Summary
Het huidige protocol beschrijft een experimenteel platform om de effecten van mechanische en biochemische signalen op chemotherapeutische reacties van patiënt-afgeleide glioblastoomcellen in 3D matrix-mimetische culturen te beoordelen met behulp van een op maat gemaakt UV-verlichtingsapparaat dat high-throughput photocrosslinking van hydrogels met instelbare mechanische kenmerken mogelijk maakt.
Abstract
Cel-matrix interacties bemiddelen complexe fysiologische processen door middel van biochemische, mechanische en geometrische signalen, die pathologische veranderingen en therapeutische reacties beïnvloeden. Rekening houden met matrixeffecten eerder in de pijplijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen zal naar verwachting de kans op klinisch succes van nieuwe therapieën vergroten. Er bestaan op biomateriaal gebaseerde strategieën die specifieke weefselmicro-omgevingen in 3D-celkweek samenvatten, maar het integreren van deze met de 2D-kweekmethoden die voornamelijk worden gebruikt voor geneesmiddelenscreening is een uitdaging geweest. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft dus de ontwikkeling van methoden voor 3D-cultuur binnen geminiaturiseerde biomateriaalmatrices in een multi-well plaatformaat om integratie met bestaande medicijnscreeningpijplijnen en conventionele testen voor cel levensvatbaarheid te vergemakkelijken. Aangezien de matrixkenmerken die van cruciaal belang zijn voor het behoud van klinisch relevante fenotypen in gekweekte cellen naar verwachting zeer weefsel- en ziektespecifiek zullen zijn, zal combinatorische screening van matrixparameters nodig zijn om geschikte omstandigheden voor specifieke toepassingen te identificeren. De hier beschreven methoden gebruiken een geminiaturiseerd cultuurformaat om kankercelresponsen op orthogonale variatie van matrixmechanica en ligandpresentatie te beoordelen. Specifiek toont deze studie het gebruik van dit platform om de effecten van matrixparameters op de reacties van van patiënten afgeleide glioblastoom (GBM) cellen op chemotherapie te onderzoeken.
Introduction
De verwachte kosten van de ontwikkeling van een nieuw medicijn zijn het afgelopen decennium gestaag gestegen, met meer dan $ 1 miljard in de huidige schattingen1. Een deel van deze kosten is het hoge faalpercentage van geneesmiddelen die klinische onderzoeken ingaan. Ongeveer 12% van de kandidaat-geneesmiddelen verdient uiteindelijk goedkeuring van de Amerikaanse Food & Drug Administration (FDA) in 2019. Veel geneesmiddelen falen in fase I vanwege onverwachte toxiciteit2, terwijl anderen die veiligheidsonderzoeken doorstaan, kunnen mislukken vanwege een gebrek aan werkzaamheid3. Dit verloop als gevolg van niet-werkzaamheid kan gedeeltelijk worden verklaard door het feit dat kankermodellen die tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen worden gebruikt, notoir niet-voorspellend zijn voor klinische werkzaamheid4.
Functionele verschillen tussen in vitro en in vivo modellen kunnen worden toegeschreven aan het verwijderen van kankercellen uit hun oorspronkelijke micro-omgeving, waaronder niet-tumorcellen en de fysieke ECM 5,6. Gewoonlijk gebruiken onderzoeksgroepen commercieel verkrijgbare kweekmatrices, zoals Matrigel (een eiwitachtige keldermembraanmatrix afgeleid van muizencomen) om gekweekte tumorcellen te voorzien van een 3D-matrixmicro-omgeving. Vergeleken met 2D-cultuur heeft 3D-cultuur in membraanmatrix de klinische relevantie van in vitro resultaten verbeterd 7,8. Kweekbiomaterialen uit gedecellulariseerde weefsels, inclusief de membraanmatrix, vertonen echter meestal batch-to-batch variabiliteit die de reproduceerbaarheid in gevaar kan brengen9. Bovendien bieden matrices afgeleid van tumoren met een andere weefseloorsprong dan de bestudeerde mogelijk niet de juiste fysiologische signalen10. Ten slotte hebben kankers met een hoge mate van intratumorale heterogeniteit micro-omgevingskenmerken die variëren op een submicron-schaal en waarvan de membraanmatrix niet kan worden afgestemd om11 samen te vatten.
Glioblastoom (GBM), een uniform dodelijke hersentumor met een mediane overlevingstijd van ongeveer 15 maanden, is een kanker waarvoor de ontwikkeling van de behandeling bijzonder moeilijk is geweest12,13. De huidige zorgstandaard voor GBM bestaat uit primaire tumorresectie, gevolgd door radiotherapie en vervolgens chemotherapie met temozolomide (TMZ)14. Toch vertoont meer dan de helft van de klinische GBM-tumoren behandelingsresistentie via verschillende mechanismen 15,16,17. Het voorspellen van de werkzaamheid van een behandelingsregime voor een individuele patiënt is uiterst moeilijk. Standaard preklinische modellen die worden gebruikt om individuele uitkomsten te voorspellen, bestaan uit van patiënten afgeleide tumorcellen die orthotopisch zijn getransplanteerd in immuungecompromitteerde muizen. Hoewel patiënt-afgeleide xenografts veel aspecten van klinische GBM-tumoren kunnen samenvatten en waardevol zijn voor preklinische modellen18, zijn ze inherent duur, lage doorvoer, tijdrovend en brengen ze ethische problemen met zich mee19. Culturen van patiënt-afgeleide cellen, op 2D-plastic oppervlakken of als sferoïden, vermijden deze problemen meestal. Terwijl van patiënten afgeleide cellen genetische afwijkingen behouden, zijn hun culturen in 2D of als gesuspendeerde sferoïden grotendeels slechte representaties van patiënt-afgeleide xenografts bij knaagdieren en originele patiënttumoren20. Eerder hebben wij, en anderen, aangetoond dat GBM-cellen gekweekt in een 3D ECM die de mechanische en biochemische eigenschappen van hersenweefsel nabootst, medicijnresistentiefenotypen 10,21,22,23 kunnen behouden.
