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Bioengineering

Gli array di idrogel consentono una maggiore produttività per gli effetti di screening dei componenti della matrice e delle terapie nei modelli tumorali 3D

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/63791
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1University of California Los Angeles

Summary

Il presente protocollo descrive una piattaforma sperimentale per valutare gli effetti dei segnali meccanici e biochimici sulle risposte chemioterapiche delle cellule di glioblastoma derivate dal paziente in colture 3D matrix-mimetiche utilizzando un dispositivo di illuminazione UV su misura che facilita il fotocrosslinking ad alto rendimento di idrogel con caratteristiche meccaniche sintonizzabili.

Abstract

Le interazioni cellula-matrice mediano processi fisiologici complessi attraverso segnali biochimici, meccanici e geometrici, influenzando i cambiamenti patologici e le risposte terapeutiche. Si prevede che la contabilizzazione degli effetti della matrice nelle prime fasi della pipeline di sviluppo del farmaco aumenterà la probabilità di successo clinico di nuove terapie. Esistono strategie basate su biomateriali che ricapitolano specifici microambienti tissutali in colture cellulari 3D, ma integrarle con i metodi di coltura 2D utilizzati principalmente per lo screening dei farmaci è stata una sfida. Pertanto, il protocollo qui presentato descrive in dettaglio lo sviluppo di metodi per la coltura 3D all'interno di matrici di biomateriali miniaturizzati in un formato di piastra multi-pozzo per facilitare l'integrazione con le pipeline di screening dei farmaci esistenti e i saggi convenzionali per la vitalità cellulare. Poiché si prevede che le caratteristiche della matrice critiche per la conservazione dei fenotipi clinicamente rilevanti nelle cellule coltivate siano altamente specifiche per i tessuti e la malattia, sarà necessario lo screening combinatorio dei parametri della matrice per identificare le condizioni appropriate per applicazioni specifiche. I metodi qui descritti utilizzano un formato di coltura miniaturizzato per valutare le risposte delle cellule tumorali alla variazione ortogonale della meccanica della matrice e della presentazione del ligando. In particolare, questo studio dimostra l'uso di questa piattaforma per studiare gli effetti dei parametri della matrice sulle risposte delle cellule di glioblastoma derivate dal paziente (GBM) alla chemioterapia.

Introduction

Il costo previsto per lo sviluppo di un nuovo farmaco è aumentato costantemente negli ultimi dieci anni, con oltre $ 1 miliardo nelle stime attuali1. Parte di questa spesa è l'alto tasso di fallimento dei farmaci che entrano negli studi clinici. Circa il 12% dei farmaci candidati alla fine ottiene l'approvazione dalla Food & Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti (USA) nel 2019. Molti farmaci falliscono nella fase I a causa della tossicità imprevista2, mentre altri che superano gli studi di sicurezza possono fallire a causa della mancanza di efficacia3. Questo logoramento dovuto alla non efficacia può essere in parte spiegato dal fatto che i modelli di cancro utilizzati durante lo sviluppo del farmaco sono notoriamente non predittivi dell'efficacia clinica4.

Le disparità funzionali tra modelli in vitro e in vivo possono essere attribuite alla rimozione delle cellule tumorali dal loro microambiente nativo, comprese le cellule non tumorali e l'ECM fisico 5,6. Comunemente, i gruppi di ricerca utilizzano matrici di coltura disponibili in commercio, come Matrigel (una matrice di membrana basale proteica derivata da sarcomi di topo) per fornire alle cellule tumorali in coltura un microambiente a matrice 3D. Rispetto alla coltura 2D, la coltura 3D nella matrice di membrana ha migliorato la rilevanza clinica dei risultati in vitro 7,8. Tuttavia, i biomateriali di coltura da tessuti decellularizzati, compresa la matrice di membrana, in genere mostrano una variabilità da lotto a lotto che può compromettere la riproducibilità9. Inoltre, le matrici derivate da tumori con origini tissutali diverse da quelle studiate potrebbero non fornire gli opportuni spunti fisiologici10. Infine, i tumori con alti gradi di eterogeneità intratumorale hanno caratteristiche microambientali che variano su una scala di dimensioni submicroniche e che la matrice di membrana non può essere sintonizzata per ricapitolare11.

Il glioblastoma (GBM), un tumore cerebrale uniformemente letale con un tempo di sopravvivenza mediano di circa 15 mesi, è un tumore per il quale lo sviluppo del trattamento è stato particolarmente difficile12,13. L'attuale standard di cura per GBM consiste nella resezione primaria del tumore, seguita dalla radioterapia e quindi dalla chemioterapia con temozolomide (TMZ)14. Tuttavia, più della metà dei tumori GBM clinici mostra resistenza al trattamento attraverso vari meccanismi 15,16,17. Prevedere l'efficacia di un regime di trattamento per un singolo paziente è estremamente difficile. I modelli preclinici standard utilizzati per prevedere i risultati individuali sono costituiti da cellule tumorali derivate dal paziente che si sono deformate ortotopicamente in topi immunocompromessi. Mentre gli xenotrapianti derivati dal paziente possono ricapitolare molti aspetti dei tumori GBM clinici e sono preziosi per i modelli preclinici18, sono intrinsecamente costosi, a bassa produttività, richiedono molto tempo e comportano preoccupazioni etiche19. Le colture di cellule derivate dal paziente, su superfici di plastica 2D o come sferoidi, per lo più evitano questi problemi. Mentre le cellule derivate dal paziente conservano le aberrazioni genetiche, le loro colture in 2D o come sferoidi sospesi sono state in gran parte rappresentazioni scadenti di xenotrapianti derivati dal paziente nei roditori e nei tumori originali dei pazienti20. In precedenza, noi e altri abbiamo dimostrato che le cellule GBM coltivate in un ECM 3D che imita le proprietà meccaniche e biochimiche del tessuto cerebrale possono preservare i fenotipi di resistenza ai farmaci 10,21,22,23.

Le interazioni tra l'acido ialuronico (HA), un polisaccaride abbondante nell'ECM cerebrale e sovraespresso nei tumori GBM, e il suo recettore CD44 modulano l'acquisizione della resistenza ai farmaci in vitro 21,24,25,26,27. Ad esempio, l'inclusione di HA all'interno di colture 3D morbide ha aumentato la capacità delle cellule GBM derivate dal paziente di acquisire resistenza terapeutica. Questa meccano-responsività dipendeva dal legame dell'HA ai recettori CD44 sulle cellule GBM21. Inoltre, il legame dell'integrina ai peptidi portatori di RGD, incorporato in matrici di coltura 3D, ha amplificato la chemioresistenza mediata da CD44 in modo dipendente dalla rigidità21. Oltre all'HA, l'espressione di diverse proteine ECM, molte contenenti regioni RGD, varia tra il cervello normale e i tumori GBM28. Ad esempio, uno studio ha riportato che 28 distinte proteine ECM erano sovraregolate nei tumori GBM29. All'interno di questo complesso microambiente a matrice tumorale, le cellule tumorali integrano segnali meccanici e biochimici per produrre un particolare fenotipo di resistenza, che dipende da differenze relativamente piccole (ad esempio, meno di un ordine di grandezza) nel modulo di Young o densità di peptidi leganti l'integrina 28,29,30.

