Summary
本プロトコールは、調整可能な機械的特徴を有するヒドロゲルのハイスループット光架橋を容易にするカスタムメイドのUV照明装置を使用して、3Dマトリックス模倣培養における患者由来の膠芽腫細胞の化学療法応答に対する機械的および生化学的手がかりの効果を評価するための実験プラットフォームを記載する。
Abstract
細胞-マトリックス相互作用は、生化学的、機械的、幾何学的手がかりを通じて複雑な生理学的プロセスを媒介し、病理学的変化および治療応答に影響を与える。医薬品開発パイプラインの早い段階でマトリックス効果を考慮することで、新規治療薬の臨床的成功の可能性が高まると予想されます。3D細胞培養における特定の組織微小環境を再現する生体材料ベースの戦略が存在するが、これらを主に薬物スクリーニングに使用される2D培養方法と統合することは困難であった。したがって、ここで提示されたプロトコルは、既存の薬物スクリーニングパイプラインおよび細胞生存率のための従来のアッセイとの統合を容易にするために、マルチウェルプレートフォーマットの小型化された生体材料マトリックス内で3D培養のための方法の開発を詳述する。培養細胞における臨床的に関連する表現型を保存するために重要なマトリックス特徴は、高度に組織特異的および疾患特異的であると予想されるため、マトリックスパラメータの組み合わせスクリーニングは、特定の用途に適した条件を特定するために必要であろう。ここで説明する方法は、微細化された培養フォーマットを使用して、マトリックス力学およびリガンド提示の直交変動に対する癌細胞応答を評価する。具体的には、この研究は、化学療法に対する患者由来の膠芽腫(GBM)細胞の応答に対するマトリックスパラメータの効果を調査するために、このプラットフォームを使用することを実証する。
Introduction
新薬開発の予想コストは過去10年間で着実に上昇しており、現在の見積もりでは10億ドルを超えています1。この費用の一部は、臨床試験に入る薬の高い失敗率です。医薬品候補の約12%が、最終的に2019年に米国食品医薬品局(FDA)から承認を得ています。多くの薬剤は、予期せぬ毒性2のために第I相で失敗しますが、安全性試験に合格した他の薬剤は有効性の欠如3のために失敗する可能性があります。非有効性によるこの消耗は、医薬品開発中に使用される癌モデルが臨床的有効性の予測がないことで悪名高いという事実によって部分的に説明することができる4。
インビトロモデルとインビボモデルとの間の機能的差異は、非腫瘍細胞および物理的ECMを含むそれらの天然微小環境から癌細胞を除去することに起因し得る5,6。一般に、研究グループは、マトリゲル(マウス肉腫に由来するタンパク質性基底膜マトリックス)などの市販の培養マトリックスを使用して、培養腫瘍細胞に3Dマトリックス微小環境を提供する。2D培養と比較して、膜マトリックス中の3D培養は、in vitro結果の臨床的関連性を改善した7、8。しかしながら、膜マトリックスを含む脱細胞化組織からの培養生体材料は、典型的には、再現性を損なう可能性のあるバッチ間変動性を示す9。さらに、研究されたものとは異なる組織起源を有する腫瘍に由来するマトリックスは、適切な生理学的手がかり10を提供しない可能性がある。最後に、腫瘍内不均一性の高いがんは、サブミクロンサイズのスケールで変化し、膜マトリックスを反復するように調整することができない微小環境的特徴を有する11。
膠芽腫(GBM)は、生存期間の中央値が約15ヶ月の均一致死性の脳腫瘍であり、治療法の開発が特に困難であった癌である12,13。GBMの現在の標準治療は、原発性腫瘍切除、続いて放射線療法、次いでテモゾロミド(TMZ)を用いた化学療法からなる14。しかしながら、臨床的GBM腫瘍の半分以上が様々な機序を通じて治療抵抗性を示す15、16、17。個々の患者に対する治療レジメンの有効性を予測することは非常に困難である。個々の転帰を予測するために使用される標準的な前臨床モデルは、免疫不全マウスに同所性異所性に異所的に移植された患者由来の腫瘍細胞からなる。患者由来の異種移植片は、臨床GBM腫瘍の多くの側面を再現することができ、前臨床モデル18にとって価値があるが、本質的に高価で、スループットが低く、時間がかかり、倫理的懸念を伴う19。患者由来の細胞を、2Dプラスチック表面上で、または回転楕円体として培養すると、ほとんどの場合、これらの問題を回避します。患者由来の細胞は遺伝的異常を保持しているが、2Dまたは浮遊スフェロイドとしてのそれらの培養物は、げっ歯類および元の患者腫瘍における患者由来異種移植片の表現がほとんど不十分であった20。これまで、私たちや他の人々は、脳組織の機械的および生化学的特性を模倣する3D ECMで培養されたGBM細胞が薬剤耐性表現型を維持できることを示しました10,21,22,23。
脳ECMに豊富に存在し、GBM腫瘍において過剰発現される多糖であるヒアルロン酸(HA)とそのCD44受容体との間の相互作用は、インビトロでの薬物耐性の獲得を調節する21、24、25、26、27。例えば、軟質3D培養物内にHAを含めることで、患者由来のGBM細胞が治療抵抗性を獲得する能力が増加した。このメカノ応答性は、GBM細胞上のCD44受容体へのHA結合に依存していた21。さらに、RGD担持ペプチドへのインテグリン結合は、3D培養マトリックスに組み込まれ、CD44媒介性化学抵抗性を剛性依存的に増幅した21。HAを超えて、いくつかのECMタンパク質の発現は、多くはRGD領域を含み、正常な脳腫瘍とGBM腫瘍との間で変化する28。例えば、ある研究では、GBM腫瘍において28種類のECMタンパク質がアップレギュレートされたことが報告されています29。この複雑な腫瘍マトリックス微小環境内で、癌細胞は、機械的および生化学的手がかりを統合して、インテグリン結合ペプチドのヤング率または密度における比較的小さな差(例えば、一桁未満)に依存する特定の耐性表現型を生じる28、29、30。
本プロトコールは、腫瘍細胞がマトリックス合図のユニークな組み合わせを解釈し、治療抵抗性を促進する複雑で患者固有のマトリックス微小環境を特定する方法を特徴付けるものです(図1A)。3D培養用の小型で正確に調整された行列を生成するための光化学的方法は、大きくて直交する可変空間を提供する。マイクロコントローラによって実行されるカスタムメイドのLEDアレイは、自動化と再現性を高めるために、384ウェルプレートフォーマット内のヒドロゲルを光架橋するために組み込まれました。露光強度は、原子間力顕微鏡(AFM)を用いて評価されるように、得られたヒドロゲルのマイクロ機械的特性を変化させるためにウェルにわたって変化させた。本稿では照明アレイ自体の構築には焦点を当てていませんが、デバイスの再生の補助として回路図(図1B)と部品リスト(材料表)を提供しています。
この報告は、ヤング率(1桁の4つのレベル)とインテグリン結合ペプチド含量(4つの異なるECMタンパク質に由来する)が直交して変化したユニークな3D微小環境で培養された一連のGBM細胞の迅速な生成を実証している。次に、このアプローチを使用して、患者由来GBM細胞がテモゾロミド(TMZ)化学療法に対する耐性を獲得する際の生存率および増殖に対するヒドロゲル力学およびECM特異的インテグリン関与の相対的寄与を調査した。
