Summary
본 프로토콜은 맞춤형 UV 조명 장치를 사용하여 3D 매트릭스-모방 배양물에서 환자 유래 교모세포종 세포의 화학요법 반응에 대한 기계적 및 생화학적 단서의 영향을 평가하기 위한 실험 플랫폼을 기술하며, 조정 가능한 기계적 특징을 갖는 하이드로젤의 고처리량 광가교를 용이하게 한다.
Abstract
세포 - 매트릭스 상호 작용은 생화학적, 기계적, 기하학적 단서를 통해 복잡한 생리 학적 과정을 중재하여 병리학 적 변화와 치료 반응에 영향을 미칩니다. 약물 개발 파이프라인 초기에 매트릭스 효과를 고려하면 새로운 치료제의 임상 성공 가능성이 높아질 것으로 예상된다. 3D 세포 배양에서 특정 조직 미세 환경을 재순환시키는 생체 재료 기반 전략은 존재하지만 이를 약물 스크리닝에 주로 사용되는 2D 배양 방법과 통합하는 것은 어려운 과제였습니다. 따라서, 여기에 제시된 프로토콜은 세포 생존을 위한 기존 약물 스크리닝 파이프라인 및 종래의 분석과의 통합을 용이하게 하기 위해 다중 웰 플레이트 포맷으로 소형화된 생체재료 매트릭스 내에서 3D 배양을 위한 방법의 개발을 상세히 기술한다. 배양된 세포에서 임상적으로 관련된 표현형을 보존하는데 중요한 매트릭스 특징이 고도로 조직- 및 질병-특이적일 것으로 예상되기 때문에, 매트릭스 파라미터의 조합 스크리닝은 특정 적용을 위한 적절한 조건을 식별하기 위해 필요할 것이다. 여기에 설명된 방법들은 매트릭스 역학 및 리간드 프리젠테이션의 직교 변이에 대한 암 세포 반응을 평가하기 위해 소형화된 배양 포맷을 사용한다. 구체적으로, 본 연구는 화학요법에 대한 환자 유래 교모세포종 (GBM) 세포의 반응에 대한 매트릭스 파라미터의 효과를 조사하기 위해 이 플랫폼의 사용을 입증한다.
Introduction
신약 개발의 예상 비용은 지난 10 년 동안 꾸준히 상승했으며 현재 추정치에서 10 억 달러 이상이었습니다 1. 이 비용의 일부는 임상 시험에 들어가는 약물의 높은 실패율입니다. 약물 후보의 약 12 %는 궁극적으로 2019 년 미국 (미국) 식품 의약품 안전청 (FDA)의 승인을 얻습니다. 많은 약물이 예기치 않은 독성2로 인해 I 단계에서 실패하는 반면, 안전성 시험을 통과 한 다른 약물은 효능 부족으로 인해 실패 할 수 있습니다3. 비효능으로 인한 이러한 감소는 약물 개발 동안 사용되는 암 모델이 임상적 효능의 비예측으로 악명 높다는 사실에 의해 부분적으로 설명될 수 있다4.
시험관내 및 생체내 모델 사이의 기능적 불균형은 비종양 세포 및 물리적 ECM 5,6을 포함하는 그들의 천연 미세환경으로부터 암 세포를 제거하는 것에 기인할 수 있다. 일반적으로 연구 그룹은 Matrigel (마우스 육종에서 유래 한 단백질성 기저막 매트릭스)과 같은 상업적으로 이용 가능한 배양 매트릭스를 사용하여 배양 된 종양 세포에 3D 매트릭스 미세 환경을 제공합니다. 2D 배양과 비교하여, 막 매트릭스에서의 3D 배양은 시험관내 결과 7,8의 임상적 관련성을 개선시켰다. 그러나, 막 매트릭스를 포함하는 탈세포화된 조직으로부터의 배양 생체재료는, 전형적으로 재현성9를 손상시킬 수 있는 배치-배치-배치-배치 가변성을 나타낸다. 더욱이, 연구된 것들로부터 상이한 조직 기원을 갖는 종양으로부터 유래된 매트릭스는 적절한 생리학적 단서(10)를 제공하지 않을 수 있다. 마지막으로, 종양내 이질성이 높은 암은 서브마이크론 크기 규모에 따라 다양하고 막 매트릭스가11을 재조정하도록 조정될 수 없는 미세환경적 특징을 갖는다.
교모세포종(GBM)은 약 15개월의 중간 생존 시간을 갖는 균일하게 치명적인 뇌종양으로, 치료 개발이 특히 어려웠던 암이다12,13. GBM에 대한 현재의 치료 표준은 원발성 종양 절제술, 방사선 요법, 그리고 테모졸로마이드 (TMZ)14를 사용한 화학 요법으로 구성됩니다. 그러나 임상 GBM 종양의 절반 이상이 다양한 메커니즘 15,16,17을 통해 치료 저항성을 나타냅니다. 개별 환자에 대한 치료 요법의 효능을 예측하는 것은 매우 어렵습니다. 개별 결과를 예측하는 데 사용되는 표준 전임상 모델은 면역저하된 마우스에 정형외적으로 이종이식편된 환자 유래 종양 세포로 구성된다. 환자 유래 이종이식편은 임상 GBM 종양의 여러 측면을 재검토할 수 있고 전임상 모델(18)에 가치가 있지만, 본질적으로 비용이 많이 들고, 처리량이 낮고, 시간이 많이 걸리며, 윤리적 관심사19를 수반한다. 환자 유래 세포의 배양, 2D 플라스틱 표면 또는 구상체는 대부분 이러한 문제를 피합니다. 환자 유래 세포는 유전적 수차를 보존하는 반면, 2D 또는 현탁된 구상체로서의 그들의 배양은 설치류 및 원래 환자 종양(20)에서 환자 유래 이종이식편의 표현이 대체로 불량하였다. 이전에 우리와 다른 사람들은 뇌 조직의 기계적 및 생화학 적 특성을 모방 한 3D ECM에서 배양 된 GBM 세포가 약물 내성 표현형10,21,22,23을 보존 할 수 있음을 보여주었습니다.
