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Bioengineering

हाइड्रोगेल सरणियाँ 3 डी ट्यूमर मॉडल में मैट्रिक्स घटकों और चिकित्सीय के स्क्रीनिंग प्रभाव के लिए बढ़े हुए थ्रूपुट को सक्षम करती हैं

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/63791
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1University of California Los Angeles

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एक कस्टम-निर्मित यूवी रोशनी डिवाइस का उपयोग करके 3 डी मैट्रिक्स-माइमेटिक संस्कृतियों में रोगी-व्युत्पन्न ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के कीमोथेरेप्यूटिक प्रतिक्रियाओं पर यांत्रिक और जैव रासायनिक संकेतों के प्रभावों का आकलन करने के लिए एक प्रयोगात्मक मंच का वर्णन करता है, जो ट्यून करने योग्य यांत्रिक विशेषताओं के साथ हाइड्रोगेल के उच्च-थ्रूपुट फोटोक्रॉसलिंकिंग की सुविधा प्रदान करता है।

Abstract

सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन जैव रासायनिक, यांत्रिक और ज्यामितीय संकेतों के माध्यम से जटिल शारीरिक प्रक्रियाओं की मध्यस्थता करते हैं, जो रोग संबंधी परिवर्तनों और चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करते हैं। दवा विकास पाइपलाइन में पहले मैट्रिक्स प्रभावों के लिए लेखांकन उपन्यास चिकित्सीय की नैदानिक सफलता की संभावना को बढ़ाने की उम्मीद है। 3 डी सेल संस्कृति में विशिष्ट ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट को पुन: पेश करने वाली बायोमैटेरियल-आधारित रणनीतियां मौजूद हैं, लेकिन मुख्य रूप से दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयोग की जाने वाली 2 डी संस्कृति विधियों के साथ इन्हें एकीकृत करना चुनौतीपूर्ण रहा है। इस प्रकार, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल मौजूदा दवा स्क्रीनिंग पाइपलाइनों और सेल व्यवहार्यता के लिए पारंपरिक परख के साथ एकीकरण की सुविधा के लिए एक बहु-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में लघु बायोमैटेरियल मैट्रिक्स के भीतर 3 डी संस्कृति के तरीकों के विकास का विवरण देता है। चूंकि सुसंस्कृत कोशिकाओं में नैदानिक रूप से प्रासंगिक फेनोटाइप को संरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण मैट्रिक्स सुविधाओं को अत्यधिक ऊतक- और रोग-विशिष्ट होने की उम्मीद है, इसलिए विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त परिस्थितियों की पहचान करने के लिए मैट्रिक्स मापदंडों की संयोजन स्क्रीनिंग आवश्यक होगी। यहां वर्णित विधियां मैट्रिक्स यांत्रिकी और लिगैंड प्रस्तुति के ऑर्थोगोनल भिन्नता के लिए कैंसर सेल प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए एक लघु संस्कृति प्रारूप का उपयोग करती हैं। विशेष रूप से, यह अध्ययन कीमोथेरेपी के लिए रोगी-व्युत्पन्न ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं पर मैट्रिक्स मापदंडों के प्रभावों की जांच करने के लिए इस मंच के उपयोग को दर्शाता है।

Introduction

एक नई दवा विकसित करने की अपेक्षित लागत पिछले एक दशक में लगातार बढ़ी है,वर्तमान अनुमानों में $ 1 बिलियन से अधिक है। इस खर्च का एक हिस्सा नैदानिक परीक्षणों में प्रवेश करने वाली दवाओं की उच्च विफलता दर है। लगभग 12% दवा उम्मीदवार अंततः 2019 में संयुक्त राज्य अमेरिका (यूएस) खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) से अनुमोदन अर्जित करते हैं। अप्रत्याशित विषाक्तता2 के कारण चरण 1 में कई दवाएं विफल हो जाती हैं, जबकि अन्य जो सुरक्षा परीक्षणों को पारित करती हैं, प्रभावकारिता की कमी के कारण विफल हो सकतीहैं 3. गैर-प्रभावकारिता के कारण इस एट्रिशन को आंशिक रूप से इस तथ्य से समझाया जा सकता है कि दवा के विकास के दौरान उपयोग किए जाने वाले कैंसर मॉडल नैदानिक प्रभावकारिता के कुख्यात गैर-पूर्वानुमानित हैं4.

इन विट्रो और इन विवो मॉडल के बीच कार्यात्मक असमानताओं को उनके मूल माइक्रोएन्वायरमेंट से कैंसर कोशिकाओं को हटाने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जिसमें गैर-ट्यूमर कोशिकाएं और भौतिक ईसीएम 5,6 शामिल हैं। आमतौर पर, अनुसंधान समूह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संस्कृति मैट्रिक्स का उपयोग करते हैं, जैसे मैट्रिगेल (माउस सारकोमा से प्राप्त एक प्रोटीनयुक्त तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स) 3 डी मैट्रिक्स माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं को प्रदान करने के लिए। 2 डी संस्कृति की तुलना में, झिल्ली मैट्रिक्स में 3 डी संस्कृति ने इन विट्रो परिणाम7,8 की नैदानिक प्रासंगिकता में सुधार किया है। हालांकि, झिल्ली मैट्रिक्स सहित विकोशिकीय ऊतकों से संस्कृति बायोमैटेरियल्स, आमतौर पर बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता प्रदर्शित करते हैं जो प्रजनन क्षमता9 से समझौता कर सकते हैं। इसके अलावा, अध्ययन किए गए लोगों से विभिन्न ऊतक उत्पत्ति वाले ट्यूमर से प्राप्त मैट्रिक्स उपयुक्त शारीरिक संकेत प्रदान नहीं कर सकतेहैं 10. अंत में, इंट्राट्यूमोरल विषमता की उच्च डिग्री वाले कैंसर में सूक्ष्म पर्यावरणीय विशेषताएं होती हैं जो सबमाइक्रोन आकार के पैमाने पर भिन्न होती हैं और जो झिल्ली मैट्रिक्स को11 को पुन: प्राप्त करने के लिए ट्यून नहीं किया जा सकता है।

ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम), लगभग 15 महीने के औसत जीवित रहने के समय के साथ एक समान रूप से घातक मस्तिष्क ट्यूमर, एक कैंसर है जिसके लिए उपचार का विकास विशेष रूप से कठिन12,13 रहा है। जीबीएम के लिए देखभाल के वर्तमान मानक में प्राथमिक ट्यूमर लकीर शामिल है, इसके बाद रेडियोथेरेपी, और फिर टेमोज़ोलोमाइड (टीएमजेड) 14 का उपयोग करके कीमोथेरेपी। फिर भी, आधे से अधिक नैदानिक जीबीएम ट्यूमर विभिन्नतंत्रों 15,16,17 के माध्यम से उपचार प्रतिरोध प्रदर्शित करते हैं। एक व्यक्तिगत रोगी के लिए उपचार आहार की प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करना बेहद मुश्किल है। व्यक्तिगत परिणामों की भविष्यवाणी करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक प्रीक्लिनिकल मॉडल में रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाएं शामिल होती हैं जो इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों में ऑर्थोटोपिक रूप से होती हैं। जबकि रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट नैदानिक जीबीएम ट्यूमर के कई पहलुओं को दोहरा सकते हैं और प्रीक्लिनिकल मॉडल18 के लिए मूल्यवान हैं, वे स्वाभाविक रूप से महंगे, कम थ्रूपुट, समय लेने वाले हैं, और नैतिक चिंताओं को शामिल करते हैं19. रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं की संस्कृतियां, 2 डी प्लास्टिक की सतहों पर या स्फेरॉइड के रूप में, ज्यादातर इन मुद्दों से बचती हैं। जबकि रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाएं आनुवंशिक विपथन को संरक्षित करती हैं, 2 डी में या निलंबित स्फेरॉइड के रूप में उनकी संस्कृतियां कृन्तकों और मूल रोगी ट्यूमर20 में रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट के काफी हद तक खराब प्रतिनिधित्व रही हैं। इससे पहले, हमने, और अन्य लोगों ने दिखाया है कि 3 डी ईसीएम में सुसंस्कृत जीबीएम कोशिकाएं जो मस्तिष्क के ऊतकों के यांत्रिक और जैव रासायनिक गुणों की नकल करती हैं, दवा प्रतिरोध फेनोटाइप 10,21,22,23 को संरक्षित कर सकती हैं।