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Protocol
患者由来のGBM細胞株(GS122およびGS304)は、UCLA治験審査委員会(IRB#10-000655)によって承認されたプロトコルの下でこれらの株を開発したDavid Nathanson教授(私たちの共同研究者)によって提供されました。細胞株を個々の患者に再び連結することができないように、細胞を非同定して提供した。
ヒドロゲル溶液の調製
- HEPES粉末をハンクス平衡塩溶液(HBSS)に20mMで溶解して、HEPES緩衝溶液を調製する。完全な溶媒和後にpHを7に調整します。
- HEPES 緩衝溶液に、前の報告31 に従って調製したチオール化 HA (700 kDa 公称分子量、材料表を参照) を溶解し、各グルクロン酸上のカルボン酸残基の 6% ~ 8% がチオールで修飾されるように、緩衝液に 10 mg/mL の濃度で溶解します。
注:周囲光によるチオール酸化を防ぐために、琥珀色のバイアルをお勧めします。- マグネチックスターリングプレート(<1,000rpm)を用いて、完全に溶解するまで室温で、典型的には約45分間撹拌する。
- HAが溶解している間に、(1)100mg/mLの8-アーム-PEG-ノルボルネン(20kDa)、(2)100mg/mLの4-アーム-PEG-チオール(20kDa)、(3)4mMのシステインまたはシステイン含有ペプチド(GCGYGRGDSPG)、および(4)4mg/mLのLAPの別々の溶液を微小遠心管で調製する( 材料表を参照)。
- ステップ1.1で調製したHEES緩衝溶液にこれら4つの溶液のそれぞれを調製する。溶液を渦巻き、ステップ4を実行する前に各試薬の完全な溶解を確実にする。
注:複数の異なるペプチドを試験する場合、各ペプチドは、このコンジュゲーション化学のためにシステインまたは他のチオール部分の供給源を含んでいなければならない。 - この時点で単一のヒドロゲル内で連結されるすべてのペプチドの溶液(4mM利用可能なチオール)を調製する。
注:ペプチド配列およびそれらが由来し、本研究で使用されたECMタンパク質を 表1に列挙する。細胞が結合しないN-アセチルシステイン( 材料表を参照)を生理活性チオール含有ペプチドに置換して、接着ペプチドの濃度を滴定するか、または陰性対照31として作用させることができる。
- ステップ1.1で調製したHEES緩衝溶液にこれら4つの溶液のそれぞれを調製する。溶液を渦巻き、ステップ4を実行する前に各試薬の完全な溶解を確実にする。
- HA、PEG-ノルボルネン、PEG-チオール、およびシステイン/チオール含有ペプチド( 材料表を参照)の個々の溶液を混合して、 表2にリストされている最終ヒドロゲルマトリックスの最終濃度を達成します。マグネチックスタープレート上で少なくとも30分間攪拌(<1,000rpm)して完全に混合する。
注:HA溶液は粘性が高く、容積ピペットを使用して取り扱うのが最適です( 材料表を参照)。正の変位ピペットが利用できない場合、粘性溶液は、ワイドオリフィスチップを使用してゆっくりとピペッティングすることによって、標準的なマイクロピペットで分配することもできます。
2. LEDアレイ を介した ヒドロゲルの照明と光架橋
警告: UV 保護メガネを着用し、照明フィールドを UV 吸収材で覆ってください。
メモ:このプロトコルで説明されているLEDアレイは、付属の回路図(図1A)に示すように、直列に配置された6組の8つのLEDで構成されています。各LEDセットは独立して給電できるため、1回のランで最大6つの異なる放射照度が可能です。 補足ファイル 1 には、詳細なガイダンスとして、次の指示に対応するスクリーンショットが含まれています。
- 補助コーディング ファイルから照明デバイス.zip ファイルをダウンロードします。このディレクトリには、Arduino.zip (補足コーディング ファイル 1)、ドライバー.zip (補足コーディング ファイル 2)、GUI.zip (補足コーディング ファイル 3)、およびホルダー.zip (補足コーディング ファイル 4) のファイルが含まれています。
メモ: 回路基板を所定の位置に保持するために、上部と下部を 3D 印刷します(詳細については、「 補足コーディングファイル 」を参照してください)。 - マイクロコントローラソフトウェアをダウンロードしてインストールします( 材料表を参照)。
- GUIソフトウェアをダウンロードしてインストールします( 資料表を参照)。ソフトウェアの操作手順については、 補足ファイル 1 を参照してください。
- 処理を開き、スケッチ>インポートライブラリ>ライブラリの追加をクリックしてcontrolIP5ライブラリをインストールします。次に、ライブラリでcontrolIP5を検索し、[インストール]をクリックします。これを初めて実行します。
- 36ボルト電源を使用して照明装置( 材料表を参照)に電力を供給し、マイクロUSBケーブルを使用してPCに接続します。
メモ:一部のデバイスでは、さまざまなArduinoナノボード用のドライバが自動的にインストールされません。ドライバーの 1 つのセットは、デバイスの zip ファイルで提供されます。 - Adruino.zip フォルダにある Arduino.ino ファイルを Arduino IDE を使用して開きます。
- Arduino.inoファイルをコンパイルするには、[ チェックマーク ]ボタンをクリックします。矢印 ボタンをクリックしてコンパイル 済みコードをアップロードします。
- GUI.zip フォルダーにある GUI.pde ファイルを「処理」を使用して開きます。
- 処理プログラムで[ 実行 ]をクリックして、照明デバイスを制御するためのグラフィカルユーザーインターフェイスを起動します。
- グラフィカルユーザーインターフェイスウィンドウで、架橋するヒドロゲル前駆体溶液を含むカラムの 強度 をクリックし、所望の強度を入力します。[時間]ボックスをクリックし、希望する 時間 を入力します。 表 2 に示すソリューションの場合、これは 15 秒になります。
メモ: エンドユーザーは、放射計を使用してデジタル強度値を放射照度に較正する必要があります。典型的な強度の例が 図2Aに提供される。 - サンプルを照明装置(図2B)と他のすべてのLEDとシリコーンモールド( 材料表を参照)または384ウェルプレートの1列に合わせます。 [完了] をクリックしてイルミネーションを開始します。384ウェルプレートの複数のスライドまたは他のウェルの照明のために、必要に応じてこのプロセスを繰り返します。
メモ:ホルダーは、照明中に384ウェルプレートが内室の片隅と同一平面に収まるように設計されています。- 照明に続いて、1つのコーナーに置かれたら、ウェルプレートを次のコーナーに移動して繰り返します。プレートのもう半分のウェルを照らすには、プレートをホルダーから持ち上げて180°回転させます。