Interacties tussen hyaluronzuur (HA), een polysaccharide die overvloedig aanwezig is in de hersenen ECM en overexpressie in GBM-tumoren, en zijn CD44-receptor moduleren de verwerving van geneesmiddelresistentie in vitro 21,24,25,26,27. De opname van HA in zachte, 3D-culturen verhoogde bijvoorbeeld het vermogen van van de patiënt afgeleide GBM-cellen om therapeutische resistentie te verwerven. Deze mechano-responsiviteit was afhankelijk van HA-binding aan CD44-receptoren op GBM-cellen21. Bovendien versterkte integrinebinding aan RGD-dragende peptiden, opgenomen in 3D-cultuurmatrices, CD44-gemedieerde chemoresistantie op een stijfheidsafhankelijke manier21. Naast HA varieert de expressie van verschillende ECM-eiwitten, waarvan er vele RGD-regio's bevatten, tussen normale hersenen en GBM-tumoren28. Een studie meldde bijvoorbeeld dat 28 verschillende ECM-eiwitten werden geupreguleerd in GBM-tumoren29. Binnen deze complexe tumormatrix micro-omgeving integreren kankercellen mechanische en biochemische signalen om een bepaald resistentiefenotype te produceren, dat afhankelijk is van relatief kleine verschillen (bijvoorbeeld minder dan een orde van grootte) in Young's modulus of dichtheid van integrinebindende peptiden 28,29,30.
Het huidige protocol karakteriseert hoe tumorcellen unieke combinaties van matrixsignalen interpreteren en complexe, patiëntspecifieke matrixmicro-omgevingen identificeren die behandelingsresistentie bevorderen (figuur 1A). Een fotochemische methode voor het genereren van geminiaturiseerde, nauwkeurig afgestemde matrices voor 3D-cultuur biedt een grote, orthogonale variabele ruimte. Een op maat gemaakte reeks LED's, gerund door een microcontroller, werd opgenomen in photocrosslink hydrogels binnen een 384-well plaatformaat om de automatisering en reproduceerbaarheid te vergroten. De intensiteit van de blootstelling varieerde goed om de micromechanische eigenschappen van de resulterende hydrogels te veranderen, zoals beoordeeld met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM). Hoewel dit manuscript zich niet richt op het construeren van de verlichtingsarray zelf, worden een schakelschema (figuur 1B) en een onderdelenlijst (tabel met materialen) verstrekt als hulpmiddelen voor de reproductie van apparaten.
Dit rapport toont de snelle generatie van een reeks GBM-cellen gekweekt in unieke, 3D-micro-omgevingen waarin Young's modulus (vier niveaus in een enkele orde van grootte) en integrine-bindende peptide-inhoud (afgeleid van vier verschillende ECM-eiwitten) orthogonaal werden gevarieerd. De aanpak werd vervolgens gebruikt om de relatieve bijdragen van hydrogelmechanica en ECM-specifieke integrine-betrokkenheid op de levensvatbaarheid en proliferatie van patiënt-afgeleide GBM-cellen te onderzoeken als ze resistentie verwerven tegen temozolomide (TMZ) chemotherapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Van patiënten afgeleide GBM-cellijnen (GS122 en GS304) werden geleverd door professor David Nathanson (onze medewerker), die deze lijnen ontwikkelde onder een protocol dat is goedgekeurd door de UCLA Institutional Review Board (IRB # 10-000655). Cellen werden gedeïdentificeerd verstrekt, zodat de cellijnen niet konden worden gekoppeld aan de individuele patiënten.
1. Bereiding van hydrogeloplossing
- Bereid HEPES-gebufferde oplossing door HEPES-poeder op 20 mM op te lossen in hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS). Stel de pH in op 7 na volledige solvatie.
- Los in de HEPES-gebufferde oplossing thiolische HA op (700 kDa nominaal molecuulgewicht, zie materiaaltabel), bereid volgens het vorige rapport31, zodat 6%-8% van de carbonzuurresiduen op elk glucuronzuur wordt gemodificeerd met een thiol, in een concentratie van 10 mg/ml in bufferoplossing.
OPMERKING: Een amberkleurige injectieflacon wordt aanbevolen om thioloxidatie door omgevingslicht te voorkomen.- Roer met behulp van een magnetische roerplaat (<1.000 tpm) bij kamertemperatuur totdat het volledig is opgelost, meestal ongeveer 45 minuten.
- Terwijl HA oplost, bereidt u afzonderlijke oplossingen van (1) 100 mg/ml 8-arm-PEG-Norborneen (20 kDa), (2) 100 mg/ml 4-arm-PEG-Thiol (20 kDa), (3) 4 mM cysteïne of cysteïnebevattend peptide (bijv. GCGYGRGDSPG) en (4) 4 mg/ml LAP in microcentrifugebuizen (zie Materiaaltabel).
- Bereid elk van deze vier oplossingen voor in de hepes-gebufferde oplossing die in stap 1.1 is bereid. Vortex de oplossingen om volledige oplossing van elk reagens te garanderen voorafgaand aan het uitvoeren van stap 4.
OPMERKING: Als u meerdere verschillende peptiden test, moet elk een cysteïne of een andere bron van thiolgroep bevatten voor deze conjugatiechemie. - Bereid oplossingen (4 mM beschikbare thiol) van alle peptiden die op dit punt in een enkele hydrogel moeten worden vastgebonden.
OPMERKING: Peptidesequenties en ECM-eiwitten waaruit ze zijn afgeleid en gebruikt in deze studie zijn vermeld in tabel 1. N-acetylcysteïne (zie Materiaaltabel), waaraan cellen niet binden, kan worden vervangen door een bioactief, thiolbevattend peptide om de concentratie van een kleefpeptide te titreren of als negatieve controle te fungeren31.
- Bereid elk van deze vier oplossingen voor in de hepes-gebufferde oplossing die in stap 1.1 is bereid. Vortex de oplossingen om volledige oplossing van elk reagens te garanderen voorafgaand aan het uitvoeren van stap 4.
- Meng de afzonderlijke oplossingen van HA, PEG-Norborneen, PEG-thiol en cysteïne/thiolbevattende peptiden (zie Materiaaltabel) om de eindconcentraties voor de uiteindelijke hydrogelmatrices in tabel 2 te bereiken. Roer (<1.000 tpm) minstens 30 minuten op een magnetische roerplaat om volledig te mengen.
OPMERKING: HA-oplossingen zijn zeer viskeus en kunnen het beste worden gehanteerd met behulp van een pipet met positieve verplaatsing (zie materiaaltabel). Als een pipet met positieve verplaatsing niet beschikbaar is, kunnen viskeuze oplossingen ook worden achterwege gelaten met een standaard micropipette door langzaam te pipetteren met behulp van brede openingen.
2. Verlichting en photocrosslinking van hydrogels via een LED-array
LET OP: Draag uv-beschermende brillen en bedek het verlichtingsveld met UV-absorberend materiaal.
OPMERKING: De LED-array die in dit protocol wordt beschreven, bestaat uit zes sets van acht LED's die in serie zijn geplaatst, zoals geïllustreerd door het meegeleverde schakelschema (figuur 1A). Elke set LED's kan onafhankelijk worden gevoed, wat tot zes verschillende bestralingen per run mogelijk maakt. Aanvullend bestand 1 bevat schermafbeeldingen die overeenkomen met de volgende aanwijzingen voor verdere richtlijnen.