हाइलूरोनिक एसिड (एचए) के बीच बातचीत, मस्तिष्क ईसीएम में प्रचुर मात्रा में एक पॉलीसेकेराइड और जीबीएम ट्यूमर में अतिरंजित, और इसके सीडी 44 रिसेप्टर इन विट्रो21,24,25,26,27 में दवा प्रतिरोध के अधिग्रहण को संशोधित करते हैं। उदाहरण के लिए, नरम, 3 डी संस्कृतियों के भीतर एचए को शामिल करने से चिकित्सीय प्रतिरोध प्राप्त करने के लिए रोगी-व्युत्पन्न जीबीएम कोशिकाओं की क्षमता में वृद्धि हुई। यह मैकेनो-उत्तरदायित्व जीबीएम कोशिकाओं21 पर सीडी 44 रिसेप्टर्स के लिए एचए बाध्यकारी पर निर्भर था। इसके अतिरिक्त, आरजीडी-असर पेप्टाइड्स के लिए एकीकृत बाध्यकारी, 3 डी संस्कृति मैट्रिक्स में शामिल, कठोरता-निर्भर तरीके से प्रवर्धित सीडी 44-मध्यस्थता कीमोरेसिस्टेंस21. एचए से परे, कई ईसीएम प्रोटीन की अभिव्यक्ति, आरजीडी क्षेत्रों वाले कई, सामान्य मस्तिष्क और जीबीएम ट्यूमर28 के बीच भिन्न होते हैं। उदाहरण के लिए, एक अध्ययन ने बताया कि जीबीएम ट्यूमर29 में 28 अलग-अलग ईसीएम प्रोटीन को अपग्रेड किया गया था। इस जटिल ट्यूमर मैट्रिक्स माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर, कैंसर कोशिकाएं एक विशेष प्रतिरोध फेनोटाइप उत्पन्न करने के लिए यांत्रिक और जैव रासायनिक संकेतों को एकीकृत करती हैं, जो यंग के मापांक या इंटीग्रिन-बाइंडिंग पेप्टाइड्स 28,29,30 के घनत्व में अपेक्षाकृत छोटे अंतर (जैसे, परिमाण के क्रम से कम) पर निर्भर करती हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल विशेषता है कि ट्यूमर कोशिकाएं मैट्रिक्स संकेतों के अद्वितीय संयोजनों की व्याख्या कैसे करती हैं और उपचार प्रतिरोध (चित्रा 1 ए) को बढ़ावा देने वाले जटिल, रोगी-विशिष्ट मैट्रिक्स माइक्रोएन्वायरमेंट की पहचान करती हैं। 3 डी संस्कृति के लिए लघु, सटीक रूप से ट्यून किए गए मैट्रिक्स उत्पन्न करने के लिए एक फोटोकेमिकल विधि एक बड़ा, ऑर्थोगोनल चर स्थान प्रदान करती है। माइक्रोकंट्रोलर द्वारा संचालित एलईडी की एक कस्टम-निर्मित सरणी को स्वचालन और प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए 384-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप के भीतर फोटोक्रॉसलिंक हाइड्रोगेल में शामिल किया गया था। एक्सपोजर तीव्रता परिणामी हाइड्रोगेल के सूक्ष्म-यांत्रिक गुणों को बदलने के लिए अच्छी तरह से विविध थी, जैसा कि परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था। हालांकि यह पांडुलिपि रोशनी सरणी के निर्माण पर ध्यान केंद्रित नहीं करती है, एक सर्किट आरेख (चित्रा 1 बी) और भागों की सूची (सामग्री की तालिका) डिवाइस प्रजनन के लिए एड्स के रूप में प्रदान की जाती है।

यह रिपोर्ट अद्वितीय, 3 डी माइक्रोएन्वायरमेंट में सुसंस्कृत जीबीएम कोशिकाओं की एक सरणी की तेजी से पीढ़ी को दर्शाती है जिसमें यंग के मापांक (परिमाण के एक ही क्रम में चार स्तर) और इंटीग्रिन-बाइंडिंग पेप्टाइड सामग्री (चार अलग-अलग ईसीएम प्रोटीन से व्युत्पन्न) ऑर्थोगोनली विविध थे। दृष्टिकोण का उपयोग तब रोगी-व्युत्पन्न जीबीएम कोशिकाओं की व्यवहार्यता और प्रसार पर हाइड्रोगेल यांत्रिकी और ईसीएम-विशिष्ट एकीकृत सगाई के सापेक्ष योगदान की जांच करने के लिए किया गया था क्योंकि वे टेमोज़ोलोमाइड (टीएमजेड) कीमोथेरेपी के प्रतिरोध को प्राप्त करते हैं।

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Protocol

रोगी-व्युत्पन्न जीबीएम सेल लाइनें (जीएस 122 और जीएस 304) प्रोफेसर डेविड नाथनसन (हमारे सहयोगी) द्वारा प्रदान की गई थीं, जिन्होंने यूसीएलए संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी # 10-000655) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत इन लाइनों को विकसित किया था। कोशिकाओं को डी-आइडेंटिफाइड प्रदान किया गया था ताकि सेल लाइनों को व्यक्तिगत रोगियों से वापस नहीं जोड़ा जा सके।

1. हाइड्रोगेल समाधान की तैयारी

  1. हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) में 20 एमएम पर एचईपीईएस पाउडर को भंग करके एचईपीईएस-बफर समाधान तैयार करें। पूर्ण सॉल्वेशन के बाद पीएच को 7 में समायोजित करें।
  2. एचईपीईएस-बफर किए गए समाधान में, थियोलेटेड एचए (700 केडीए नाममात्र आणविक भार, सामग्री की तालिका देखें) को भंग करें, पिछली रिपोर्ट31 के बाद तैयार किया गया है, ताकि प्रत्येक ग्लूकुरोनिक एसिड पर कार्बोक्जिलिक एसिड अवशेषों का 6% -8% एक थियोल के साथ संशोधित किया जाए, बफर समाधान में 10 मिलीग्राम /
    नोट: परिवेश प्रकाश द्वारा थियोल ऑक्सीकरण को रोकने के लिए एक एम्बर शीशी की सिफारिश की जाती है।
    1. पूरी तरह से भंग होने तक कमरे के तापमान पर एक चुंबकीय हलचल प्लेट (<1,000 आरपीएम) का उपयोग करके हिलाओ, आमतौर पर लगभग 45 मिनट।
  3. जबकि एचए भंग हो रहा है, (1) 8-हाथ-पीईजी-नॉरबोर्न (20 केडीए), (2) 4-हाथ-खूंटी-थियोल (20 केडीए) के 100 मिलीग्राम / एमएल के अलग-अलग समाधान तैयार करें, (3) सिस्टीन या सिस्टीन युक्त पेप्टाइड के 4 एमएम (जैसे, जीसीजीवाईजीआरजीडीएसपीजी), और (4) एलएपी के 4 मिलीग्राम /
    1. चरण 1.1 में तैयार एचईपीईएस-बफर समाधान में इन चार समाधानों में से प्रत्येक को तैयार करें। चरण 4 करने से पहले प्रत्येक अभिकर्मक के पूर्ण विघटन को सुनिश्चित करने के लिए समाधान भंवर।
      नोट: यदि कई अलग-अलग पेप्टाइड्स का परीक्षण किया जाता है, तो प्रत्येक में इस संयुग्मन रसायन विज्ञान के लिए सिस्टीन या थियोल मॉइटी का अन्य स्रोत होना चाहिए।
    2. इस बिंदु पर एक एकल हाइड्रोगेल के भीतर टेदर किए जाने वाले सभी पेप्टाइड्स के समाधान (4 एमएम उपलब्ध थियोल) तैयार करें।
      नोट: पेप्टाइड अनुक्रम और ईसीएम प्रोटीन जिनसे वे व्युत्पन्न थे और इस अध्ययन में उपयोग किए गए थे , तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं। एन-एसिटाइल सिस्टीन ( सामग्री की तालिका देखें), जिसमें कोशिकाएं बंधती नहीं हैं, को एक चिपकने वाला पेप्टाइड की एकाग्रता को टाइट्रेट करने या नकारात्मक नियंत्रण31 के रूप में कार्य करने के लिए बायोएक्टिव, थियोल युक्त पेप्टाइड के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  4. तालिका 2 में सूचीबद्ध अंतिम हाइड्रोगेल मैट्रिसेस के लिए अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए एचए, पीईजी-नॉरबोर्न, पीईजी-थियोल और सिस्टीन / थियोल युक्त पेप्टाइड्स (सामग्री की तालिका देखें) के व्यक्तिगत समाधानों को मिलाएं। पूरी तरह से मिश्रण करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए चुंबकीय हलचल प्लेट पर हिलाओ (<1,000 आरपीएम)।
    नोट: हा समाधान अत्यधिक चिपचिपा और सबसे अच्छा एक सकारात्मक विस्थापन विंदुक का उपयोग कर संभाला कर रहे हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। यदि एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट अनुपलब्ध है, तो चिपचिपा समाधान भी व्यापक छिद्र युक्तियों का उपयोग करके धीरे-धीरे पाइपिंग द्वारा एक मानक माइक्रोपिपेट के साथ वितरित किया जा सकता है।

2. एक एलईडी सरणी के माध्यम से हाइड्रोगेल की रोशनी और फोटोक्रॉसलिंकिंग

सावधानी: यूवी सुरक्षात्मक चश्मा पहनें और यूवी-अवशोषित सामग्री के साथ रोशनी क्षेत्र को कवर करें।

नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित एलईडी सरणी में श्रृंखला में रखे गए आठ एल ई डी के छह सेट होते हैं, जैसा कि प्रदान किए गए सर्किट आरेख (चित्रा 1 ए) द्वारा सचित्र है। एल ई डी के प्रत्येक सेट को स्वतंत्र रूप से संचालित किया जा सकता है, जो प्रति रन छह अलग-अलग विकिरणों की अनुमति देता है। अनुपूरक फ़ाइल 1 में आगे के मार्गदर्शन के लिए निम्नलिखित निर्देशों के अनुरूप स्क्रीनशॉट शामिल हैं।