뇌 ECM에 풍부하며 GBM 종양에서 과발현되는 다당류인 히알루론산(HA)과 이의 CD44 수용체 사이의 상호작용은 시험관내 약물 내성의 획득을 조절한다 21,24,25,26,27. 예를 들어, 연질, 3D 배양물 내에 HA를 포함시키는 것은 치료 내성을 획득하는 환자 유래 GBM 세포의 능력을 증가시켰다. 이러한 메카노-반응성은 GBM 세포21 상의 CD44 수용체에 대한 HA 결합에 의존하였다. 추가적으로, RGD 함유 펩티드에 대한 인테그린 결합은, 3D 배양 매트릭스에 혼입되어, 강성 의존적 방식으로 CD44 매개된 화학저항성을 증폭시켰다21. HA 이외에도, RGD 영역을 함유하는 많은 ECM 단백질의 발현은 정상 뇌와 GBM 종양(28) 사이에서 다양하다. 예를 들어, 한 연구는 GBM 종양29에서 28 개의 별개의 ECM 단백질이 상향 조절되었다고보고했습니다. 이러한 복잡한 종양 매트릭스 미세환경 내에서, 암 세포는 기계적 및 생화학적 단서를 통합하여 특정 내성 표현형을 산출하는데, 이는 인테그린 결합 펩티드28,29,30의 영 모듈러스 또는 밀도에서 상대적으로 작은 차이(예를 들어, 크기 차수 미만)에 의존한다.
본 프로토콜은 종양 세포가 매트릭스 단서의 고유한 조합을 해석하고 치료 저항성을 촉진하는 복잡하고 환자 특정 매트릭스 미세환경을 식별하는 방법을 특성화합니다(그림 1A). 3D 배양을 위해 소형화되고 정밀하게 조정된 매트릭스를 생성하는 광화학적 방법은 크고 직교하는 가변 공간을 제공합니다. 마이크로 컨트롤러에 의해 실행되는 맞춤형 LED 어레이가 384웰 플레이트 형식 내의 포토크로스링크 하이드로젤에 통합되어 자동화 및 재현성을 높였습니다. 노출 강도는 원자력 현미경 (AFM)을 사용하여 평가된 바와 같이 생성된 하이드로젤의 마이크로기계적 특성을 변경시키기 위해 웰에 걸쳐 다양하였다. 이 원고는 조명 어레이 자체를 구성하는 데 초점을 맞추지는 않지만 회로도(그림 1B) 및 부품 목록(재료 표)은 장치 재생을 위한 보조 도구로 제공됩니다.
이 보고서는 영 모듈러스 (단일 크기의 순서에 걸쳐 네 가지 수준)와 인테그린 결합 펩티드 함량 (네 가지 ECM 단백질에서 유래)이 직교적으로 다양한 독특한 3D 미세 환경에서 배양 된 GBM 세포 어레이의 신속한 생성을 보여줍니다. 이 접근법은 테모졸로마이드 (TMZ) 화학요법에 대한 내성을 획득함에 따라 환자 유래 GBM 세포의 생존 가능성 및 증식에 대한 하이드로겔 역학 및 ECM 특이적 인테그린 결합의 상대적 기여를 조사하기 위해 사용되었다.
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Protocol
환자 유래 GBM 세포주 (GS122 및 GS304)는 UCLA 기관 검토 위원회 (IRB # 10-000655)가 승인 한 프로토콜에 따라이 라인을 개발 한 David Nathanson 교수 (공동 작업자)에 의해 제공되었습니다. 세포주가 개별 환자와 다시 연결될 수 없도록 비확인 세포를 제공하였다.
1. 하이드로겔 용액의 제조
- 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)에 HEPES 분말을 20mM로 용해시켜 HEPES 완충 용액을 준비하십시오. 완전 용매화 후 pH를 7로 조정한다.
- HEPES 완충 용액에서, 티올화된 HA (700 kDa 공칭 분자량, 물질 표 참조)를 이전 보고서31에 따라 제조하여 각 글루쿠론산의 카르복실산 잔기의 6 % -8 %가 완충 용액 중 10 mg / mL의 농도로 티올로 변형되도록합니다.
참고: 주변광에 의한 티올 산화를 방지하기 위해 호박색 바이알을 사용하는 것이 좋습니다.- 자석 교반 플레이트 (<1,000 rpm)를 사용하여 완전히 용해 될 때까지 실온에서 교반하십시오, 전형적으로 약 45 분.
- HA가 용해되는 동안, (1) 100 mg/mL의 8-arm-PEG-Norbornene (20 kDa), (2) 100 mg/mL의 4-arm-PEG-Thiol (20 kDa), (3) 4 mM의 시스테인 또는 시스테인 함유 펩티드 (예를 들어, GCGYGRGDSPG), 및 (4) 4 mg/mL의 LAP를 마이크로원심분리 튜브에 담아 별도의 용액을 준비 한다(표 참조).
- 이 네 가지 용액을 단계 1.1에서 준비된 HEPES 완충 용액에서 각각 준비하십시오. 단계 4를 수행하기 전에 각 시약의 완전한 용해를 보장하기 위해 용액을 소용돌이친다.
참고: 다수의 상이한 펩티드를 시험하는 경우, 각각은 이러한 접합 화학을 위한 시스테인 또는 티올 모이어티의 다른 공급원을 함유해야 한다. - 이 시점에서 단일 하이드로겔 내에 테더링될 모든 펩티드의 용액 (4 mM 이용가능한 티올)을 준비한다.
참고: 이들이 유래되고 본 연구에서 사용된 ECM 단백질 및 펩티드 서열은 표 1에 열거되어 있다. N-아세틸 시스테인 ( 표 참조)은 세포가 결합하지 않는, 접착성 펩티드의 농도를 적정하거나 음성 대조군으로 작용하여 생체활성, 티올 함유 펩티드를 대체할 수 있다31.
- 이 네 가지 용액을 단계 1.1에서 준비된 HEPES 완충 용액에서 각각 준비하십시오. 단계 4를 수행하기 전에 각 시약의 완전한 용해를 보장하기 위해 용액을 소용돌이친다.
- HA, PEG-노보넨, PEG-티올 및 시스테인/티올 함유 펩티드( 물질 표 참조)의 개별 용액을 혼합하여 표 2에 열거된 최종 하이드로겔 매트릭스에 대한 최종 농도를 달성하십시오. 자석 교반 플레이트 상에서 (<1,000 rpm) 적어도 30분 동안 교반하여 완전히 혼합한다.
참고: HA 솔루션은 점성이 높으며 포지티브 변위 피펫을 사용하여 가장 잘 처리 됩니다(재료 표 참조). 포지티브 변위 피펫을 사용할 수없는 경우, 점성 용액은 넓은 오리피스 팁을 사용하여 천천히 피펫팅하여 표준 마이크로 피펫으로 분배 될 수도 있습니다.
2. LED 어레이를 통한 하이드로젤의 조명 및 광가교
주의: UV 보호 안경을 착용하고 자외선 흡수 소재로 조명 필드를 덮으십시오.
참고: 이 프로토콜에 설명된 LED 어레이는 제공된 회로도에서 설명한 대로 직렬로 배치된 여덟 개의 LED 여섯 세트로 구성됩니다(그림 1A). 각 LED 세트는 독립적으로 전원을 공급할 수 있으므로 실행 당 최대 여섯 개의 서로 다른 조도가 가능합니다. 보충 파일 1 에는 추가 지침을 위해 다음 지침에 해당하는 스크린 샷이 포함되어 있습니다.