- 以下の手順に従って、機械的特性評価のためのさまざまな力学を有するヒドロゲルを生成する。
- スライドガラスとシリコンモールドをテープで拭き取り、破片を取り除きます。シリコーンモールドをスライドガラスに接着し、押し下げて良好なシールを確保し、気泡を置換します。
- ステップ1.4で調製したヒドロゲル前駆体溶液80 μLをスライドガラス上の各シリコーンモールドにピペットで入れた。
- スライドガラスを、1つの列の他のすべてのLEDと整列した照明装置の上に置きます。ヒドロゲル前駆体を15秒間UV光に曝し、ステップ2で説明したように、光架橋させる。
- 照明が止まったらスライドを取り出し、金型の内周を細かい先端(10μLピペットチップ、30G針など)でなぞって金型からゲルをほぐします。ピンセット/鉗子でシリコーンモールドを取り除きます。
- 架橋ヒドロゲルをヘラを濡らし、スライドガラスから静かに押し出すことによって、12ウェルプレートの個々のウェルに移動する。ヒドロゲルを加える前に、各ウェルに2mLのDPBS( 材料表を参照)を充填する。DPBS溶液中のゲルを室温で少なくとも12時間(通常は一晩)膨潤させる(翌日の機械的特性評価のため)。
3. 原子間力顕微鏡(AFM)測定
- 製造元の指示に従って原子間力顕微鏡(AFM)の電源を入れます( 材料表を参照)。このプロトコルは、計測器および関連ソフトウェアの使用に関する簡単な手順を提供します。
- AFMプローブを取り付けます( 材料表を参照)。
注:本研究では、公称ばね定数0.01N/mの三角形窒化ケイ素片持ち梁を球状の2.5μm二酸化ケイ素粒子で修飾した。 - 取り付け後、レーザーを三角形プローブの頂点に合わせ、ミラーとレーザーのたわみを調整して信号の合計(通常は1.5~2.2ボルト)を最大にします。
- プローブをDPBSに浸し、熱平衡が得られるまで最大15分間待ちます。キャリブレーションボタンをクリックし、連絡先依存キャリブレーションを選択します。「サーマルチューニングを収集」ボタンをクリックし、データ収集に続いて、キャリブレーション用に約3kHzのピークを選択します。
注:屈折率の変化により、液体に浸漬した後、ミラーとレーザー偏向器のわずかな調整が必要な場合があります。 - アプローチパラメータを等速、目標高さ7.5μm、アプローチ速度15μm/sに設定して、シャーレ(プラスチック)の表面にアプローチします。アプローチの実行ごとのベースライン測定を有効にして、アプローチが継続的に実行され、ディフレクターのドリフトが原因で早期に停止しないようにします。
- アプローチ時に、フォースマッピング用の集録パラメータを4 nNターンアラウンド、2 μmのくぼみ距離、1 μm/sの速度、および0 sの接触時間に設定します。 スタート ボタンを押して、プラスチック表面(ウェルプレートなど)の力曲線の収集を開始します。
- キャリブレーションウィンドウに戻り、プラスチックの接触とくぼみに対応する力曲線の部分を選択します。計算された感度と剛性の値を受け入れて、プローブのキャリブレーションを完了します。
- 較正後、AFMプローブを持ち上げ、尋問のためにヒドロゲルサンプルを置く。ステップ5で提供された設定に従ってヒドロゲルにアプローチする。
注:ヒドロゲル表面へのアプローチ手順中に、ユニットが誤ってアプローチ状態をトリガーすることがあります。実際のアプローチを検証するには、手順 4.6 のように力曲線を取得します。結果のカーブに接触とインデントが表示されない場合は、アプローチ手順を繰り返します。 - サーフェスアプローチが成功したら、 フォースマッピング モードに切り替えて、集録パラメータを軸あたり40μmの長さで8 x 8サイズのマップに設定します。さまざまな領域の力マップを取得して、剛性測定の均一性を評価します。
- ソフトウェアプログラムJPK SPMデータ処理を使用して、球面形状を選択したヘルツ/スネドンモデルフィット(式1と式2、すべての変数の定義については表3を参照)を使用して力曲線を解釈します32,33,3 4。
式 132
式 232
- ソフトウェアプログラムJPK SPMデータ処理を使用して、球面形状を選択したヘルツ/スネドンモデルフィット(式1と式2、すべての変数の定義については表3を参照)を使用して力曲線を解釈します32,33,3 4。
式 132
式 232
4. 3Dマトリックス埋め込み培養物のセットアップと薬物処理
- 所望の細胞を単一細胞溶液として調製する。
注: 細胞タイプが異なれば、異なる継代方法が必要になる場合があります。T−75フラスコからのGBMスフェロイドの浮遊培養物を継代するための典型的なプロトコールが参考文献31に報告されている。 - TBMスフェロイド(直径約150μm)をT-75フラスコ浮遊培養物から15mL円錐管に集める。培養フラスコを5mLのDPBSですすぎ、残留細胞および培地を除去し、この容量を円錐管に加える。
- 細胞を含む円錐管を室温で200 x g で5分間遠心分離する。遠心分離後、細胞ペレットを乱さないように注意しながら、5mL血清学的ピペットで上清を除去し、5mLのDPBSに再懸濁する。
- 200 x g で室温で5分間遠心分離し、細胞を洗浄する。細胞ペレットを乱さないように注意しながら、5 mLの血清学的ピペットで上清を吸引し、次いで細胞を2 mLの細胞解離試薬に再懸濁する( 材料表を参照)。
- 室温で10〜15分間インキュベートする。3mLの完全培地( 材料表を参照)および穏やかにピペットを3〜5回加えて、スフェロイドを単一細胞懸濁液31に分解する。
- 単一細胞懸濁液を400 x g で遠心分離し(単一細胞懸濁液はペレット形成のためにより速く紡糸され得る)、室温でペレット細胞に5分間遠心分離する。上清を5mL血清学的ピペットで吸引し、細胞ペレットを乱さないように注意してください。細胞を1mLの完全培地に再懸濁する。
注:細胞が懸濁液中の単一細胞としてではなく凝集塊に残っている場合、継代後、細胞を40μmの細胞ストレーナーに通して単一細胞懸濁液を達成することができます。 - 血球計数器を用いて計数のために細胞の一部を除去する。この部分をトリパンブルーで2倍に希釈し、生存率が損なわれた細胞に浸透させる。生きた無色の細胞だけを数えます。典型的には、フラスコ当たり800,000細胞で播種されたT−75は、培養において1週間後に200万〜300万個の細胞を生じる。
- カプセル化に必要なセルの数を決定します。必要な細胞の総数を含む量の培地を滅菌1.7mL微量遠心管に移す。室温で400 x g で5分間スピンダウンします。
注:例えば、250万細胞/mLで細胞を封入するには、1mLのゲル容量に再懸濁された最低250万個の細胞が必要である。1mLのゲル容量により、ユーザーは100個のゲル滴を分注することができ、各ゲル滴は10μLの体積である。ヒドロゲル溶液に懸濁された余分な〜20%容量の細胞を調製することは、ピペット移送中の損失を考慮するために推奨される。したがって、この例では、300万個の細胞および1.2mLのヒドロゲル前駆体溶液を調製するであろう。500,000細胞/mLの最小密度が推奨されます。 - 上清をマイクロピペットで吸引し、細胞ペレットを乱さないように注意する。ステップ1.4で調製したように、細胞ペレットをヒドロゲル前駆体溶液に再懸濁し、1,000 μLのマイクロピペットで上下に4〜5回ピペッティングしてよく混合する。