Il presente protocollo caratterizza il modo in cui le cellule tumorali interpretano combinazioni uniche di segnali matriciali e identificano microambienti a matrice complessi e specifici per il paziente che promuovono la resistenza al trattamento (Figura 1A). Un metodo fotochimico per generare matrici miniaturizzate e sintonizzate con precisione per la coltura 3D fornisce un ampio spazio variabile ortogonale. Un array di LED costruito su misura, gestito da un microcontrollore, è stato incorporato per fotocrosslink idrogel all'interno di un formato di piastra a 384 pozzetti per aumentare l'automazione e la riproducibilità. L'intensità dell'esposizione è stata variata in modo variabile per alterare le proprietà micromeccaniche degli idrogel risultanti, come valutato utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM). Mentre questo manoscritto non si concentra sulla costruzione dell'array di illuminazione stesso, uno schema elettrico (Figura 1B) e un elenco di parti (Tabella dei materiali) sono forniti come ausili per la riproduzione del dispositivo.

Questo rapporto dimostra la rapida generazione di una serie di cellule GBM coltivate in microambienti 3D unici in cui il modulo di Young (quattro livelli in un singolo ordine di grandezza) e il contenuto peptidico legante l'integrina (derivato da quattro diverse proteine ECM) sono stati variati ortogonalmente. L'approccio è stato poi utilizzato per studiare i contributi relativi della meccanica dell'idrogel e dell'impegno dell'integrina specifica dell'ECM sulla vitalità e la proliferazione delle cellule GBM derivate dal paziente mentre acquisiscono resistenza alla chemioterapia temozolomide (TMZ).

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Protocol

Le linee cellulari GBM derivate dal paziente (GS122 e GS304) sono state fornite dal professor David Nathanson (nostro collaboratore), che ha sviluppato queste linee secondo un protocollo approvato dall'UCLA Institutional Review Board (IRB # 10-000655). Le cellule sono state fornite de-identificate in modo che le linee cellulari non potessero essere ricollegate ai singoli pazienti.

1. Preparazione della soluzione di idrogel

  1. Preparare la soluzione tamponata con HEPES sciogliendo la polvere di HEPES a 20 mM nella soluzione salina bilanciata (HBSS) di Hank. Regolare il pH a 7 dopo la completa solvatazione.
  2. Nella soluzione tamponata con HEPES, sciogliere l'HA tiolato (peso molecolare nominale di 700 kDa, vedere Tabella dei materiali), preparato seguendo la precedente relazione31, in modo che il 6%-8% dei residui di acido carbossilico su ciascun acido glucuronico siano modificati con un tiolo, ad una concentrazione di 10 mg/mL in soluzione tampone.
    NOTA: Si raccomanda un flaconcino ambrato per prevenire l'ossidazione del tiolo da parte della luce ambientale.
    1. Mescolare usando una piastra magnetica (<1.000 giri / min) a temperatura ambiente fino a completa dissoluzione, in genere intorno ai 45 minuti.
  3. Durante la dissoluzione dell'HA, preparare soluzioni separate di (1) 100 mg/mL di PEG-Norbornene a 8 bracci (20 kDa), (2) 100 mg/mL di PEG-tiolo a 4 bracci (20 kDa), (3) 4 mM di peptide contenente cisteina o cisteina (ad esempio, GCGYGRGDSPG) e (4) 4 mg/mL di LAP in tubi di microcentrifuga (vedere Tabella dei materiali).
    1. Preparare ciascuna di queste quattro soluzioni nella soluzione con buffer HEPES preparata nel passaggio 1.1. Vortex le soluzioni per garantire la completa dissoluzione di ciascun reagente prima di eseguire la fase 4.
      NOTA: Se si testano più peptidi diversi, ognuno deve contenere una cisteina o un'altra fonte di tiolo per questa chimica di coniugazione.
    2. Preparare soluzioni (4 mM di tiolo disponibile) di tutti i peptidi da legare all'interno di un singolo idrogel a questo punto.
      NOTA: Le sequenze peptidiche e le proteine ECM da cui sono state derivate e utilizzate in questo studio sono elencate nella Tabella 1. La N-acetil cisteina (vedi Tabella dei materiali), a cui le cellule non si legano, può essere sostituita da un peptide bioattivo contenente tiolo per titolare la concentrazione di un peptide adesivo o agire come controllo negativo31.
  4. Mescolare le singole soluzioni di HA, PEG-Norbornene, PEG-tiolo e peptidi contenenti cisteina/tiolo (vedere Tabella dei materiali) per ottenere le concentrazioni finali per le matrici finali di idrogel elencate nella Tabella 2. Mescolare (<1.000 giri /min) su una piastra magnetica per almeno 30 minuti per mescolare completamente.
    NOTA: le soluzioni HA sono altamente viscose e meglio gestite utilizzando una pipetta a spostamento positivo (vedere Tabella dei materiali). Se una pipetta a spostamento positivo non è disponibile, le soluzioni viscose possono anche essere eliminate con una micropipetta standard mediante il pipettaggio lento utilizzando punte a orifizio largo.

2. Illuminazione e fotocrosslinking di idrogel tramite un array di LED

ATTENZIONE: Indossare occhiali protettivi UV e coprire il campo di illuminazione con materiale che assorbe i raggi UV.

NOTA: l'array di LED descritto in questo protocollo è costituito da sei set di otto LED disposti in serie, come illustrato dallo schema elettrico fornito (Figura 1A). Ogni set di LED può essere alimentato in modo indipendente, il che consente fino a sei diversi irraggiamenti per corsa. Il file 1 supplementare contiene schermate corrispondenti alle seguenti istruzioni per ulteriori indicazioni.

