Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Hydrogelarrays muliggør øget gennemstrømning til screeningseffekter af matrixkomponenter og terapi i 3D-tumormodeller

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/63791
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1University of California Los Angeles

Summary

Denne protokol beskriver en eksperimentel platform til vurdering af virkningerne af mekaniske og biokemiske signaler på kemoterapeutiske reaktioner af patientafledte glioblastomceller i 3D-matrixmimetiske kulturer ved hjælp af en specialfremstillet UV-belysningsenhed, der letter fotocrosslinking med høj kapacitet af hydrogeler med indstillelige mekaniske egenskaber.

Abstract

Cellematrixinteraktioner medierer komplekse fysiologiske processer gennem biokemiske, mekaniske og geometriske signaler, der påvirker patologiske ændringer og terapeutiske reaktioner. Regnskab for matrixeffekter tidligere i lægemiddeludviklingspipelinen forventes at øge sandsynligheden for klinisk succes med nye terapier. Biomaterialebaserede strategier, der rekapitulerer specifikke vævsmikromiljøer i 3D-cellekultur, findes, men det har været udfordrende at integrere disse med de 2D-dyrkningsmetoder, der primært anvendes til lægemiddelscreening. Protokollen, der præsenteres her, beskriver således udviklingen af metoder til 3D-kultur inden for miniaturiserede biomaterialematricer i et multi-well pladeformat for at lette integrationen med eksisterende lægemiddelscreeningsrørledninger og konventionelle assays for cellelevedygtighed. Da matrixens egenskaber, der er afgørende for at bevare klinisk relevante fænotyper i dyrkede celler, forventes at være meget vævs- og sygdomsspecifikke, vil kombinatorisk screening af matrixparametre være nødvendig for at identificere passende betingelser for specifikke anvendelser. De metoder, der er beskrevet her, bruger et miniaturiseret kulturformat til at vurdere kræftcelleresponser på ortogonal variation af matrixmekanik og ligandpræsentation. Specifikt demonstrerer denne undersøgelse brugen af denne platform til at undersøge virkningerne af matrixparametre på responsen af patientafledte glioblastomceller (GBM) på kemoterapi.

Introduction

De forventede omkostninger ved at udvikle et nyt lægemiddel er steget støt i løbet af det sidste årti med over 1 mia. USD i de nuværende skøn1. En del af denne udgift er den høje fejlrate for lægemidler, der indgår i kliniske forsøg. Ca. 12% af lægemiddelkandidaterne tjener i sidste ende godkendelse fra USA (US) Food &drug Administration (FDA) i 2019. Mange lægemidler fejler i fase I på grund af uventet toksicitet2, mens andre, der består sikkerhedsforsøg, kan mislykkes på grund af manglende effekt3. Denne nedslidning på grund af manglende effekt kan til dels forklares ved, at kræftmodeller, der anvendes under lægemiddeludvikling, notorisk ikke er prædiktive for klinisk effekt4.

Funktionelle forskelle mellem in vitro- og in vivo-modeller kan tilskrives fjernelse af kræftceller fra deres oprindelige mikromiljø, herunder ikke-tumorceller og den fysiske ECM 5,6. Almindeligvis bruger forskergrupper kommercielt tilgængelige kulturmatricer, såsom Matrigel (en proteinholdig kældermembranmatrix afledt af musesarkomer) til at tilvejebringe dyrkede tumorceller med et 3D-matrixmikromiljø. Sammenlignet med 2D-dyrkning har 3D-dyrkning i membranmatrix forbedret den kliniske relevans af in vitro-resultater 7,8. Imidlertid udviser kulturbiomaterialer fra decellulariseret væv, herunder membranmatrixen, typisk batch-til-batch-variabilitet, der kan kompromittere reproducerbarheden9. Desuden giver matricer afledt af tumorer med forskellig vævsoprindelse end de undersøgte muligvis ikke de relevante fysiologiske signaler10. Endelig har kræftformer med høje grader af intratumoral heterogenitet mikromiljøegenskaber, der varierer på en submikronstørrelsesskala, og som membranmatrixen ikke kan indstilles til at rekapitulere11.

Glioblastom (GBM), en ensartet dødelig hjernetumor med en median overlevelsestid på ca. 15 måneder, er en kræftform, for hvilken behandlingsudviklingen har været særlig vanskelig12,13. Den nuværende standard for pleje af GBM består af primær tumorresektion efterfulgt af strålebehandling og derefter kemoterapi ved hjælp af temozolomid (TMZ)14. Alligevel udviser mere end halvdelen af kliniske GBM-tumorer behandlingsresistens gennem forskellige mekanismer 15,16,17. Forudsigelse af effekten af et behandlingsregime for en individuel patient er ekstremt vanskelig. Standard prækliniske modeller, der bruges til at forudsige individuelle resultater, består af patientafledte tumorceller xenografteret ortopisk i immunkompromitterede mus. Mens patientafledte xenotransplantater kan rekapitulere mange aspekter af kliniske GBM-tumorer og er værdifulde for prækliniske modeller18, er de i sagens natur dyre, lave gennemstrømning, tidskrævende og involverer etiske bekymringer19. Kulturer af patientafledte celler, på 2D-plastoverflader eller som sfæroider, undgår for det meste disse problemer. Mens patientafledte celler bevarer genetiske afvigelser, har deres kulturer i 2D eller som suspenderede sfæroider stort set været dårlige repræsentationer af patientafledte xenotransplantater hos gnavere og originale patienttumorer20. Tidligere har vi og andre vist, at GBM-celler dyrket i en 3D ECM, der efterligner hjernevævets mekaniske og biokemiske egenskaber, kan bevare lægemiddelresistensfænotyper 10,21,22,23.

Interaktioner mellem hyaluronsyre (HA), et polysaccharid, der er rigeligt i hjernen ECM og overudtrykt i GBM-tumorer, og dets CD44-receptor modulerer erhvervelsen af lægemiddelresistens in vitro 21,24,25,26,27. For eksempel øgede inkluderingen af HA i bløde 3D-kulturer evnen hos patientafledte GBM-celler til at erhverve terapeutisk resistens. Denne mekano-responsivitet var afhængig af HA-binding til CD44-receptorer på GBM-celler21. Derudover forstærkede integrinbinding til RGD-bærende peptider, inkorporeret i 3D-kulturmatricer, CD44-medieret kemoresistens på en stivhedsafhængig måde21. Ud over HA varierer ekspressionen af flere ECM-proteiner, mange indeholdende RGD-regioner, mellem normale hjerne- og GBM-tumorer28. For eksempel rapporterede en undersøgelse, at 28 forskellige ECM-proteiner blev opreguleret i GBM-tumorer29. Inden for dette komplekse tumormatrixmikromiljø integrerer kræftceller mekaniske og biokemiske signaler for at give en bestemt resistensfænotype, som afhænger af relativt små forskelle (f.eks. Mindre end en størrelsesorden) i Youngs modul eller densitet af integrinbindende peptider 28,29,30.