  1. अनुपूरक कोडिंग फ़ाइलों से रोशनी डिवाइस.zip फ़ाइल डाउनलोड करें। इस निर्देशिका में निम्न फ़ाइलें हैं: Arduino.zip (पूरक कोडिंग फ़ाइल 1), ड्राइवर.zip (पूरक कोडिंग फ़ाइल 2), जीयूआई.zip (पूरक कोडिंग फ़ाइल 3), और धारक.zip (पूरक कोडिंग फ़ाइल 4)।
    नोट: 3 डी सर्किट बोर्ड को जगह में रखने के लिए ऊपर और नीचे के हिस्सों को प्रिंट करें (विवरण के लिए पूरक कोडिंग फ़ाइलें देखें)।
  2. माइक्रोकंट्रोलर सॉफ़्टवेयर डाउनलोड और इंस्टॉल करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. डाउनलोड करें और जीयूआई सॉफ्टवेयर स्थापित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। सॉफ़्टवेयर ऑपरेटिंग निर्देशों के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें।
  4. प्रसंस्करण खोलें और स्केच > आयात पुस्तकालय पर क्लिक करके नियंत्रणआईपी 5 लाइब्रेरी स्थापित करें > लाइब्रेरी जोड़ें। फिर, पुस्तकालयों में नियंत्रणआईपी 5 की खोज करें और इंस्टॉल करें पर क्लिक करें। ऐसा पहली बार करें।
  5. 36 वोल्ट बिजली की आपूर्ति का उपयोग करके रोशनी डिवाइस ( सामग्री की तालिका देखें) को पावर करें और इसे माइक्रो-यूएसबी केबल का उपयोग करके पीसी से कनेक्ट करें।
    नोट: कुछ डिवाइस विभिन्न Arduino नैनो बोर्डों के लिए स्वचालित रूप से ड्राइवरों को स्थापित नहीं करेगा। डिवाइस ज़िप फ़ाइल में ड्राइवरों का एक सेट प्रदान किया गया है।
  6. Arduino IDE का उपयोग करके एडरुइनो.zip फ़ोल्डर में स्थित Arduino.ino फ़ाइल खोलें।
  7. चेकमार्क बटन पर क्लिक करके Arduino.ino फ़ाइल संकलित करें। एरो बटन पर क्लिक करके संकलित कोड अपलोड करें।
  8. प्रसंस्करण का उपयोग करते हुए जीयूआई.zip फ़ोल्डर में स्थित जीयूआई.पीडीई फ़ाइल खोलें।
  9. रोशनी डिवाइस को नियंत्रित करने के लिए ग्राफिकल यूजर इंटरफेस लॉन्च करने के लिए प्रोसेसिंग प्रोग्राम में रन पर क्लिक करें।
  10. ग्राफिकल यूजर इंटरफेस विंडो में, क्रॉसलिंक किए जाने के लिए हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान वाले कॉलम के लिए तीव्रता पर क्लिक करें और वांछित तीव्रता इनपुट करें। टाइम बॉक्स और इनपुट वांछित समय पर क्लिक करें। तालिका 2 में दिए गए समाधान के लिए, यह 15 एस होगा।
    नोट: अंत उपयोगकर्ताओं को रेडियोमीटर का उपयोग करके विकिरण के लिए डिजिटल तीव्रता मूल्यों को कैलिब्रेट करने की आवश्यकता है। विशिष्ट तीव्रता के उदाहरण चित्रा 2 ए में प्रदान किए गए हैं।
  11. सिलिकॉन मोल्ड्स (सामग्री की तालिका देखें) या 384-अच्छी तरह से प्लेट के एक स्तंभ में हर दूसरे एलईडी के साथ रोशनी डिवाइस (चित्रा 2 बी) के साथ नमूनों को संरेखित करें। रोशनी शुरू करने के लिए समाप्त पर क्लिक करें। 384-अच्छी तरह से प्लेट के कई स्लाइड या अन्य कुओं की रोशनी के लिए आवश्यक के रूप में इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    नोट: धारक को इस तरह से डिज़ाइन किया गया है कि 384-अच्छी तरह से प्लेट रोशनी के दौरान आंतरिक कक्ष के एक कोने के साथ फ्लश बैठती है।
    1. रोशनी के बाद, जब एक कोने में रखा जाता है, तो अच्छी तरह से प्लेट को अगले कोने में ले जाएं और दोहराएं। प्लेट के दूसरे आधे हिस्से पर कुओं को रोशन करने के लिए, प्लेट को धारक से बाहर निकालें और 180 ° घुमाएं।
  12. नीचे दिए गए चरणों के बाद यांत्रिक लक्षण वर्णन के लिए अलग-अलग यांत्रिकी के साथ हाइड्रोगेल उत्पन्न करें।
    1. मलबे को हटाने के लिए टेप का उपयोग करके ग्लास स्लाइड और सिलिकॉन मोल्ड्स को साफ करें। ग्लास स्लाइड के लिए सिलिकॉन मोल्ड्स का पालन करें, एक अच्छी मुहर सुनिश्चित करने के लिए नीचे दबाएं, और किसी भी हवा के बुलबुले को विस्थापित करें।
    2. हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान के पिपेट 80 μL, के रूप में चरण 1.4 में तैयार, ग्लास स्लाइड पर प्रत्येक सिलिकॉन मोल्ड में।
    3. ग्लास स्लाइड को एक कॉलम में हर दूसरे एलईडी के साथ संरेखित रोशनी डिवाइस पर रखें। हाइड्रोगेल अग्रदूतों को 15 एस के लिए यूवी प्रकाश में उजागर करें, जैसा कि चरण 2 में वर्णित है, फोटोक्रॉसलिंक के लिए।
    4. एक बार रोशनी बंद हो जाने के बाद, स्लाइड्स को पुनः प्राप्त करें, और एक ठीक टिप (10 μL पिपेट टिप, 30 जी सुई, आदि) के साथ मोल्ड की आंतरिक परिधि का पता लगाकर मोल्डों से जैल को ढीला करें। चिमटी/संदंश के साथ सिलिकॉन मोल्ड निकालें।
    5. एक स्पैटुला को गीला करके और धीरे-धीरे उन्हें ग्लास स्लाइड से धक्का देकर 12-अच्छी तरह से प्लेट के अलग-अलग कुओं में क्रॉसलिंक किए गए हाइड्रोगेल को स्थानांतरित करें। हाइड्रोगेल जोड़ने से पहले डीपीबीएस के 2 एमएल ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से भरें। कमरे के तापमान पर (अगले दिन के यांत्रिक लक्षण वर्णन के लिए) कम से कम 12 घंटे (आमतौर पर रात भर) के लिए डीपीबीएस समाधान में जैल को प्रफुल्लित करें।

3. परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) माप

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार परमाणु बल माइक्रोस्कोप (एएफएम) चालू करें ( सामग्री की तालिका देखें)। यह प्रोटोकॉल साधन और संबंधित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने के लिए संक्षिप्त निर्देश प्रदान करता है।
  2. एएफएम जांच स्थापित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, 0.01 एन / मीटर के नाममात्र वसंत स्थिरांक के साथ एक त्रिकोणीय सिलिकॉन नाइट्राइड ब्रैकट को गोलाकार 2.5 μm सिलिकॉन डाइऑक्साइड कण के साथ संशोधित किया गया था।
  3. स्थापना के बाद, लेजर को त्रिकोणीय जांच के शीर्ष पर संरेखित करें, और फिर सिग्नल योग (आमतौर पर 1.5-2.2 वोल्ट के बीच) को अधिकतम करने के लिए दर्पण और लेजर विक्षेपण को समायोजित करें।
  4. डीपीबीएस में जांच विसर्जित करें और थर्मल संतुलन प्राप्त करने के लिए 15 मिनट तक प्रतीक्षा करें। अंशांकन बटन पर क्लिक करें और संपर्क-निर्भर अंशांकन का चयन करें। थर्मल ट्यूनिंग इकट्ठा करें बटन पर क्लिक करें, और डेटा संग्रह के बाद, अंशांकन के लिए 3 किलोहर्ट्ज के आसपास चोटी का चयन करें।
    नोट: अपवर्तक सूचकांक परिवर्तनों के कारण तरल में विसर्जन के बाद दर्पण और लेजर विक्षेपकों का मामूली समायोजन आवश्यक हो सकता है।
  5. निरंतर वेग, 7.5 μm की लक्ष्य ऊंचाई, और 15 μm / s की दृष्टिकोण गति के लिए दृष्टिकोण पैरामीटर सेट करके पेट्री डिश (प्लास्टिक) की सतह तक पहुंचें। दृष्टिकोण के लिए प्रति रन बेसलाइन मापन सक्षम करें ताकि दृष्टिकोण लगातार चलता रहे और विक्षेपक में बहाव के कारण जल्दी न रुके।
  6. दृष्टिकोण पर, 4 एनएन टर्नअराउंड, 2 μm इंडेंटेशन दूरी, 1 μm / s वेग, और 0 एस संपर्क समय के लिए बल मानचित्रण के लिए अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें। प्लास्टिक की सतह पर एक बल वक्र इकट्ठा करना शुरू करने के लिए स्टार्ट बटन दबाएं (उदाहरण के लिए, एक अच्छी तरह से प्लेट)।
  7. अंशांकन खिड़की पर लौटें और प्लास्टिक के संपर्क और इंडेंटेशन के अनुरूप बल वक्र के हिस्से का चयन करें। अंशांकन पूरा करने के लिए जांच के लिए गणना संवेदनशीलता और कठोरता मूल्यों को स्वीकार करें।
  8. अंशांकन के बाद, एएफएम जांच बढ़ाएं और पूछताछ के लिए हाइड्रोजेल नमूना रखें। चरण 5 में प्रदान की गई सेटिंग्स के बाद हाइड्रोगेल दृष्टिकोण।
    नोट: हाइड्रोगेल सतह की ओर दृष्टिकोण प्रक्रिया के दौरान, इकाई गलती से संपर्क की गई स्थिति को ट्रिगर कर सकती है। वास्तविक दृष्टिकोण को सत्यापित करने के लिए, चरण 4.6 के रूप में एक बल वक्र प्राप्त करें। दृष्टिकोण प्रक्रिया को दोहराएं यदि परिणामी वक्र संपर्क नहीं दिखाता है और परिणामस्वरूप इंडेंटेशन होता है।
  9. जब सतह दृष्टिकोण सफल होता है, तो फोर्स मैपिंग मोड पर स्विच करें और प्रति अक्ष 40 μm लंबाई के साथ 8 x 8 आकार के मानचित्र पर अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें। कठोरता माप की एकरूपता का आकलन करने के लिए विभिन्न क्षेत्रों में बल मानचित्र प्राप्त करें।
    1. स्नेडन मॉडल फिट (समीकरण 1 और 2, सभी चर की परिभाषा के लिए तालिका 3 देखें) के माध्यम से सॉफ्टवेयर प्रोग्राम जेपीके एसपीएम डेटा प्रोसेसिंग का उपयोग करके बल घटता की व्याख्या करें गोलाकार ज्यामितिचयनित 32,33,3 4.
      Equation 1समीकरण 132
      Equation 2समीकरण 232