- 보조 코딩 파일에서 조명 장치.zip 파일을 다운로드합니다. 이 디렉토리에는 Arduino.zip (보충 코딩 파일 1), 드라이버.zip (보충 코딩 파일 2), GUI.zip (보충 코딩 파일 3) 및 홀더.zip (보충 코딩 파일 4) 파일이 포함되어 있습니다.
참고: 3D 회로 기판을 제자리에 고정하기 위해 위쪽과 아래쪽 부분을 인쇄합니다(자세한 내용은 보조 코딩 파일 참조). - 마이크로 컨트롤러 소프트웨어를 다운로드하여 설치합니다( 자료표 참조).
- GUI 소프트웨어를 다운로드하여 설치합니다( 자료표 참조). 소프트웨어 작동 지침은 보조 파일 1을 참조하십시오.
- 처리를 열고 스케치 > 가져 오기 라이브러리 > 라이브러리 추가를 클릭하여 controlIP5 라이브러리를 설치하십시오. 그런 다음 라이브러리에서 controlIP5를 검색하고 설치를 클릭하십시오. 이 작업을 처음으로 수행하십시오.
- 36V 전원 공급 장치를 사용하여 조명 장치( 재료 표 참조)에 전원을 공급하고 micro-USB 케이블을 사용하여 PC에 연결합니다.
참고: 일부 장치는 다양한 Arduino 나노 보드용 드라이버를 자동으로 설치하지 않습니다. 하나의 드라이버 집합이 장치 zip 파일에 제공됩니다. - Arduino IDE를 사용하여 Adruino.zip 폴더에 있는 Arduino.ino 파일을 엽니다.
- 체크 마크 버튼을 클릭하여 Arduino.ino 파일을 컴파일하십시오. 화살표 버튼을 클릭하여 컴파일된 코드를 업로드합니다.
- 처리를 사용하여 GUI.zip 폴더에 있는 GUI.pde 파일을 엽니다.
- 처리 프로그램에서 실행 을 클릭하여 조명 장치를 제어하기위한 그래픽 사용자 인터페이스를 시작하십시오.
- 그래픽 사용자 인터페이스 창에서 가교될 하이드로겔 전구체 용액을 포함하는 컬럼에 대한 강도 를 클릭하고 원하는 강도를 입력한다. 시간 상자를 클릭하고 원하는 시간을 입력하십시오. 표 2에 제공된 용액의 경우, 이것은 15초일 것이다.
참고: 최종 사용자는 라디오미터를 사용하여 디지털 강도 값을 조도에 맞게 보정해야 합니다. 전형적인 강도의 예가 도 2A에 제공된다. - 샘플을 실리콘 몰드의 단일 컬럼(재료 표 참조) 또는 384웰 플레이트에 있는 다른 모든 LED와 조명 장치(그림 2B)와 정렬합니다. 마침을 클릭하여 조명을 시작하십시오. 여러 슬라이드 또는 384웰 플레이트의 다른 웰을 조명하는 데 필요한 경우 이 과정을 반복합니다.
참고: 홀더는 384웰 플레이트가 조명 중에 내부 챔버의 한쪽 모서리와 플러시되도록 설계되었습니다.- 조명에 이어 한쪽 모서리에 놓으면 웰 플레이트를 다음 모서리로 이동하고 반복하십시오. 플레이트의 나머지 절반에 있는 웰을 비추려면 홀더에서 플레이트를 들어올리고 180° 회전합니다.
- 아래 단계에 따라 기계적 특성화를 위해 다양한 역학을 가진 하이드로젤을 생성합니다.
- 이물질을 제거하기 위해 테이프를 사용하여 유리 슬라이드와 실리콘 몰드를 청소하십시오. 실리콘 몰드를 유리 슬라이드에 부착하고 아래로 눌러 좋은 씰을 보장하고 기포를 대체하십시오.
- 피펫 단계 1.4에서 제조된 하이드로겔 전구체 용액 80 μL를 유리 슬라이드 상에 각각의 실리콘 몰드에 넣는다.
- 유리 슬라이드를 단일 열의 다른 모든 LED와 정렬된 조명 장치 위에 놓습니다. 하이드로겔 전구체를 단계 2에 기재된 바와 같이 15초 동안 자외선에 노출시켜 광가교결합시킨다.
- 조명이 멈춘 후에는 슬라이드를 회수하고 미세한 팁(10μL 피펫 팁, 30G 바늘 등)으로 몰드의 내부 둘레를 추적하여 몰드에서 겔을 느슨하게 합니다. 핀셋 / 포셉으로 실리콘 몰드를 제거하십시오.
- 가교 된 하이드로 젤을 주걱을 적시고 유리 슬라이드에서 부드럽게 밀어 넣어 12 웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 하이드로겔을 첨가하기 전에 각 웰을 2mL의 DPBS ( 물질표 참조)로 채운다. 실온에서 적어도 12 h (전형적으로 하룻밤) 동안 DPBS 용액에서 겔을 팽윤시킨다 (다음날의 기계적 특성화를 위해).
3. 원자력 현미경 (AFM) 측정
- 제조업체의 지침에 따라 원자력 현미경 (AFM)을 켭니다 ( 재료 표 참조). 이 프로토콜은 기기 및 관련 소프트웨어 사용에 대한 간단한 지침을 제공합니다.
- AFM 프로브를 설치합니다( 재료 표 참조).
참고: 본 연구를 위해, 0.01N/m의 공칭 스프링 상수를 갖는 삼각형 질화 실리콘 캔틸레버를 구형 2.5μm 이산화규소 입자로 개질하였다. - 설치 후 레이저를 삼각형 프로브의 정점에 맞춘 다음 미러와 레이저 편향을 조정하여 신호 합(일반적으로 1.5-2.2V 사이)을 최대화합니다.
- 프로브를 DPBS에 담그고 최대 15분 동안 기다렸다가 열적 평형을 얻습니다. 교정 버튼을 클릭하고 접촉 종속 교정을 선택합니다. 열 튜닝 수집 버튼을 클릭하고 데이터 수집 후 교정을 위해 약 3kHz의 피크를 선택하십시오.
참고: 굴절률 변화로 인해 액체에 침지한 후 거울과 레이저 디플렉터를 약간 조정해야 할 수 있습니다. - 접근 파라미터를 일정한 속도, 목표 높이 7.5μm 및 접근 속도 15μm/s로 설정하여 페트리 접시(플라스틱)의 표면에 접근합니다. 접근 방식에 대해 실행당 기준선 측정을 활성화하여 접근 방식이 지속적으로 실행되고 디플렉터의 드리프트로 인해 조기에 중단되지 않도록 합니다.