Den nuværende protokol karakteriserer, hvordan tumorceller fortolker unikke kombinationer af matrixsignaler og identificerer komplekse, patientspecifikke matrixmikromiljøer, der fremmer behandlingsresistens (figur 1A). En fotokemisk metode til generering af miniaturiserede, præcist indstillede matricer til 3D-kultur giver et stort, ortogonalt variabelt rum. Et specialbygget udvalg af lysdioder, der drives af en mikrocontroller, blev inkorporeret i photocrosslink-hydrogeler inden for et 384-brønds pladeformat for at øge automatisering og reproducerbarhed. Eksponeringsintensiteten blev varieret på tværs af brønde for at ændre mikromekaniske egenskaber af resulterende hydrogeler, som vurderet ved hjælp af atomkraftmikroskopi (AFM). Selvom dette manuskript ikke fokuserer på at konstruere selve belysningsarrayet, leveres et kredsløbsdiagram (figur 1B) og delliste (materialetabel) som hjælpemidler til enhedsgengivelse.

Denne rapport demonstrerer den hurtige generering af en række GBM-celler dyrket i unikke 3D-mikromiljøer, hvor Youngs modul (fire niveauer over en enkelt størrelsesorden) og integrinbindende peptidindhold (afledt af fire forskellige ECM-proteiner) blev varieret ortogonalt. Metoden blev derefter brugt til at undersøge de relative bidrag fra hydrogelmekanik og ECM-specifikt integrinengagement på levedygtigheden og spredningen af patientafledte GBM-celler, når de erhverver resistens over for temozolomid (TMZ) kemoterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Patientafledte GBM-cellelinjer (GS122 og GS304) blev leveret af professor David Nathanson (vores samarbejdspartner), der udviklede disse linjer under en protokol godkendt af UCLA Institutional Review Board (IRB # 10-000655). Celler blev afidentificeret, så cellelinjerne ikke kunne knyttes tilbage til de enkelte patienter.

1. Fremstilling af hydrogelopløsning

  1. Tilbered HEPES-bufferopløsning ved at opløse HEPES-pulver ved 20 mM i Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS). PH justeres til 7 efter fuld opløsning.
  2. I HEPES-bufferopløsningen opløses thioleret HA (700 kDa nominel molekylvægt, se Materialetabel), fremstillet efter den foregående rapport31, således at 6%-8% af carboxylsyreresterne på hver glucuronsyre modificeres med en thiol i en koncentration på 10 mg/ml i bufferopløsning.
    BEMÆRK: Et ravfarvet hætteglas anbefales for at forhindre thioloxidation ved omgivende lys.
    1. Rør ved hjælp af en magnetisk omrøringsplade (<1.000 o / min) ved stuetemperatur, indtil den er helt opløst, typisk omkring 45 min.
  3. Mens HA opløses, skal der fremstilles separate opløsninger af (1) 100 mg / ml 8-arm-PEG-norbornen (20 kDa), (2) 100 mg / ml 4-arm-PEG-Thiol (20 kDa), (3) 4 mM cystein- eller cysteinholdigt peptid (f.eks. GCGYGRGDSPG) og (4) 4 mg / ml LAP i mikrocentrifugerør (se materialetabel).
    1. Hver af disse fire opløsninger fremstilles i den HEPES-bufferopløsning, der er fremstillet i trin 1.1. Vortex opløsningerne for at sikre fuld opløsning af hvert reagens inden udførelse af trin 4.
      BEMÆRK: Hvis der testes flere forskellige peptider, skal hver indeholde en cystein eller anden kilde til thioldel for denne konjugeringskemi.
    2. Forbered opløsninger (4 mM tilgængelig thiol) af alle peptider, der skal bindes i en enkelt hydrogel på dette tidspunkt.
      BEMÆRK: Peptidsekvenser og ECM-proteiner, hvorfra de blev afledt og anvendt i denne undersøgelse, er anført i tabel 1. N-acetylcystein (se materialetabel), som celler ikke binder til, kan erstattes af et bioaktivt, thiolholdigt peptid for at titrere koncentrationen af et klæbende peptid eller fungere som en negativ kontrol31.
  4. De individuelle opløsninger af HA, PEG-Norbornen, PEG-thiol og cystein/thiolholdige peptider blandes (se materialetabel) for at opnå de endelige koncentrationer for de endelige hydrogelmatricer, der er anført i tabel 2. Rør (<1.000 o /min) på en magnetisk omrøringsplade i mindst 30 minutter for at blande helt.
    BEMÆRK: HA-opløsninger er meget tyktflydende og håndteres bedst ved hjælp af en positiv forskydningspipette (se Materialetabel). Hvis en positiv forskydningspipette ikke er tilgængelig, kan viskøse opløsninger også undværes med en standard mikropipette ved langsomt at pipettere ved hjælp af brede åbningsspidser.

2. Belysning og fotocrosslinking af hydrogeler via et LED-array

FORSIGTIG: Brug UV-beskyttende briller, og dæk belysningsfeltet med UV-absorberende materiale.

BEMÆRK: LED-arrayet beskrevet i denne protokol består af seks sæt med otte lysdioder placeret i serie, som illustreret af det medfølgende kredsløbsdiagram (figur 1A). Hvert sæt lysdioder kan drives uafhængigt, hvilket giver mulighed for op til seks forskellige bestrålinger pr. Kørsel. Supplerende fil 1 indeholder skærmbilleder svarende til følgende anvisninger for yderligere vejledning.

