Summary
El presente protocolo describe el método de cría de insectos plaga tortricidas en los laboratorios. Los procedimientos para distinguir el sexo de los insectos y extraer ácidos nucleicos para la secuenciación de alto rendimiento se establecen utilizando dos plagas tortricidas.
Abstract
Tortricidae (Lepidoptera), comúnmente conocidos como polillas tortrix o leafroller, comprende muchas plagas agrícolas y forestales, que causan graves pérdidas agrícolas. Para comprender la biología de tales polillas plaga, las técnicas fundamentales han tenido una gran demanda. Aquí, los métodos para la cría en masa, las observaciones y los estudios moleculares se desarrollan utilizando dos tortrix de té, Homona magnanima y Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Los insectos fueron criados en masa con una dieta artificial en rodajas y mantenidos por endogamia durante más de 100 generaciones teniendo en cuenta sus características biológicas. Los insectos tienen varios dimorfismos sexuales; por lo tanto, es difícil distinguir el sexo durante las etapas de desarrollo, que han impedido los ensayos posteriores. El presente trabajo destacó que el sexo de las larvas de tortricidas podría determinarse mediante la observación de testículos o tinción de orceína láctico-acética para visualizar el cromosoma W específico de la hembra. Además, utilizando los métodos de determinación del sexo, el presente estudio permitió la extracción de ácido nucleico de embriones determinados por sexo y la aplicación hacia la secuenciación de alto rendimiento. Estos consejos son aplicables para otros insectos plaga y facilitarán más estudios morfológicos y genéticos.
Introduction
Los insectos lepidópteros representan más del 10% de todas las especies vivas descritas1, y ciertas especies de taxones causan graves daños a las plantas y graves pérdidas agrícolas 2,3. Aunque se han desarrollado estudios moleculares y genéticos utilizando modelos de insectos como el gusano de seda Bombyx mori 4,5, los insectos plaga siguen sin ser investigados, en parte debido a las dificultades para la cría y manipulación 6,7. Por lo tanto, los estudios y técnicas fundamentales son necesarios para comprender la biología de tales insectos plaga no modelo.
Los Tortricidae (Lepidoptera), comúnmente conocidos como tortrix o polillas de las hojas, comprenden muchas plagas agrícolas y forestales8. De los taxones de insectos, la tortrix oriental del té Homona magnanima Diakonoff y la tortrix de frutas de verano Adoxophyes honmai Yasuda son plagas polífagas graves que se sabe que dañan los árboles de té en el este de Asia7. Las dos especies ponen racimos de huevos planos y ovalados (o masas de huevos) que consisten en huevos delgados, blandos y frágiles cubiertos por secreciones maternas. Aunque las etapas de embriogénesis son cruciales para el desarrollo de insectos y las determinaciones del sexo9, las estructuras de los huevos impiden que un análisis más detallado comprenda la biología de los insectos. Es importante superar las dificultades para un mayor estudio de las plagas que oviponen una masa de huevos tan compleja.
Aquí, para comprender la biología de los tortricidos, se han desarrollado métodos para la cría en masa, observaciones y estudios moleculares utilizando A. honmai y H. magnanima. En primer lugar, los métodos de cría en masa mantienen a ambos tortricidos más de 100 generaciones por endogámicos. La separación de los huevos de la masa de huevo concatenada similar a una escama facilitó la observación de la embriogénesis de los tortricidos utilizando disolventes alcalinos y orgánicos previamente desarrollados a partir de técnicas utilizadas en moscas10. Además, el presente estudio estableció la discriminación sexual de embriones pequeños mediante el desarrollo de métodos de tinción de la cromatina sexual de hembras lepidópteras utilizando orceína láctico-acética11. Mediante la combinación de estos métodos, se extrajeron ácidos nucleicos de alta calidad y cantidad de embriones determinados por sexo, lo que de otro modo sería difícil de establecer6. El ARN extraído se utilizó para la secuenciación de próxima generación. Colectivamente, los métodos presentados aquí se aplican a otros insectos lepidópteros y otros taxones de insectos.