4. 3 डी, मैट्रिक्स-एम्बेडेड संस्कृतियों की स्थापना और दवा उपचार

  1. एक एकल कोशिका समाधान के रूप में वांछित कोशिकाओं को तैयार करें।
    नोट: विभिन्न सेल प्रकारों को अलग-अलग पासिंग विधियों की आवश्यकता हो सकती है। एक टी -75 फ्लास्क से जीबीएम स्फेरॉइड की निलंबन संस्कृति को पारित करने के लिए एक विशिष्ट प्रोटोकॉल संदर्भ31 में बताया गया है।
  2. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक टी -75 फ्लास्क निलंबन संस्कृति से जीबीएम स्फेरॉइड (व्यास में लगभग 150 μm) ले लीजिए। किसी भी अवशिष्ट कोशिकाओं और मीडिया को हटाने और शंक्वाकार ट्यूब में इस मात्रा को जोड़ने के लिए डीपीबीएस के 5 एमएल के साथ संस्कृति फ्लास्क कुल्ला।
  3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर कोशिकाओं युक्त शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्र। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सेल गोली को परेशान न करने के लिए ध्यान रखते हुए, 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और डीपीबीएस के 5 एमएल में फिर से निलंबित करें।
  4. कोशिकाओं को धोने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर अपकेंद्रित्र। एक 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा, सेल गोली परेशान नहीं करने के लिए देखभाल कर रही है, और फिर सेल पृथक्करण अभिकर्मक के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  5. 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। पूर्ण माध्यम के 3 एमएल जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और धीरे पिपेट 3-5 बार एक एकल सेल निलंबन के लिए स्फेरॉइड को तोड़ने के लिए31.
  6. कमरे के तापमान पर गोली कोशिकाओं के लिए 5 मिनट के लिए 400 एक्स जी (एकल सेल निलंबन गोली गठन के लिए तेजी से काता जा सकता है) पर एकल सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। सेल गोली परेशान नहीं करने के लिए ध्यान रखना, एक 5 एमएल सीरोलॉजिकल विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा। पूर्ण माध्यम के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    नोट: यदि कोशिकाएं निलंबन में एकल कोशिकाओं के बजाय गुच्छों में रहती हैं, तो पासिंग के बाद, कोशिकाओं को एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए 40 μm सेल छलनी के माध्यम से पारित किया जा सकता है।
  7. एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके गिनती के लिए कोशिकाओं के एक हिस्से को निकालें। ट्रिपैन नीले रंग के साथ इस हिस्से को दो गुना पतला करें, जो समझौता व्यवहार्यता के साथ कोशिकाओं में व्याप्त है। केवल जीवित, रंगहीन कोशिकाओं की गिनती करें। आमतौर पर, प्रति फ्लास्क 800,000 कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त टी -75 संस्कृति में एक सप्ताह के बाद 2-3 मिलियन कोशिकाओं का उत्पादन करता है।
  8. एनकैप्सुलेशन के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें। एक बाँझ 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में आवश्यक कोशिकाओं की कुल संख्या युक्त मीडिया की एक मात्रा हस्तांतरण। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर नीचे स्पिन।
    नोट: उदाहरण के लिए, जेल वॉल्यूम के 1 एमएल में पुन: निलंबित 2.5 मिलियन कोशिकाओं की एक न्यूनतम 2.5 मिलियन कोशिकाओं को 2.5 मिलियन कोशिकाओं / एमएल पर कोशिकाओं को समाहित करने की आवश्यकता होती है। 1 एमएल की जेल मात्रा उपयोगकर्ताओं को 100 जेल बूंदों को वितरित करने की अनुमति देती है, जहां प्रत्येक जेल ड्रॉप 10 μL वॉल्यूम का होता है। हाइड्रोगेल समाधान में निलंबित कोशिकाओं की एक अतिरिक्त ~ 20% मात्रा तैयार करने की सिफारिश की जाती है पिपेट हस्तांतरण के दौरान नुकसान के लिए खाते में। इस प्रकार, कोई इस उदाहरण में 3 मिलियन कोशिकाओं और 1.2 मिलीलीटर हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान तैयार करेगा। एमएल के न्यूनतम घनत्व की सिफारिश की जाती है।
  9. एक माइक्रोपिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें, ध्यान रखें कि सेल गोली को परेशान न करें। हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान में सेल गोली को फिर से निलंबित करें, जैसा कि चरण 1.4 में तैयार किया गया है, 1,000 μL माइक्रोपिपेट के साथ 4-5 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं।
  10. एक दोहराने पिपेटर में कोशिकाओं लोड ( सामग्री की तालिका देखें) 10 μL वितरण करने के लिए सेट। बुलबुले और असमान वितरण से बचने के लिए, अपशिष्ट कंटेनर में अतिरिक्त 1-2 बार वितरित करके दोहराने वाले पिपेटर को प्राइम करें।
  11. 384-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में, दोहराने वाले पिपेटर से हाइड्रोगेल समाधान में निलंबित कोशिकाओं के 10 μL वितरित करें। एलईडी सरणी का उपयोग करके, वांछित यांत्रिक गुणों को प्राप्त करने के लिए तीव्रता के साथ 15 एस के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त कोशिकाओं (चरण 2) को रोशन करें (उदाहरण के लिए चित्रा 2 ए में 1.14, 1.55, 2.15,2.74 मेगावाट /
    नोट: यह प्रयोगात्मक स्थिति प्रति पांच प्रतिकृतियों के साथ शुरू करने और वांछित थ्रूपुट और समापन बिंदु परख के विचरण के आधार पर ऊपर या नीचे स्केल करने का सुझाव दिया जाता है।
  12. कोशिकाओं युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पूर्ण मीडिया के 40 μL जोड़ें। वाष्पीकरण के कारण होने वाले नुकसान को कम करने के लिए जैल के आसपास गैर-प्रयोगात्मक, सूखे कुओं में डीपीबीएस के 50 μL जोड़ें।
  13. जीबीएम कोशिकाओं के लिए, अंतिम वांछित एकाग्रता (डाइमिथाइलसल्फोक्साइड (डीएमएसओ) या वाहन (डीएमएसओ) में 10 μM-100 μM) प्राप्त करने के लिए मीडिया युक्त दवा (जैसे, टीएमजेड, सामग्री की तालिका देखें) के 40 μL जोड़ें, तदनुसार, एनकैप्सुलेशन के 3 दिन बाद शुरू करें।

5. सीसीके 8 प्रसार परख

  1. कोशिकाओं युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सीसीके 8 अभिकर्मक के 10 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: यदि पहली बार के लिए इस परख प्रदर्शन, इस तरह के मीडिया केवल या मीडिया में सेल मुक्त हाइड्रोगेल के रूप में नकारात्मक नियंत्रण कुओं शामिल हैं।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 1-4 घंटे के लिए सेते हैं।
    नोट: यह समय सेल प्रकार और घनत्व के एक समारोह के रूप में भिन्न हो सकता है, और इस प्रकार प्रत्येक एप्लिकेशन के लिए इनक्यूबेशन बार परीक्षण करने की आवश्यकता होती है ताकि अवशोषण मान एक रैखिक सीमा के भीतर आते हैं, बीयर के नियम35 को लागू करने की आवश्यकता।
  3. इनक्यूबेशन के बाद सभी कुओं के लिए 450 एनएम पर अवशोषण पढ़ें।
  4. प्रत्येक समूह के लिए वाहन की स्थिति के लिए चरण 3 में प्राप्त 450 एनएम पर औसत अवशोषण की गणना करें। प्रत्येक दवा-उपचारित को प्रति समूह वाहन नियंत्रण के औसत से अच्छी तरह से विभाजित करें।
  5. प्रतिशतक विधि36 के माध्यम से बूटस्ट्रैप वितरण (एन = 10,000) उत्पन्न करके आत्मविश्वास अंतराल की गणना करें।
    नोट: आम तौर पर, कोई 95% आत्मविश्वास अंतराल का उपयोग कर सकता है और उन स्थितियों की व्याख्या कर सकता है जिनके आत्मविश्वास अंतराल महत्वपूर्ण होने के लिए 1 से अधिक पार नहीं करते हैं और आगे की जांच का वारंट करते हैं। 95% पर आत्मविश्वास अंतराल सेट करना पी = 0.05 के महत्व कटऑफ को सेट करने के साथ संगत है। परिणामों में दिखाए गए आंकड़ों के लिए, उन स्थितियों को अलग करने में उपयोगिता है जो मैट्रिक्स-मध्यस्थता दवा प्रतिरोध को बढ़ावा देते हैं या बाधित करते हैं, जिसके लिए दो-तरफा विश्लेषण की आवश्यकता होती है।