  1. Download filen Illumination Device.zip fra de supplerende kodningsfiler. Denne mappe indeholder følgende filer: Arduino.zip (Supplementary Coding File 1), Drivers.zip (Supplementary Coding File 2), GUI.zip (Supplementary Coding File 3) og Holder.zip (Supplementary Coding File 4).
    BEMÆRK: 3D Print de øverste og nederste dele til at holde printkortet på plads (se Supplerende kodningsfiler for detaljer).
  2. Download og installer mikrocontrollersoftwaren (se Materialetabel).
  3. Download og installer GUI-softwaren (se Materialetabel). Se Supplerende fil 1 for instruktioner til softwarebetjening.
  4. Åbn Behandling og installer controlIP5-biblioteket ved at klikke på Sketch > Importer bibliotek > Tilføj bibliotek. Søg derefter efter controlIP5 i biblioteker, og klik på Installer. Udfør dette for allerførste gang.
  5. Tænd belysningsenheden (se Materialetabel) ved hjælp af 36 Volt strømforsyningen, og tilslut den til en pc ved hjælp af et mikro-USB-kabel.
    BEMÆRK: Nogle enheder installerer ikke drivere automatisk til forskellige Arduino nano-kort. Et sæt drivere findes i enhedens zip-fil.
  6. Åbn filen Arduino.ino, der findes i mappen Adruino.zip, ved hjælp af Arduino IDE.
  7. Kompiler filen Arduino.ino ved at klikke på knappen Flueben . Upload den kompilerede kode ved at klikke på pilknappen .
  8. Åbn filen GUI.pde, der findes i mappen GUI.zip, ved hjælp af Processing.
  9. Klik på Kør i behandlingsprogrammet for at starte den grafiske brugergrænseflade til styring af belysningsenheden.
  10. I det grafiske brugergrænsefladevindue skal du klikke på Intensitet for at kolonnen, der indeholder hydrogelprecursoropløsningen, skal krydslinkes, og indtaste den ønskede intensitet. Klik på feltet Tid og indtast ønsket tid. For den løsning, der er angivet i tabel 2, vil dette være 15 s.
    BEMÆRK: Slutbrugere skal kalibrere digitale intensitetsværdier til bestråling ved hjælp af et radiometer. Eksempler på typiske intensiteter findes i figur 2A.
  11. Juster prøverne med belysningsanordningen (figur 2B) med hver anden LED i en enkelt kolonne af silikoneformene (se Materialetabel) eller 384-brøndplade. Klik på Udfør for at starte belysningen. Gentag denne proces efter behov for belysning af flere dias eller andre brønde på en 384-brøndplade.
    BEMÆRK: Holderen er konstrueret således, at pladen med 384 brønde sidder i flugt med det ene hjørne af det indre kammer under belysning.
    1. Efter belysning, når den placeres i et hjørne, skal du flytte brøndpladen til det næste hjørne og gentage. For at belyse brønde på den anden halvdel af pladen skal du løfte pladen ud af holderen og dreje 180 °.
  12. Generer hydrogeler med varierende mekanik til mekanisk karakterisering ved at følge nedenstående trin.
    1. Rengør glassedrids og silikoneforme ved hjælp af tape for at fjerne snavs. Sæt silikoneformene på glasglasset, tryk ned for at sikre en god tætning, og fortræng eventuelle luftbobler.
    2. 80 μL hydrogelprecursoropløsning, som fremstillet i trin 1.4, pipetteres i hver silikoneform på glasglasset.
    3. Placer glasglasset på belysningsanordningen, der er justeret med hver anden LED i en enkelt kolonne. Udsæt hydrogelprecursorerne for UV-lys i 15 s, som beskrevet i trin 2, for fotocrosslink.
    4. Når belysningen er stoppet, skal du hente gliderne og løsne gelerne fra formene ved at spore formens indre omkreds med en fin spids (10 μL pipettespids, 30 G nål osv.). Fjern silikoneforme med pincet/pincet.
    5. Flyt tværbundne hydrogeler i individuelle brønde på en 12-brøndplade ved at væde en spatel og forsigtigt skubbe dem af glasglasset. Fyld hver brønd med 2 ml DPBS (se materialetabel), inden hydrogelen tilsættes. Opsvulm gelerne i DPBS-opløsning i mindst 12 timer (typisk natten over) ved stuetemperatur (til den næste dags mekaniske karakterisering).

3. Målinger af atomic force microscopy (AFM)

  1. Tænd for atomkraftmikroskopet (AFM) i henhold til producentens anvisninger (se Materialetabel). Denne protokol indeholder korte instruktioner til brug af instrumentet og den relaterede software.
  2. Installer AFM-sonden (se Materialetabel).
    BEMÆRK: Til denne undersøgelse blev en trekantet siliciumnitrid cantilever med en nominel fjederkonstant på 0,01 N/ m modificeret med en sfærisk 2,5 μm siliciumdioxidpartikel.
  3. Efter installationen skal du justere laseren til toppen af den trekantede sonde og derefter justere spejl- og laserafbøjning for at maksimere signalsummen (typisk mellem 1,5-2,2 volt).
  4. Sonden nedsænkes i DPBS, og vent i op til 15 minutter for at opnå termisk ligevægt. Klik på kalibreringsknappen , og vælg Kontaktafhængig kalibrering. Klik på knappen Indsaml termisk tuning , og vælg toppen omkring 3 kHz til kalibrering efter dataindsamling.
    BEMÆRK: Let justering af spejlet og laserdeflektorerne kan være nødvendig efter nedsænkning i en væske på grund af ændringer i brydningsindekset.
  5. Gå hen til overfladen af en petriskål (plast) ved at indstille indflyvningsparametrene til konstant hastighed, en målhøjde på 7,5 μm og en indflyvningshastighed på 15 μm/s. Aktivér baselinemåling pr. kørsel for indflyvning , så indflyvningen kører kontinuerligt og ikke stopper tidligt på grund af afdrift i deflektoren.
  6. Ved indflyvning indstilles anskaffelsesparametre for kraftkortlægning til 4 nN-turnarounds, 2 μm indrykningsafstand, 1 μm/s hastighed og 0 s kontakttid. Tryk på Start-knappen for at begynde at opsamle en kraftkurve på plastoverfladen (f.eks. en brøndplade).
  7. Gå tilbage til kalibreringsvinduet, og vælg den del af kraftkurven, der svarer til plastens kontakt og indrykning. Accepter de beregnede følsomheds- og stivhedsværdier for sonden for at fuldføre kalibreringen.
  8. Efter kalibrering hæves AFM-sonden, og hydrogelprøven anbringes til forhør. Fremgangsmåde hydrogel efter indstillingerne i trin 5.
    BEMÆRK: Under indflyvningsproceduren mod hydrogeloverfladen kan enheden fejlagtigt udløse den nærmede tilstand. For at kontrollere den faktiske tilgang skal der opnås en kraftkurve som i trin 4.6. Gentag indflyvningsproceduren, hvis den resulterende kurve ikke viser kontakt og resulterende indrykning.
  9. Når overfladetilgangen er vellykket, skal du skifte til Force Mapping-tilstand og indstille anskaffelsesparametre til et kort på 8 x 8 størrelse med 40 μm længde pr. Akse. Få kraftkort i forskellige regioner for at vurdere ensartetheden af stivhedsmålinger.
    1. Fortolke kraftkurver ved hjælp af softwareprogrammet JPK SPM Data Processing gennem en Hertz/Sneddon-modeltilpasning (ligning 1 og 2, se tabel 3 for definitionen af alle variablerne) med den sfæriske geometri valgt 32,33,3 4.
      Equation 1Ligning 132
      Equation 2Ligning 232