- 접근 시 힘 매핑을 위한 수집 파라미터를 4nN 턴어라운드, 2μm 압입 거리, 1μm/s 속도 및 0s 접촉 시간으로 설정합니다. 시작 버튼을 눌러 플라스틱 표면(예: 우물 플레이트)에서 힘 곡선을 수집하기 시작합니다.
- 보정 창으로 돌아가서 플라스틱의 접촉 및 압흔에 해당하는 힘 곡선의 부분을 선택합니다. 프로브에 대해 계산된 감도 및 강성 값을 수락하여 교정을 완료합니다.
- 교정 후 AFM 프로브를 올리고 심문을 위해 하이드로겔 샘플을 놓습니다. 단계 5에서 제공된 설정에 따라 하이드로겔에 접근한다.
참고: 하이드로겔 표면을 향한 접근 절차 동안, 유닛은 실수로 접근된 상태를 트리거할 수 있습니다. 실제 접근 방식을 확인하려면 4.6단계와 같이 힘 곡선을 구하십시오. 결과 커브에 접촉 및 결과 들여쓰기가 표시되지 않는 경우 접근 절차를 반복합니다. - 표면 접근이 성공하면 강제 매핑 모드로 전환하고 획득 파라미터를 축당 길이가 40μm인 8 x 8 크기의 맵으로 설정합니다. 다양한 영역에서 힘 맵을 획득하여 강성 측정의 균일성을 평가합니다.
- 소프트웨어 프로그램 JPK SPM 데이터 프로세싱을 사용하여 Hertz/Sneddon 모델 피팅(수식 1 및 2, 모든 변수의 정의에 대해서는 표 3 참조)을 사용하여 힘 곡선을 해석하고 구형 지오메트리를 선택한 32,33,3 4.
수학식 132
수학식 232
- 소프트웨어 프로그램 JPK SPM 데이터 프로세싱을 사용하여 Hertz/Sneddon 모델 피팅(수식 1 및 2, 모든 변수의 정의에 대해서는 표 3 참조)을 사용하여 힘 곡선을 해석하고 구형 지오메트리를 선택한 32,33,3 4.
수학식 132
수학식 232
4. 3D, 매트릭스 임베디드 문화의 설정 및 약물 처리
- 원하는 세포를 단일 세포 용액으로 준비하십시오.
참고: 셀 유형마다 다른 패시징 방법이 필요할 수 있습니다. T-75 플라스크로부터 GBM 구상체의 현탁 배양물을 계대배양하기 위한 전형적인 프로토콜이 참고문헌31에 보고되어 있다. - 15 mL 원뿔형 튜브 내로 배양된 T-75 플라스크 현탁액으로부터 GBM 구상체(직경 약 150 μm)를 수집한다. 배양 플라스크를 5 mL의 DPBS로 헹구어 잔류 세포 및 배지를 제거하고 이 부피를 원뿔형 튜브에 첨가한다.
- 세포를 함유하는 원뿔형 튜브를 실온에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리한다. 원심분리 후, 5 mL 혈청학적 피펫으로 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 교란시키지 않도록 주의하고, DPBS 5 mL에 재현탁시켰다.
- 실온에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리하여 세포를 세척한다. 상층액을 5 mL 혈청학적 피펫으로 흡인하고, 세포 펠릿을 교란하지 않도록 주의하고, 이어서 세포를 2 mL의 세포 해리 시약에 재현탁시킨다( 표 참조).
- 실온에서 10-15분 동안 인큐베이션한다. 3 mL의 완전한 배지 ( 물자재 표 참조)를 첨가하고 부드럽게 피펫을 3-5회 피펫하여 구상체를 단일 세포 현탁액(31)으로 분해한다.
- 단일 세포 현탁액을 400 x g 에서 원심분리(단세포 현탁액은 펠릿 형성을 위해 더 빠르게 회전할 수 있음)를 실온에서 펠릿 세포에 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 5 mL 혈청학적 피펫으로 흡인하고, 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의한다. 세포를 1 mL의 완전 배지에 재현탁시킨다.
참고: 세포가 현탁액 중의 단일 세포가 아닌 덩어리에 남아 있는 경우, 통과 후, 세포는 단일 세포 현탁액을 달성하기 위해 40 μm 세포 스트레이너를 통과할 수 있다. - 혈구측정기를 사용하여 계수하기 위해 세포의 일부를 제거하십시오. 이 부분을 트립판 블루로 두 배로 희석하여 생존력이 손상된 세포에 침투시킵니다. 살아있는 무색 세포 만 계산하십시오. 전형적으로, 플라스크 당 800,000 세포에 시딩된 T-75는 배양에서 일주일 후에 2-3백만 세포를 산출한다.
- 캡슐화에 필요한 셀 수를 결정합니다. 필요한 총 세포 수를 포함하는 배지의 부피를 멸균 1.7 mL 마이크로원심분리 튜브 내로 옮긴다. 실온에서 5 분 동안 400 x g 에서 회전하십시오.
참고: 예를 들어, 2.5백만 세포/mL에서 세포를 캡슐화하기 위해서는 1mL의 젤 부피에 재현탁된 최소 2.5백만 개의 세포가 필요합니다. 1mL의 겔 부피를 통해 사용자는 100 겔 방울을 분배 할 수 있으며, 각 겔 방울은 10 μL 부피입니다. 하이드로겔 용액에 현탁 된 여분의 ~ 20 % 부피의 세포를 준비하는 것은 피펫 전달 중 손실을 고려하는 것이 좋습니다. 따라서, 이 예에서 3백만 개의 세포와 1.2mL의 하이드로겔 전구체 용액을 제조할 것이다. 500,000,000,mL의 최소 밀도를 권장합니다. - 상층액을 마이크로 피펫으로 흡인하고, 세포 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오. 단계 1.4에서 제조된 하이드로겔 전구체 용액에 세포 펠렛을 재현탁시키고, 1,000 μL 마이크로피펫으로 4-5회 상하로 피펫팅하여 잘 혼합한다.
- 세포를 10 μL를 분배하도록 설정된 반복 피펫터 ( 재료 표 참조)에 로딩하십시오. 거품과 고르지 않은 분배를 피하려면 폐기물 용기에 1-2 번 추가로 분배하여 반복 피펫터를 프라이밍하십시오.
- 384-웰 플레이트의 각 웰에서, 하이드로겔 용액에 현탁된 10 μL의 세포를 반복 피펫터로부터 분주한다. LED 어레이를 사용하여 셀을 포함하는 각 웰을 15초 동안 강도로 조명(단계 2)합니다( 그림 2A 의 결과 1.14, 1.55, 2.15, 2.74mW/cm2의 강도를 활용함).