  1. Scaricare il file Illumination Device.zip dai file di codifica supplementari. Questa directory contiene i seguenti file: Arduino.zip (Supplementary Coding File 1), Drivers.zip (Supplementary Coding File 2), GUI.zip (Supplementary Coding File 3) e Holder.zip (Supplementary Coding File 4).
    NOTA: stampa 3D delle parti superiore e inferiore per tenere in posizione il circuito stampato (vedere File di codifica supplementari per i dettagli).
  2. Scaricare e installare il software del microcontrollore (vedere Tabella dei materiali).
  3. Scaricare e installare il software GUI (vedere Tabella dei materiali). Fare riferimento al file supplementare 1 per le istruzioni per l'uso del software.
  4. Apri Elaborazione e installa la libreria controlIP5 facendo clic su Sketch > Importa libreria > Aggiungi libreria. Quindi, cerca controlIP5 nelle librerie e fai clic su Installa. Eseguilo per la prima volta.
  5. Alimentare il dispositivo di illuminazione (vedere Tabella dei materiali) utilizzando l'alimentatore da 36 Volt e collegarlo a un PC tramite un cavo micro-USB.
    NOTA: alcuni dispositivi non installeranno automaticamente i driver per varie schede nano Arduino. Un set di driver è fornito nel file zip del dispositivo.
  6. Aprire il file Arduino.ino, che si trova nella cartella Adruino.zip, utilizzando Arduino IDE.
  7. Compila il file Arduino.ino cliccando sul pulsante Segno di spunta . Carica il codice compilato facendo clic sul pulsante Freccia .
  8. Aprire il file GUI.pde, che si trova nella cartella GUI.zip, utilizzando Elaborazione.
  9. Fare clic su Esegui nel programma di elaborazione per avviare l'interfaccia utente grafica per il controllo del dispositivo di illuminazione.
  10. Nella finestra dell'interfaccia utente grafica, fare clic su Intensità per la colonna contenente la soluzione precursore dell'idrogel da reticolare e inserire l'intensità desiderata. Fare clic sulla casella Ora e inserire l'ora desiderata. Per la soluzione fornita nella tabella 2, questo sarà 15 s.
    NOTA: gli utenti finali devono calibrare i valori di intensità digitale in base all'irradianza utilizzando un radiometro. Esempi di intensità tipiche sono forniti nella Figura 2A.
  11. Allineare i campioni con il dispositivo di illuminazione (Figura 2B) con ogni altro LED in una singola colonna degli stampi in silicone (vedere Tabella dei materiali) o piastra a 384 pozzetti. Fare clic su Fine per iniziare l'illuminazione. Ripetere questo processo se necessario per l'illuminazione di più diapositive o altri pozzetti di una piastra a 384 pozzetti.
    NOTA: il supporto è progettato in modo tale che la piastra a 384 pozzetti si trovi a filo con un angolo della camera interna durante l'illuminazione.
    1. Dopo l'illuminazione, quando viene posizionato in un angolo, spostare la piastra del pozzo nell'angolo successivo e ripetere. Per illuminare i pozzetti sull'altra metà della piastra, sollevare la piastra dal supporto e ruotare di 180°.
  12. Generare idrogel con meccanica variabile per la caratterizzazione meccanica seguendo i passaggi seguenti.
    1. Pulire le diapositive di vetro e gli stampi in silicone usando del nastro adesivo per rimuovere i detriti. Aderire gli stampi in silicone alla slitta di vetro, premere verso il basso per garantire una buona tenuta e spostare eventuali bolle d'aria.
    2. Pipettare 80 μL di soluzione precursore di idrogel, come preparato nella fase 1.4, in ogni stampo in silicone sul vetrino.
    3. Posizionare la slitta di vetro sul dispositivo di illuminazione allineato con ogni altro LED in una singola colonna. Esporre i precursori dell'idrogel alla luce UV per 15 s, come descritto nel passaggio 2, al photocrosslink.
    4. Una volta che l'illuminazione si è fermata, recuperare i vetrini e allentare i gel dagli stampi tracciando la circonferenza interna dello stampo con una punta fine (punta della pipetta da 10 μL, ago da 30 G, ecc.). Rimuovere gli stampi in silicone con pinzette / pinze.
    5. Spostare idrogel reticolati in singoli pozzetti di una piastra a 12 pozzetti bagnando una spatola e spingendoli delicatamente fuori dal vetrino. Riempire ogni pozzetto con 2 ml di DPBS (vedi Tabella dei materiali) prima di aggiungere l'idrogel. Gonfiare i gel in soluzione dpbs per almeno 12 ore (in genere durante la notte) a temperatura ambiente (per la caratterizzazione meccanica del giorno successivo).

3. Misure di microscopia a forza atomica (AFM)

  1. Accendere il microscopio a forza atomica (AFM) secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). Questo protocollo fornisce brevi istruzioni per l'utilizzo dello strumento e del relativo software.
  2. Installare la sonda AFM (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: Per il presente studio, un cantilever triangolare in nitruro di silicio con una costante nominale della molla di 0,01 N/m è stato modificato con una particella sferica di biossido di silicio da 2,5 μm.
  3. Dopo l'installazione, allineare il laser all'apice della sonda triangolare, quindi regolare la deflessione dello specchio e del laser per massimizzare la somma del segnale (in genere tra 1,5-2,2 Volt).
  4. Immergere la sonda in DPBS e attendere fino a 15 minuti per ottenere l'equilibrio termico. Fare clic sul pulsante Calibrazione e selezionare Calibrazione dipendente dal contatto. Fare clic sul pulsante Raccogli sintonizzazione termica e, dopo la raccolta dei dati, selezionare il picco intorno ai 3 kHz per la calibrazione.
    NOTA: una leggera regolazione dello specchio e dei deflettori laser può essere necessaria dopo l'immersione in un liquido a causa di variazioni dell'indice di rifrazione.
  5. Avvicinati alla superficie di una capsula di Petri (plastica) impostando i parametri di approccio su Velocità costante, un'altezza target di 7,5 μm e una velocità di avvicinamento di 15 μm/s. Abilitare la misurazione di base per run for approach in modo che l'approccio venga eseguito continuamente e non si fermi presto a causa della deriva nel deflettore.
  6. All'avvicinamento, impostare i parametri di acquisizione per la mappatura della forza su turnaround di 4 nN, distanza di rientro di 2 μm, velocità di 1 μm/s e tempo di contatto di 0 s. Premere il pulsante Start per iniziare a raccogliere una curva di forza sulla superficie di plastica (ad esempio, una piastra del pozzo).
  7. Tornate alla finestra di calibrazione e selezionate la porzione della curva di forza corrispondente al contatto e alla rientranza della plastica. Accettate i valori di sensibilità e rigidità calcolati affinché la sonda completi la calibrazione.
  8. Dopo la calibrazione, sollevare la sonda AFM e posizionare il campione di idrogel per l'interrogazione. Avvicinarsi all'idrogel seguendo le impostazioni fornite nel passaggio 5.
    NOTA: durante la procedura di avvicinamento verso la superficie dell'idrogel, l'unità potrebbe erroneamente attivare lo stato avvicinato. Per verificare l'approccio effettivo, ottenere una curva di forza come nel passaggio 4.6. Ripetete la procedura di avvicinamento se la curva risultante non mostra il contatto e il rientro risultante.
  9. Quando l'approccio superficiale ha esito positivo, passare alla modalità Force Mapping e impostare i parametri di acquisizione su una mappa di dimensioni 8 x 8 con una lunghezza di 40 μm per asse. Ottenere mappe di forza in varie regioni per valutare l'uniformità delle misurazioni di rigidità.
    1. Interpretare le curve di forza utilizzando il programma software JPK SPM Data Processing attraverso un adattamento del modello Hertz/Sneddon (equazioni 1 e 2, vedere tabella 3 per la definizione di tutte le variabili) con la geometria sferica selezionata 32,33,3 4.
      Equation 1Equazione 132
      Equation 2Equazione 232