- Download het bestand Illumination Device.zip uit de aanvullende coderingsbestanden. Deze map bevat de volgende bestanden: Arduino.zip (Supplementary Coding File 1), Drivers.zip (Supplementary Coding File 2), GUI.zip (Supplementary Coding File 3) en Holder.zip (Supplementary Coding File 4).
OPMERKING: 3D Print de bovenste en onderste delen om de printplaat op zijn plaats te houden (zie Aanvullende coderingsbestanden voor meer informatie). - Download en installeer de microcontrollersoftware (zie Materiaaltabel).
- Download en installeer de GUI-software (zie Materiaaltabel). Raadpleeg Aanvullend bestand 1 voor de gebruiksaanwijzing van de software.
- Open Processing en installeer de controlIP5-bibliotheek door te klikken op Sketch > Import Library > Add Library. Zoek vervolgens naar controlIP5 in bibliotheken en klik op Installeren. Voer dit voor de allereerste keer uit.
- Voed het verlichtingsapparaat (zie Materiaaltabel) met behulp van de 36 Volt voeding en sluit het aan op een pc met behulp van een micro-USB-kabel.
OPMERKING: Sommige apparaten installeren niet automatisch stuurprogramma's voor verschillende Arduino nano-boards. Eén set stuurprogramma's is beschikbaar in het zip-bestand van het apparaat. - Open het bestand Arduino.ino in de map Adruino.zip met arduino IDE.
- Compileer het Arduino.ino-bestand door op de knop Vinkje te klikken. Upload de gecompileerde code door op de pijlknop te klikken.
- Open het bestand GUI.pde in de map GUI.zip met Processing.
- Klik op Uitvoeren in het verwerkingsprogramma om de grafische gebruikersinterface voor het bedienen van het verlichtingsapparaat te starten.
- Klik in het venster van de grafische gebruikersinterface op Intensiteit voor de kolom met hydrogel-precursoroplossing die moet worden gekruist en voer de gewenste intensiteit in. Klik op het vak Tijd en voer de gewenste tijd in. Voor de oplossing in tabel 2 is dit 15 s.
OPMERKING: Eindgebruikers moeten digitale intensiteitswaarden kalibreren voor bestraling met behulp van een radiometer. Voorbeelden van typische intensiteiten zijn weergegeven in figuur 2A. - Lijn de monsters uit met het verlichtingsapparaat (figuur 2B) met elke andere LED in een enkele kolom van de siliconen mallen (zie Materiaaltabel) of 384-well plaat. Klik op Voltooien om de verlichting te starten. Herhaal dit proces indien nodig voor het verlichten van meerdere dia's of andere putten van een 384-well plaat.
OPMERKING: De houder is zo ontworpen dat de 384-well plaat tijdens de verlichting gelijk met een hoek van de binnenkamer zit.- Na verlichting, wanneer geplaatst in een hoek, verplaats de putplaat naar de volgende hoek en herhaal. Om putjes op de andere helft van de plaat te verlichten, tilt u de plaat uit de houder en draait u 180°.
- Genereer hydrogels met verschillende mechanica voor mechanische karakterisering volgens de onderstaande stappen.
- Reinig de glasglaasjes en siliconen mallen met tape om vuil te verwijderen. Bevestig de siliconen mallen aan de glasschuif, druk naar beneden om een goede afdichting te garanderen en verplaats eventuele luchtbellen.
- Pipetteer 80 μL hydrogel precursoroplossing, zoals bereid in stap 1.4, in elke siliconenmal op de glasplaat.
- Plaats de glasschuif op het verlichtingsapparaat dat is uitgelijnd met elke andere LED in een enkele kolom. Stel de hydrogelvoorlopers gedurende 15 s, zoals beschreven in stap 2, bloot aan UV-licht aan photocrosslink.
- Zodra de verlichting is gestopt, haalt u de dia's op en maakt u de gels los van de mallen door de binnenomtrek van de mal te volgen met een fijne punt (10 μL pipetpunt, 30 G naald, enz.). Verwijder siliconen mallen met een pincet/tang.
- Verplaats crosslinked hydrogels in individuele putten van een 12-wells plaat door een spatel nat te maken en ze voorzichtig van de glazen glijbaan te duwen. Vul elk putje met 2 ml DPBS (zie materiaaltabel) voordat u de hydrogel toevoegt. Zwellen de gels in DPBS-oplossing gedurende ten minste 12 uur (meestal 's nachts) bij kamertemperatuur (voor de mechanische karakterisering van de volgende dag).
3. Atomic Force Microscopy (AFM) metingen
- Schakel de atoomkrachtmicroscoop (AFM) in volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Dit protocol bevat korte instructies voor het gebruik van het instrument en de bijbehorende software.
- Installeer de AFM-sonde (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Voor deze studie werd een driehoekige siliciumnitride cantilever met een nominale veerconstante van 0,01 N/m gewijzigd met een bolvormig siliciumdioxidedeeltje van 2,5 μm. - Na de installatie lijnt u de laser uit op de top van de driehoekige sonde en past u vervolgens de spiegel- en laserafbuiging aan om de signaalsom te maximaliseren (meestal tussen 1,5-2,2 Volt).
- Dompel de sonde onder in DPBS en wacht tot 15 minuten om thermisch evenwicht te verkrijgen. Klik op de knop Kalibratie en selecteer Contactafhankelijke kalibratie. Klik op de knop Thermische afstemming verzamelen en selecteer na het verzamelen van gegevens de piek rond 3 kHz voor kalibratie.
OPMERKING: Een lichte aanpassing van de spiegel en laserdeflectoren kan nodig zijn na onderdompeling in een vloeistof als gevolg van veranderingen in de brekingsindex. - Benader het oppervlak van een petrischaaltje (plastic) door de naderingsparameters in te stellen op constante snelheid, een doelhoogte van 7,5 μm en een naderingssnelheid van 15 μm /s. Schakel Nulmeting per run in voor approach , zodat de approach continu wordt uitgevoerd en niet vroegtijdig stopt als gevolg van drift in de deflector.
- Stel bij nadering acquisitieparameters voor force mapping in op 4 nN turnarounds, 2 μm inspringingsafstand, 1 μm/s snelheid en 0 s contacttijd. Druk op de startknop om te beginnen met het verzamelen van een krachtcurve op het plastic oppervlak (bijvoorbeeld een putplaat).
- Ga terug naar het kalibratievenster en selecteer het deel van de krachtcurve dat overeenkomt met contact en inkeping van de kunststof. Accepteer de berekende gevoeligheids- en stijfheidswaarden voor de sonde om de kalibratie te voltooien.