참고: 실험 조건당 다섯 번의 반복실험으로 시작하고 끝점 분석의 원하는 처리량 및 분산에 따라 확장 또는 축소하는 것이 좋습니다. - 세포를 함유하는 각 웰에 40 μL의 완전한 배지를 첨가한다. 50μL의 DPBS를 겔을 둘러싸고 있는 비실험적이고 건조한 웰에 첨가하여 증발로 인한 손실을 최소화합니다.
- GBM 세포의 경우, 40 μL의 배지-함유 약물 (예를 들어, TMZ, 표 참조)을 첨가하여 최종 원하는 농도 (디메틸설폭시드 (DMSO) 또는 비히클 (DMSO) 중 100 μM)을 달성하고, 이에 따라, 캡슐화 후 3일 후에 시작한다.
5. CCK8 증식 분석
- 10 μL의 CCK8 시약 ( 물질 표 참조)을 세포를 함유하는 각 웰에 첨가한다.
참고: 이 분석을 처음 수행하는 경우, 배지 전용 또는 무세포 하이드로젤과 같은 음성 대조군 웰을 배지에 포함시키십시오. - 제조업체의 지침에 따라 1-4 시간 동안 배양하십시오.
참고 :이 시간은 세포 유형 및 밀도의 함수로 다를 수 있으므로 흡광도 값이 맥주의 법칙35를 적용하기위한 요구 사항 인 선형 범위 내에 속하도록 각 응용 프로그램에 대해 배양 시간을 테스트해야합니다. - 인큐베이션 후 모든 웰에 대해 450nm에서 흡광도를 판독합니다.
- 각 그룹에 대한 비히클 조건에 대해 단계 3에서 수득된 450 nm에서의 평균 흡광도를 계산한다. 각 약물 처리된 웰을 그룹당 비히클 대조군의 평균으로 나눈다.
- 백분위수 방법(36)을 통해 부트스트랩 분포(N = 10,000)를 생성하여 신뢰 구간을 계산한다.
참고: 일반적으로 95% 신뢰 구간을 활용하고 신뢰 구간이 1을 넘지 않는 조건을 유의하게 해석하고 추가 조사를 보증할 수 있습니다. 신뢰 구간을 95%로 설정하는 것은 p = 0.05의 유의 컷오프를 설정하는 것과 일치합니다. 결과에 나타난 데이터의 경우, 매트릭스 매개 약물 내성을 촉진하거나 억제하는 조건을 구별하는 데 유용성이 있으며, 양면 분석이 필요합니다.
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Representative Results
AFM 측정은 맞춤형 Arduino 제어 LED 어레이를 사용하여 광가교 중에 UV 조도(mW/cm2)의 함수로서 하이드로겔 역학의 정밀한 제어를 확인했다(그림 2A). 이 프로토콜에 사용된 하이드로겔 제형은 표 2에서 확인할 수 있다. 제공된 템플릿에 있는 LED의 간격은 384웰 플레이트의 다른 모든 웰의 간격과 일치하므로 플레이트 내부에 젤을 형성할 수 있습니다(그림 2B). 단일 하이드로젤의 표면에서 미크론 스케일 영역에 대한 AFM 심문은 더 부드러운 평균 영 모듈리를 갖는 하이드로젤이 또한 더 뻣뻣한 하이드로젤보다 더 작은 모듈리 범위를 갖는다는 것을 보여주었다(도 2C-E).
생존력을 극대화하는 세포 시딩 밀도는 각 세포 유형에 대해 경험적으로 결정되어야합니다. 이 연구는 2,500,000 cells/mL의 밀도로 시딩된 GS122 세포의 3D 배양물이 500,000 cells/mL의 밀도로 시딩된 세포에 비해 배양 7일 후에 평가되었을 때 실질적으로 더 높은 생존력을 나타냈다는 것을 입증한다(도 3A). 또한, GS122 및 GS304 세포를 매트릭스 미세환경의 강성 및 생화학적 조성에 대한 화학요법 반응의 의존성을 조사하기 위해 환자 유래 GBM 세포를 배양하기 위한 모델로 사용하였다(도 3B-D). 세포 생존율은 상응하는 비히클 대조군에 의한 OD450 측정을 스케일링하고 백분위수 방법36으로 부트스트래핑(N=10,000)에 의해 95% 신뢰구간을 생성함으로써 7일의 총 배양 시간을 유도한 후 CCK8 분석을 통해 평가되었다. 이러한 분포에서는 신뢰 구간이 값 1(점선)과 겹치지 않는 조건이 유의한 것으로 간주되었습니다. t-검정 또는 ANOVA와 같이 더 일반적으로 사용되는 통계적 방법과 비교할 때, 부트스트래핑을 사용하여 더 큰 표본 크기에 대해 존재할 분포를 추정하는 신뢰 구간의 추정은 추가 조사를 위한 조건의 더 작은 하위 집합을 확인하는 것이 목표인 스크리닝 검정에 선호됩니다. 이 방법의 또 다른 이점 중 하나는 신뢰 구간에서 더 작은 스프레드를 갖는 조건이 유사한 평균값을 갖지만 신뢰 구간에서 더 높은 스프레드를 갖는 다른 조건보다 우선순위를 정할 수 있다는 것이다. 이 연구는 GS122 세포가 미세 환경 상호 작용으로부터 생존 이점을 얻었다는 것을 나타냈다 (그림 3B). 이러한 생존 이익은 0.8, 1 및 4 kPa 조건에서는 유의하였지만 GS122 세포에 대한 8 kPa 조건에서는 유의하지 않았다. GS304 세포는 강성 및 TMZ 처리 둘 다에 둔감하였다.
매트릭스 미세환경의 생화학적 조성의 효과는 GBM 종양 미세환경에서 상향조절되는 것으로 알려진 ECM 유래, 인테그린 결합 펩티드 (표 1)의 포함을 두 강성, 0.8 kPa, 및 8 kPa에서 변화시킴으로써 조사하였다. 다시, GS304 세포는 매트릭스 포함으로부터 유의한 생존 이익을 얻지 못했고, TMZ에 둔감하였다. 그러나, GS122 세포는 오스테오폰틴 유래 펩티드가 매트릭스에 포함되었을 때 8 kPa 조건에서 생존 이득을 보인 반면, 인테그린 결합 시알로단백질(IBSP)- 또는 테나신-C 유래 펩티드의 혼입은 일반적인 RGD 펩티드와 함께 매트릭스에서 배양하는 것과 같은 최소한의 생존 이점을 제공하였다(도 3C). 대조적으로, 어떠한 펩티드도 0.8 kPa 배양 조건에서 생존 이득을 부여하지 않았다(도 3D). 함께, 결과는 평가된 두 환자 유래 세포주 사이의 매트릭스 및 약물 반응 둘 다에서의 내재적 차이를 시사한다.