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Representative Results

सेमी2) के एक समारोह के रूप में हाइड्रोगेल यांत्रिकी के सटीक नियंत्रण की पुष्टि की फोटो-क्रॉसलिंकिंग के दौरान एक कस्टम-निर्मित, Arduino-नियंत्रित एलईडी सरणी (चित्रा 2 ए) का उपयोग कर। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले हाइड्रोगेल फॉर्मूलेशन को तालिका 2 में पाया जा सकता है। प्रदान किए गए टेम्पलेट पर एल ई डी की रिक्ति एक 384 अच्छी तरह से प्लेट के हर दूसरे कुएं के लिए रिक्ति से मेल खाती है, जिससे प्लेट (चित्रा 2 बी) के अंदर जैल के गठन की अनुमति मिलती है। एकल हाइड्रोगेल की सतहों पर माइक्रोन-स्केल क्षेत्रों की एएफएम पूछताछ से पता चला है कि नरम औसत यंग के मॉड्यूली वाले हाइड्रोगेल में स्टिफर हाइड्रोगेल (चित्रा 2 सी-ई) की तुलना में मॉड्यूली की छोटी श्रेणियां भी थीं।

व्यवहार्यता को अधिकतम करने वाले सेल सीडिंग घनत्व को प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। यह अध्ययन दर्शाता है कि 2,500,000 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर वरीयता प्राप्त जीएस 122 कोशिकाओं की 3 डी संस्कृतियों ने 500,000 कोशिकाओं / एमएल (चित्रा 3 ए) के घनत्व पर वरीयता प्राप्त लोगों की तुलना में संस्कृति में 7 दिनों के बाद मूल्यांकन किए जाने पर काफी अधिक व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, जीएस 122 और जीएस 304 कोशिकाओं का उपयोग मैट्रिक्स माइक्रोएनवायरनमेंट (चित्रा 3 बी-डी) की कठोरता और जैव रासायनिक संरचना पर कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया की निर्भरता की जांच करने के लिए रोगी-व्युत्पन्न जीबीएम कोशिकाओं को संवर्धन के लिए मॉडल के रूप में किया गया था। सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन सीसीके 8 परख के माध्यम से 4 दिनों के लिए टीएमजेड के साथ उपचार के बाद किया गया था, जिससे संबंधित वाहन नियंत्रण द्वारा ओडी450 माप को स्केल करके 7 दिनों का कुल संस्कृति समय और प्रतिशत विधि36 के साथ बूटस्ट्रैपिंग (एन = 10,000) द्वारा 95% आत्मविश्वास अंतराल उत्पन्न किया गया था। इन वितरणों के साथ, जिन स्थितियों में आत्मविश्वास अंतराल 1 (धराशायी रेखा) के मूल्य के साथ ओवरलैप नहीं हुआ था, उन्हें महत्वपूर्ण माना जाता था। टी-टेस्ट या एनोवा जैसे अधिक सामान्यतः उपयोग किए जाने वाले सांख्यिकीय तरीकों की तुलना में, बड़े नमूना आकारों के लिए मौजूद वितरण का अनुमान लगाने के लिए बूटस्ट्रैपिंग का उपयोग करके आत्मविश्वास अंतराल का अनुमान लगाना, स्क्रीनिंग परख के लिए पसंद किया जाता है जिसका लक्ष्य आगे की जांच के लिए स्थितियों के एक छोटे सबसेट की पहचान करना है। इस पद्धति का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि आत्मविश्वास अंतराल में एक छोटे प्रसार वाली स्थितियों को एक समान औसत मूल्य के साथ अन्य स्थितियों पर प्राथमिकता दी जा सकती है लेकिन आत्मविश्वास अंतराल में एक उच्च प्रसार होता है। इस अध्ययन ने संकेत दिया कि जीएस 122 कोशिकाओं ने माइक्रोएनवायरनमेंटल इंटरैक्शन (चित्रा 3 बी) से उत्तरजीविता लाभ प्राप्त किया। यह उत्तरजीविता लाभ 0.8, 1 और 4 केपीए स्थितियों में महत्वपूर्ण था, लेकिन जीएस 122 कोशिकाओं के लिए 8 केपीए स्थिति में नहीं। जीएस 304 कोशिकाएं कठोरता और टीएमजेड उपचार दोनों के प्रति असंवेदनशील थीं।

मैट्रिक्स माइक्रोएन्वायरमेंट की जैव रासायनिक संरचना के प्रभाव की जांच तब ईसीएम-व्युत्पन्न, इंटीग्रिन-बाइंडिंग पेप्टाइड्स (तालिका 1) को शामिल करके की गई थी, जिसे जीबीएम ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट में दो कठोरता, 0.8 केपीए और 8 केपीए पर अपग्रेड करने के लिए जाना जाता है। फिर, जीएस 304 कोशिकाओं को मैट्रिक्स समावेश से कोई महत्वपूर्ण उत्तरजीविता लाभ नहीं मिला और टीएमजेड के प्रति असंवेदनशील थे। हालांकि, जीएस 122 कोशिकाओं ने 8 केपीए स्थिति में जीवित रहने के लाभ दिखाए जब ऑस्टियोपोंटिन-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स को मैट्रिक्स में शामिल किया गया था, जबकि इंटीग्रिन-बाइंडिंग सियालोप्रोटीन (आईबीएसपी) - या टेनासिन-सी-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के समावेश ने न्यूनतम उत्तरजीविता लाभ प्रदान किए, जैसे कि सामान्य आरजीडी पेप्टाइड (चित्रा 3 सी) के साथ मैट्रिक्स में संस्कृति। इसके विपरीत, कोई पेप्टाइड्स 0.8 केपीए संस्कृति की स्थिति (चित्रा 3 डी) में उत्तरजीविता लाभ प्रदान नहीं करता है। साथ में, परिणाम मूल्यांकन किए गए दो रोगी-व्युत्पन्न सेल लाइनों के बीच मैट्रिक्स और दवा प्रतिक्रियाओं दोनों में आंतरिक अंतर का सुझाव देते हैं।