4. Impostazione e trattamento farmacologico di colture 3D, matrix-embedded

  1. Preparare le cellule desiderate come soluzione a cella singola.
    NOTA: diversi tipi di celle possono richiedere metodi di passaggio diversi. Un protocollo tipico per il passaggio di una coltura in sospensione di sferoidi GBM da un pallone T-75 è riportato nel riferimento31.
  2. Raccogliere sferoidi GBM (circa 150 μm di diametro) da una coltura di sospensione del pallone T-75 in un tubo conico da 15 ml. Risciacquare il matraccio di coltura con 5 ml di DPBS per rimuovere eventuali cellule e mezzi residui e aggiungere questo volume al tubo conico.
  3. Centrifugare il tubo conico contenente le celle a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica da 5 ml, facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare, e risospendere in 5 ml di DPBS.
  4. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per lavare le celle. Aspirare il surnatante con una pipetta sierologica da 5 ml, avendo cura di non disturbare il pellet cellulare, e quindi risospese le cellule in 2 mL di reagente di dissociazione cellulare (vedi Tabella dei materiali).
  5. Incubare a temperatura ambiente per 10-15 min. Aggiungere 3 ml di mezzo completo (vedere Tabella dei materiali) e pipettare delicatamente 3-5 volte per abbattere gli sferoidi in una sospensione a cella singola31.
  6. Centrifugare la sospensione monocellulare a 400 x g (le sospensioni monocellulari possono essere filate più velocemente per la formazione di pellet) per 5 minuti in celle a pellet a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante con una pipetta sierologica da 5 ml, avendo cura di non disturbare il pellet cellulare. Sostituire le cellule in 1 mL di terreno completo.
    NOTA: Se le cellule rimangono in grumi, piuttosto che come singole cellule in sospensione, dopo il passaggio, le cellule possono essere fatte passare attraverso un filtro cellulare da 40 μm per ottenere una sospensione a singola cellula.
  7. Rimuovere una parte delle cellule per il conteggio utilizzando un emocitometro. Diluire questa porzione due volte con tripano blu, che permea le cellule con vitalità compromessa. Conta solo le cellule vive e incolori. Tipicamente, un T-75 seminato a 800.000 cellule per pallone produce 2-3 milioni di cellule dopo una settimana in coltura.
  8. Determinare il numero di celle necessarie per l'incapsulamento. Trasferire un volume di fluido contenente il numero totale di cellule necessarie in un tubo microcentrifuga sterile da 1,7 mL. Girare verso il basso a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Ad esempio, è necessario un minimo di 2,5 milioni di cellule risospese in 1 mL di volume di gel per incapsulare le cellule a 2,5 milioni di cellule / mL. Un volume di gel di 1 mL consente agli utenti di erogare 100 gocce di gel, dove ogni goccia di gel è di 10 μL di volume. Si consiglia di preparare un volume extra di circa il 20% di celle sospese in soluzione di idrogel per tenere conto della perdita durante il trasferimento della pipetta. Quindi, si preparerebbero 3 milioni di cellule e 1,2 ml di soluzione precursore dell'idrogel in questo esempio. Si raccomanda una densità minima di 500 mila celle/ml.
  9. Aspirare il surnatante con una micropipetta, avendo cura di non disturbare il pellet cellulare. Risospesso il pellet di cella nella soluzione precursore dell'idrogel, come preparato nella fase 1.4, mescolando bene pipettando su e giù con una micropipetta da 1.000 μL 4-5 volte.
  10. Caricare le celle in un pipettor ripetuto (vedere Tabella dei materiali) impostato per erogare 10 μL. Per evitare bolle e erogazione irregolare, innescare il pipettor ripetuto erogando altre 1-2 volte in un contenitore per rifiuti.
  11. In ogni pozzetto di una piastra da 384 pozzetti, erogare 10 μL di cellule sospese in soluzione di idrogel dal pipettor ripetuto. Utilizzando l'array di LED, illuminare ogni pozzo contenente celle (fase 2) per 15 s con intensità (esempio risultati in Figura 2A intensità utilizzate di 1,14, 1,55, 2,15, 2,74 mW / cm2) per ottenere le proprietà meccaniche desiderate.
    NOTA: si consiglia di iniziare con cinque repliche per condizione sperimentale e scalare verso l'alto o verso il basso a seconda del throughput desiderato e della varianza del test dell'endpoint.
  12. Aggiungere 40 μL di media completi a ciascun pozzo contenente le cellule. Aggiungere 50 μL di DPBS a pozzi asciutti non sperimentali che circondano i gel per ridurre al minimo le perdite dovute all'evaporazione.
  13. Per le cellule GBM, aggiungere 40 μL del farmaco contenente fluidi (ad esempio, TMZ, vedere Tabella dei materiali) per ottenere la concentrazione finale desiderata (10 μM-100 μM in dimetilsolfossido (DMSO) o veicolo (DMSO), di conseguenza, a partire da 3 giorni dopo l'incapsulamento.

5. Saggio di proliferazione CCK8

  1. Aggiungere 10 μL di reagente CCK8 (vedi Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto contenente le cellule.
    NOTA: se si esegue questo test per la prima volta, includere pozzetti di controllo negativi come solo media o idrogel privo di cellule nei media.
  2. Incubare per 1-4 ore secondo le istruzioni del produttore.
    NOTA: Questo tempo può variare in funzione del tipo di cellula e della densità, e quindi i tempi di incubazione devono essere testati per ogni applicazione in modo che i valori di assorbanza rientrino in un intervallo lineare, un requisito per l'applicazione della legge35 di Beer.
  3. Leggere le assorbanze a 450 nm per tutti i pozzetti successivi all'incubazione.
  4. Calcolare l'assorbanza media a 450 nm ottenuta nella fase 3 per le condizioni del veicolo per ciascun gruppo. Dividere bene ogni farmaco trattato per la media del controllo del veicolo per gruppo.
  5. Calcola gli intervalli di confidenza generando distribuzioni bootstrap (N = 10.000) attraverso il metodo percentile36.
    NOTA: Generalmente, si possono utilizzare intervalli di confidenza del 95% e interpretare le condizioni i cui intervalli di confidenza non attraversano 1 per essere significative e giustificare ulteriori indagini. L'impostazione degli intervalli di confidenza al 95% è congruente con l'impostazione di un limite di significatività di p = 0,05. Per i dati mostrati nei risultati, c'è utilità nel distinguere le condizioni che promuovono o inibiscono la resistenza ai farmaci mediata dalla matrice, richiedendo un'analisi a due lati.