- Til na kalibratie de AFM-sonde op en plaats het hydrogelmonster voor ondervraging. Benader hydrogel volgens de instellingen in stap 5.
OPMERKING: Tijdens de naderingsprocedure naar het hydrogeloppervlak kan de eenheid per ongeluk de benaderde toestand activeren. Om de werkelijke nadering te controleren, verkrijgt u een krachtcurve zoals in stap 4.6. Herhaal de naderingsprocedure als de resulterende curve geen contact en resulterende inspringing weergeeft. - Wanneer de oppervlaktebenadering succesvol is, schakelt u over naar de Force Mapping-modus en stelt u acquisitieparameters in op een kaart van 8 x 8 met een lengte van 40 μm per as. Verkrijg krachtkaarten in verschillende regio's om de uniformiteit van stijfheidsmetingen te beoordelen.
- Interpreteer krachtcurves met behulp van het softwareprogramma JPK SPM Data Processing via een Hertz/Sneddon-model (vergelijkingen 1 en 2, zie tabel 3 voor de definitie van alle variabelen) met de bolvormige geometrie geselecteerd 32,33,3 4.
Vergelijking 132
Vergelijking 232
- Interpreteer krachtcurves met behulp van het softwareprogramma JPK SPM Data Processing via een Hertz/Sneddon-model (vergelijkingen 1 en 2, zie tabel 3 voor de definitie van alle variabelen) met de bolvormige geometrie geselecteerd 32,33,3 4.
Vergelijking 132
Vergelijking 232
4. Opzetten en medicamenteuze behandeling van 3D, matrix-ingebedde culturen
- Bereid de gewenste cellen voor als een oplossing met één cel.
OPMERKING: Verschillende celtypen kunnen verschillende passagingmethoden vereisen. Een typisch protocol voor het passeren van een suspensiecultuur van GBM-sferoïden uit een T-75-kolf wordt gerapporteerd in referentie31. - Verzamel GBM-sferoïden (ongeveer 150 μm in diameter) uit een T-75 kolf suspensiecultuur in een conische buis van 15 ml. Spoel de kweekkolf af met 5 ml DPBS om eventuele restcellen en media te verwijderen en voeg dit volume toe aan de conische buis.
- Centrifugeer de conische buis met cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na centrifugatie het supernatant met een serologische pipet van 5 ml, zorg ervoor dat de celpellet niet wordt verstoord en resuspenseer in 5 ml DPBS.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om cellen te wassen. Aspirateer het supernatant met een serologische pipet van 5 ml, zorg ervoor dat de celpellet niet wordt verstoord en resuspensiecellen vervolgens in 2 ml celdissociatiereagens (zie materiaaltabel).
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10-15 min. Voeg 3 ml compleet medium toe (zie materiaaltabel) en pipetteer voorzichtig 3-5 keer om de sferoïden af te breken tot een eencellige suspensie31.
- Centrifugeer de eencellige suspensie bij 400 x g (eencellige suspensies kunnen sneller worden gesponnen voor pelletvorming) gedurende 5 minuten naar pelletcellen bij kamertemperatuur. Aspirateer het supernatant met een serologische pipet van 5 ml en zorg ervoor dat de celpellet niet wordt verstoord. Resuspend cellen in 1 ml compleet medium.
OPMERKING: Als de cellen in klonten blijven, in plaats van als enkele cellen in suspensie, kunnen cellen na passaging door een celzeef van 40 μm worden geleid om een eencellige suspensie te bereiken. - Verwijder een deel van de cellen om te tellen met behulp van een hemocytometer. Verdun dit deel tweevoudig met trypan blue, dat cellen met een verminderde levensvatbaarheid doordringt. Tel alleen de levende, kleurloze cellen. Typisch, een T-75 gezaaid met 800.000 cellen per kolf levert 2-3 miljoen cellen op na een week in cultuur.
- Bepaal het aantal cellen dat nodig is voor inkapseling. Breng een volume media met het totale aantal benodigde cellen over in een steriele microcentrifugebuis van 1,7 ml. Draai af op 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Er is bijvoorbeeld minimaal 2,5 miljoen cellen geresuspendeerd in 1 ml gelvolume nodig om cellen in te kapselen bij 2,5 miljoen cellen / ml. Een gelvolume van 1 ml stelt gebruikers in staat om 100 geldruppels af te geven, waarbij elke geldruppel een volume van 10 μL heeft. Het bereiden van een extra ~ 20% volume cellen gesuspendeerd in hydrogeloplossing wordt aanbevolen om rekening te houden met verlies tijdens pipetoverdracht. Men zou dus 3 miljoen cellen en 1,2 ml hydrogel-precursoroplossing bereiden in dit voorbeeld. Een minimale dichtheid van 500 duizend cellen / ml wordt aanbevolen. - Aspirateer het supernatant met een micropipette en zorg ervoor dat de celpellet niet wordt verstoord. Resuspenseer de celpellet in de hydrogel precursoroplossing, zoals bereid in stap 1.4, meng goed door 4-5 keer op en neer te pipetteren met een micropipette van 1.000 μL.
- Laad de cellen in een herhaalde pipettor (zie Materiaaltabel) die is ingesteld om 10 μL af te geven. Om bubbels en ongelijke dosering te voorkomen, primeert u de herhaalde pipettor door nog eens 1-2 keer in een afvalcontainer te doseren.
- Doseer in elke put van een 384-well plaat 10 μL cellen gesuspendeerd in hydrogeloplossing van de herhaalde pipettor. Verlicht met behulp van de LED-array elke put met cellen (stap 2) gedurende 15 s met intensiteiten (voorbeeldresultaten in figuur 2A gebruikte intensiteiten van 1,14, 1,55, 2,15, 2,74 mW / cm2) om de gewenste mechanische eigenschappen te bereiken.
OPMERKING: Het wordt voorgesteld om te beginnen met vijf replicaties per experimentele conditie en op- of af te schalen, afhankelijk van de gewenste doorvoer en variantie van de eindpunttest. - Voeg 40 μL volledige media toe aan elk putje dat de cellen bevat. Voeg 50 μL DPBS toe aan niet-experimentele, droge putten rond de gels om verliezen als gevolg van verdamping te minimaliseren.
- Voeg voor GBM-cellen 40 μL van het mediabevattende geneesmiddel toe (bijv. TMZ, zie materiaaltabel) om de uiteindelijke gewenste concentratie (10 μM-100 μM in dimethylsulfoxide (DMSO) of medium (DMSO) te bereiken, dienovereenkomstig, beginnend 3 dagen na inkapseling.
5. CCK8 proliferatietest
- Voeg 10 μL CCK8-reagens (zie materiaaltabel) toe aan elk putje dat de cellen bevat.