3 डी हाइड्रोगेल संस्कृतियों को मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है ताकि यह आकलन किया जा सके कि सेल आकृति विज्ञान और आक्रामक व्यवहार सेल-लाइन-निर्भर तरीके से संस्कृति की स्थिति से कैसे प्रभावित होते हैं (चित्रा 4)। आरजीडी युक्त पेप्टाइड्स (चित्रा 4 ए) सहित नरम या कठोर हाइड्रोगेल मैट्रिक्स में सुसंस्कृत होने पर जीएस 122 और जीएस 304 कोशिकाएं दोनों फैलती हैं। जबकि पेप्टाइड्स ने सेल प्रसार को प्रभावित किया, एक सेल की फैलने की क्षमता ने जरूरी नहीं कि टीएमजेड प्रतिरोध प्राप्त करने के लिए संस्कृति की क्षमता की भविष्यवाणी की। उदाहरण के लिए, जीएस 122 कोशिकाएं ऑस्टियोपोंटिन के साथ 0.8 और 8 केपीए दोनों में फैलने की समान कमी दिखाती हैं; हालांकि, जीएस 122 ने केवल 8 केपीए स्थिति (चित्रा 4 बी) में टीएमजेड के लिए बढ़ाया प्रतिरोध दिखाया। अंत में, इस लघु, 3 डी संस्कृति मंच का उपयोग अन्य ट्यूमर प्रकारों से मानव कोशिकाओं को संस्कृति करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें टर्मिनल रूप से विभेदित, न्यूरोएंडोक्राइन प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं (चित्रा 4 सी) के व्यवहार्य ऑर्गेनोइड शामिल हैं।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का कार्टून चित्रण. (ए) 3 डी संस्कृति पीढ़ी और निगरानी के लिए प्रक्रिया का कार्टून चित्रण। (1) एचए-आधारित हाइड्रोगेल समाधान तैयार किए जाते हैं। (2) हाइड्रोगेल समाधान तब एक आर्डिनो माइक्रोकंट्रोलर द्वारा नियंत्रित एल ई डी के माध्यम से चर तीव्रता के साथ क्रॉसलिंक किए जाते हैं। (3) जेल यांत्रिकी में अंतर को सत्यापित करने के लिए एएफएम द्वारा परिणामी हाइड्रोगेल यांत्रिकी का मूल्यांकन किया जाता है। (4) चरण 1 से सूत्रीकरण से मेल खाने वाले समाधानों का उपयोग रोगी-व्युत्पन्न जीबीएम कोशिकाओं को समाहित करने और दवा के साथ इलाज करने के लिए किया जाता है। (5) 7 दिनों के बाद, सेल व्यवहार्यता सीसीके 8 वर्णमिति परख के माध्यम से पढ़ा जाता है। (बी) इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले कस्टम एलईडी रोशनी सरणी के लिए सर्किट आरेख। व्यक्तिगत घटक सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: विकिरण को संशोधित करने के लिए ट्यूनेबल एल ई डी का उपयोग करके अलग-अलग कठोरता के साथ गढ़े गए हाइड्रोगेल (ए) वायलिन भूखंड तीन सतह क्षेत्रों में एएफएम द्वारा उत्पन्न बल घटता से गणना किए गए यंग के मापांक को दिखाते हैं, जो व्यक्तिगत हाइड्रोगेल के 40 μm x 40 μm तक फैले हुए हैं। प्रत्येक हाइड्रोगेल के यंग के मापांक को फोटोक्रॉसलिंकिंग के दौरान यूवी विकिरण के एक कार्य के रूप में दिखाया गया है। क्षैतिज सफेद रेखाएं प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए माध्यिका का संकेत देती हैं। (बी) बहु-अच्छी तरह से प्लेटों (384 कुओं) की पिच से मेल खाने वाले रिक्ति के साथ एलईडी सरणी। (सी) हीट मैप यंग के मापांक (माध्य = 0.8 केपीए) की क्षेत्रीय भिन्नता को दर्शाता है, जो 15 एस के लिए 1.55 मेगावाट / सेमी2 के संपर्क में आने से क्रॉसलिंक किया गया है (डी) हीट मैप यंग के मापांक (माध्य = 8 केपीए) की क्षेत्रीय भिन्नता दिखा रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: कठोरता और एकीकृत-बाध्यकारी पेप्टाइड की ऑर्थोगोनल प्रस्तुति जीबीएम सेल लाइनों के बीच आंतरिक जैविक अंतर को प्रकट करती है। (ए) 500,000 या 2,500,00 कोशिकाओं प्रति एमएल के घनत्व पर 10 μL हाइड्रोगेल में समझाए गए GS122 कोशिकाओं के लिए विशिष्ट अवशोषण मूल्य। (बी) जीएस 122 और जीएस 304 सेल लाइनों के लिए ड्रग रिस्पॉन्स डेटा को वाहन-उपचारित कुओं (एन = 5) के औसत से दवा-उपचारित कुओं (एन = 5) के ओडी 450 मूल्य को सामान्य करके कल्पना की जाती है। दवा उपचार के संदर्भ में व्यवहार्यता हाइड्रोगेल कठोरता के लिए गैर-रैखिक रूप से भिन्न देखी गई, जो सेल लाइनों के बीच भिन्नता का प्रदर्शन करती है। (सी, डी) जीएस 122 और जीएस 304 सेल लाइनों के लिए ड्रग रिस्पॉन्स डेटा जब इंटीग्रिन-बाइंडिंग पेप्टाइड का प्रकार शामिल किया गया था और मैट्रिक्स कठोरता ऑर्थोगोनली विविध थी। सभी त्रुटि सलाखों एन = 10,000 द्वारा प्रत्येक स्थिति बूटस्ट्रैपिंग से प्राप्त 95% आत्मविश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करते हैं। धराशायी रेखा (वाई-अक्ष = 1) उस मामले से मेल खाती है जहां उपचार की स्थिति के लिएआयुध डिपो 450 वाहन के बराबर होता है। संस्कृति में 7 दिनों के बाद सभी प्रयोगात्मक मूल्य प्राप्त किए गए थे; दवा अध्ययन के लिए प्रारंभिक एनकैप्सुलेशन के 3 दिन बाद टीएमजेड जोड़ा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: विभिन्न एचए-आधारित हाइड्रोगेल वातावरण में एन्कैप्सुलेटेड कोशिकाओं के बीच रूपात्मक अंतर( ए) जीएस 122 और जीएस 304 की चरण-विपरीत छवियां, जब हाइड्रोगेल (0.8 और 8 केपीए) में सुसंस्कृत होती हैं, तो आरजीडी आकृति प्रदर्शित होती है। सफेद तीर प्रसार आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं को इंगित करते हैं। (बी) जीएस 122 और जीएस 304 की चरण छवियां, जब हाइड्रोगेल (0.8 और 8 केपीए) में सुसंस्कृत होती हैं, तो ऑस्टियोपॉन्टिन से प्राप्त पेप्टाइड प्रदर्शित होता है। सफेद तीर प्रसार आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं को इंगित करते हैं। काले तीर गोल आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं को इंगित करते हैं। संस्कृति में 7 दिनों के बाद, छवियों को लिया गया था, और प्रारंभिक एनकैप्सुलेशन के 3 दिन बाद टीएमजेड जोड़ा गया था। (सी) टर्मिनल रूप से विभेदित न्यूरोएंडोक्राइन प्रोस्टेट ऑर्गेनोइड की चरण छवि। स्केल सलाखों = 200 μm ( ए, बी के लिए); 100 μm ( C के लिए)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रोटीन पेप्टाइड अनुक्रम
आरजीडी जीसीजीवाईजीआरजीडीएसपीजी
टेनासिन-सी जीसीजीवाईजीआरएसटीडीएलपीजीटीआईटीआईआरजीवी
इंटीग्रिन-बाइंडिंग सियालोप्रोटीन (आईबीएसपी) जी.सी.जी
ऑस्टियोपॉन्टिन जीसीजीवाईजीटीवीडीवीपीडीजीआरजीडीएसएलएईजी

तालिका 1: ईसीएम प्रोटीन और व्युत्पन्न पेप्टाइड अनुक्रम।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) प्रारंभिक एकाग्रता आयतन (μL) अंतिम एकाग्रता
एचए-एसएच समाधान 10 मिलीग्राम / 2300 5 मिलीग्राम /
खूंटी-श 100 मिलीग्राम / 503 प्रति प्रयोग बदलता रहता है
खूंटी-नॉरबोर्न 100 मिलीग्राम / 443 प्रति प्रयोग बदलता रहता है
पेप्टाइड 4 μM 288 0.250 μM
गोद 4 मिलीग्राम / 288 0.25 मिलीग्राम /
हेप्स-एचबीएस एन/ए 798

तालिका 2: हाइड्रोगेल के लिए विशिष्ट अंतिम सूत्रीकरण घटक।

परिवर्तनशील प्राचल
F बल
E यंग का मापांक
ν पॉइसन का अनुपात
δ इंडेंटेशन (ऊर्ध्वाधर टिप स्थिति)
एक संपर्क वृत्त की त्रिज्या
आरएस गोले की त्रिज्या

तालिका 3: एएफएम गणना के लिए चर और संबंधित पैरामीटर।

अनुपूरक फ़ाइल 1: हाइड्रोगेल की रोशनी और फोटोक्रॉसलिंकिंग के लिए एलईडी सरणी के उपयोग के बारे में मार्गदर्शन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: एलईडी सरणी माइक्रोकंट्रोलर (अरुडिनो.zip) के लिए अरुडिनो फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 2: Arduino नैनो (ड्राइवर.zip) के लिए तृतीय-पक्ष ड्राइवर। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 3: एलईडी सरणी माइक्रोकंट्रोलर (जीयूआई.zip) के जीयूआई नियंत्रण के लिए प्रसंस्करण फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 4: एलईडी सरणी माइक्रोकंट्रोलर (धारक.zip) के लिए 3 डी प्रिंटिंग बाहरी धारक के लिए फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वर्तमान कार्य एचए-आधारित के भीतर 3 डी, लघु संस्कृतियों को उत्पन्न करने के तरीकों को प्रस्तुत करता है, जबकि एक साथ मैट्रिक्स कठोरता और एकीकृत सगाई के लिए उपलब्ध पेप्टाइड्स को बदलता है। यह तकनीक व्यवस्थित अध्ययन को सक्षम बनाती है कि मैट्रिक्स पैरामीटर सेलुलर फेनोटाइप (जैसे, कीमोथेरेपी के संपर्क में आने वाली कैंसर कोशिकाओं की व्यवहार्यता) को बढ़े हुए थ्रूपुट के साथ कैसे प्रभावित करते हैं। यहां प्रस्तुत किए गए पिछले दृष्टिकोणों सहित, अंतिम सूत्रीकरण में प्रतिशत कुल बहुलक को अलग करके हाइड्रोगेल कठोरता को ट्यून किया गया है, जहां स्टिफर हाइड्रोगेल में उच्च बहुलक सामग्री21,31 है। हालांकि, इस दृष्टिकोण को वांछित प्रत्येक कठोरता के लिए एक अद्वितीय हाइड्रोगेल सूत्रीकरण तैयार करने की आवश्यकता होती है, एक प्रक्रिया जो आंतरिक रूप से थ्रूपुट को कम करती है। यहां, हाइड्रोगेल कठोरता को क्रॉसलिंकिंग के दौरान यूवी विकिरण को अलग करके ट्यून किया जाता है ताकि एक ही अग्रदूत समाधान से कई कठोरताओं के हाइड्रोगेल प्राप्त किए जा सकें। भविष्य के चिकित्सक जिनके पास यहां वर्णित कस्टम प्रकाशक का निर्माण करने का अवसर नहीं हो सकता है, वे आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध यूवी स्पॉट-इलाज डिवाइस को प्रतिस्थापित कर सकते हैं और रोशनी को समायोजित कर सकते हैं क्योंकि एक अच्छी तरह से प्लेट के विभिन्न क्षेत्र ठीक हो जाते हैं। कस्टम प्रकाशक की तुलना में वाणिज्यिक स्पॉट-इलाज डिवाइस का उपयोग करने का नकारात्मक पक्ष थ्रूपुट कम हो जाता है। वर्तमान तरीकों की एक सीमा यह है कि प्रत्येक पेप्टाइड स्थिति के लिए अद्वितीय समाधान अभी भी तैयार किए जाने चाहिए। इसी तरह के तरीकों का उपयोग पहले अन्य समूहों द्वारा कठोरता-ढाल युक्त हाइड्रोगेल37,38 का उत्पादन करने के लिए किया गया है। हालांकि, यह अध्ययन दर्शाता है कि फोटोक्रॉसलिंकिंग प्रयोगात्मक नमूनों के लघुकरण को कैसे सक्षम कर सकती है और प्रयोगात्मक सेटअप की जटिलता को कम कर सकती है। कुल मिलाकर, ये सुधार शोधकर्ताओं को मैट्रिक्स-माइमेटिक बायोमैटेरियल्स में 3 डी संस्कृतियों का संचालन करते समय प्रयोगात्मक थ्रूपुट बढ़ाने की अनुमति देंगे और न्यूरो-ऑन्कोलॉजी से परे जैव चिकित्सा विज्ञान में कई क्षेत्रों में उपयोगिता होगी।