4. Opsætning og lægemiddelbehandling af 3D, matrix-indlejrede kulturer

  1. Forbered ønskede celler som en enkeltcelleopløsning.
    BEMÆRK: Forskellige celletyper kan kræve forskellige adgangsmetoder. En typisk protokol til passaging af en suspensionskultur af GBM-sfæroider fra en T-75-kolbe er rapporteret i reference31.
  2. GBM-sfæroider (ca. 150 μm i diameter) opsamles fra en T-75 kolbeophængskultur til et 15 ml konisk rør. Kulturkolben skylles med 5 ml DPBS for at fjerne eventuelle resterende celler og medier og tilsættes dette volumen til det koniske rør.
  3. Det koniske rør indeholdende celler centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugering fjernes supernatanten med en 5 ml serologisk pipette, idet du sørger for ikke at forstyrre cellepillen, og resuspend i 5 ml DPBS.
  4. Centrifuger ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at vaske celler. Aspirer supernatanten med en 5 ml serologisk pipette, pas på ikke at forstyrre cellepillen, og resuspend derefter celler i 2 ml celledissociationsreagens (se materialetabel).
  5. Inkuberes ved stuetemperatur i 10-15 min. Der tilsættes 3 ml komplet medium (se materialetabel), og pipetter forsigtigt 3-5 gange for at nedbryde sfæroiderne til en enkeltcellesuspension31.
  6. Enkeltcellesuspensionen centrifugeres ved 400 x g (enkeltcellesuspensioner kan spindes hurtigere til pelletdannelse) i 5 minutter til pelletceller ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten med en 5 ml serologisk pipette, og pas på ikke at forstyrre cellepillen. Resuspend celler i 1 ml komplet medium.
    BEMÆRK: Hvis cellerne forbliver i klumper, snarere end som enkeltceller i suspension, efter passaging, kan celler føres gennem en 40 μm cellesi for at opnå en enkelt celle suspension.
  7. Fjern en del af cellerne til tælling ved hjælp af et hæmocytometer. Fortynd denne del to gange med trypanblå, som gennemsyrer celler med kompromitteret levedygtighed. Tæl kun de levende, farveløse celler. Typisk giver en T-75 podet ved 800.000 celler pr. Kolbe 2-3 millioner celler efter en uge i kultur.
  8. Bestem antallet af celler, der er nødvendige for indkapsling. Overfør et volumen medier indeholdende det samlede antal celler, der er nødvendige, til et sterilt 1,7 ml mikrocentrifugerør. Centrifuger ned ved 400 x g i 5 min ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: For eksempel er der behov for mindst 2,5 millioner celler, der er resuspenderet i 1 ml gelvolumen, for at indkapsle celler ved 2,5 millioner celler / ml. Et gelvolumen på 1 ml giver brugerne mulighed for at dispensere 100 geldråber, hvor hver geldråbe er på 10 μL volumen. Forberedelse af et ekstra ~ 20% volumen celler suspenderet i hydrogelopløsning anbefales for at tage højde for tab under pipetteoverførsel. Således ville man forberede 3 millioner celler og 1,2 ml hydrogelprecursoropløsning i dette eksempel. En minimumsdensitet på 500 tusind celler / ml anbefales.
  9. Aspirer supernatanten med en mikropipette, og pas på ikke at forstyrre cellepillen. Cellepille i hydrogelprecursoropløsningen, som fremstillet i trin 1.4, blandes godt ved at pipettere op og ned med en 1.000 μL mikropipette 4-5 gange.
  10. Indlæs cellerne i en gentagen pipette (se Materialetabel), der er indstillet til at dispensere 10 μL. For at undgå bobler og ujævn dispensering skal du prime repeatpipettoren ved at dispensere yderligere 1-2 gange i en affaldsbeholder.
  11. I hver brønd af en 384-brøndplade dispenseres 10 μL celler suspenderet i hydrogelopløsning fra gentagelsespipettoren. Brug LED-arrayet til at belyse hver brønd indeholdende celler (trin 2) i 15 s med intensiteter (eksempel resulterer i figur 2A anvendte intensiteter på 1,14, 1,55, 2,15, 2,74 mW / cm2) for at opnå de ønskede mekaniske egenskaber.
    BEMÆRK: Det foreslås at starte med fem replikater pr. eksperimentel tilstand og skalere op eller ned afhængigt af den ønskede gennemstrømning og varians af slutpunktsassayet.
  12. Der tilsættes 40 μL komplet medie til hver brønd, der indeholder cellerne. Tilsæt 50 μL DPBS til ikke-eksperimentelle, tørre brønde, der omgiver gelerne for at minimere tab som følge af fordampning.
  13. For GBM-celler tilsættes 40 μL af det medieholdige lægemiddel (f.eks. TMZ, se Materialetabel) for at opnå den endelige ønskede koncentration (10 μM-100 μM i dimethylsulfoxid (DMSO) eller køretøj (DMSO) i overensstemmelse hermed startende 3 dage efter indkapsling.

5. CCK8-spredningsassay

  1. Der tilsættes 10 μL CCK8-reagens (se materialetabel) til hver brønd, der indeholder cellerne.
    BEMÆRK: Hvis du udfører dette assay for første gang, skal du inkludere negative kontrolbrønde såsom kun medier eller cellefri hydrogel i medier.
  2. Inkuberes i 1-4 timer i henhold til producentens anvisninger.
    BEMÆRK: Denne tid kan variere som funktion af celletype og densitet, og derfor skal inkubationstider testes for hver applikation, så absorbansværdier falder inden for et lineært interval, et krav for anvendelse af øllov35.
  3. Absorbanser ved 450 nm aflæses for alle brønde efter inkubation.
  4. Den gennemsnitlige absorbans ved 450 nm opnået i trin 3 beregnes for køretøjets tilstand for hver gruppe. Opdel hver lægemiddelbehandlet brønd med gennemsnittet af køretøjets kontrol pr. Gruppe.
  5. Konfidensintervaller beregnes ved at generere bootstrap-fordelinger (N = 10.000) gennem percentilmetoden36.
    BEMÆRK: Generelt kan man bruge 95% konfidensintervaller og fortolke forhold, hvis konfidensintervaller ikke krydser over 1, for at være signifikante og berettige yderligere undersøgelse. Indstilling af konfidensintervaller til 95% er kongruent med indstilling af en signifikansafskæring på p = 0,05. For de data, der er vist i resultaterne, er der nytte ved at skelne mellem forhold, der enten fremmer eller hæmmer matrixmedieret lægemiddelresistens, hvilket kræver en tosidet analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

AFM-målinger bekræftede præcis kontrol af hydrogelmekanik som en funktion af UV-bestråling (mW / cm2) under fotokrydsbinding ved hjælp af et specialbygget, Arduino-styret LED-array (figur 2A). Hydrogelformuleringen, der anvendes i denne protokol, findes i tabel 2. Afstanden mellem led'erne på den medfølgende skabelon matcher afstanden for hver anden brønd i en 384-brøndplade, hvilket giver mulighed for dannelse af geler inde i pladen (figur 2B). AFM-undersøgelse af mikronskalaområder på overfladerne af enkelthydrogeler viste, at hydrogeler med blødere gennemsnitlig Youngs moduli også havde mindre moduliområder end stivere hydrogeler (figur 2C-E).