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Protocol
1. Recolección de insectos y cría masiva
- Recolectar insectos tortricidas de los campos siguiendo las Referencias 8,12 publicadas anteriormente.
NOTA: Las larvas de H. magnanima y A. honmai se recogen de hojas de té dañadas (Figura 1A); los adultos son atraídos usando luz UV portátil de 4 W (longitud de onda de 365 nm, ver Tabla de Materiales, Figura 1B). - Recoja las larvas recolectadas (Figura 1C, D) individualmente en una pieza de dieta artificial en una taza de 1/2 oz durante 2-3 semanas hasta la eclosión adulta (Figura 1E, F). Confirmar el sexo de pupas y adultos por rasgos morfológicos (Figura 1G,I).
- Aparea los machos y las hembras en una caja de plástico (30 cm x 20 cm x 5 cm) para ovipositar masas de huevos en un papel de parafina (Figura 1J-L). Coloque una hembra y dos machos en un vaso de plástico de 120 ml con un trozo de papel de parafina para establecer una matrilina.
NOTA: Es importante hacer pliegues en el papel de parafina. Para H. magnanima, el papel de parafina debe estar en la parte inferior de la caja. Mientras tanto, para A. honmai, coloque un papel en el techo de la caja para recolectar huevos (Figura 1L) ya que la masa de huevo de H. magnanima oviposit en la parte superior de las hojas de té, pero A. honmai pone huevos en la parte inferior de las hojas8. Los procedimientos también se verificaron en otras especies de tortricidas, y es mejor colocar documentos en ambos lados si la ecología y el comportamiento de las especies objetivo no están aclarados. - Cortar las masas de huevo (aproximadamente 100-200 huevos por masa de huevo12, Figura 1M) en el papel de parafina con tijeras. Coloque los huevos en una taza de 1/2 oz con papel vertido durante 5-7 días.
NOTA: El embrión maduro exhibe una cápsula de espinillas (Figura 1N). Los períodos de embriogénesis se atribuyen de manera diversa a las especies de tortricidas, pero generalmente 5 días después de la oviposición (dpo) para H. magnanima y 4 dpo para A. honmai a 25 ° C con 60% de humedad relativa, 16 h de luz / 8 h ciclos de oscuridad7. - Guarde las masas de huevo que muestran cápsulas de cabeza negra a 4-8 ° C durante 7 días.
- Cortar ~ 60 g dietas artificiales usando un rallador para la cría en masa. Coloque la masa de huevo llena de embriones maduros en la dieta artificial en rodajas en un recipiente de plástico (23 cm x 16 cm x 8 cm). Coloque papeles de parafina en la masa de huevo con las dietas en rodajas (Figura 10).
NOTA: Por debajo del 30% de humedad relativa se considera demasiado seco, mientras que más del 70% es demasiado húmedo. Crear agujeros en la tapa del recipiente de plástico es mejor para permitir una mejor ventilación. Llene los agujeros con algodón para evitar los escapes de pequeñas larvas. - Para eliminar los contaminantes superficiales de los huevos, remoje la masa de huevo en una solución de formalina al 3% y cloruro de benzalconio al 0,2% durante 5 min, respectivamente12. Para erradicar las bacterias intestinales o intracelulares, utilice una dieta artificial suplementada con 0.05% (p/p) de clorhidrato de tetraciclina o 0.06% (p/p) de rifampicina en lugar de una dieta artificial normal (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Este paso es opcional. Es importante amasar Silk Mate 2S y 0.05% (p/p) clorhidrato de tetraciclina o 0.06% (p/p) rifampicina de manera equitativa para mayor consistencia. - Recoge las pupas del recipiente de plástico y distingue el sexo en función delas 12 características morfológicas (Figura 1G-I).