प्रतिनिधि परिणाम दर्शाते हैं कि इस तकनीक का उपयोग परिभाषित मैट्रिक्स में रोगी-व्युत्पन्न जीबीएम कोशिकाओं की लघु, 3 डी संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए कैसे किया जा सकता है, जिसमें उपलब्ध इंटीग्रिन-बाइंडिंग पेप्टाइड्स और कठोरता विविध हैं, एक मानक 384-अच्छी तरह से प्लेट के भीतर कई मानक परखों के लिए उपयुक्त है। यह विधि स्क्रीन करने के लिए प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करती है कि मैट्रिक्स पैरामीटर दो अद्वितीय रोगियों से प्राप्त जीबीएम कोशिकाओं में टीएमजेड कीमोथेरेपी की प्रतिक्रियाओं को कैसे प्रभावित करते हैं, जिन्हें जीएस 122 और जीएस 304 कोशिकाओं के रूप में दर्शाया गया है। यहां मूल्यांकन की गई दो रोगी-व्युत्पन्न सेल लाइनों में से, टीएमजेड उपचार के लिए जीएस 122 कोशिकाओं की प्रतिक्रिया मैट्रिक्स माइक्रोएनवायरनमेंट के प्रति संवेदनशील थी, जबकि जीएस 304 कोशिकाओं की प्रतिक्रिया असंवेदनशील थी। मैट्रिक्स कठोरता के बारे में, जीएस 122 कोशिकाओं ने 4 केपीए माइक्रो-कंप्रेसिव मापांक अधिकतम टीएमजेड प्रतिरोध के साथ 3 डी हाइड्रोगेल में सुसंस्कृत किया, जिसके तहत 7-दिवसीय प्रयोगात्मक पाठ्यक्रम में अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में इलाज कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई। यांत्रिक गुणों का टीएमजेड प्रतिरोध पर एकीकृत-बाध्यकारी पेप्टाइड्स की तुलना में बड़ा प्रभाव पड़ा। इस प्रकार, यह उम्मीद की जाती है कि अलग-अलग पेप्टाइड सांद्रता का प्रभाव, अकेले और संयोजन में, भविष्य में दवा प्रतिरोध को बढ़ावा देने वाली मैट्रिक्स स्थितियों की खोज को सक्षम करेगा। अपने आसपास के मैट्रिक्स के लिए जीएस 304 कोशिकाओं की असंवेदनशीलता यह संकेत दे सकती है कि मैट्रिक्स कोशिकाओं पर अधिक प्रभावशाली है, जैसे जीएस 122 कोशिकाएं, जो मूल रूप से टीएमजेड के प्रति संवेदनशील हैं, फिर भी उपचार के दौरान प्रतिरोध प्राप्त करती हैं। इसके विपरीत, मैट्रिक्स संकेत किस हद तक कोशिकाओं को प्रभावित करते हैं जो प्रयोग की शुरुआत में पहले से ही उपचार प्रतिरोधी हैं, यह स्पष्ट नहीं है, जैसा कि जीएस 304 कोशिकाओं के साथ है।

इस अध्ययन के परिणाम पहले बताए गए परिणामों से कुछ हद तक विचलित हो गए। मूल्यांकन किए गए सबसे नरम एचए-आधारित हाइड्रोगेल (1 केपीए थोक यंग के मापांक, देशी मस्तिष्क की कठोरता की नकल करते हुए) ने यहां मूल्यांकन किए गए विभिन्न रोगियों से चार ट्यूमर से प्राप्त अधिकतम टीएमजेड प्रतिरोध जीबीएम कोशिकाओं को बढ़ावा दिया। इस विसंगति के कई संभावित कारण हैं। सबसे पहले, वर्तमान अध्ययन में हाइड्रोगेल कठोरता की एक विस्तारित श्रृंखला से पूछताछ की गई थी, जिसने 0.8 केपीए से 8 केपीए माइक्रो-कंप्रेसिव मॉड्यूली की सीमा में हाइड्रोगेल की तुलना की थी, जबकि पिछले अध्ययनों ने केवल 1 केपीए और 2 केपीए यंग के मॉड्यूली के साथ हाइड्रोगेल की तुलना की थी। इसके अतिरिक्त, पिछले अध्ययनों में, यंग के मापांक का अनुमान लगाने के लिए रैखिक यांत्रिक संपीड़न का उपयोग करके थोक पैमाने पर यांत्रिक लक्षण वर्णन किया गया था, जबकि, इस अध्ययन में, एएफएम का उपयोग सूक्ष्म-संपीड़न मापांक को मापने के लिए किया गया था। यहां मौजूद तरीकों को लागू करने की मांग करने वाले शोधकर्ताओं के लिए जिन्हें सूक्ष्म पैमाने पर यांत्रिकी माप की आवश्यकता नहीं है, थोक पैमाने पर मॉड्यूली, रियोमेट्री या रैखिक यांत्रिक परीक्षण का उपयोग करके, एएफएम के लिए पूरी तरह से स्वीकार्य विकल्प हैं। विशेष रूप से, सूक्ष्म-यांत्रिक विश्लेषण ने एक ही जेल की सतह पर विषम मॉड्यूली का खुलासा किया। पिछले अध्ययनों में तैयार हाइड्रोगेल पर तुलनीय एएफएम माप नहीं किए गए हैं, लेकिन यह उम्मीद की जाती है कि एक हाइड्रोगेल के भीतर प्रस्तुत कठोरता का विचरण वर्तमान अध्ययन की तुलना में अधिक है। पिछले अध्ययनों में हाइड्रोगेल 37 डिग्री सेल्सियस10,21,24 पर गतिज मिश्रण पर निर्भर माइकल-प्रकार के अतिरिक्त क्रॉसलिंकिंग का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे। इसके विपरीत, फोटोक्रॉसलिंकिंग प्रकाश जोखिम से पहले हाइड्रोगेल अग्रदूतों के पूरी तरह से मिश्रण की अनुमति देता है, जो 3 डी हाइड्रोगेल के भीतर एकरूपता में सुधार करता है और बदले में, सेल प्रतिक्रियाओं की परिवर्तनशीलता को कम करता है। अंत में, जीबीएम ट्यूमर कुख्यात विषम और अप्रत्याशित व्यवहार39 प्रदर्शित करते हैं और इस प्रकार, यह उम्मीद करना उचित है कि व्यक्तिगत ट्यूमर से प्राप्त कोशिकाओं में भी अद्वितीय गुण होंगे। रोगी के नमूनों में स्थिरता की यह कमी रोगी-विशिष्ट ट्यूमर विशेषताओं को स्पष्ट करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट मंच की आवश्यकता को प्रेरित करती है।

लघु हाइड्रोगेल फोटोक्रॉसलिंकिंग प्रक्रिया करते समय सामान्य नुकसान में हाइड्रोगेल अग्रदूतों का अधूरा मिश्रण शामिल होता है, जिसके परिणामस्वरूप खराब प्रजनन क्षमता और मिश्रण करते समय एचए समाधान का सहज जेलेशन होता है। इन मुद्दों को कम से कम 45 मिनट के लिए एचए-थियोल को सरगर्मी करके कम किया जा सकता है और कम से कम अतिरिक्त 30 मिनट के लिए पूर्ण अग्रदूत समाधान हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधानों के पीएच की बारीकी से निगरानी करते हुए यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह थियोल ऑक्सीकरण और क्रॉसलिंक के लिए डाइसल्फाइड के गठन को रोकने के लिए 7 से नीचे रहता है। गतिज माइकल-प्रकार के जोड़ तंत्र10,21 का उपयोग करके क्रॉसलिंकिंग विधियों के विपरीत, इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली फोटोक्रॉसलिंकिंग विधि सहज जेलेशन की संभावना को कम करती है जब सभी अभिकर्मकों को21 संयुक्त किया जाता है। गुणवत्ता नियंत्रण चौकियों की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है, जैसे कि एचए थियोलेशन प्रतिशत31 को मापना और 3 डी संस्कृतियों के प्रत्येक बैच के समानांतर यांत्रिक परीक्षण के लिए अतिरिक्त हाइड्रोगेल बनाना। अंत में, हाइड्रोगेल में 3 डी एनकैप्सुलेशन के लिए बीजारोपण घनत्व को उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक सेल प्रकार या लाइन के लिए पहचाना जाना चाहिए। आम तौर पर, परिणाम बताते हैं कि अधिकांश कोशिकाओं की 3 डी संस्कृति के लिए 1 मिलियन कोशिकाओं / एमएल की न्यूनतम एकाग्रता पर्याप्त है, जो रोगी-व्युत्पन्न जीबीएम कोशिकाओं, मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एच 9), और मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (डेटा नहीं दिखाया गया है) सहित स्फेरॉइड बनाते हैं। विशेष रूप से संवेदनशील कोशिकाओं का उपयोग करते समय एनकैप्सुलेशन (चरण 4.1) से पहले रॉक अवरोधक उपचार को शामिल करने की भी सिफारिश की जाती है40.