- セルを10 μLを分配するようにセットした繰り返しピペッター( 材料表を参照)にロードします。気泡や不均一な分配を避けるために、廃棄物容器にさらに1〜2回分注することによって、繰り返しピペッターをプライミングする。
- 384ウェルプレートの各ウェルに、ヒドロゲル溶液に懸濁した10μLの細胞を反復ピペッターから分注する。LEDアレイを使用して、所望の機械的特性を達成するために、細胞を含む各ウェルを15秒間強度で照明する(例えば、 図2A の結果は、1.14、1.55、2.15、2.74mW/cm2の強度を利用する)。
注: 実験条件ごとに 5 回の反復から開始し、エンドポイントアッセイの望ましいスループットと分散に応じてスケールアップまたはスケールダウンすることをお勧めします。 - 細胞を含む各ウェルに40 μLの完全培地を加える。50 μL の DPBS をゲルを囲む非実験的な乾燥ウェルに追加して、蒸発による損失を最小限に抑えます。
- GBM細胞の場合、40μLの培地含有薬物(例えば、TMZ、 材料表を参照)を添加して、最終所望の濃度(ジメチルスルホキシド(DMSO)またはビヒクル(DMSO)中の10μM〜100μM)を達成し、それに応じて、封入の3日後に開始する。
CCK8増殖アッセイ
- 細胞を含む各ウェルに10 μLのCCK8試薬( 材料表を参照)を加える。
注:このアッセイを初めて行う場合は、培地のみまたは無細胞ヒドロゲルなどの陰性対照ウェルを培地に含めてください。 - 製造業者の指示に従って1〜4時間インキュベートする。
注:この時間は細胞の種類と密度の関数として変化する可能性があるため、吸光度値がビールの法則35を適用するための要件である線形範囲内に収まるように、各アプリケーションでインキュベーション時間をテストする必要があります。 - インキュベーション後のすべてのウェルについて、450nmでの吸光度を読み取ります。
- 各群のビヒクル条件についてステップ3で得られた450nmにおける平均吸光度を算出する。ウェル処理した各薬物を、1群あたりのビヒクル対照の平均で割る。
- 百分位数法36を使用してブートストラップ分布(N = 10,000)を生成して信頼区間を計算します。
注: 一般に、95% 信頼区間を利用し、信頼区間が 1 を横切らない条件を有意であると解釈し、さらなる調査を正当化することができます。信頼区間を95%に設定することは、有意カットオフをp = 0.05に設定することと一致します。結果に示されたデータに対して、マトリックス媒介性薬物耐性を促進または阻害する条件を区別することに有用性があり、両面分析が必要である。
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Representative Results
AFM測定では、カスタムメイドのArduino制御LEDアレイを使用して、光架橋中のUV放射照度(mW/cm2)の関数としてヒドロゲル力学を正確に制御することが確認されました(図2A)。このプロトコールで使用されるヒドロゲル製剤を 表2に見出すことができる。提供されたテンプレート上のLEDの間隔は、384ウェルプレートの他のすべてのウェルの間隔と一致し、プレート内にゲルを形成することができます(図2B)。単一のヒドロゲルの表面におけるミクロンスケール領域のAFM調査は、より柔らかい平均ヤング率を有するヒドロゲルも、より硬いヒドロゲルよりも小さいモジュライの範囲を有することを示した(図2C−E)。
生存率を最大化する細胞播種密度は、細胞種ごとに経験的に決定されるべきである。この研究は、2,500,000細胞/mLの密度で播種したGS122細胞の3D培養が、500,000細胞/mLの密度で播種されたものと比較して、培養7日後に評価した場合、実質的に高い生存率を示したことを実証した(図3A)。さらに、GS122およびGS304細胞を患者由来GBM細胞を培養するためのモデルとして使用し、マトリックス微小環境の剛性および生化学的組成に対する化学療法応答の依存性を調査した(図3B−D)。細胞生存率は、TMZで4日間処理した後、CCK8アッセイを通して評価し、対応するビヒクル対照によるOD450 測定をスケーリングし、百分位数法36によるブートストラップ(N = 10,000)によって95%信頼区間を生成することによって、7日間の総培養時間をもたらした。これらの分布では、信頼区間が値1(破線)と重複しない条件が有意であると考えられました。 t検定や分散分析などのより一般的に使用される統計的方法と比較して、ブートストラップを使用してより大きなサンプルサイズに存在する分布を推定する信頼区間の推定は、さらなる調査のために条件の小さなサブセットを特定することを目的とするスクリーニングアッセイに適しています。この方法のもう1つの利点は、信頼区間の広がりが小さい条件を、平均値が類似しているが信頼区間の広がりが大きい他の条件よりも優先できることです。この研究は、GS122細胞が微小環境相互作用から生存利益を得たことを示した(図3B)。この生存利益は、0.8、1、および4kPaの条件で有意であったが、GS122細胞の8kPa条件では有意ではなかった。GS304細胞は、剛性およびTMZ処置の両方に非感受性であった。
次いで、マトリックス微小環境の生化学的組成の影響を、GBM腫瘍微小環境において2つの剛性、0.8kPa、および8kPaでアップレギュレートされることが知られているECM由来のインテグリン結合ペプチド(表1)の包含を変えることによって調べた。ここでも、GS304細胞はマトリックス包接から有意な生存利益を受けておらず、TMZに対して感受性ではなかった。しかし、GS122細胞は、オステオポンチン由来ペプチドをマトリックスに含めた場合、8kPa条件下で生存率向上を示したが、インテグリン結合シアロタンパク質(IBSP)またはテナシンC由来ペプチドの組み込みは、一般的なRGDペプチドを用いたマトリックスでの培養など、生存利益を最小限に抑えた(図3C)。対照的に、0.8kPa培養条件下で生存率向上を与えたペプチドはなかった(図3D)。一緒に、結果は、評価された2つの患者由来細胞株間のマトリックスおよび薬物応答の両方における本質的な違いを示唆している。
3Dヒドロゲル培養は、標準的な光学顕微鏡を使用して視覚化し、細胞形態および侵襲的挙動が細胞株依存的に培養条件によってどのように影響されるかを評価することができる(図4)。GS122およびGS304細胞はいずれも、RGD含有ペプチドを含む軟質または硬質ヒドロゲルマトリックス中で培養すると広がります(図4A)。ペプチドは細胞の広がりに影響を与えたが、細胞が広がる能力は、TMZ耐性を獲得する培養物の能力を必ずしも予測しなかった。例えば、GS122細胞は、オステオポンチンを用いて0.8および8kPaの両方で同様の広がりの欠如を示す。しかし、GS122は8kPaの条件でTMZに対する耐性の増強を示したのみであった(図4B)。最後に、この小型化された3D培養プラットフォームを使用して、末分化した神経内分泌前立腺癌細胞の生存可能なオルガノイドを含む、他の腫瘍タイプのヒト細胞を培養することができる(図4C)。