OPMERKING: Als u deze test voor de eerste keer uitvoert, neem dan negatieve controleputten op, zoals alleen media of celvrije hydrogel in media. - Incubeer gedurende 1-4 uur volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Deze tijd kan variëren als een functie van het celtype en de dichtheid, en daarom moeten incubatietijden voor elke toepassing worden getest, zodat absorptiewaarden binnen een lineair bereik vallen, een vereiste voor het toepassen van Beer's Law35. - Lees absorptiewaarden bij 450 nm voor alle putten na incubatie.
- Bereken de gemiddelde absorptie bij 450 nm verkregen in stap 3 voor de voertuigconditie voor elke groep. Deel elke goed behandelde drug door het gemiddelde van de voertuigcontrole per groep.
- Bereken betrouwbaarheidsintervallen door bootstrapverdelingen (N = 10.000) te genereren via de percentielmethode36.
OPMERKING: Over het algemeen kan men 95% betrouwbaarheidsintervallen gebruiken en voorwaarden interpreteren waarvan de betrouwbaarheidsintervallen niet meer dan 1 overschrijden om significant te zijn en verder onderzoek te rechtvaardigen. Het instellen van betrouwbaarheidsintervallen op 95% is congruent met het instellen van een significantiegrens van p = 0,05. Voor de gegevens die in de resultaten worden getoond, is het nuttig om omstandigheden te onderscheiden die matrixgemedieerde medicijnresistentie bevorderen of remmen, waarvoor een tweezijdige analyse vereist is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AFM-metingen bevestigden een nauwkeurige controle van hydrogelmechanica als functie van UV-straling (mW / cm2) tijdens foto-crosslinking met behulp van een op maat gemaakte, Arduino-gestuurde LED-array (figuur 2A). De hydrogelformulering die in dit protocol wordt gebruikt, is te vinden in tabel 2. De afstand van de LED's op de meegeleverde sjabloon komt overeen met de afstand voor elke andere put van een 384-well plaat, waardoor de vorming van gels in de plaat mogelijk is (figuur 2B). AFM-ondervraging van micronschaalgebieden aan de oppervlakken van enkele hydrogels toonde aan dat hydrogels met zachtere gemiddelde Young's moduli ook kleinere modulibereiken hadden dan stijvere hydrogels (figuur 2C-E).
Celzaaidichtheden die de levensvatbaarheid maximaliseren, moeten empirisch worden bepaald voor elk celtype. Deze studie toont aan dat 3D-culturen van GS122-cellen gezaaid met dichtheden van 2.500.000 cellen / ml aanzienlijk hogere levensvatbaarheden vertoonden wanneer ze na 7 dagen in cultuur werden beoordeeld in vergelijking met die gezaaid bij dichtheden van 500.000 cellen / ml (figuur 3A). Bovendien werden GS122- en GS304-cellen gebruikt als modellen voor het kweken van van patiënten afgeleide GBM-cellen om de afhankelijkheid van chemotherapierespons van de stijfheid en biochemische samenstelling van de matrixmicro-omgeving te onderzoeken (figuur 3B-D). De levensvatbaarheid van cellen werd beoordeeld door middel van de CCK8-test na behandeling met TMZ gedurende 4 dagen, wat leidde tot een totale kweektijd van 7 dagen door OD450-meting te schalen door een overeenkomstige voertuigcontrole en 95% betrouwbaarheidsintervallen te genereren door bootstrapping (N = 10.000) met de percentielmethode36. Met deze verdelingen werden omstandigheden waarin betrouwbaarheidsintervallen niet overlapten met een waarde van 1 (stippellijn) als significant beschouwd. In vergelijking met meer algemeen gebruikte statistische methoden zoals t-tests of ANOVA, heeft schatting van betrouwbaarheidsintervallen, met behulp van bootstrapping om distributies te schatten die aanwezig zouden zijn voor grotere steekproefgroottes, de voorkeur voor screeningstests waarvan het doel is om een kleinere subset van voorwaarden voor verder onderzoek te identificeren. Een bijkomend voordeel van deze methode is dat voorwaarden met een kleinere spread in een betrouwbaarheidsinterval voorrang kunnen krijgen boven andere voorwaarden met een vergelijkbare gemiddelde waarde, maar een hogere spreiding in het betrouwbaarheidsinterval. Deze studie gaf aan dat GS122-cellen overlevingsvoordelen behaalden door micro-omgevingsinteracties (figuur 3B). Dit overlevingsvoordeel was significant in de 0,8, 1 en 4 kPa-condities, maar niet in de 8 kPa-conditie voor GS122-cellen. GS304-cellen waren ongevoelig voor zowel stijfheid als TMZ-behandeling.
Het effect van de biochemische samenstelling van de matrixmicro-omgeving werd vervolgens onderzocht door de opname van ECM-afgeleide, integrinebindende peptiden (tabel 1) waarvan bekend is dat ze in de GBM-tumormicro-omgeving worden geupreguleerd bij twee stijfheid, 0,8 kPa en 8 kPa, te variëren. Nogmaals, GS304-cellen kregen geen significant overlevingsvoordeel van matrixinclusie en waren ongevoelig voor TMZ. GS122-cellen vertoonden echter overlevingswinsten in de 8 kPa-conditie wanneer van osteopontine afgeleide peptiden in de matrix werden opgenomen, terwijl de opname van integrine-bindend sialoproteïne (IBSP) of tenascin-C-afgeleide peptiden minimale overlevingsvoordelen opleverde, zoals cultuur in matrices met het algemene RGD-peptide (figuur 3C). Daarentegen leverden geen peptiden overlevingswinst op in de 0,8 kPa-cultuurconditie (figuur 3D). Samen suggereren de resultaten intrinsieke verschillen in zowel matrix- als medicijnresponsen tussen de twee van de patiënt afgeleide cellijnen die zijn geëvalueerd.
3D-hydrogelculturen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van standaard lichtmicroscopie om te beoordelen hoe celmorfologie en invasief gedrag worden beïnvloed door kweekomstandigheden op een cellijnafhankelijke manier (figuur 4). Zowel GS122- als GS304-cellen verspreiden zich wanneer ze worden gekweekt in zachte of stijve hydrogelmatrices, waaronder RGD-bevattende peptiden (figuur 4A). Hoewel peptiden de verspreiding van cellen beïnvloedden, voorspelde het vermogen van een cel om zich te verspreiden niet noodzakelijkerwijs het vermogen van de cultuur om TMZ-resistentie te verwerven. GS122-cellen vertonen bijvoorbeeld een vergelijkbaar gebrek aan verspreiding in zowel 0,8 als 8 kPa met osteopontine; GS122 vertoonde echter alleen een verhoogde weerstand tegen TMZ in de 8 kPa-toestand (figuur 4B). Ten slotte kan dit geminiaturiseerde, 3D-kweekplatform worden gebruikt om menselijke cellen uit andere tumortypen te kweken, waaronder levensvatbare organoïden van terminaal gedifferentieerde, neuro-endocriene prostaatkankercellen (figuur 4C).