3D 하이드로겔 배양물은 표준 광 현미경을 사용하여 시각화하여 세포 형태학 및 침습적 행동이 세포주 의존적 방식으로 배양 조건에 의해 어떻게 영향을 받는지 평가할 수 있습니다(그림 4). GS122 및 GS304 세포 둘 다 RGD 함유 펩티드를 포함하는 연질 또는 뻣뻣한 하이드로겔 매트릭스에서 배양될 때 퍼졌다(도 4A). 펩티드가 세포 확산에 영향을 미치는 반면, 세포의 확산 능력은 TMZ 내성을 획득하는 배양물의 능력을 반드시 예측하지는 않았다. 예를 들어, GS122 세포는 오스테오폰틴과 함께 0.8 및 8 kPa 모두에서 확산의 유사한 결핍을 나타내고; 그러나, GS122는 단지 8 kPa 조건에서 TMZ에 대한 향상된 내성을 나타냈다(도 4B). 마지막으로, 이러한 소형화된 3D 배양 플랫폼은 말단 분화된, 신경내분비 전립선암 세포의 실행 가능한 오가노이드를 포함하는 다른 종양 유형으로부터 인간 세포를 배양하는데 사용될 수 있다(도 4C).
그림 1: 프로토콜의 만화 묘사. (A) 3D 문화 생성 및 모니터링을 위한 프로세스의 만화 묘사. (1) HA계 하이드로겔 용액을 제조한다. (2) 하이드로겔 솔루션은 Arduino 마이크로 컨트롤러에 의해 제어되는 LED를 통해 가변 강도로 가교됩니다. (3) 결과 하이드로겔 역학은 AFM에 의해 평가되어 겔 역학의 차이를 검증한다. (4) 단계 1로부터의 제형과 일치하는 용액은 환자 유래 GBM 세포를 캡슐화하고 약물로 처리하는데 사용된다. (5) 7일 후, CCK8 비색 검정을 통해 세포 생존율을 판독한다. (B) 이 프로토콜에 사용되는 맞춤형 LED 조명 어레이를 위한 회로도. 개별 구성 요소는 재료 표에 나열되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 조도를 수정하기 위해 조정 가능한 LED를 사용하여 다양한 강성으로 제작된 하이드로젤. (A) 바이올린 플롯은 개별 하이드로젤의 40μm x 40μm에 걸쳐 세 표면 영역에 걸쳐 AFM에 의해 생성된 힘 곡선으로부터 계산된 영 모듈러스를 보여줍니다. 각 하이드로젤의 영 모듈러스는 광가교 동안 UV 조사의 함수로 표시됩니다. 수평 흰색 선은 각 실험 그룹의 중앙값을 나타냅니다. (B) 멀티 웰 플레이트 (384 웰)의 피치와 일치하는 간격이있는 LED 어레이. (C) 15초 동안 1.55 mW/cm2에 노출에 의해 가교된 전형적인 겔에 대한 영 모듈러스(평균 = 0.8 kPa)의 지역적 변화를 보여주는 히트 맵. (D) 15초 동안 2.74 mW/cm2에 노출시 가교된 전형적인겔에 대한 영 모듈러스(평균 = 8 kPa)의 지역적 변화를 보여주는 히트 맵. (E) C 및 D에 나타낸 하이드로젤의 표면에 걸친 영 모듈러스 측정의 범위를 보여주는 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 강성과 인테그린 결합 펩티드의 직교 프리젠테이션은 GBM 세포주 사이의 본질적인 생물학적 차이를 드러낸다. (A) mL당 500,000 또는 2,500,00 세포의 밀도로 10 μL 하이드로겔에 캡슐화된 GS122 세포에 대한 전형적인 흡광도 값. (b) GS122 및 GS304 세포주에 대한 약물 반응 데이터는 약물 처리 웰 (N=5)의 OD450 값을 비히클 처리 웰의 평균에 의해 정규화함으로써 시각화된다 (N=5). 약물 치료의 맥락에서 생존력은 하이드로겔 강성에 대해 비선형적으로 변하는 것으로 관찰되었고, 세포주 간의 변이를 입증하였다. (C,D) GS122 및 GS304 세포주에 대한 약물 반응 데이터는 인테그린 결합 펩티드의 유형이 포함되었을 때 매트릭스 강성은 직교적으로 다양하였다. 모든 오류 막대는 N = 10,000으로 각 조건을 부트스트래핑하여 얻은 95% 신뢰 구간을 나타냅니다. 점선(y축 = 1)은 치료 조건에 대한OD450이 비히클과 동일한 경우에 해당한다. 모든 실험 값은 배양 7일 후에 수득되었다; TMZ는 약물 연구를 위해 초기 캡슐화 3일 후에 첨가되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 상이한 HA 기반 하이드로겔 환경에서 캡슐화된 세포 간의 형태학적 차이 . (A) GS122 및 GS304의 위상차 이미지는, 하이드로겔(0.8 및 8 kPa)에서 배양했을 때, RGD 모티프를 나타내었다. 흰색 화살표는 확산 형태가 있는 세포를 나타냅니다. (b) GS122 및 GS304의 위상 이미지는, 하이드로겔(0.8 및 8kPa)에서 배양하였을 때, 오스테오폰틴으로부터 유래된 펩티드를 나타내었다. 흰색 화살표는 확산 형태가 있는 세포를 나타냅니다. 검은 색 화살표는 둥근 형태를 가진 세포를 나타냅니다. 배양 7일 후, 이미지를 촬영하고, 초기 캡슐화 3일 후에 TMZ를 첨가하였다. (c) 말단 분화된 신경내분비 전립선 오가노이드의 위상 이미지. 스케일 바 = 200 μm ( A, B의 경우); 100 μm ( C의 경우). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 단백질 | 펩티드 서열 |
| 증권 시세 표시기 | GCGYGRGDSPG |
| 테나신-C | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIRGV |
| 인테그린 결합 시알로단백질 (IBSP) | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| 오스테오폰틴 | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
표 1: ECM 단백질 및 유도 펩티드 서열.
| 시약 | 초기 농도 | 부피 (μL) | 최종 집중 |
| HA-SH 솔루션 | 10 밀리그램/mL | 2300 | 5 밀리그램/mL |
| PEG-SH | 100 밀리그램/mL | 503 | 실험에 따라 다름 |
| PEG-노르보르넨 | 100 밀리그램/mL | 443 | 실험에 따라 다름 |
| 펩타이드 | 4 μM | 288 | 0.250 μM |
| 무릎 | 4 밀리그램/mL | 288 | 0.25 밀리그램/mL |
| 헤페스-HBSS | 해당 없음 | 798 |
표 2: 하이드로겔에 대한 전형적인 최종 제형 성분.
| 변수 | 매개 변수 |
| F | 포스 |
| E | 영 모듈러스 |
| ν | 푸아송의 비율 |
| δ | 들여쓰기(수직 팁 위치) |
| a | 접촉 원의 반경 |
| RS | 구의 반지름 |
표 3: AFM 계산을 위한 변수 및 해당 매개변수.