図 1: プロトコル の漫画の描写。(A) 3D カルチャの生成と監視のプロセスの漫画の描写。(1)HA系ハイドロゲル溶液が調製される。(2)ヒドロゲル溶液は、Arduinoマイクロコントローラによって制御されるLEDを介して可変強度で架橋される。(3)得られたヒドロゲル力学をAFMにより評価し、ゲル力学の違いを検証する。(4)次いで、ステップ1からの製剤に合致する溶液を用いて、患者由来GBM細胞を封入し、薬物で処理する。(5)7日後、CCK8比色アッセイ を介して 細胞生存率を読み出す。(B)このプロトコルで使用されるカスタムLED照明アレイの回路図。個々のコンポーネントは、 材料表にリストされています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:調整可能なLEDを使用して剛性を変えて作製したヒドロゲルで、放射照度を修正します。(A)バイオリンプロットは、個々のヒドロゲルの40μm x 40μmにまたがる3つの表面領域にわたってAFMによって生成された力曲線から計算されたヤング率を示しています。各ヒドロゲルのヤング率は、光架橋時の紫外線放射照度の関数として示される。水平な白線は、各実験群の中央値を示す。(B)マルチウェルプレート(384ウェル)のピッチに一致する間隔を有するLEDアレイ。(C)15秒間に1.55mW/cm2に曝露して架橋された典型的なゲルのヤング率(平均=0.8kPa)の局所的変動を示すヒートマップ、(D)15秒間2.74mW/cm2に曝露した際の典型的なゲル架橋のヤング率(平均=8kPa)の局所的変動を示すヒートマップ、(E)CおよびDに示すヒドロゲルの表面にわたるヤング率測定値の範囲を示すヒストグラム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:剛性とインテグリン結合ペプチドの直交表示は、GBM細胞株間の固有の生物学的差異を明らかにする 。 (A)10 μLヒドロゲルに封入されたGS122細胞の典型的な吸光度値は、1mLあたり500,000または2,500,000細胞の密度で。(b)GS122およびGS304細胞株の薬物応答データは、薬物処理ウェルのOD450値(N=5)をビヒクル処理ウェルの平均(N=5)で正規化することによって可視化される。薬物処理の文脈における生存率は、ヒドロゲルの剛性について非線形に変動することが観察され、細胞株間の変動を実証した。(C、D)GS122およびGS304細胞株の薬物応答データは、インテグリン結合ペプチドのタイプが含まれ、マトリックスの剛性が直交して変化した場合。すべてのエラーバーは、N = 10,000で各条件をブートストラップして得られた95%信頼区間を表します。なお、破線(y軸=1)は、処理条件に対するOD450 が車両と等しい場合に相当する。全ての実験値は、培養7日後に得られた;TMZは、薬物研究のための最初の封入の3日後に添加した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)GS122およびGS304の位相差画像は、ヒドロゲル(0.8および8kPa)で培養した場合、RGDモチーフを示した。白い矢印は、拡散した形態を有する細胞を示す。GS122およびGS304の相画像は、ヒドロゲル(0.8および8kPa)中で培養した場合に、オステオポンチン由来のペプチドを表示した。白い矢印は、拡散した形態を有する細胞を示す。黒い矢印は丸みを帯びた形態を持つ細胞を示す。培養の7日後、画像を撮影し、そして最初の封入の3日後にTMZを添加した。(c)終末分化型神経内分泌前立腺オルガノイドの位相像。スケールバー = 200 μm (A、B の場合)。100 μm (C の場合)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 蛋白質 | ペプチド配列 |
| ティッカー | GCGYGRGDSPG |
| テナシン-C | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIRGV |
| インテグリン結合シアロタンパク質(IBSP) | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| オステオポンチン | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
表1:ECMタンパク質および由来ペプチド配列。
| 試薬 | 初期濃度 | 容量 (μL) | 最終濃度 |
| HA-SH ソリューション | 10 ミリグラム/ミリリットル | 2300 | 5ミリグラム/ミリリットル |
| ペグシュ | 100 ミリグラム/ミリリットル | 503 | 実験ごとに異なる |
| ペグ-ノルボルネン | 100 ミリグラム/ミリリットル | 443 | 実験ごとに異なる |
| ペプチド | 4 μM | 288 | 0.250 μM |
| ラップ | 4ミリグラム/mL | 288 | 0.25 ミリグラム/mL |
| ヘペス-HBSS | 該当なし | 798 |
表2:ヒドロゲルのための典型的な最終製剤成分。
| 変数 | パラメーター |
| F | 力 |
| E | ヤング率 |
| ν | ポアソン比 |
| δ | インデント(垂直方向の先端位置) |
| ある | 接触円の半径 |
| RS | 球の半径 |
表 3: AFM 計算の変数と対応するパラメータ
補足ファイル1:ヒドロゲルの照明および光架橋のためのLEDアレイの使用に関するガイダンス。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル1:LEDアレイマイクロコントローラ(Arduino.zip)用のArduinoファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル2:Arduinoナノ用のサードパーティ製ドライバ(ドライバ.zip)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足符号化ファイル3:LEDアレイマイコン(GUI.zip)のGUI制御のための処理ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足符号化ファイル4:LEDアレイマイクロコントローラ用3Dプリント用外部ホルダ(ホルダ.zip)用ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