Figuur 1: Cartoonafbeelding van het protocol. (A) Cartoonafbeelding van het proces voor het genereren en monitoren van 3D-cultuur. (1) Hydrogeloplossingen op basis van HA worden bereid. (2) Hydrogel-oplossingen worden vervolgens met variabele intensiteit gekoppeld via LED's die worden bestuurd door een Arduino-microcontroller. (3) Resulterende hydrogelmechanica wordt beoordeeld door AFM om het verschil in gelmechanica te verifiëren. (4) Oplossingen die overeenkomen met de formulering uit stap 1 worden vervolgens gebruikt om van de patiënt afgeleide GBM-cellen in te kapselen en met het geneesmiddel te behandelen. (5) Na 7 dagen wordt de levensvatbaarheid van de cel uitgelezen via de CCK8 colorimetrische test. (B) Schakelschema voor aangepaste LED-verlichtingsarray die in dit protocol wordt gebruikt. De afzonderlijke componenten worden vermeld in de tabel met materialen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Hydrogels vervaardigd met variërende stijfheid met behulp van instelbare LED's om de bestralingssterkte te wijzigen. (A) Vioolplots tonen de berekende Young's Modulus uit krachtcurven gegenereerd door AFM over drie oppervlaktegebieden, verspreid over 40 μm x 40 μm, van individuele hydrogels. Young's modulus van elke hydrogel wordt weergegeven als een functie van UV-straling tijdens photocrosslinking. Horizontale witte lijnen geven de mediaan voor elke experimentele groep aan. (B) LED-array met afstand die overeenkomt met de toonhoogte van multi-well platen (384 putten). (C) Heatmap met de regionale variatie van Young's modulus (gemiddelde = 0,8 kPa) voor een typische gel gekruist door blootstelling aan 1,55 mW/cm2 gedurende 15 s. (D) Hittekaart met de regionale variatie van Young's modulus (gemiddelde = 8 kPa) voor een typische gel gekruist bij blootstelling aan 2,74 mW/cm2 gedurende 15 s. (E) Histogram ter illustratie van het bereik van Young's modulusmetingen over het oppervlak van hydrogels weergegeven in C en D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Orthogonale presentatie van stijfheid en integrinebindend peptide onthult intrinsieke biologische verschillen tussen GBM-cellijnen. (A) Typische absorptiewaarden voor GS122-cellen ingekapseld in een hydrogel van 10 μL met een dichtheid van 500.000 of 2.500,00 cellen per ml. (B) Geneesmiddelresponsgegevens voor GS122- en GS304-cellijnen worden gevisualiseerd door de OD450-waarde van de met geneesmiddelen behandelde putten (N = 5) te normaliseren met het gemiddelde van de met voertuigen behandelde putten (N = 5). Levensvatbaarheid in de context van medicamenteuze behandeling werd waargenomen om niet-lineair te variëren voor hydrogelstijfheid, wat variatie tussen cellijnen aantoont. (C,D) Geneesmiddelresponsgegevens voor GS122- en GS304-cellijnen wanneer het type integrinebindend peptide werd opgenomen en matrixstijfheid orthogonaal werd gevarieerd. Alle foutbalken vertegenwoordigen de 95% betrouwbaarheidsintervallen die worden verkregen door elke voorwaarde met N = 10.000 te bootstrappen. De stippellijn (y-as = 1) komt overeen met het geval waarin OD450 voor de behandelingsomstandigheden gelijk is aan het voertuig. Alle experimentele waarden werden verkregen na 7 dagen in cultuur; TMZ werd 3 dagen na de eerste inkapseling toegevoegd voor geneesmiddelenstudies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Morfologische verschillen tussen cellen ingekapseld in verschillende HA-gebaseerde hydrogelomgevingen. (A) Fasecontrastbeelden van GS122 en GS304, wanneer gekweekt in een hydrogel (0,8 en 8 kPa), vertoonden een RGD-motief. Witte pijlen geven cellen aan met gespreide morfologieën. (B) Fasebeelden van GS122 en GS304, wanneer gekweekt in een hydrogel (0,8 en 8kPa), vertoonden een peptide afgeleid van osteopontine. Witte pijlen geven cellen aan met gespreide morfologieën. Zwarte pijlen geven cellen aan met afgeronde morfologieën. Na 7 dagen in cultuur werden beelden gemaakt en TMZ werd 3 dagen na de eerste inkapseling toegevoegd. (C) Fasebeeld van een terminaal gedifferentieerd neuro-endocriene prostaatorganoïde. Schaalstaven = 200 μm (voor A,B); 100 μm (voor C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Eiwit | Peptide sequentie |
| RGD | GCGYGRGDSPG |
| Tenascine-C | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIRGV |
| Integrine-bindend sialoproteïne (IBSP) | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Osteopontine | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
Tabel 1: ECM-eiwitten en afgeleide peptidesequenties.
| Reagens | Initiële concentratie | Volume (μL) | Eindconcentratie |
| HA-SH Oplossing | 10 mg/ml | 2300 | 5 mg/ml |
| Peg-Sh | 100 mg/ml | 503 | Verschilt per experiment |
| PEG-Norborneen | 100 mg/ml | 443 | Verschilt per experiment |
| Peptide | 4 μM | 288 | 0,250 μM |
| Schoot | 4 mg/ml | 288 | 0,25 mg/ml |
| HEPES-HBSS | N.v.t | 798 |
Tabel 2: Typische eindformuleringscomponenten voor hydrogel.
| Veranderlijk | Parameter |
| F | Kracht |
| E | Young's Modulus |
| ν | Poissons's Ratio |
| δ | Inkeping (verticale tippositie) |
| een | Straal van de contactcirkel |
| RS | Straal van de bol |
Tabel 3: Variabelen en bijbehorende parameters voor AFM-berekeningen.