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Representative Results

Le misurazioni AFM hanno confermato il controllo preciso della meccanica dell'idrogel in funzione dell'irraggiamento UV (mW/cm2) durante la fotorelazione utilizzando un array di LED personalizzato e controllato da Arduino (Figura 2A). La formulazione in idrogel utilizzata in questo protocollo può essere trovata nella Tabella 2. La spaziatura dei LED sul modello fornito corrisponde alla spaziatura per ogni altro pozzo di una piastra a 384 pozzetti, consentendo la formazione di gel all'interno della piastra (Figura 2B). L'interrogazione AFM delle regioni su scala micron sulle superfici di singoli idrogel ha mostrato che gli idrogel con moduli di Young medi più morbidi avevano anche intervalli di moduli più piccoli rispetto agli idrogel più rigidi (Figura 2C-E).

Le densità di semina cellulare che massimizzano la vitalità dovrebbero essere determinate empiricamente per ciascun tipo di cellula. Questo studio dimostra che le colture 3D di cellule GS122 seminate a densità di 2.500.000 cellule / mL hanno mostrato viabilità sostanzialmente più elevate se valutate dopo 7 giorni in coltura rispetto a quelle seminate a densità di 500.000 cellule / mL (Figura 3A). Inoltre, le cellule GS122 e GS304 sono state utilizzate come modelli per la coltura di cellule GBM derivate dal paziente per studiare la dipendenza della risposta chemioterapica dalla rigidità e dalla composizione biochimica del microambiente della matrice (Figura 3B-D). La vitalità cellulare è stata valutata attraverso il test CCK8 dopo il trattamento con TMZ per 4 giorni, portando a un tempo di coltura totale di 7 giorni scalando la misurazione OD450 da un corrispondente controllo del veicolo e generando intervalli di confidenza del 95% mediante bootstrap (N = 10.000) con il metodo percentile36. Con queste distribuzioni, le condizioni in cui gli intervalli di confidenza non si sovrapponevano a un valore di 1 (linea tratteggiata) sono state considerate significative. Rispetto ai metodi statistici più comunemente usati come t-test o ANOVA, la stima degli intervalli di confidenza, utilizzando il bootstrap per stimare le distribuzioni che sarebbero presenti per campioni di dimensioni maggiori, è preferita per i saggi di screening il cui obiettivo è identificare un sottoinsieme più piccolo di condizioni per ulteriori indagini. Un ulteriore vantaggio di questo metodo è che le condizioni con uno spread più piccolo in un intervallo di confidenza possono essere prioritarie rispetto ad altre condizioni con un valore medio simile ma uno spread più elevato nell'intervallo di confidenza. Questo studio ha indicato che le cellule GS122 hanno ottenuto benefici di sopravvivenza dalle interazioni microambientali (Figura 3B). Questo beneficio di sopravvivenza è stato significativo nelle condizioni di 0,8, 1 e 4 kPa, ma non nella condizione di 8 kPa per le cellule GS122. Le cellule GS304 erano insensibili sia alla rigidità che al trattamento con TMZ.

L'effetto della composizione biochimica del microambiente della matrice è stato quindi esaminato variando l'inclusione di peptidi derivati dall'integrina derivati da ECM (Tabella 1) noti per essere sovraregolati nel microambiente tumorale GBM a due rigidità, 0,8 kPa e 8 kPa. Ancora una volta, le cellule GS304 non hanno ricevuto alcun beneficio significativo in termini di sopravvivenza dall'inclusione della matrice e sono state insensibili a TMZ. Tuttavia, le cellule GS122 hanno mostrato guadagni di sopravvivenza nella condizione di 8 kPa quando i peptidi derivati dall'osteopontina sono stati inclusi nella matrice, mentre l'incorporazione di peptidi derivati dalla sialoproteina legante l'integrina (IBSP) o dalla tenascina-C ha fornito benefici minimi di sopravvivenza, come la coltura in matrici con il peptide RGD generale (Figura 3C). Al contrario, nessun peptide ha conferito guadagni di sopravvivenza nella condizione di coltura di 0,8 kPa (Figura 3D). Insieme, i risultati suggeriscono differenze intrinseche sia nella matrice che nelle risposte ai farmaci tra le due linee cellulari derivate dal paziente valutate.

Le colture di idrogel 3D possono essere visualizzate utilizzando la microscopia ottica standard per valutare in che modo la morfologia cellulare e i comportamenti invasivi sono influenzati dalle condizioni di coltura in modo dipendente dalla linea cellulare (Figura 4). Entrambe le cellule GS122 e GS304 si diffondono quando coltivate in matrici di idrogel morbide o rigide, compresi i peptidi contenenti RGD (Figura 4A). Mentre i peptidi influenzavano la diffusione cellulare, la capacità di una cellula di diffondersi non prevedeva necessariamente la capacità della coltura di acquisire resistenza TMZ. Ad esempio, le cellule GS122 mostrano una simile mancanza di diffusione sia in 0,8 che in 8 kPa con osteopontina; tuttavia, GS122 ha mostrato una maggiore resistenza a TMZ solo nella condizione di 8 kPa (Figura 4B). Infine, questa piattaforma di coltura 3D miniaturizzata può essere utilizzata per coltivare cellule umane di altri tipi di tumore, inclusi organoidi vitali di cellule tumorali della prostata neuroendocrine differenziate terminalmente (Figura 4C).