現在の研究は、HAベース内で3Dの小型化された培養物を生成すると同時に、マトリックスの剛性とインテグリンエンゲージメントに利用可能なペプチドを変更する方法を提示しています。この技術は、マトリックスパラメータが細胞表現型(例えば、化学療法に曝露された癌細胞の生存率)にどのように影響するかを、より高いスループットで体系的に研究することを可能にする。本明細書に提示されたものを含む以前のアプローチは、最終製剤中の全ポリマーパーセントを変化させることによってヒドロゲル剛性を調整しており、ここで、より硬いヒドロゲルは、より高いポリマー含有量21、31を有する。しかしながら、このアプローチは、所望の各剛性に対して固有のヒドロゲル製剤を調製する必要があり、このプロセスは本質的にスループットを低下させる。ここで、ヒドロゲルの剛性は、架橋中にUV放射照度を変化させることによって調整され、単一の前駆体溶液から複数の剛性のヒドロゲルが得られる。ここで説明するカスタムイルミネーターを構築する機会がないかもしれない将来の開業医は、市販のUVスポット硬化装置を簡単に置き換え、ウェルプレートの異なるセクターが硬化するにつれて照明を調整することができます。市販のスポット硬化装置を使用することの欠点は、カスタムイルミネーターと比較してスループットが低下することです。現在の方法の限界は、ペプチド条件ごとに固有の溶液を調製しなければならないことです。同様の方法が、剛性勾配含有ヒドロゲル37、38を製造するために他のグループによって以前に使用されてきた。しかし、この研究は、光架橋が実験サンプルの微細化を可能にし、実験セットアップの複雑さを軽減する方法を示しています。全体として、これらの改善により、研究者はマトリックス模倣生体材料で3D培養を行う際の実験スループットを向上させることができ、神経腫瘍学以外の生物医学のいくつかの分野で有用性を持つことができます。
代表的な結果は、この技術を使用して、いくつかの標準的なアッセイに適した標準的な384ウェルプレート内で、利用可能なインテグリン結合ペプチドおよび剛性が変化する定義されたマトリックス中の患者由来GBM細胞の小型化された3D培養物をどのようにセットアップできるかを示しています。この方法は、マトリックスパラメータがGS122およびGS304細胞と表記される2人のユニークな患者に由来するGBM細胞におけるTMZ化学療法に対する応答にどのように影響するかをスクリーニングするための代表的な結果を提示する。ここで評価された2つの患者由来細胞株のうち、TMZ処置に対するGS122細胞の応答はマトリックス微小環境に対して感受性であったが、GS304細胞の応答は非感受性であった。マトリックス剛性に関しては、4kPaの微小圧縮弾性率を有する3Dヒドロゲルで培養したGS122細胞はTMZ耐性を最大化し、その条件下では、処理された細胞は7日間の実験コースにわたって未処理の細胞よりも数が増加した。機械的特性は、含まれるインテグリン結合ペプチドよりもTMZ耐性に大きな影響を及ぼした。したがって、ペプチド濃度の変動の影響により、単独および組み合わせて、将来的に薬剤耐性を促進するマトリックス条件の発見が可能になることが期待される。周囲のマトリックスに対するGS304細胞の非感受性は、GS122細胞のように、もともとTMZに感受性でありながら治療中に耐性を獲得する細胞に対して、マトリックスがより影響力があることを示している可能性がある。対照的に、マトリックスの手がかりが、実験の開始時にすでに治療抵抗性である細胞にどの程度影響するかは、GS304細胞と同様に不明である。
この研究の結果は、以前に報告された結果から幾分逸脱していた。評価された最も柔らかいHAベースのヒドロゲル(1kPaバルクヤング率、天然脳の剛性を模倣する)は、ここで評価されたものとは異なる患者由来の4つの腫瘍に由来する最大TMZ耐性GBM細胞を促進した21。この不一致にはいくつかの理由が考えられます。まず、現在の研究では、0.8kPa〜8kPaの微小圧縮弾性率の範囲にわたってヒドロゲルを比較したが、以前の研究ではヒドロゲルのみを1kPaおよび2kPaのヤングモジュライと比較した。さらに、以前の研究では、ヤング率を推定するために線形機械的圧縮を使用してバルクスケールで機械的特性評価が行われていましたが、この研究では、AFMを使用して微小圧縮弾性率を測定しました。マイクロスケール力学測定を必要としない、ここに存在する方法を実装しようとしている研究者にとって、レオメトリーまたは線形機械的試験を使用したバルクスケールモジュラは、AFMの完全に受け入れられる代替品です。特に、マイクロメカニカル解析により、単一のゲルの表面にわたる不均一なモジュライが明らかになりました。以前の研究で処方されたヒドロゲルに関する同等のAFM測定は行われていないが、単一のヒドロゲル内で提示された剛性の分散は、現在の研究におけるものよりも大きいことが予想される。以前の研究におけるヒドロゲルは、37°C10、21、24での速度論的混合に依存するマイケル型付加架橋を用いて生成した。対照的に、光架橋は、光露光前にヒドロゲル前駆体の徹底的な混合を可能にし、3Dヒドロゲル内の均質性を改善し、ひいては細胞応答の変動性を低減する。最後に、GBM腫瘍は、悪名高いほど不均一で予測不可能な挙動39を示し、したがって、個々の腫瘍に由来する細胞が同様にユニークな特性を有すると予想することは合理的である。患者サンプル間での一貫性の欠如は、患者固有の腫瘍特性を解明するためのハイスループットプラットフォームの必要性を動機付けています。
微細化されたヒドロゲル光架橋手順を行う際の一般的な落とし穴は、ヒドロゲル前駆体の不完全な混合、再現性の悪さ、および混合中のHA溶液の自発的なゲル化をもたらすことを含む。これらの問題は、ヒドロゲル前駆体溶液のpHを注意深く監視しながら、チオールの酸化および架橋へのジスルフィドの形成を防ぐために、HA-チオールを最低45分間、完全な前駆体溶液をさらに30分間攪拌することによって軽減することができる。キネティックマイケル型付加機構10,21を用いる架橋方法とは対照的に、このプロトコルで使用される光架橋方法は、すべての試薬が組み合わされた場合の自発的なゲル化の確率を低下させる21。HAチオール化率31の測定や、3D培養の各バッチへの並行機械的試験のための追加のヒドロゲルの作成など、品質管理チェックポイントを強くお勧めします。最後に、ヒドロゲルへの3Dカプセル化のための播種密度は、使用される細胞タイプまたはラインごとに同定される必要がある。一般に、この結果は、患者由来のGBM細胞、ヒト胚性幹細胞(H9)、およびヒト人工多能性幹細胞を含むスフェロイドを形成するほとんどの細胞の3D培養には、最低濃度100万細胞/mLで十分であることを示している(データは示さず)。特に感受性の高い細胞を使用する場合の封入前のROCK阻害剤処理(ステップ4.1)を含めることも推奨される40。