보충 파일 1 : 하이드로 젤의 조명 및 광가교를위한 LED 어레이의 사용에 관한 지침. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 1 : LED 어레이 마이크로 컨트롤러 (Arduino.zip)에 대한 아두 이노 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 2 : Arduino nano 용 타사 드라이버 (드라이버.zip). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 3 : LED 어레이 마이크로 컨트롤러 (GUI.zip)의 GUI 제어를위한 처리 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 4 : LED 어레이 마이크로 컨트롤러 (홀더.zip)에 대한 3D 인쇄 외부 홀더 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
현재의 연구는 HA 기반 내에서 3D, 소형화 된 배양물을 생성하는 동시에 인테그린 결합에 사용할 수있는 매트릭스 강성과 펩타이드를 변경하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 매트릭스 파라미터가 증가된 처리량으로 세포 표현형(예를 들어, 화학요법에 노출된 암 세포의 생존력)에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 체계적인 연구를 가능하게 한다. 본원에 제시된 것을 포함하는 이전의 접근법들은 최종 제형 내의 전체 중합체 퍼센트를 변화시킴으로써 조정된 히드로겔 강성을 가지며, 여기서 더 뻣뻣한 히드로겔은 더 높은 중합체 함량21,31을 갖는다. 그러나, 이러한 접근법은 본질적으로 처리량을 낮추는 과정인 원하는 각각의 강성에 대해 독특한 하이드로겔 제형을 제조할 필요가 있다. 여기서, 하이드로겔 강성은 가교 동안 UV 조도를 변화시킴으로써 조정되어, 다중 강성의 하이드로겔이 단일 전구체 용액으로부터 얻어질 수 있다. 여기에 설명된 맞춤형 조명기를 구성할 기회가 없을 수도 있는 미래의 실무자는 상업적으로 이용가능한 UV 스폿 경화 장치를 쉽게 대체하고 웰 플레이트의 다른 섹터가 경화됨에 따라 조명을 조정할 수 있다. 상용 스폿 경화 장치를 사용하는 단점은 맞춤형 조명기에 비해 처리량이 감소한다는 것이다. 현재 방법의 한계는 각 펩티드 조건에 대해 독특한 용액이 여전히 준비되어야한다는 것입니다. 유사한 방법들이 강성-구배-함유 히드로겔37,38을 생산하기 위해 이전에 다른 그룹에 의해 사용되어 왔다. 그러나이 연구는 광가교가 어떻게 실험 샘플의 소형화를 가능하게하고 실험 설정의 복잡성을 줄일 수 있는지 보여줍니다. 전반적으로, 이러한 개선은 연구자가 매트릭스 모방 생체 재료에서 3D 문화를 수행 할 때 실험 처리량을 높이고 신경 종양학을 넘어 생물 의학 과학의 여러 분야에서 유용성을 가질 수있게합니다.
대표적인 결과는 이 기술이 여러 표준 분석에 적합한 표준 384-웰 플레이트 내에서 사용 가능한 인테그린 결합 펩티드 및 강성이 다양해지는 정의된 매트릭스에서 환자 유래 GBM 세포의 소형화된 3D 배양물을 설정하는 데 어떻게 사용될 수 있는지를 보여줍니다. 이 방법은 매트릭스 파라미터가 GS122 및 GS304 세포로 표시된 두 개의 독특한 환자로부터 유래된 GBM 세포에서 TMZ 화학요법에 대한 반응에 어떻게 영향을 미치는지를 스크리닝하는 대표적인 결과를 제시한다. 여기에서 평가된 두 환자 유래 세포주 중에서, TMZ 처리에 대한 GS122 세포의 반응은 매트릭스 미세환경에 민감한 반면, GS304 세포의 반응은 둔감하였다. 매트릭스 강성과 관련하여, 4 kPa 마이크로압축 모듈러스를 갖는 3D 하이드로젤에서 배양된 GS122 세포는 TMZ 내성을 최대화하였고, 이 조건 하에서 처리된 세포는 7일간의 실험 과정에 걸쳐 처리되지 않은 세포보다 더 많은 수가 증가하였다. 기계적 특성은 포함된 인테그린 결합 펩티드보다 TMZ 내성에 더 큰 영향을 미쳤다. 따라서, 단독으로 및 조합하여 다양한 펩티드 농도의 영향이 미래에 약물 내성을 촉진하는 매트릭스 조건의 발견을 가능하게 할 것으로 예상된다. GS304 세포가 그들의 주변 매트릭스에 둔감하다는 것은 매트릭스가 GS122 세포와 같이 원래 TMZ에 민감하지만 치료 중에 내성을 획득하는 세포에 더 영향력이 있음을 나타낼 수 있다. 대조적으로, 매트릭스 단서가 실험 초기에 이미 치료 내성인 세포에 영향을 미치는 정도는 GS304 세포와 마찬가지로 불분명하다.
이 연구의 결과는 이전에보고 된 결과와 다소 벗어났습니다. 평가된 가장 연질 HA계 하이드로젤 (1 kPa 벌크영 모듈러스, 네이티브 뇌의 강성을 모방함)은 여기에서 평가된 것보다 상이한 환자로부터의 네 개의 종양으로부터 유래된 최대 TMZ 내성 GBM 세포를 촉진시켰다21. 이러한 불일치에는 몇 가지 이유가 있을 수 있습니다. 첫째, 현재 연구에서 확장 된 범위의 하이드로 겔 강성을 조사하여 0.8kPa ~ 8kPa 마이크로 압축 모듈리 범위의 하이드로 젤을 비교한 반면, 이전 연구는 1kPa 및 2kPa Young의 모듈리를 가진 하이드로 젤 만 비교했습니다. 또한, 이전 연구에서, 기계적 특성화는 선형 기계적 압축을 사용하여 벌크 스케일에서 영 모듈러스를 추정하는 반면, 이 연구에서는 AFM을 사용하여 미세 압축 모듈러스를 측정하였다. 마이크로 스케일 역학 측정이 필요하지 않은 여기에 제시된 방법을 구현하고자하는 연구자에게는 레오 메트리 또는 선형 기계 테스트를 사용하는 벌크 스케일 모듈리가 AFM을 완벽하게 대체 할 수 있습니다. 특히, 미세 기계적 분석은 단일 겔의 표면에 걸쳐 불균질 모듈리를 밝혀 냈습니다. 이전 연구에서 제형화된 하이드로겔에 대한 비교가능한 AFM 측정은 이루어지지 않았지만, 단일 하이드로겔 내에서 제시된 강성의 분산이 현재 연구의 그것보다 더 클 것으로 예상된다. 이전 연구에서 하이드로겔은 37°C 10,21,24에서 키네틱 혼합에 의존하는 마이클형 부가 가교결합을 사용하여 생성되었다. 대조적으로, 광가교는 광 노출 전에 하이드로겔 전구체의 철저한 혼합을 허용하며, 이는 3D 하이드로겔 내의 균질성을 향상시키고, 차례로 세포 반응의 가변성을 감소시킨다. 마지막으로, GBM 종양은 악명 높게도 이질적이고 예측할 수 없는 거동(39)을 나타내므로, 개별 종양으로부터 유래된 세포도 마찬가지로 독특한 특성을 가질 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 환자 샘플 간의 일관성 부족은 환자 특정 종양 특성을 밝히기 위한 고처리량 플랫폼의 필요성을 자극합니다.