Aanvullend bestand 1: Richtlijnen met betrekking tot het gebruik van de LED-array voor verlichting en fotocrosslinking van hydrogels. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 1: Arduino-bestand voor LED-array microcontroller (Arduino.zip). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 2: Stuurprogramma's van derden voor Arduino nano (stuurprogramma's.zip). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 3: Verwerkingsbestand voor GUI-besturing van LED-arraymicrocontroller (GUI.zip). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende codering Bestand 4: Bestand voor 3D-printen externe houder voor LED array microcontroller (Houder.zip). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige werk presenteert methoden om 3D, geminiaturiseerde culturen te genereren binnen HA-gebaseerde en tegelijkertijd matrixstijfheid en peptiden te veranderen die beschikbaar zijn voor integrine-betrokkenheid. Deze techniek maakt de systematische studie mogelijk van hoe matrixparameters cellulaire fenotypes beïnvloeden (bijvoorbeeld de levensvatbaarheid van kankercellen die worden blootgesteld aan chemotherapie) met een verhoogde doorvoer. Eerdere benaderingen, waaronder die hierin gepresenteerd, hebben de hydrogelstijfheid afgestemd door het percentage totaal polymeer in de uiteindelijke formulering te variëren, waar stijvere hydrogels een hoger polymeergehalte hebben21,31. Deze aanpak vereist echter het voorbereiden van een unieke hydrogelformulering voor elke gewenste stijfheid, een proces dat de doorvoer intrinsiek verlaagt. Hier wordt de hydrogelstijfheid afgestemd door de UV-straling tijdens crosslinking te variëren, zodat hydrogels van meerdere stijfheiden kunnen worden verkregen uit een enkele precursoroplossing. Toekomstige beoefenaars die misschien niet de mogelijkheid hebben om de hier beschreven aangepaste verlichting te bouwen, kunnen gemakkelijk een in de handel verkrijgbaar UV-spot-uithardingsapparaat vervangen en de verlichting aanpassen naarmate verschillende sectoren van een putplaat worden uitgehard. Het nadeel van het gebruik van een commercieel spot-curing-apparaat is een verminderde doorvoer in vergelijking met de aangepaste illuminator. Een beperking van de huidige methoden is dat er nog steeds unieke oplossingen moeten worden bereid voor elke peptideconditie. Soortgelijke methoden zijn eerder door andere groepen gebruikt om stijfheid-gradiënt-bevattende hydrogels te produceren37,38. Deze studie toont echter aan hoe photocrosslinking de miniaturisatie van experimentele monsters mogelijk kan maken en de complexiteit van experimentele opstellingen kan verminderen. Over het algemeen zullen deze verbeteringen onderzoekers in staat stellen om de experimentele doorvoer te verhogen bij het uitvoeren van 3D-culturen in matrix-mimetische biomaterialen en nuttig zijn op verschillende gebieden in de biomedische wetenschap buiten de neuro-oncologie.
De representatieve resultaten laten zien hoe deze techniek kan worden gebruikt om geminiaturiseerde, 3D-culturen van patiënt-afgeleide GBM-cellen op te zetten in gedefinieerde matrices, waarin beschikbare integrine-bindende peptiden en stijfheid worden gevarieerd, binnen een standaard 384-well plaat die geschikt is voor verschillende standaardtests. Deze methode presenteert representatieve resultaten om te screenen hoe matrixparameters de reacties op TMZ-chemotherapie beïnvloeden in GBM-cellen afgeleid van twee unieke patiënten, aangeduid als GS122- en GS304-cellen. Van de twee patiënt-afgeleide cellijnen die hier werden geëvalueerd, was de respons van GS122-cellen op TMZ-behandeling gevoelig voor de matrixmicro-omgeving, terwijl die van GS304-cellen ongevoelig was. Wat de matrixstijfheid betreft, kweekten GS122-cellen in 3D-hydrogels met een 4 kPa microcompressiemodulus gemaximaliseerde TMZ-weerstand, waaronder behandelde cellen in aantal meer toenamen dan onbehandelde cellen gedurende een 7-daagse experimentele cursus. Mechanische eigenschappen hadden grotere effecten op TMZ-resistentie dan de integrinebindende peptiden inbegrepen. Er wordt dus verwacht dat de impact van verschillende peptideconcentraties, alleen en in combinatie, de ontdekking van matrixcondities mogelijk zal maken die resistentie tegen geneesmiddelen in de toekomst bevorderen. De ongevoeligheid van GS304-cellen voor hun omringende matrix kan erop wijzen dat de matrix meer invloed heeft op cellen, zoals GS122-cellen, die oorspronkelijk gevoelig zijn voor TMZ, maar tijdens de behandeling resistentie krijgen. Daarentegen is onduidelijk in hoeverre matrixsignalen cellen beïnvloeden die aan het begin van het experiment al behandelingsresistent zijn, zoals bij GS304-cellen.
De resultaten van dit onderzoek weken enigszins af van eerder gerapporteerde resultaten. De zachtste op HA gebaseerde hydrogels geëvalueerd (1 kPa bulk Young's modulus, die de stijfheid van de inheemse hersenen nabootst) bevorderden maximale TMZ-resistentie GBM-cellen afgeleid van vier tumoren van verschillende patiënten dan die hier geëvalueerd21. Er zijn verschillende mogelijke redenen voor deze discrepantie. Ten eerste werd een uitgebreid bereik van hydrogelstijfheden ondervraagd in de huidige studie, die hydrogels vergeleek over een bereik van 0,8 kPa tot 8 kPa microcompressiemodulus, terwijl eerdere studies alleen hydrogels vergeleken met 1 kPa en 2 kPa Young's moduli. Bovendien werd in de vorige studies mechanische karakterisering gedaan op de bulkschaal met behulp van lineaire mechanische compressie om de modulus van Young te schatten, terwijl in deze studie AFM werd gebruikt om een microcompressiemodulus te meten. Voor onderzoekers die de hier aanwezige methoden willen implementeren die geen microschaalmechanicametingen vereisen, zijn bulkschaalmodulus, met behulp van rheometrie of lineaire mechanische tests, perfect aanvaardbare substituten voor AFM. Met name micromechanische analyses onthulden de heterogene moduli over het oppervlak van een enkele gel. Vergelijkbare AFM-metingen aan de hydrogels geformuleerd in eerdere studies zijn niet gedaan, maar de verwachting is dat de variantie van stijfheid binnen een enkele hydrogel groter is geweest dan die in de huidige studie. Hydrogels in de vorige studies werden gegenereerd met behulp van een Michael-type additie crosslinking afhankelijk van kinetische menging bij 37 graden C 10,21,24. Fotocrosslinking daarentegen maakt een grondige menging van hydrogelprecursoren mogelijk voorafgaand aan blootstelling aan licht, wat de homogeniteit in de 3D-hydrogel verbetert en op zijn beurt de variabiliteit van celresponsen vermindert. Ten slotte vertonen GBM-tumoren notoir heterogeen en onvoorspelbaar gedrag39 en daarom is het redelijk om te verwachten dat cellen afgeleid van individuele tumoren ook unieke eigenschappen zouden hebben. Dit gebrek aan consistentie tussen patiëntmonsters motiveert de behoefte aan een high-throughput platform voor het ophelderen van patiëntspecifieke tumorkenmerken.