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione animata del protocollo. (A) Rappresentazione animata del processo per la generazione e il monitoraggio della cultura 3D. (1) Vengono preparate soluzioni di idrogel a base di HA. (2) Le soluzioni di idrogel vengono quindi reticolate con intensità variabile attraverso LED controllati da un microcontrollore Arduino. (3) La meccanica dell'idrogel risultante viene valutata da AFM per verificare la differenza nella meccanica del gel. (4) Le soluzioni corrispondenti alla formulazione della fase 1 vengono quindi utilizzate per incapsulare le cellule GBM derivate dal paziente e trattate con il farmaco. (5) Dopo 7 giorni, la vitalità cellulare viene letta tramite il test colorimetrico CCK8. (B) Schema elettrico per l'array di illuminazione a LED personalizzato utilizzato in questo protocollo. I singoli componenti sono elencati nella Tabella dei materiali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Idrogel fabbricati con rigidità variabile utilizzando LED sintonizzabili per modificare l'irraggiamento. (A) I grafici di violino mostrano il modulo di Young calcolato dalle curve di forza generate da AFM su tre regioni superficiali, che coprono 40 μm x 40 μm, di singoli idrogel. Il modulo di Young di ogni idrogel è mostrato in funzione dell'irradianza UV durante il fotocrosslinking. Le linee bianche orizzontali indicano la mediana per ciascun gruppo sperimentale. (B) Array di LED con spaziatura corrispondente al passo delle piastre multi-pozzo (384 pozzetti). (C) Mappa termica che mostra la variazione regionale del modulo di Young (media = 0,8 kPa) per un tipico gel reticolato dall'esposizione a 1,55 mW/cm2 per 15 s. (D) Mappa termica che mostra la variazione regionale del modulo di Young (media = 8 kPa) per un tipico gel reticolato all'esposizione a 2,74 mW/cm2 per 15 s. (E) Istogramma che illustra la gamma di misurazioni del modulo di Young sulla superficie degli idrogel mostrati in C e D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: La presentazione ortogonale della rigidità e del peptide legante l'integrina rivela differenze biologiche intrinseche tra le linee cellulari GBM. (A) Valori di assorbanza tipici per le cellule GS122 incapsulate in un idrogel da 10 μL ad una densità di 500.000 o 2.500.00 cellule per mL. (B) I dati di risposta ai farmaci per le linee cellulari GS122 e GS304 sono visualizzati normalizzando il valore OD450 dei pozzi trattati con farmaci (N = 5) per la media dei pozzi trattati con il veicolo (N = 5). La vitalità nel contesto del trattamento farmacologico è stata osservata per variare non linearmente per la rigidità dell'idrogel, dimostrando variazioni tra le linee cellulari. (C,D) Dati di risposta al farmaco per le linee cellulari GS122 e GS304 quando è stato incluso il tipo di peptide legante l'integrina e la rigidità della matrice è stata variata ortogonalmente. Tutte le barre di errore rappresentano gli intervalli di confidenza del 95% ottenuti dal bootstrap di ogni condizione di N = 10.000. La linea tratteggiata (asse y = 1) corrisponde al caso in cui OD450 per le condizioni di trattamento sia uguale al veicolo. Tutti i valori sperimentali sono stati ottenuti dopo 7 giorni in coltura; TMZ è stato aggiunto 3 giorni dopo l'incapsulamento iniziale per gli studi farmacologici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Differenze morfologiche tra cellule incapsulate in diversi ambienti idrogel a base di HA. (A) Le immagini a contrasto di fase di GS122 e GS304, quando coltivate in idrogel (0,8 e 8 kPa), mostravano un motivo RGD. Le frecce bianche indicano le cellule con morfologie diffuse. (B) Le immagini di fase di GS122 e GS304, quando coltivate in idrogel (0,8 e 8 kPa), mostravano un peptide derivato dall'osteopontina. Le frecce bianche indicano le cellule con morfologie diffuse. Le frecce nere indicano le cellule con morfologie arrotondate. Dopo 7 giorni in cultura, sono state scattate immagini e TMZ è stato aggiunto 3 giorni dopo l'incapsulamento iniziale. (C) Immagine di fase di un organoide neuroendocrino prostatico terminalmente differenziato. Barre di scala = 200 μm (per A,B); 100 μm (per C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Proteina Sequenza peptidica
RGD · GCGYGRGDSPG
Tenascina-C GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIRGV
Sialoproteina legante l'integrina (IBSP) GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Osteopontina GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG

Tabella 1: Proteine ECM e sequenze peptidiche derivate.

Reagente Concentrazione iniziale Volume (μL) Concentrazione finale
Soluzione HA-SH 10 mg/ml 2300 5 mg/ml
PEG-SH 100 mg/ml 503 Varia in base all'esperimento
PEG-Norbornene 100 mg/ml 443 Varia in base all'esperimento
Peptide 4 μM 288 0,250 μM
Giro 4 mg/ml 288 0,25 mg/ml
HEPES-HBSS N/D 798

Tabella 2: Componenti tipici della formulazione finale per idrogel.

Variabile Parametro
F Forza
E Modulo di Young
ν Rapporto di Poissons
δ Rientro (posizione della punta verticale)
un Raggio del cerchio di contatto
RS · Raggio della sfera

Tabella 3: Variabili e parametri corrispondenti per i calcoli AFM.

File 1 supplementare: Guida all'uso del LED Array per l'illuminazione e il fotocrosslinking di idrogel. Fare clic qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare 1: file Arduino per microcontroller array LED (Arduino.zip). Fare clic qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare 2: driver di terze parti per Arduino nano (driver.zip). Fare clic qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare 3: file di elaborazione per il controllo GUI del microcontroller array LED (GUI.zip). Fare clic qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare 4: File per la stampa 3D supporto esterno per microcontrollore array LED (holder.zip). Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Il lavoro attuale presenta metodi per generare colture miniaturizzate 3D all'interno di HA, alterando contemporaneamente la rigidità della matrice e i peptidi disponibili per l'impegno dell'integrina. Questa tecnica consente lo studio sistematico di come i parametri della matrice influenzano i fenotipi cellulari (ad esempio, la vitalità delle cellule tumorali esposte alla chemioterapia) con una maggiore produttività. Gli approcci precedenti, incluso quello qui presentato, hanno regolato la rigidità dell'idrogel variando la percentuale di polimero totale nella formulazione finale, dove gli idrogel più rigidi hanno un contenuto di polimero più elevato21,31. Tuttavia, questo approccio richiede la preparazione di una formulazione di idrogel unica per ogni rigidità desiderata, un processo che riduce intrinsecamente la produttività. Qui, la rigidità dell'idrogel viene regolata variando l'irradianza UV durante la reticolazione in modo che idrogel di rigidità multiple possano essere ottenuti da una singola soluzione precursore. I futuri professionisti che potrebbero non avere l'opportunità di costruire l'illuminatore personalizzato qui descritto possono facilmente sostituire un dispositivo di polimerizzazione spot UV disponibile in commercio e regolare l'illuminazione man mano che vengono polimerizzati diversi settori di una piastra di pozzo. Lo svantaggio dell'utilizzo di un dispositivo commerciale di spot-curing è la diminuzione della produttività rispetto all'illuminatore personalizzato. Una limitazione dei metodi attuali è che devono ancora essere preparate soluzioni uniche per ogni condizione peptidica. Metodi simili sono stati utilizzati in precedenza da altri gruppi per produrre idrogel contenenti rigidità-gradiente37,38. Tuttavia, questo studio dimostra come il photocrosslinking possa consentire la miniaturizzazione di campioni sperimentali e ridurre la complessità delle configurazioni sperimentali. Nel complesso, questi miglioramenti consentiranno ai ricercatori di aumentare la produttività sperimentale durante la conduzione di colture 3D in biomateriali matrici-mimetici e hanno utilità in diversi campi della scienza biomedica oltre la neuro-oncologia.