소형화된 하이드로겔 광가교 절차를 수행할 때의 일반적인 함정은 하이드로겔 전구체의 불완전한 혼합, 결과적으로 재현성 저하, 혼합 중 HA 용액의 자발적인 겔화를 초래하는 것이다. 이러한 문제는 HA-티올을 최소 45분 동안 교반하고 완전한 전구체 용액을 적어도 추가 30분 동안 교반하면서 하이드로겔 전구체 용액의 pH를 면밀히 모니터링하여 티올 산화 및 가교결합에 대한 디설파이드의 형성을 방지하기 위해 7 미만으로 유지되도록 함으로써 완화될 수 있다. 키네틱 마이클형 부가 기구(10,21)를 이용한 가교결합 방법과는 달리, 이 프로토콜에 사용된 광가교 방법은 모든 시약이 조합될 때 자발적인 겔화의 확률을 낮춘다(21). HA 티올레이션 백분율 31을 측정하고3D 배양의 각 배치에 대한 병렬 기계 테스트를 위해 추가 하이드로젤을 만드는 것과 같은 품질 관리 체크포인트가 적극 권장됩니다. 마지막으로, 하이드로겔에서의 3D 캡슐화를 위한 시딩 밀도는 사용된 각 세포 유형 또는 라인에 대해 확인될 필요가 있다. 일반적으로 결과는 환자 유래 GBM 세포, 인간 배아 줄기 세포 (H9) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (데이터 미도시)를 포함하여 구상체를 형성하는 대부분의 세포의 3D 배양에 최소 1 백만 세포 / mL의 최소 농도가 충분하다는 것을 보여줍니다. 캡슐화 전(단계 4.1)에 ROCK 억제제 처리의 포함이 특히 민감한 세포를 사용할 때 또한 추천된다(40).
GBM에 대한 새로운 치료 접근법을 개발하는 맥락에서, 여기에 제시된 프로토콜은 생리학적으로 관련된 미세환경 내에서 환자 유래 GBM 세포의 약물 반응을 기능적으로 스크리닝하는 방법을 제공한다. GBM (및 기타 암)에 대한 유전, 후성 유전 및 임상 mRNA 발현 데이터의 풍부한 저장소는 암 게놈 아틀라스 (TCGA) 및 기타15의 노력 덕분에 공개적으로 사용할 수 있습니다. 이러한 대규모 데이터 세트와 함께 사용하면 소형화된 3D 배양의 기능 스크린에서 생성된 데이터가 새로운 상관 관계를 밝혀 개별 환자의 임상 결과 예측을 향상시킬 수 있을 것으로 예상됩니다. 예를 들어, 환자 종양의 하위집단이 확인될 수 있으며, 이는 실렝기트와 같은 매트릭스-교란 화합물과 같은 일부 치료가 임상 결과(41)를 개선할 수 있다. 약물 반응 이외에도, 이 배양 플랫폼은 웰 플레이트 호환, 고함량 이미저를 사용하여 종양 세포 침윤의 평가를 가능하게 한다. 직교적으로 변하는 강성을 갖는 동안 많은 상이한 펩티드들을 단독으로 또는 조합하여 혼입시키는 이 플랫폼의 유연성은 GBM 종양 공격성을 유도하는 매트릭스 특징을 식별하는 데 도움이 될 수 있다.
GBM 이외에도, 이들 방법은 다른 질병, 조직 발달 및 정상 조직 기능의 맥락에서 다른 세포 유형에 대한 매트릭스 파라미터의 효과를 조사하도록 적응될 수 있다. 앞으로는 상용화된 자동화된 액체 핸들러 및 고함량 이미저를 활용하여 약물 발견을 위한 기존 워크플로우로의 채택을 용이하게 하기 위해 다중 웰 플레이트의 맥락에서 수행되도록 특별히 설계되었기 때문에 이러한 방법의 처리량을 더욱 높이는 것이 간단할 것입니다. 기존 인프라와의 통합 및 자동화 강화로 인해 세포가 풍부한 3D 하이드로겔 배양물을 생산하고 유지하는 데 필요한 기술 기술이 감소하면이 방법을 채택하는 데 대한 장벽이 크게 낮아집니다. 여기서의 연구는 HA 기반 하이드로젤 내의 배양물을 구체적으로 제시하지만, 이 방법은 메타크릴레이트 젤라틴과 같은 3D 세포 배양을 위해 일반적으로 사용되는 다른 광가교성 물질로 쉽게 번역될 수 있고, 여기에 보고된 방법들은 추가적인 적용을 위한 유용한 가이드라인을 제공할 것으로 기대된다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore, Itay Solomon이 포토겔화 계획의 초기 반복에 기여한 것에 대해 구체적으로 인정하고 싶습니다. 세포주 GS122 및 GS304는 데이비드 네이선슨에 의해 관대하게 제공되었다. 모든 인물은 BioRender.com 로 만들어졌습니다. UCLA 핵심 시설, 분자 스크리닝 공유 자원 및 나노 및 피코 특성화 실험실이이 작업에 도움이되었습니다. Chen Chia-Chun은 UCLA Eli와 Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program의 지원을 받았습니다. Grigor Varuzhanyan은 종양 세포 생물학 교육 프로그램 NIH 그랜트 (T32 CA 009056)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
| 384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
| 40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
| 4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
| 6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
| 80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
| 8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
| AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
| Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
| Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CCK8 | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
| CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
| Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
| DMEM - F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
| EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
| Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
| Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
| Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
| Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
| HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
| Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
| Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
| Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
| Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
| Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
| mLine micropipette | Sartorious | ||
| N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
| Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
| NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
| Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
| Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
| Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
| Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
| Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
| Processing | Processing | 3.5.4 | |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
| Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
| RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
| Scoth Tape | |||
| Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
| Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
| Solder Wire | |||
| Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
| Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
| T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
| Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
| Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
| VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |
References
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