Cellesåningstætheder, der maksimerer levedygtigheden, bør bestemmes empirisk for hver celletype. Denne undersøgelse viser, at 3D-kulturer af GS122-celler podet ved tætheder på 2.500.000 celler / ml udviste væsentligt højere anvendeligheder, når de blev vurderet efter 7 dage i kultur sammenlignet med dem, der blev podet ved tætheder på 500.000 celler / ml (figur 3A). Desuden blev GS122- og GS304-celler brugt som modeller til dyrkning af patientafledte GBM-celler for at undersøge afhængigheden af kemoterapirespons på stivheden og den biokemiske sammensætning af matrixmikromiljøet (figur 3B-D). Cellelevedygtigheden blev vurderet gennem CCK8-analysen efter behandling med TMZ i 4 dage, hvilket førte til en samlet dyrkningstid på 7 dage ved at skalere OD450-måling ved en tilsvarende køretøjskontrol og generere 95% konfidensintervaller ved bootstrapping (N = 10.000) med percentilmetoden36. Med disse fordelinger blev forhold, hvor konfidensintervaller ikke overlappede med en værdi på 1 (stiplet linje), betragtet som signifikante. Sammenlignet med mere almindeligt anvendte statistiske metoder såsom t-tests eller ANOVA foretrækkes estimering af konfidensintervaller ved hjælp af bootstrapping til at estimere distributioner, der ville være til stede for større prøvestørrelser, til screeningsassays, hvis mål er at identificere en mindre delmængde af betingelser for yderligere undersøgelse. En yderligere fordel ved denne metode er, at betingelser med et mindre spread i et konfidensinterval kan prioriteres frem for andre betingelser med en lignende middelværdi, men et højere spread i konfidensintervallet. Denne undersøgelse viste, at GS122-celler opnåede overlevelsesfordele fra mikromiljøinteraktioner (figur 3B). Denne overlevelsesfordel var signifikant i 0,8, 1 og 4 kPa-betingelserne, men ikke i 8 kPa-tilstanden for GS122-celler. GS304-celler var ufølsomme over for både stivhed og TMZ-behandling.

Effekten af den biokemiske sammensætning af matrixmikromiljøet blev derefter undersøgt ved at variere inkluderingen af ECM-afledte, integrinbindende peptider (tabel 1), der vides at være opreguleret i GBM-tumormikromiljøet ved to stivheder, 0,8 kPa og 8 kPa. Igen modtog GS304-celler ingen signifikant overlevelsesfordel ved matrixinklusion og var ufølsomme over for TMZ. GS122-celler viste imidlertid overlevelsesgevinster i 8 kPa-tilstanden, når osteopontinafledte peptider blev inkluderet i matrixen, mens inkorporeringen af integrinbindende sialoprotein (IBSP) - eller tenascin-C-afledte peptider gav minimale overlevelsesfordele, såsom kultur i matricer med det generelle RGD-peptid (figur 3C). I modsætning hertil gav ingen peptider overlevelsesgevinster i 0,8 kPa-kulturtilstanden (figur 3D). Sammen antyder resultaterne iboende forskelle i både matrix- og lægemiddelrespons mellem de to patientafledte cellelinjer, der evalueres.

3D-hydrogelkulturer kan visualiseres ved hjælp af standard lysmikroskopi for at vurdere, hvordan cellemorfologi og invasiv adfærd påvirkes af kulturforhold på en cellelinjeafhængig måde (figur 4). Både GS122- og GS304-celler spredes, når de dyrkes i bløde eller stive hydrogelmatricer, herunder RGD-holdige peptider (figur 4A). Mens peptider påvirkede cellespredning, forudsagde en celles evne til at sprede sig ikke nødvendigvis kulturens evne til at erhverve TMZ-resistens. For eksempel viser GS122-celler en lignende mangel på spredning i både 0,8 og 8 kPa med osteopontin; GS122 viste dog kun forbedret modstand mod TMZ i 8 kPa-tilstand (figur 4B). Endelig kan denne miniaturiserede 3D-kulturplatform bruges til at dyrke humane celler fra andre tumortyper, herunder levedygtige organoider af terminalt differentierede, neuroendokrine prostatacancerceller (figur 4C).