GBMの新しい治療アプローチを開発するという文脈において、ここで提示されるプロトコルは、生理学的に関連する微小環境内の患者由来GBM細胞の薬物応答を機能的にスクリーニングするための方法を提供する。GBM(および他のがん)の遺伝的、エピジェネティック、および臨床的mRNA発現データの豊富なリポジトリは、The Cancer Genome Atlas(TCGA)などの努力のおかげで公開されています15。これらの大規模なデータセットと組み合わせて使用すると、小型化された3D培養の機能的スクリーンから生成されたデータが新しい相関関係を明らかにし、個々の患者の臨床転帰の予測を改善することが期待されます。例えば、シレンギチドなどのマトリックス破壊化合物のような何らかの治療が臨床転帰を改善し得る患者腫瘍の部分集団が同定され得る41。薬物応答に加えて、この培養プラットフォームは、ウェルプレート適合性の高含有イメージャーを使用して腫瘍細胞浸潤の評価を可能にします。このプラットフォームの柔軟性は、単独でまたは組み合わせて多くの異なるペプチドを組み込む一方で、直交的に変化する剛性は、GBM腫瘍攻撃性を駆動するマトリックスの特徴を特定するのに役立つ可能性がある。
GBMを超えて、これらの方法は、他の疾患、組織発達、および正常な組織機能の文脈における他の細胞型に対するマトリックスパラメータの影響を調査するために適合させることができる。将来的には、これらの方法は、市販の自動液体ハンドラーおよび高コンテンツイメージャーを利用して創薬のための既存のワークフローへの採用を容易にするために、マルチウェルプレートの文脈で実行されるように特別に設計されているため、これらの方法のスループットをさらに向上させることは容易である。既存のインフラストラクチャとの容易な統合と自動化の向上により、細胞を含む3Dヒドロゲル培養の製造と維持に必要な技術的スキルが低下し、この方法を採用する際の障壁が大幅に低下します。ここでの研究は、HAベースのヒドロゲル内の培養を具体的に提示するが、この方法は、メタクリレート化ゼラチンなどの3D細胞培養に一般的に使用される他の光架橋性材料に容易に翻訳することができ、ここで報告された方法は、さらなる用途のための有用なガイドラインを提供することが期待される。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、Carolyn Kim、Amelia Lao、Ryan Stoutamore、Itay Solomonがフォトジェレーションスキームの初期の反復に貢献したことを特に認めたいと思います。細胞株GS122およびGS304は、David Nathansonによって寛大に提供された。すべての図は BioRender.com で作成されました。UCLAの中核施設、分子スクリーニング共有リソース、ナノおよびピコキャラクタリゼーション研究所は、この研究に役立った。Chen Chia-Chunは、UCLA Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Programの支援を受けました。Grigor Varuzhanyanは、Tumor Cell Biology Training Program NIH Grant(T32 CA 009056)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
| 384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
| 40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
| 4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
| 6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
| 80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
| 8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
| AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
| Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
| Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CCK8 | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
| CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
| Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
| DMEM - F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
| EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
| Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
| Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
| Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
| Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
| HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
| Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
| Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
| Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
| Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
| Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
| mLine micropipette | Sartorious | ||
| N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
| Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
| NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
| Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
| Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
| Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
| Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
| Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
| Processing | Processing | 3.5.4 | |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
| Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
| RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
| Scoth Tape | |||
| Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
| Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
| Solder Wire | |||
| Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
| Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
| T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
| Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
| Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
| VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |
References
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).
- Booth, B., Ma, P., Glassman, R.
- Da Ros, M., et al. Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).
- Broekman, M. L., et al.
- Grundy, T. J., et al. Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness. Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).
- Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses. Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).
- Simoni, R. D., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (2002).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L.
- Spinelli, C., et al. Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).
- Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018. Neuro-Oncology. 23, Supplement_3 (2021).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge. Contemporary oncology. 19, Poznan, Poland. 68-77 (2015).
- Lee, S. Y.
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Levy, N. The use of animal as models: Ethical considerations. International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).
- Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).
- Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Preston, M. Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination. Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. Future Science OA. 3 (3), (2017).
- Trombetta-Lima, M., et al. Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma. Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).
- Schregel, K., et al. Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography. NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
- Sneddon, I. N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).
- Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).
- Mayerhöfer, T. G., Popp, J. Beer's law - Why absorbance depends (almost) linearly on concentration. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).
- Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping. Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).
- Lavrentieva, A.
- Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).
- da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals. Cells. 8 (10), 1177 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results. Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).