I risultati rappresentativi dimostrano come questa tecnica possa essere utilizzata per impostare colture miniaturizzate e 3D di cellule GBM derivate dal paziente in matrici definite, in cui i peptidi e le rigidità disponibili che legano l'integrina sono variati, all'interno di una piastra standard a 384 pozzetti appropriata per diversi saggi standard. Questo metodo presenta risultati rappresentativi per esaminare come i parametri della matrice influenzano le risposte alla chemioterapia TMZ in cellule GBM derivate da due pazienti unici, indicati come cellule GS122 e GS304. Delle due linee cellulari derivate dal paziente qui valutate, la risposta delle cellule GS122 al trattamento con TMZ era sensibile al microambiente della matrice, mentre quella delle cellule GS304 era insensibile. Per quanto riguarda la rigidità della matrice, le cellule GS122 coltivate in idrogel 3D con un modulo microcompressivo da 4 kPa hanno massimizzato la resistenza a TMZ, in base alla quale le cellule trattate sono aumentate di numero più delle cellule non trattate in un corso sperimentale di 7 giorni. Le proprietà meccaniche hanno avuto effetti maggiori sulla resistenza a TMZ rispetto ai peptidi leganti l'integrina inclusi. Pertanto, si prevede che l'impatto delle diverse concentrazioni di peptidi, da solo e in combinazione, consentirà la scoperta di condizioni della matrice che promuovono la resistenza ai farmaci in futuro. L'insensibilità delle cellule GS304 alla loro matrice circostante può indicare che la matrice è più influente sulle cellule, come le cellule GS122, che sono originariamente sensibili a TMZ ma acquisiscono resistenza durante il trattamento. Al contrario, la misura in cui i segnali della matrice influenzano le cellule che sono già resistenti al trattamento all'inizio dell'esperimento non è chiara, come con le cellule GS304.

I risultati di questo studio si sono in qualche modo discostati dai risultati precedentemente riportati. Gli idrogel a base di HA più morbidi valutati (il modulo di Young di 1 kPa alla rinfusa, che imita la rigidità del cervello nativo) hanno promosso la massima resistenza TMZ alle cellule GBM derivate da quattro tumori di pazienti diversi da quelli valutati qui21. Ci sono diverse possibili ragioni per questa discrepanza. In primo luogo, una gamma ampliata di rigidità dell'idrogel è stata interrogata nel presente studio, che ha confrontato gli idrogel in un intervallo da 0,8 kPa a 8 kPa moduli microcompressivi, mentre studi precedenti hanno confrontato solo idrogel con moduli di Young da 1 kPa e 2 kPa. Inoltre, negli studi precedenti, la caratterizzazione meccanica è stata effettuata su scala bulk utilizzando la compressione meccanica lineare per stimare il modulo di Young, mentre, in questo studio, l'AFM è stato utilizzato per misurare un modulo microcompressivo. Per i ricercatori che cercano di implementare i metodi qui presenti che non richiedono misurazioni meccaniche su microscala, i moduli su scala di massa, utilizzando la reometria o i test meccanici lineari, sono sostituti perfettamente accettabili per l'AFM. In particolare, le analisi micromeccaniche hanno rivelato i moduli eterogenei sulla superficie di un singolo gel. Non sono state effettuate misurazioni AFM comparabili sugli idrogel formulati in studi precedenti, ma si prevede che la varianza delle rigidità presentate all'interno di un singolo idrogel sia stata maggiore di quelle dello studio in corso. Gli idrogel negli studi precedenti sono stati generati utilizzando una reticolazione di addizione di tipo Michael che si basa sulla miscelazione cinetica a 37 gradi C 10,21,24. Al contrario, il fotocrosslinking consente un'accurata miscelazione dei precursori dell'idrogel prima dell'esposizione alla luce, il che migliora l'omogeneità all'interno dell'idrogel 3D e, a sua volta, riduce la variabilità delle risposte cellulari. Infine, i tumori GBM mostrano un comportamento notoriamente eterogeneo e imprevedibile39 e, quindi, è ragionevole aspettarsi che le cellule derivate da singoli tumori abbiano anche proprietà uniche. Questa mancanza di coerenza tra i campioni dei pazienti motiva la necessità di una piattaforma ad alto rendimento per chiarire le caratteristiche tumorali specifiche del paziente.

Le insidie comuni durante l'esecuzione della procedura miniaturizzata di fotocollegamento dell'idrogel includono la miscelazione incompleta dei precursori dell'idrogel, con conseguente scarsa riproducibilità e la gelificazione spontanea della soluzione di HA durante la miscelazione. Questi problemi possono essere mitigati mescolando l'HA-tiolo per un minimo di 45 minuti e la soluzione precursore completa per almeno altri 30 minuti, monitorando attentamente il pH delle soluzioni precursori dell'idrogel per garantire che rimanga inferiore a 7 per prevenire l'ossidazione del tiolo e la formazione di disolfuro a reticoli. A differenza dei metodi di reticolazione che utilizzano un meccanismo di addizione cinetica di tipo Michael10,21, il metodo di fotocollegamento utilizzato in questo protocollo riduce la probabilità di gelificazione spontanea quando tutti i reagenti sono combinati21. I punti di controllo qualità sono altamente raccomandati, come la misurazione della percentuale di tiolazione HA31 e la produzione di idrogel extra per test meccanici paralleli a ciascun lotto di colture 3D. Infine, le densità di semina per l'incapsulamento 3D in idrogel devono essere identificate per ogni tipo di cellula o linea utilizzata. In generale, i risultati mostrano che una concentrazione minima di 1 milione di cellule / mL è sufficiente per la coltura 3D della maggior parte delle cellule, che formano sferoidi, comprese le cellule GBM derivate dal paziente, le cellule staminali embrionali umane (H9) e le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (dati non mostrati). Si raccomanda anche l'inclusione del trattamento con inibitori ROCK prima dell'incapsulamento (fase 4.1) quando si utilizzano cellule particolarmente sensibili40.