जीबीएम के लिए नए उपचार दृष्टिकोण विकसित करने के संदर्भ में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल शारीरिक रूप से प्रासंगिक माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर रोगी-व्युत्पन्न जीबीएम कोशिकाओं की कार्यात्मक रूप से स्क्रीनिंग दवा प्रतिक्रियाओं के लिए तरीके प्रदान करता है। जीबीएम (और अन्य कैंसर) के लिए आनुवंशिक, एपिजेनेटिक और नैदानिक एमआरएनए अभिव्यक्ति डेटा का एक समृद्ध भंडार कैंसर जीनोम एटलस (टीसीजीए) और अन्य15 के प्रयासों के लिए सार्वजनिक रूप से उपलब्ध है। इन बड़े डेटासेट के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किया जाता है, यह उम्मीद की जाती है कि लघु, 3 डी संस्कृतियों की कार्यात्मक स्क्रीन से उत्पन्न डेटा नए सहसंबंधों को प्रकट कर सकता है, जिससे व्यक्तिगत रोगियों में नैदानिक परिणामों की भविष्यवाणी में सुधार हो सकता है। उदाहरण के लिए, रोगी ट्यूमर की उप-आबादी की पहचान की जा सकती है जिसके लिए कुछ उपचार, जैसे मैट्रिक्स-विघटनकारी यौगिक जैसे कि सिलेंजिटाइड, नैदानिक परिणामों में सुधार कर सकतेहैं 41. दवा प्रतिक्रिया के अलावा, यह संस्कृति मंच अच्छी तरह से प्लेट संगत, उच्च सामग्री इमेजर का उपयोग करके ट्यूमर सेल आक्रमण के आकलन को सक्षम बनाता है। अकेले या संयोजन में कई अलग-अलग पेप्टाइड्स को शामिल करने के लिए इस मंच का लचीलापन, जबकि ऑर्थोगोनली अलग-अलग कठोरता जीबीएम ट्यूमर आक्रामकता को चलाने वाली मैट्रिक्स सुविधाओं की पहचान करने में मदद कर सकती है।

जीबीएम से परे, इन विधियों को अन्य बीमारियों, ऊतक विकास और सामान्य ऊतक समारोह के संदर्भ में अन्य सेल प्रकारों पर मैट्रिक्स मापदंडों के प्रभावों की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। भविष्य में, इन विधियों के थ्रूपुट को और बढ़ाना सीधा होगा, क्योंकि उन्हें विशेष रूप से बहु-अच्छी तरह से प्लेटों के संदर्भ में प्रदर्शन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है ताकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित तरल हैंडलर और उच्च सामग्री इमेजर का उपयोग करके दवा की खोज के लिए मौजूदा वर्कफ़्लो में गोद लेने की सुविधा मिल सके। मौजूदा बुनियादी ढांचे और बढ़े हुए स्वचालन के साथ सरल एकीकरण, जो सेल-लेटे हुए, 3 डी हाइड्रोगेल संस्कृतियों के उत्पादन और रखरखाव के लिए आवश्यक तकनीकी कौशल को कम करता है, इस पद्धति को अपनाने के लिए बाधाओं को काफी कम कर देगा। जबकि यहां काम विशेष रूप से एचए-आधारित हाइड्रोगेल के भीतर संस्कृतियों को प्रस्तुत करता है, यह उम्मीद की जाती है कि इस विधि को आसानी से 3 डी सेल संस्कृति के लिए अन्य आमतौर पर उपयोग की जाने वाली फोटोक्रॉसलिंक करने योग्य सामग्रियों में अनुवादित किया जा सकता है, जैसे कि मेथैक्रिलेटेड जिलेटिन, और यहां बताई गई विधियां अतिरिक्त अनुप्रयोगों के लिए एक सहायक दिशानिर्देश प्रदान करेंगी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक विशेष रूप से कैरोलिन किम, अमेलिया लाओ, रयान स्टाउटमोर और इटाय सोलोमन को फोटोगेलेशन योजना के पहले पुनरावृत्तियों में उनके योगदान के लिए स्वीकार करना चाहते हैं। सेल लाइनें जीएस 122 और जीएस 304 उदारतापूर्वक डेविड नाथनसन द्वारा प्रदान की गई थीं। सभी आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे। यूसीएलए कोर सुविधाएं, आणविक स्क्रीनिंग साझा संसाधन, और नैनो और पिको लक्षण वर्णन प्रयोगशाला काम के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी। चेन चिया-चुन को यूसीएलए एली और एडिथ ब्रॉड सेंटर ऑफ रीजनरेटिव मेडिसिन एंड स्टेम सेल रिसर्च ट्रेनिंग प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था। ग्रिगोर वरुझानियन को ट्यूमर सेल बायोलॉजी ट्रेनिंग प्रोग्राम एनआईएच ग्रांट (टी 32 सीए 009056) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.1 kOhm resistors, 6 W Digikey 35601k1ft
1.7 mL microcentrifuge tube Genesse Scientific 21-108
15 mL conical tube Fisher Scientific 14-959-70C
365 nm LED Digikey ltpl-c034uvh365
384 well plate Bio Greiner One 781090
40 µm cell strainer MTC bio C4040
4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) Laysan Bio 4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTs Digikey 2n5550ta
80 Ohm resistors, 0.125 W Digikey erjj-6enf80r6v
8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) Jenkem Technology A7025-1
Accutase Innovative Cell Technologies AT104500  cell dissociation  reagent
AFM Probes Novascan 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle
Arduino IDE Arduino 1.8.19
Arduino Nano Makerfire Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board
bFGF Peprotech 100-18B 20 ng/mL
CCK8 Abcam ab228554
Centrifuge Thermoscientific sorvall legend xtr
CP100ST Gilson F148415 Pipette tips for positive displacement pipette
Cubis Semi-Micro Balance Sartorius MSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50) Life Technologies 11330057 1x
DMSO Fisher Scientific BP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-) Genesse Scientific 25-508
EGF Peprotech AF100-15 50 ng/mL
Ethanol, Anhydrous Fisher Scientific A405P Add DI water to dilute to 70%
Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials Fisher Scientific 03-339-23C
Fisherbrand Weighing Paper Fisher Scientific 09-898-12B
G21 Supplement Gemini Bio 400-160 50x
Hanks Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific 14175095
HCl, ACS, 12M Sigma Aldrich S25838A Add DI water to dilute to 1 M
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma Aldrich H3149-100Ku 25 µg/mL
HEPES Sigma Aldrich H7006-100G
Hot Air Gun Wagner HT1000
Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide Genscript Custom Order GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% Sigma Aldrich 900889-1G
Magnetic stir plate Thermo Scientific SP194715
Microcentrifuge Thermo Scientific Sorvall legend micro 21R
Microman E single Channel Pipettor Gilson FD10004 Positive displacement pipette
Micropipette Tips Various Manufacturs Various sizes
mLine micropipette Sartorious
N-acetyl Cysteine Sigma Aldrich A7250-10G
Nanowizard 4 Bruker AFM microscope
NaOH Fisher Scientific ss255-1 Add DI water to dilute to 1 M
Normoicin Invivogen ant-nr-1 500x
Osteopontin Peptide Genscript Custom Order GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet Aid Drummond 4000102
Plain Microscope Slides Globe Scientific 1301
Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep Grace Bio Labs 664201-A Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet
Processing Processing 3.5.4
Repeater M4 Eppendorf 4982000322
Repeater Pipette Tips Sartorious 30089430 1 mL sizes
RGD Peptide Genscript GCGYGRGDSPG
Scoth Tape
Serological Pipettes Genesse Scientific 12-102,12-104 5,10 mL Pipettes
Solder Paste Digikey 315-NC191LT15T5-ND
Solder Wire
Straight dissecting forceps VWR Scientific 82027-408
Synergy H1 Plate Reader Biotek
T-75 Cell Culture Treated Flask Genesee Scientific 25-209
Temozolomide Sigma Aldrich T2577 Typically used from 10 µM to 100 µM
Tenascin-C Peptide Genscript GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR
GV
Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified Lifecore Biomedical HA700K5
VWR Spinbar, Flea Micro VWR 58948-375

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 184
हाइड्रोगेल सरणियाँ 3 डी ट्यूमर मॉडल में मैट्रिक्स घटकों और चिकित्सीय के स्क्रीनिंग प्रभाव के लिए बढ़े हुए थ्रूपुट को सक्षम करती हैं
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