NOTA: Generalmente, los tortricidos presentan 5-6 instars hasta la pupación12. Las larvas de H. magnanima y A. honmai tardan 3 semanas y 2 semanas, respectivamente, después de la eclosión hasta la pupación. - Coloque 15 machos y 10 hembras en una caja de plástico (30 cm x 20 cm x 5 cm, Figura 1K) para aparearse con 25 ° C, 16 L / 8 D. Recoja los huevos por 5-7 días y repita los pasos 1.4-1.9. para cada generación.
NOTA: Si es necesario recolectar masas de huevos recién ovipuestas para su posterior análisis, establezca el inicio y el final del período oscuro, por ejemplo, de 9 a.m. a 5 p.m. En esta condición, H. magnanima y A. honami generalmente oviposit huevos después de 5 h (2 PM).
2. Separación de huevos y larvas de fraato de masas de huevos para fijación, permeabilización y tinción
- Remoje la masa del huevo en 1.000 μL de solución acuosa de hipoclorito de sodio al 1,2% durante 10 min o en 1.000 μL de solución acuosa de hidróxido de potasio al 5 M durante 30 min para separar los huevos.
- Lavar los huevos separados en 1.000 μL de PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 0,05% de polioxietileno (20) Sorbitan Monolaurate [Tween-20] pH 7,4, ver Tabla de Materiales) siguiendo el informe publicado anteriormente7.
- Remoje los huevos en una mezcla de 500 μL de 100% de heptano y 500 μL de solución de paraformaldehído-PBSt al 4% (p/v). Mezclar durante 10 min a 1.500 rpm con un mezclador de vórtice.
- Remoje los huevos en una mezcla de 500 μL de 100% de heptano y 500 μL de 100% de metanol. Mezclar durante 10 min a 1.500 rpm.
- Lave los huevos dos veces con 1.000 μL de metanol al 100% y guárdelos a 4 °C en metanol al 100% hasta nuevos experimentos (Figura 2A).
NOTA: Los huevos se pueden almacenar durante al menos 1 año a 4 °C. - Remoje los huevos secuencialmente en 99%, 70%, 50% de etanol y PBSt durante 5 minutos cada uno para hidrofilización después del informe publicado anteriormente7.
- Lave los huevos con PBSt, sumerja los huevos en 1 μg / ml de solución DAPI durante 5 minutos y luego lave los huevos con 1x PBS dos veces. Remoje los huevos en 20 μL de solución de orceína láctico-acética al 1,25% (p/p) (ver Tabla de Materiales)11 para visualizar la heterocromatina hasta que los núcleos exhiban un color rojo brillante (esto varía de 5-60 min) (Figura 2B,C).
NOTA: Los períodos de tinción láctico-acético de la orceína dependen de la temperatura y la humedad. Es mejor verificar la tinción adecuada con un microscopio con un aumento de 4x-10x. - Transfiera los huevos teñidos con una pipeta a un portaobjetos de vidrio. Encierre los huevos teñidos con reactivo antifade (ver Tabla de Materiales) y una cubierta de vidrio7.
- Extraer las larvas de H. magnanima y A. honmai (4-5 días después de la oviposición (dpo)) de las masas de huevos utilizando fórceps (Figura 2D). Bisectar larvas en un portaobjetos de vidrio (Figura 2E).
- Fije cualquier tejido (por ejemplo, ganglio suboesofágico, ganglios torácicos, túbulo malpighiano, etc.) con una mezcla de 1:3 (v/v) 99,7% de ácido acético/100% de metanol durante 5 min. Manche aquellos con 1.25% (p/p) solución de orceína láctico-acética11 hasta que los núcleos estén teñidos (esto puede tomar de 5 a 60 min, dependiendo de la temperatura y la humedad).
- Determinar el sexo de cada espécimen observando la presencia (hembra) o ausencia (macho) de heterocromatina (el cromosoma W, Figura 2F,G) bajo un microscopio.