Nel contesto dello sviluppo di nuovi approcci terapeutici per GBM, il protocollo qui presentato fornisce metodi per lo screening funzionale delle risposte farmacologiche delle cellule GBM derivate dal paziente all'interno di un microambiente fisiologicamente rilevante. Un ricco archivio di dati genetici, epigenetici e clinici sull'espressione dell'mRNA per GBM (e altri tumori) è pubblicamente disponibile grazie agli sforzi di The Cancer Genome Atlas (TCGA) e altri15. Utilizzato in combinazione con questi grandi set di dati, si prevede che i dati generati da schermi funzionali di colture miniaturizzate e 3D possano rivelare nuove correlazioni, migliorando la previsione dei risultati clinici nei singoli pazienti. Ad esempio, possono essere identificate sottopopolazioni di tumori dei pazienti per i quali alcuni trattamenti, come composti che interrompono la matrice come il cilengitide, possono migliorare i risultati clinici41. Oltre alla risposta ai farmaci, questa piattaforma di coltura consente valutazioni dell'invasione delle cellule tumorali utilizzando imager ad alto contenuto compatibili con piastre ben compatibili. La flessibilità di questa piattaforma di incorporare molti peptidi diversi, da soli o in combinazione, mentre le rigidità ortogonali variabili possono aiutare a identificare le caratteristiche della matrice che guidano l'aggressività del tumore GBM.

Oltre al GBM, questi metodi possono essere adattati per studiare gli effetti dei parametri della matrice su altri tipi di cellule nel contesto di altre malattie, sviluppo dei tessuti e normale funzione tissutale. In futuro, sarà semplice aumentare ulteriormente la produttività di questi metodi, poiché sono stati specificamente progettati per essere eseguiti nel contesto di piastre multi-pozzo per facilitare l'adozione nei flussi di lavoro esistenti per la scoperta di farmaci utilizzando gestori di liquidi automatizzati disponibili in commercio e imager ad alto contenuto. La facile integrazione con l'infrastruttura esistente e una maggiore automazione, che riduce le competenze tecniche necessarie per produrre e mantenere colture di idrogel 3D cariche di cellule, ridurranno significativamente le barriere all'adozione di questo metodo. Mentre il lavoro qui presenta specificamente colture all'interno di idrogel a base di HA, si prevede che questo metodo possa essere facilmente tradotto in altri materiali fotocollegabili comunemente usati per la coltura cellulare 3D, come la gelatina metacrilata, e che i metodi riportati qui forniranno una linea guida utile per ulteriori applicazioni.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero ringraziare specificamente Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore e Itay Solomon per i loro contributi alle precedenti iterazioni dello schema di fotogelazione. Le linee cellulari GS122 e GS304 sono state generosamente fornite da David Nathanson. Tutte le figure sono state create con BioRender.com. Le strutture principali dell'UCLA, le risorse condivise di screening molecolare e il laboratorio di caratterizzazione nano e pico sono stati fondamentali per il lavoro. Chen Chia-Chun è stato supportato dall'UCLA Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program. Grigor Varuzhanyan è stato supportato da un tumor cell biology training program NIH Grant (T32 CA 009056).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.1 kOhm resistors, 6 W Digikey 35601k1ft
1.7 mL microcentrifuge tube Genesse Scientific 21-108
15 mL conical tube Fisher Scientific 14-959-70C
365 nm LED Digikey ltpl-c034uvh365
384 well plate Bio Greiner One 781090
40 µm cell strainer MTC bio C4040
4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) Laysan Bio 4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTs Digikey 2n5550ta
80 Ohm resistors, 0.125 W Digikey erjj-6enf80r6v
8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) Jenkem Technology A7025-1
Accutase Innovative Cell Technologies AT104500  cell dissociation  reagent
AFM Probes Novascan 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle
Arduino IDE Arduino 1.8.19
Arduino Nano Makerfire Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board
bFGF Peprotech 100-18B 20 ng/mL
CCK8 Abcam ab228554
Centrifuge Thermoscientific sorvall legend xtr
CP100ST Gilson F148415 Pipette tips for positive displacement pipette
Cubis Semi-Micro Balance Sartorius MSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50) Life Technologies 11330057 1x
DMSO Fisher Scientific BP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-) Genesse Scientific 25-508
EGF Peprotech AF100-15 50 ng/mL
Ethanol, Anhydrous Fisher Scientific A405P Add DI water to dilute to 70%
Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials Fisher Scientific 03-339-23C
Fisherbrand Weighing Paper Fisher Scientific 09-898-12B
G21 Supplement Gemini Bio 400-160 50x
Hanks Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific 14175095
HCl, ACS, 12M Sigma Aldrich S25838A Add DI water to dilute to 1 M
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma Aldrich H3149-100Ku 25 µg/mL
HEPES Sigma Aldrich H7006-100G
Hot Air Gun Wagner HT1000
Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide Genscript Custom Order GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% Sigma Aldrich 900889-1G
Magnetic stir plate Thermo Scientific SP194715
Microcentrifuge Thermo Scientific Sorvall legend micro 21R
Microman E single Channel Pipettor Gilson FD10004 Positive displacement pipette
Micropipette Tips Various Manufacturs Various sizes
mLine micropipette Sartorious
N-acetyl Cysteine Sigma Aldrich A7250-10G
Nanowizard 4 Bruker AFM microscope
NaOH Fisher Scientific ss255-1 Add DI water to dilute to 1 M
Normoicin Invivogen ant-nr-1 500x
Osteopontin Peptide Genscript Custom Order GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet Aid Drummond 4000102
Plain Microscope Slides Globe Scientific 1301
Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep Grace Bio Labs 664201-A Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet
Processing Processing 3.5.4
Repeater M4 Eppendorf 4982000322
Repeater Pipette Tips Sartorious 30089430 1 mL sizes
RGD Peptide Genscript GCGYGRGDSPG
Scoth Tape
Serological Pipettes Genesse Scientific 12-102,12-104 5,10 mL Pipettes
Solder Paste Digikey 315-NC191LT15T5-ND
Solder Wire
Straight dissecting forceps VWR Scientific 82027-408
Synergy H1 Plate Reader Biotek
T-75 Cell Culture Treated Flask Genesee Scientific 25-209
Temozolomide Sigma Aldrich T2577 Typically used from 10 µM to 100 µM
Tenascin-C Peptide Genscript GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR
GV
Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified Lifecore Biomedical HA700K5
VWR Spinbar, Flea Micro VWR 58948-375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioingegneria Numero 184
Gli array di idrogel consentono una maggiore produttività per gli effetti di screening dei componenti della matrice e delle terapie nei modelli tumorali 3D
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Liang, J., Sohrabi, A., Epperson,… More

Liang, J., Sohrabi, A., Epperson, M., Rad, L. M., Tamura, K., Sathialingam, M., Skandakumar, T., Lue, P., Huang, J., Popoli, J., Yackly, A., Bick, M., Wang, Z. Z., Chen, C. C., Varuzhanyan, G., Damoiseaux, R., Seidlits, S. K. Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models. J. Vis. Exp. (184), e63791, doi:10.3791/63791 (2022).

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