Figure 1
Figur 1: Tegneserieafbildning af protokollen. (A) Tegneserieskildring af processen til 3D-kulturgenerering og overvågning. (1) Der fremstilles HA-baserede hydrogelopløsninger. (2) Hydrogelopløsninger krydsforbindes derefter med variabel intensitet gennem LED'er, der styres af en Arduino-mikrocontroller. (3) Resulterende hydrogelmekanik vurderes af AFM for at verificere forskellen i gelmekanik. (4) Opløsninger, der matcher formuleringen fra trin 1, anvendes derefter til at indkapsle patientafledte GBM-celler og behandles med lægemidlet. (5) Efter 7 dage aflæses cellelevedygtigheden via CCK8 kolorimetrisk assay. (B) Kredsløbsdiagram for brugerdefineret LED-belysningsarray, der anvendes i denne protokol. De enkelte komponenter er angivet i materialetabellen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Hydrogeler fremstillet med varierende stivhed ved hjælp af indstillelige lysdioder til at modificere bestråling. (A) Violinplotter viser den beregnede Youngs modul fra kraftkurver genereret af AFM over tre overfladeområder, der spænder over 40 μm x 40 μm, af individuelle hydrogeler. Youngs modul af hver hydrogel er vist som en funktion af UV-bestråling under fotocrosslinking. Vandrette hvide linjer angiver medianen for hver eksperimentel gruppe. (B) LED-array med afstand, der matcher stigningen i multi-well plader (384 brønde). (C) Varmekort, der viser den regionale variation af Youngs modul (gennemsnit = 0,8 kPa) for en typisk gel tværbundet ved eksponering til 1,55 mW/cm2 for 15 s. (D) Varmekort, der viser den regionale variation af Youngs modul (gennemsnit = 8 kPa) for en typisk gel tværbundet ved eksponering til 2,74 mW/cm2 for 15 s. (E) Histogram, der illustrerer rækkevidden af Youngs modulmålinger over overfladen af hydrogeler vist i C og D. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Ortogonal præsentation af stivhed og integrinbindende peptid afslører iboende biologiske forskelle mellem GBM-cellelinjer. (A) Typiske absorbansværdier for GS122-celler indkapslet i en 10 μL hydrogel ved en densitet på 500.000 eller 2.500.00 celler pr. Ml. (B) Lægemiddelresponsdata for GS122- og GS304-cellelinjer visualiseres ved at normalisere OD450-værdien af de lægemiddelbehandlede brønde (N = 5) med gennemsnittet af de køretøjsbehandlede brønde (N = 5). Levedygtighed i forbindelse med lægemiddelbehandling blev observeret at variere ikke-lineært for hydrogelstivhed, hvilket viste variation mellem cellelinjer. (C,D) Lægemiddelresponsdata for GS122- og GS304-cellelinjer, når typen af integrinbindende peptid blev inkluderet, og matrixstivhed blev varieret ortogonalt. Alle fejllinjer repræsenterer de 95% konfidensintervaller, der opnås ved at starte hver betingelse med N = 10.000. Den stiplede linje (y-akse = 1) svarer til det tilfælde, hvor OD450 for behandlingsbetingelserne er lig med køretøjet. Alle eksperimentelle værdier blev opnået efter 7 dage i kultur; TMZ blev tilføjet 3 dage efter indledende indkapsling til lægemiddelstudier. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Morfologiske forskelle mellem celler indkapslet i forskellige HA-baserede hydrogelmiljøer. (A) Fasekontrastbilleder af GS122 og GS304, når de blev dyrket i en hydrogel (0,8 og 8 kPa), viste et RGD-motiv. Hvide pile angiver celler med spredte morfologier. (B) Fasebilleder af GS122 og GS304, når de blev dyrket i en hydrogel (0,8 og 8kPa), viste et peptid afledt af osteopontin. Hvide pile angiver celler med spredte morfologier. Sorte pile angiver celler med afrundede morfologier. Efter 7 dage i kultur blev der taget billeder, og TMZ blev tilføjet 3 dage efter den første indkapsling. (C) Fasebillede af en terminalt differentieret neuroendokrine prostataorganoid. Skalastænger = 200 μm (for A, B); 100 μm (for C). Klik her for at se en større version af denne figur.

Protein Peptid sekvens
RGD GCGYGRGDSPG
Tenascin-C GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIRGV
Integrinbindende sialoprotein (IBSP) GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Osteopontin GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG

Tabel 1: ECM-proteiner og afledte peptidsekvenser.

Reagens Indledende koncentration Volumen (μL) Endelig koncentration
HA-SH-løsning 10 mg/ml 2300 5 mg/ml
PEG-SH 100 mg/ml 503 Varierer fra eksperiment til eksperiment
PEG-Norbornene 100 mg/ml 443 Varierer fra eksperiment til eksperiment
Peptid 4 μM 288 0,250 μM
Skød 4 mg/ml 288 0,25 mg/ml
HEPES-HBSS Nielsen 798

Tabel 2: Typiske endelige formuleringskomponenter til hydrogel.

Variabel Parameter
F Kraft
E Youngs modul
ν Poissons forhold
δ Indrykning (lodret spidsposition)
en Radius af kontaktcirkel
RS Radius af kugle

Tabel 3: Variabler og tilsvarende parametre til AFM-beregninger.

Supplerende fil 1: Vejledning vedrørende brugen af LED-arrayet til belysning og fotocrosslinking af hydrogeler. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 1: Arduino-fil til LED-array-mikrocontroller (Arduino.zip). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 2: Tredjepartsdrivere til Arduino nano (drivere.zip). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 3: Behandlingsfil til GUI-styring af LED-array-mikrocontroller (GUI.zip). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 4: Fil til 3D-udskrivning ekstern holder til LED-array-mikrocontroller (holder.zip). Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det nuværende arbejde præsenterer metoder til at generere 3D, miniaturiserede kulturer inden for HA-baserede, samtidig med at matrixstivhed og peptider, der er tilgængelige for integrininddragelse, ændres. Denne teknik muliggør systematisk undersøgelse af, hvordan matrixparametre påvirker cellulære fænotyper (f.eks. Levedygtigheden af kræftceller udsat for kemoterapi) med øget gennemstrømning. Tidligere tilgange, herunder den, der præsenteres heri, har indstillet hydrogelstivhed ved at variere den procentvise totalpolymer i den endelige formulering, hvor stivere hydrogeler har et højere polymerindhold21,31. Denne tilgang kræver imidlertid udarbejdelse af en unik hydrogelformulering for hver ønsket stivhed, en proces, der i sig selv sænker gennemstrømningen. Her indstilles hydrogelstivhed ved varierende UV-bestråling under tværbinding, således at hydrogeler med flere stivheder kan opnås fra en enkelt forløberopløsning. Fremtidige udøvere, der måske ikke har mulighed for at konstruere den brugerdefinerede belysning, der er beskrevet her, kan let erstatte en kommercielt tilgængelig UV-spothærdningsenhed og justere belysningen, når forskellige sektorer af en brøndplade hærdes. Ulempen ved at bruge en kommerciel spothærdningsenhed er nedsat gennemstrømning sammenlignet med den brugerdefinerede belysning. En begrænsning af de nuværende metoder er, at der stadig skal fremstilles unikke opløsninger for hver peptidtilstand. Lignende metoder er tidligere blevet anvendt af andre grupper til fremstilling af stivhedsgradientholdige hydrogeler37,38. Denne undersøgelse viser imidlertid, hvordan fotocrosslinking kan muliggøre miniaturisering af eksperimentelle prøver og reducere kompleksiteten af eksperimentelle opsætninger. Samlet set vil disse forbedringer give forskere mulighed for at øge eksperimentel gennemstrømning, når de udfører 3D-kulturer i matrix-mimetiske biomaterialer og har nytte på tværs af flere områder inden for biomedicinsk videnskab ud over neuro-onkologi.