NOTA: El sexo se determina visualizando la cromatina sexual. Cada célula representa la cromatina sexual como un punto en las hembras 11,12, mientras que la porción restante de los tejidos larvales de fraato (no fija) debe sumergirse inmediatamente en tampón de lisis celular12 (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA y 1% SDS, pH 8.0) o reactivos de extracción de ARN que contienen fenol para la extracción de ADN o ARN. Antes de las disecciones, dispensar 20 μL de los reactivos en tubos de PCR de 0,2 ml por adelantado (Figura 3A). Sumergir y almacenar las muestras a -80 °C hasta su posterior extracción. Las muestras se pueden almacenar durante al menos 3 meses, pero es mejor continuar con los experimentos posteriores para evitar la degradación de los ácidos nucleicos.
3. Extracciones de ADN y ARN de larvas de fraato determinadas por sexo
- Agrupar 12 larvas de fraato macho o hembra determinadas por sexo (embrión de 5 dpo) y agregar tampón de lisis celular o reactivos de extracción de ARN (ver paso 2.11 y Tabla de materiales) en un tubo de 1.5 ml.
NOTA: Siga los pasos 3.2-3.7 para la extracción de ADN y los pasos 3.8-3.11 para la extracción de ARN. - Homogeneizar los tejidos en 600 μL del tampón de lisis celular (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA y 1% SDS, pH 8.0), y centrifugar las muestras a 10.000 x g durante 5 min a 4 °C.
- Recoger el sobrenadante (500 μL) con una pipeta e incubar a 50 °C con 1,5 μL de Proteinasa K (20 mg/ml, ver Tabla de Materiales) durante 5 h en un bloque térmico.
- Tratar las muestras con 1,0 μL de 10 mg/ml de solución de RNasa (ver Tabla de Materiales) a 37 °C durante 30 min.
- Añadir 200 μL de solución de precipitación de proteínas (ver Tabla de Materiales) a los tubos7, seguido de una centrífuga a 17.000 x g durante 10 min a 4 °C.
- Mezclar el sobrenadante (500 μL) con 500 μL de isopropanol al 100%, y luego centrifugar a 20.400 x g durante 10 min a 4 °C.
- Lave el ADN peletizado dos veces con 1.000 μL de etanol al 70%. Luego, seque al aire (5-10 min a temperatura ambiente), disuelva el ADN en 30 μL de tampón Tris-Cl de 10 mM (pH 8.5).
- Homogeneizar los tejidos en 600 μL de reactivos de extracción de ARN y añadir 240 μL de agua destilada ultrapura al tubo. Centrifugar los tubos a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
- Mezclar el sobrenadante (600 μL) con 600 μL de isopropanol al 100% y transferir la mezcla a una columna de espín de sílice (ver Tabla de Materiales). Centrifugar los tubos a 17.900 x g durante 1 min a 4 °C.
- Lavar la columna con 750 μL de etanol al 70% y centrifugar la columna dos veces a 17.900 x g durante 1 min cada una a 4 °C.
- Cargue 15 μL de agua destilada ultrapura a la columna. Centrifugar los tubos a 17.900 x g durante 1 min a 4 °C para eludir el ARN.
- Calcule y verifique la calidad y cantidad de ADN y ARN utilizando un espectrofotómetro basado en UV. Evaluar la pureza de los ácidos nucleicos utilizando las proporciones A260/A280 (ácidos nucleicos/proteína) y A260/A230 (ácidos nucleicos/sales y otros contaminantes)13.
NOTA: Para la extracción de ARN, se siguió el procedimiento12 previamente publicado, que resultó en contaminación por fenol (Tabla 1). El ADN y el ARN extraídos de un solo embrión o larvas de fraato producen muestras de baja cantidad y baja calidad. Típicamente, la extracción de ADN de 12 larvas de fraato produce 100-600 ng, mientras que la extracción de ARN utilizando el método actual genera 900-1,500 ng, como se muestra en la Tabla 1.