Veel voorkomende valkuilen bij het uitvoeren van de geminiaturiseerde hydrogel fotocrosslinking-procedure zijn onvolledige menging van hydrogelprecursoren, wat resulteert in een slechte reproduceerbaarheid en spontane gelatatie van de HA-oplossing tijdens het mengen. Deze problemen kunnen worden verzacht door de HA-thiol minimaal 45 minuten en de volledige precursoroplossing nog eens 30 minuten te roeren, terwijl de pH van hydrogelprecursorenoplossingen nauwlettend wordt gevolgd om ervoor te zorgen dat deze onder de 7 blijft om thioloxidatie en vorming van disulfide naar crosslinks te voorkomen. In tegenstelling tot crosslinkingmethoden met behulp van een kinetisch Michael-type additiemechanisme10,21, verlaagt de fotocrosslinkingmethode die in dit protocol wordt gebruikt de kans op spontane gelatatie wanneer alle reagentia worden gecombineerd21. Kwaliteitscontrolepunten worden ten zeerste aanbevolen, zoals het meten van HA-thiolatiepercentage31 en het maken van extra hydrogels voor parallelle mechanische tests voor elke batch 3D-culturen. Ten slotte moeten zaaidichtheden voor 3D-inkapseling in hydrogels worden geïdentificeerd voor elk gebruikt celtype of lijn. Over het algemeen tonen de resultaten aan dat een minimale concentratie van 1 miljoen cellen / ml voldoende is voor de 3D-cultuur van de meeste cellen, die sferoïden vormen, waaronder van de patiënt afgeleide GBM-cellen, menselijke embryonale stamcellen (H9) en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (gegevens niet getoond). De opname van ROCK-remmerbehandeling voorafgaand aan inkapseling (stap 4.1) bij gebruik van bijzonder gevoelige cellen wordt ook aanbevolen40.
In de context van het ontwikkelen van nieuwe behandelingsbenaderingen voor GBM, biedt het hier gepresenteerde protocol methoden voor het functioneel screenen van geneesmiddelresponsen van van patiënten afgeleide GBM-cellen binnen een fysiologisch relevante micro-omgeving. Een rijke opslagplaats van genetische, epigenetische en klinische mRNA-expressiegegevens voor GBM (en andere kankers) is openbaar beschikbaar dankzij de inspanningen van The Cancer Genome Atlas (TCGA) en anderen15. Gebruikt in combinatie met deze grote datasets, wordt verwacht dat gegevens gegenereerd uit functionele schermen van geminiaturiseerde, 3D-culturen nieuwe correlaties kunnen onthullen, waardoor de voorspelling van klinische uitkomsten bij individuele patiënten wordt verbeterd. Er kunnen bijvoorbeeld subpopulaties van patiënttumoren worden geïdentificeerd waarvoor sommige behandelingen, zoals matrixverstorende verbindingen zoals cilengitide, de klinische resultaten kunnen verbeteren41. Naast medicijnrespons maakt dit kweekplatform beoordelingen van tumorcelinvasie mogelijk met behulp van goed-plaatcompatibele imagers met een hoog gehalte. De flexibiliteit van dit platform om veel verschillende peptiden op te nemen, alleen of in combinatie, terwijl orthogonaal variërende stijfheid kan helpen bij het identificeren van matrixkenmerken die GBM-tumoragressie veroorzaken.
Naast GBM kunnen deze methoden worden aangepast om de effecten van matrixparameters op andere celtypen te onderzoeken in de context van andere ziekten, weefselontwikkeling en normale weefselfunctie. In de toekomst zal het eenvoudig zijn om de doorvoer van deze methoden verder te verhogen, omdat ze specifiek zijn ontworpen om te worden uitgevoerd in de context van multi-well platen om de acceptatie in bestaande workflows voor het ontdekken van geneesmiddelen te vergemakkelijken door gebruik te maken van commercieel beschikbare geautomatiseerde vloeistofhandlers en imagers met een hoog gehalte. Gemakkelijke integratie met bestaande infrastructuur en toegenomen automatisering, die de technische vaardigheden vermindert die nodig zijn om celbeladen, 3D-hydrogelculturen te produceren en te onderhouden, zullen de barrières voor het gebruik van deze methode aanzienlijk verlagen. Hoewel het werk hier specifiek culturen binnen HA-gebaseerde hydrogels presenteert, wordt verwacht dat deze methode gemakkelijk kan worden vertaald naar andere veelgebruikte fotocrosslinkbare materialen voor 3D-celcultuur, zoals methacrylaat gelatine, en dat de hier gerapporteerde methoden een nuttige richtlijn zullen bieden voor aanvullende toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen specifiek Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore en Itay Solomon bedanken voor hun bijdragen aan eerdere iteraties van het fotogelatieschema. Cellijnen GS122 en GS304 werden genereus geleverd door David Nathanson. Alle figuren zijn gemaakt met BioRender.com. UCLA-kernfaciliteiten, de Molecular Screening Shared Resources en het Nano and Pico Characterization Laboratory waren instrumenteel voor het werk. Chen Chia-Chun werd ondersteund door het UCLA Eli en Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program. Grigor Varuzhanyan werd ondersteund door een Tumor Cell Biology Training Program NIH Grant (T32 CA 009056).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
| 384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
| 40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
| 4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
| 6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
| 80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
| 8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
| AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
| Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
| Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CCK8 | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
| CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
| Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
| DMEM - F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
| EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
| Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
| Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
| Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
| Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
| HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
| Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
| Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
| Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
| Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
| Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
| mLine micropipette | Sartorious | ||
| N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
| Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
| NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
| Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
| Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
| Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
| Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
| Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
| Processing | Processing | 3.5.4 | |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
| Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
| RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
| Scoth Tape | |||
| Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
| Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
| Solder Wire | |||
| Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
| Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
| T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
| Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
| Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
| VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |
References
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).
- Booth, B., Ma, P., Glassman, R.
- Da Ros, M., et al. Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).
- Broekman, M. L., et al.
- Grundy, T. J., et al. Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness. Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).
- Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses. Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).
- Simoni, R. D., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (2002).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L.
- Spinelli, C., et al. Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).
- Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018. Neuro-Oncology. 23, Supplement_3 (2021).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge. Contemporary oncology. 19, Poznan, Poland. 68-77 (2015).
- Lee, S. Y.
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Levy, N. The use of animal as models: Ethical considerations. International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).
- Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).
- Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Preston, M. Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination. Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. Future Science OA. 3 (3), (2017).
- Trombetta-Lima, M., et al. Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma. Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).
- Schregel, K., et al. Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography. NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
- Sneddon, I. N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).
- Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).
- Mayerhöfer, T. G., Popp, J. Beer's law - Why absorbance depends (almost) linearly on concentration. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).
- Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping. Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).
- Lavrentieva, A.
- Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).
- da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals. Cells. 8 (10), 1177 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results. Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).
