汀染色。雌性表现出异染色质为点（用黑色箭头（F）表示），但雄性缺乏异染色质（G）。请点击此处查看此图的大图。
图3：使用性别确定的Pharate幼虫和H. magnanima和A. honmai的RNA品质提取核酸的图形摘要。（A）用乳酸乙酸菌素染色载玻片上解剖的法状幼虫的组织以确定其性别。将剩余的组织浸泡在试剂中，汇集到一个按个体性别分类的管中，然后进行DNA / RNA提取。（B）使用微芯片电泳系统评估从12个雄性大麦或本麦猪笼草中提取的RNA的质量。缩写：[nt]，核苷酸大小;[FU]，荧光单元;M，分子标记;嗯，H. magnanima;请 点击这里查看此图的放大版本。
表1：从性别决定的肉桂属的噬菌体幼虫中提取的核酸的浓度和质量。请按此下载此表格。
表2：RNA测序原始数据的质量。1 个Q20 （%） 表示读取概率，读取准确率为 99%。阿拉伯数字Q30 （%） 表示读取概率，读取准确率为 99.9%。请按此下载此表格。
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Discussion
Tortricid包括几种农业和林业害虫;本研究提出了几代人饲养Tortrix的方法，观察昆虫的胚胎发生和性别，并使用成熟的胚胎进行分子分析。
害虫研究的障碍之一是建立饲养方法。特别是，近亲繁殖有时会对物种的适应性产生负面影响。近交系的适应性下降，称为近亲繁殖抑制，已在各种植物和动物中广泛观察到，包括昆虫15，16，17，18。如前所述， H. magnanima 和 A. honmai 都已经维持了100多代（超过10年），没有明显的健身成本。虽然评估其他toricids是否对近亲繁殖也具有高耐受性还不够，但这两个物种可能通过适应单调的环境条件（即茶园）和几种内共生微生物（例如， Wolbachia11，12）而发展了这些特征。).这两个物种的卵很容易获得，但它们的产卵行为与它们的生态学不同。事实上，湿度和折痕方向似乎直接影响产卵卵的数量，这可能反映了田间昆虫的自然历史。重要的是要根据物种在自然界中的生物学特征调整养殖方法。
本研究中建立的方案允许使用性别决定的成熟胚胎和幼虫观察胚胎发生和分子研究。昆虫卵一般涂有几层壳层10、19。此外，H. magnanima和A. honmai的卵被母体分泌物覆盖。为了用这种复杂的结构染色卵子，分离，固定和透化似乎都是必要的。在糠骨癣（Crambidae）中，已经提出了使用单个胚胎的基于PCR的性别测定方案，但核酸的质量和数量低一直是后续分析的问题6，20。相比之下，本研究建议在观察女性特异性性染色质后从合并的性别决定胚胎中提取核酸。RNA很容易降解，这里显示的提取过程没有影响RNA的质量，这也得到了转录组分析（RNA-seq）的证实。这里显示的技术适用于各种昆虫物种的胚胎发生研究。此外，这些协议有可能用于评估化学农药或细胞内微生物（如沃尔巴克氏体）的影响，这些微生物在胚胎发生过程中会导致性别特异性缺陷6，11，12。
本研究有几个局限性。首先，在 H. magnanima 和 A. honmai中使用乳酸乙酸有机质染色很难确定未成熟胚胎（0-3 dpo）的性别。这是因为在胚胎发生早期，细胞核的数量和大小通常很小，因此很难观察到W染色体。为了在早期胚胎发生期间澄清Tortricids的性别，检测和定量性染色体6，20 上的标记物可能是一种替代方法。其次，在性别测定后，很难从单个个体中提取高纯度的核酸，这可能是由于细胞数量少。然而，从单个胚胎中提取的RNA或DNA可能适用于后续分析，例如PCR测定和单细胞测序。
总之，本议定书描述了两种非模型鳞翅目害虫H . magnanima 和 A. honmai的卵的大规模饲养，形态学观察和遗传分析。这些简单的技术有望适用于对托里克斯，其他鳞翅目昆虫和其他分类群的进一步研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者希望感谢日本科学促进会（JSPS）青年科学家研究奖学金的支持[拨款号19J13123和21J00895]。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
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