NOTA: Los pasos 3.13-3.15 son opcionales para ensayos adicionales de secuenciaciones de alto rendimiento. - Calcule las cantidades de ADN y ARN utilizando un espectrofotómetro basado en fluorescencia.
NOTA: Se calculó la relación entre las cantidades de ARN (concentración basada en UV (ng/μL)/concentración basada en fluorescencia (ng/μL)) para evaluar la calidad para su posterior aplicación experimental. Por ejemplo, cuando las concentraciones basadas en UV y fluorescencia son de 80 ng/uL y 60 ng/uL, respectivamente, la relación será de 1,5 (80/60). Por lo general, las proporciones inferiores a 1,5 indican una pureza suficiente para aplicaciones posteriores que utilizan secuenciación de alto rendimiento13. - Analizar la calidad del ARN mediante electroforesis de microchip14.
- Utilice los ARN calificados para preparar la biblioteca de ARN utilizando un kit de preparación de la biblioteca de ARN (consulte la Tabla de materiales). Secuenciar las bibliotecas utilizando una plataforma adecuada para las bibliotecas preparadas.
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Representative Results
Establecimiento de líneas de acogida y su mantenimiento
La viabilidad de las larvas recolectadas en el campo se atribuye de manera diferente a la ubicación del campo, las estaciones y las condiciones de cría (por ejemplo, el 90% de la viabilidad en Taiwán, Taoyuan, como se muestra en Arai et al.12). Aproximadamente el 30%-50% de los pares generarán la próxima generación como de costumbre. Para H. magnanima y A. honmai, las matrilinas se han mantenido mediante la endogamia durante más de 100 generaciones.
Observaciones morfológicas y determinaciones del sexo
El tratamiento con hidróxido de potasio (3 o 5 M KOH) o hipoclorito de sodio (1,2% Cl2 o NaClO) separa los huevos de sus masas de huevos concatenados (Figura 2A). La menor concentración de los reactivos no pudo lograr la separación. Todos los pasos de fijación, permeabilización y tinción permitieron la visualización de núcleos con solución DAPI. Los óvulos tratados solo con KOH o NaClO (separados) sin los pasos de fijación y permeabilización no se tiñeron con estos colorantes7. Las masas de huevos de H. magnanima no tratadas no se tiñeron. La orceína láctico-acética tiñe la heterocromatina (cromosoma W) con un color rojo oscuro y los núcleos con un color rojo brillante como de costumbre (Figura 3A). Esta tinción permite una determinación fácil y rápida del sexo desde 4 embriones dpo hasta sexta larvas instar. Aunque los núcleos se visualizaron en 0-3 embriones dpo, fue difícil observar el cromosoma W con un aumento de 400x.
Se obtuvo ADN y ARN de alta calidad a partir de embriones determinados por sexo y agrupados
De 12 larvas de fraato, ADN de alta calidad (A260/A280 = 1.7-2.0; A260/A230 = 1.7-2.4) se extrajeron con 100-600 ng en cantidad total (Tabla 1). Aunque el ARN extraído siguiendo el método12 publicado anteriormente produjo un producto de 500-1.000 ng con baja calidad: A260/A280 = 1,7-2,1; A260/A230 = 0.1-0.5 (Tabla 1), los protocolos modificados utilizando una columna de espín mejoraron la calidad del ARN, produciendo 900-1,500 ng de producto con A260/A280 = 1.9-2.1 y A260/A230 = 1.9-2.3 (Tabla 1). Además, la relación de concentración de ARN (valores basados en fluorescencia UV/Qbit) para el protocolo modificado fue inferior a 1,2, cumpliendo con los requisitos de calidad para la secuenciación de próxima generación13. Por el contrario, la calidad y cantidad de ácidos nucleicos extraídos de un solo embrión eran demasiado bajas para ser calculadas. La integridad del ARN extraído de larvas de fraato determinadas por sexo utilizando el protocolo modificado también se confirmó mediante electroforesis de microchip (Figura 3B). Se confirmó que las bibliotecas preparadas producían lecturas de alta puntuación Q30 (Tabla 2).