De repræsentative resultater viser, hvordan denne teknik kan bruges til at opsætte miniaturiserede 3D-kulturer af patientafledte GBM-celler i definerede matricer, hvor tilgængelige integrinbindende peptider og stivheder varieres inden for en standard 384-brøndplade, der passer til flere standardassays. Denne metode præsenterer repræsentative resultater for at screene, hvordan matrixparametre påvirker reaktioner på TMZ-kemoterapi i GBM-celler afledt af to unikke patienter, betegnet som GS122- og GS304-celler. Af de to patientafledte cellelinjer, der blev evalueret her, var GS122-cellernes respons på TMZ-behandling følsom over for matrixmikromiljøet, mens GS304-cellernes respons var ufølsom. Med hensyn til matrixstivhed, GS122 celler dyrket i 3D hydrogeler med en 4 kPa mikro-komprimerende modul maksimeret TMZ modstand, under hvilken tilstand behandlede celler steg i antal mere end ubehandlede celler over et 7-dages eksperimentelt kursus. Mekaniske egenskaber havde større virkninger på TMZ-resistens end de inkluderede integrinbindende peptider. Det forventes således, at virkningen af varierende peptidkoncentrationer, alene og i kombination, vil muliggøre opdagelsen af matrixbetingelser, der fremmer lægemiddelresistens i fremtiden. Ufølsomheden af GS304-celler til deres omgivende matrix kan indikere, at matrixen er mere indflydelsesrig på celler, som GS122-celler, der oprindeligt er følsomme over for TMZ, men alligevel erhverver resistens under behandlingen. I modsætning hertil er det uklart, i hvilket omfang matrixsignaler påvirker celler, der allerede er behandlingsresistente i begyndelsen af eksperimentet, som med GS304-celler.

Resultaterne fra denne undersøgelse afveg noget fra tidligere rapporterede resultater. De blødeste HA-baserede hydrogeler evalueret (1 kPa bulk Youngs modul, der efterligner stivheden af den indfødte hjerne) fremmede maksimal TMZ-resistens GBM-celler afledt af fire tumorer fra forskellige patienter end den, der blev evalueret her21. Der er flere mulige årsager til denne uoverensstemmelse. For det første blev et udvidet udvalg af hydrogelstivheder undersøgt i den aktuelle undersøgelse, som sammenlignede hydrogeler over et interval på 0,8 kPa til 8 kPa mikrokompressiv moduli, mens tidligere undersøgelser kun sammenlignede hydrogeler med 1 kPa og 2 kPa Youngs moduli. Derudover blev mekanisk karakterisering i de tidligere undersøgelser udført i bulkskalaen ved hjælp af lineær mekanisk kompression til at estimere Youngs modul, mens AFM i denne undersøgelse blev brugt til at måle et mikrokompressivt modul. For forskere, der søger at implementere de metoder, der er til stede her, som ikke kræver mikroskala mekanikmålinger, er bulkskalamoduli ved hjælp af reometri eller lineær mekanisk test helt acceptable erstatninger for AFM. Især mikromekaniske analyser afslørede det heterogene moduli over overfladen af en enkelt gel. Der er ikke foretaget sammenlignelige AFM-målinger på hydrogelerne formuleret i tidligere undersøgelser, men det forventes, at variansen af stivheder, der præsenteres inden for en enkelt hydrogel, har været større end dem i den aktuelle undersøgelse. Hydrogeler i de tidligere undersøgelser blev genereret ved hjælp af en Michael-type addition tværbinding afhængig af kinetisk blanding ved 37 grader C 10,21,24. I modsætning hertil tillader photocrosslinking grundig blanding af hydrogelprecursorer før lyseksponering, hvilket forbedrer homogeniteten inden for 3D-hydrogelen og igen reducerer variationen i celleresponser. Endelig udviser GBM-tumorer notorisk heterogen og uforudsigelig adfærd39, og det er derfor rimeligt at forvente, at celler afledt af individuelle tumorer ligeledes ville have unikke egenskaber. Denne mangel på konsistens på tværs af patientprøver motiverer behovet for en platform med høj kapacitet til belysning af patientspecifikke tumoregenskaber.

Almindelige faldgruber ved udførelse af den miniaturiserede hydrogelfotocrosslinking-procedure inkluderer ufuldstændig blanding af hydrogelprecursorer, hvilket resulterer i dårlig reproducerbarhed og spontan gelering af HA-opløsningen under blanding. Disse problemer kan afhjælpes ved at omrøre HA-thiol i mindst 45 minutter og den komplette forløberopløsning i mindst yderligere 30 minutter, mens man nøje overvåger pH-værdien af hydrogelprecursoropløsninger for at sikre, at den forbliver under 7 for at forhindre thioloxidation og dannelse af disulfid til tværbindinger. I modsætning til tværbindingsmetoder ved hjælp af en kinetisk Michael-type additionsmekanisme10,21 sænker fotocrosslinkingsmetoden, der anvendes i denne protokol, sandsynligheden for spontan gelering, når alle reagenser kombineres21. Kvalitetskontrolkontrolpunkter anbefales stærkt, såsom måling af HA-thiolationsprocent31 og fremstilling af ekstra hydrogeler til parallel mekanisk test til hvert parti 3D-kulturer. Endelig skal der identificeres såtætheder for 3D-indkapsling i hydrogeler for hver anvendt celletype eller linje. Generelt viser resultaterne, at en minimumskoncentration på 1 million celler / ml er tilstrækkelig til 3D-kulturen i de fleste celler, der danner sfæroider, herunder patientafledte GBM-celler, humane embryonale stamceller (H9) og humaninducerede pluripotente stamceller (data ikke vist). Det anbefales også at inkludere ROCK-hæmmerbehandling før indkapsling (trin 4.1) ved anvendelse af særligt følsomme celler40.

I forbindelse med udvikling af nye behandlingsmetoder for GBM giver protokollen, der præsenteres her, metoder til funktionel screening af lægemiddelresponser af patientafledte GBM-celler inden for et fysiologisk relevant mikromiljø. Et rigt lager af genetiske, epigenetiske og kliniske mRNA-ekspressionsdata for GBM (og andre kræftformer) er offentligt tilgængeligt takket være indsatsen fra The Cancer Genome Atlas (TCGA) og andre15. Brugt sammen med disse store datasæt forventes det, at data genereret fra funktionelle skærme af miniaturiserede 3D-kulturer kan afsløre nye korrelationer, hvilket forbedrer forudsigelsen af kliniske resultater hos individuelle patienter. For eksempel kan subpopulationer af patienttumorer identificeres, for hvilke nogle behandlinger, som matrixforstyrrende forbindelser såsom cilengitid, kan forbedre kliniske resultater41. Ud over lægemiddelrespons muliggør denne kulturplatform vurderinger af tumorcelleinvasion ved hjælp af velpladekompatible billeder med højt indhold. Fleksibiliteten af denne platform til at inkorporere mange forskellige peptider, alene eller i kombination, mens ortogonalt varierende stivheder kan hjælpe med at identificere matrixfunktioner, der driver GBM-tumoraggression.