Figura 1: Descripción general de la recolección de insectos y la cría masiva de H. magnanima y A. honmai. (A) Hojas de té y nidos dañados por una larva. (B) Trampa de luz con luz UV. (C,D) Una hembra (C) y un macho (D)6ª larva instar de H. magnanima. El triángulo naranja indica el testículo. (E,F) Las larvas recolectadas se criaron individualmente en una taza de 1/2 oz con un pedazo de dieta artificial. (G,H) Pupas de H. magnanima (G) y A. honmai (H). La hembra se muestra a la izquierda, mientras que el macho se muestra a la derecha. (I) Adultos de H. magnanima (arriba) y A. honmai (abajo). Tanto los machos como las hembras se muestran a la derecha y a la izquierda, respectivamente. (J,K) Una bolsa de plástico (J) o una caja de plástico (K) para la recolección de masa de huevos. L) Huevos de oviposito de A. honmai sobre papel de parafina colocado en la tapa, y huevos de H. magnanima sobre papel de parafina colocado en la parte inferior de la caja. (M,N) Masa de huevo de H. magnanima. Los embriones maduros exhiben cápsulas de cabeza negra indicadas con flechas blancas (N). (O) Dietas artificiales en rodajas con un rallador para la cría en masa. Las larvas eclosionadas de los huevos, colocadas en la dieta en rodajas, formarán pupas 3-4 semanas después de la eclosión a 25 ° C (menos de 16 h de ciclo de luz / 8 h de oscuridad). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Observaciones de embriones. (A) Los huevos separados, fijos y permeabilizados de H. magnanima utilizando 5 N KOH, 4% PFA / heptano, metanol / heptano y metanol. Un huevo separado se resalta con líneas discontinuas. (B) El embrión de 3 dpo se tiñó con orceína láctico-acética. La punta de flecha negra indica el embrión. (C) El embrión de 4 dpo se tiñó con DAPI. La punta de flecha blanca indica el embrión. (D,E) Disección de larvas de fraato (5 dpo) utilizando fórceps. Las larvas de fraato se extraen de la masa de huevo (D), se dividen en dos en un portaobjetos de vidrio (E). (F,G) Tinción de orceína láctico-acética utilizando las larvas de fraato diseccionadas. Las hembras exhiben heterocromatina como un punto (indicado con punta de flecha negra, (F), pero los machos carecen de la heterocromatina (G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resumen gráfico de la extracción de ácidos nucleicos utilizando larvas de fraato determinadas por sexo y cualidades de ARN de H. magnanima y A. honmai. (A) Los tejidos de larvas de fraato diseccionadas en portaobjetos de vidrio se tiñeron con orceína láctico-acética para determinar su sexo. Los tejidos restantes se empaparon en reactivos, se agruparon en un tubo clasificado por el sexo de los individuos y luego se sometieron a extracción de ADN / ARN. (B) La calidad del ARN extraído de 12 machos H. magnanima o A. honmai se evaluó mediante un sistema de electroforesis de microchip. Abreviaturas: [nt], tamaño del nucleótido; [FU], unidad de fluorescencia; M, marcador molecular; Hm, H. magnanima; Ad, A. honmai. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Concentración y calidad de ácidos nucleicos extraídos de larvas de fraato determinadas por sexo de H. magnanima. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Cualidades de los datos brutos de secuenciación de ARN. 1 Q20 (%) indica la probabilidad de lecturas con una precisión de lectura del 99%. número arábigo Q30 (%) indica la probabilidad de lecturas con una precisión de lectura del 99,9%. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Tortricid comprende varias plagas agrícolas y forestales; el presente estudio presentó métodos para criar tortrix a lo largo de generaciones, observar la embriogénesis y el sexo de los insectos, y realizar análisis moleculares utilizando embriones maduros.
Uno de los obstáculos para el estudio de insectos plaga es establecer métodos de cría. Especialmente, la endogamia a veces afecta negativamente la aptitud de la especie. La reducción de la aptitud física por la consanguínea, llamada depresión endogamia, se ha observado ampliamente en varias plantas y animales, incluidos los insectos 15,16,17,18. Como se señaló, tanto H. magnanima como A. honmai se han mantenido durante más de 100 generaciones (más de 10 años) sin costos aparentes de acondicionamiento físico. Aunque no es suficiente evaluar si otros tortricidos también tienen una alta tolerancia a la endogamia en general, las dos especies pueden haber desarrollado las características adaptando condiciones ambientales monótonas (es decir, plantaciones de té) y contra varios microorganismos endosimbióticos (por ejemplo, Wolbachia11,12 ). Los huevos de las dos especies se obtienen fácilmente, pero sus comportamientos de oviposición se atribuyen de manera diferente a su ecología. De hecho, la humedad y la dirección del pliegue parecen afectar directamente el número de huevos ovipuestos, lo que podría reflejar las historias naturales de los insectos en los campos. Es importante ajustar los métodos de cría a las especies en cuanto a sus características biológicas en la naturaleza.
Los protocolos establecidos en este estudio permitieron la observación de la embriogénesis y los estudios moleculares utilizando embriones y larvas madurados determinados por sexo. Los huevos de insectos generalmente están recubiertos con varias capas de cáscara10,19. Además, los huevos de H. magnanima y A. honmai están cubiertos de secreciones maternas. Para manchar los huevos con una estructura tan complejada, la separación, la fijación y la permeabilización parecen ser todas necesarias. En Ostrinia furnacalis (Crambidae), que oviposita masa de huevo similar a escamas como H. magnanima y A. honmai, se han propuesto protocolos de determinación del sexo basados en PCR utilizando embriones individuales, pero la baja calidad y cantidad de ácidos nucleicos ha sido un problema para el análisis posterior 6,20. En contraste, el presente estudio sugirió extraer ácidos nucleicos de embriones determinados por sexo agrupados después de observar la cromatina sexual específica de la mujer. Los ARN se degradan fácilmente, y el procedimiento de extracción que se muestra aquí no afectó la calidad del ARN, lo que también ha sido confirmado por el análisis del transcriptoma (RNA-seq). Las técnicas que se muestran aquí son aplicables para estudios de embriogénesis de varias especies de insectos. Además, los protocolos tienen el potencial de ser utilizados para evaluar los efectos de pesticidas químicos o microbios intracelulares como Wolbachia, que causa defectos específicos del sexo durante la embriogénesis 6,11,12.
El presente estudio tiene varias limitaciones. En primer lugar, el sexo de embriones inmaduros (0-3 dpo) fue difícil de determinar mediante la tinción láctico-acética de la orceína en H. magnanima y A. honmai. Esto se debe a que el número y el tamaño de los núcleos son generalmente pequeños durante la embriogénesis temprana, lo que dificulta la observación del cromosoma W. Para aclarar el sexo de los tortricidos durante la embriogénesis temprana, la detección y cuantificación de marcadores en los cromosomas sexuales 6,20 podría ser un enfoque alternativo. En segundo lugar, era difícil extraer ácidos nucleicos con alta pureza de un solo individuo después de la determinación del sexo, posiblemente debido al pequeño número de células. Sin embargo, el ARN o el ADN extraídos de un solo embrión pueden aplicarse a análisis posteriores, como ensayos de PCR y secuenciaciones unicelulares.
En resumen, el presente protocolo describe la cría masiva, las observaciones morfológicas y los análisis genéticos de los huevos de dos insectos plaga de lepidópteros no modelo, H. magnanima y A. honmai. Se espera que estas técnicas simples sean aplicables para futuras investigaciones sobre tortricidas, otros insectos lepidópteros y otros taxones.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer el apoyo de las Becas de Investigación para Jóvenes Científicos de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) [Número de subvención 19J13123 y 21J00895].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
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