Ud over GBM kan disse metoder tilpasses til at undersøge virkningerne af matrixparametre på andre celletyper i forbindelse med andre sygdomme, vævsudvikling og normal vævsfunktion. I fremtiden vil det være ligetil at øge gennemstrømningen af disse metoder yderligere, da de er specielt designet til at blive udført i forbindelse med multi-well plader for at lette vedtagelsen i eksisterende arbejdsgange til lægemiddelopdagelse ved at bruge kommercielt tilgængelige automatiserede væskebehandlere og billeddannere med højt indhold. Let integration med eksisterende infrastruktur og øget automatisering, som reducerer de tekniske færdigheder, der kræves for at producere og vedligeholde cellebelastede 3D-hydrogelkulturer, vil betydeligt sænke barriererne for at vedtage denne metode. Mens arbejdet her specifikt præsenterer kulturer inden for HA-baserede hydrogeler, forventes det, at denne metode let kan oversættes til andre almindeligt anvendte fotokrydslinkbare materialer til 3D-cellekultur, såsom methacryleret gelatine, og at de metoder, der er rapporteret her, vil give en nyttig retningslinje for yderligere anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne specifikt anerkende Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore og Itay Solomon for deres bidrag til tidligere iterationer af fotogelationsordningen. Cellelinjer GS122 og GS304 blev generøst leveret af David Nathanson. Alle figurer blev skabt med BioRender.com. UCLA kernefaciliteter, Molecular Screening Shared Resources og Nano and Pico Characterization Laboratory var medvirkende til arbejdet. Chen Chia-Chun blev støttet af UCLA Eli og Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program. Grigor Varuzhanyan blev støttet af et tumorcellebiologiuddannelsesprogram NIH Grant (T32 CA 009056).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.1 kOhm resistors, 6 W Digikey 35601k1ft
1.7 mL microcentrifuge tube Genesse Scientific 21-108
15 mL conical tube Fisher Scientific 14-959-70C
365 nm LED Digikey ltpl-c034uvh365
384 well plate Bio Greiner One 781090
40 µm cell strainer MTC bio C4040
4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) Laysan Bio 4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTs Digikey 2n5550ta
80 Ohm resistors, 0.125 W Digikey erjj-6enf80r6v
8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) Jenkem Technology A7025-1
Accutase Innovative Cell Technologies AT104500  cell dissociation  reagent
AFM Probes Novascan 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle
Arduino IDE Arduino 1.8.19
Arduino Nano Makerfire Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board
bFGF Peprotech 100-18B 20 ng/mL
CCK8 Abcam ab228554
Centrifuge Thermoscientific sorvall legend xtr
CP100ST Gilson F148415 Pipette tips for positive displacement pipette
Cubis Semi-Micro Balance Sartorius MSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50) Life Technologies 11330057 1x
DMSO Fisher Scientific BP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-) Genesse Scientific 25-508
EGF Peprotech AF100-15 50 ng/mL
Ethanol, Anhydrous Fisher Scientific A405P Add DI water to dilute to 70%
Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials Fisher Scientific 03-339-23C
Fisherbrand Weighing Paper Fisher Scientific 09-898-12B
G21 Supplement Gemini Bio 400-160 50x
Hanks Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific 14175095
HCl, ACS, 12M Sigma Aldrich S25838A Add DI water to dilute to 1 M
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma Aldrich H3149-100Ku 25 µg/mL
HEPES Sigma Aldrich H7006-100G
Hot Air Gun Wagner HT1000
Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide Genscript Custom Order GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% Sigma Aldrich 900889-1G
Magnetic stir plate Thermo Scientific SP194715
Microcentrifuge Thermo Scientific Sorvall legend micro 21R
Microman E single Channel Pipettor Gilson FD10004 Positive displacement pipette
Micropipette Tips Various Manufacturs Various sizes
mLine micropipette Sartorious
N-acetyl Cysteine Sigma Aldrich A7250-10G
Nanowizard 4 Bruker AFM microscope
NaOH Fisher Scientific ss255-1 Add DI water to dilute to 1 M
Normoicin Invivogen ant-nr-1 500x
Osteopontin Peptide Genscript Custom Order GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet Aid Drummond 4000102
Plain Microscope Slides Globe Scientific 1301
Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep Grace Bio Labs 664201-A Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet
Processing Processing 3.5.4
Repeater M4 Eppendorf 4982000322
Repeater Pipette Tips Sartorious 30089430 1 mL sizes
RGD Peptide Genscript GCGYGRGDSPG
Scoth Tape
Serological Pipettes Genesse Scientific 12-102,12-104 5,10 mL Pipettes
Solder Paste Digikey 315-NC191LT15T5-ND
Solder Wire
Straight dissecting forceps VWR Scientific 82027-408
Synergy H1 Plate Reader Biotek
T-75 Cell Culture Treated Flask Genesee Scientific 25-209
Temozolomide Sigma Aldrich T2577 Typically used from 10 µM to 100 µM
Tenascin-C Peptide Genscript GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR
GV
Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified Lifecore Biomedical HA700K5
VWR Spinbar, Flea Micro VWR 58948-375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
  2. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
  3. Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).
  4. Booth, B., Ma, P., Glassman, R. Oncology's trials. Market indicators. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 609-610 (2003).
  5. Da Ros, M., et al. Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).
  6. Broekman, M. L., et al. Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma. Nature Reviews Neurology. 14 (8), 482-495 (2018).
  7. Grundy, T. J., et al. Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness. Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).
  8. Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses. Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).
  9. Simoni, R. D., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (2002).
  10. Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
  11. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
  12. Spinelli, C., et al. Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).
  13. Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018. Neuro-Oncology. 23, Supplement_3 (2021).
  14. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  15. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  16. Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge. Contemporary oncology. 19, Poznan, Poland. 68-77 (2015).
  17. Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes and Diseases. 3 (3), 198-210 (2016).
  18. Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
  19. Levy, N. The use of animal as models: Ethical considerations. International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).
  20. Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).
  21. Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).
  22. Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
  23. Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
  24. Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
  25. Preston, M. Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination. Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).
  26. Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
  27. Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).
  28. Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. Future Science OA. 3 (3), (2017).
  29. Trombetta-Lima, M., et al. Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma. Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).
  30. Schregel, K., et al. Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography. NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).
  31. Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
  32. Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
  33. Sneddon, I. N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).
  34. Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).
  35. Mayerhöfer, T. G., Popp, J. Beer's law - Why absorbance depends (almost) linearly on concentration. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).
  36. Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping. Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).
  37. Lavrentieva, A. Gradient hydrogels. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 178, 227-251 (2020).
  38. Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).
  39. da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals. Cells. 8 (10), 1177 (2019).
  40. Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
  41. Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results. Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).

Tags

Bioengineering udgave 184
Hydrogelarrays muliggør øget gennemstrømning til screeningseffekter af matrixkomponenter og terapi i 3D-tumormodeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liang, J., Sohrabi, A., Epperson,… More

Liang, J., Sohrabi, A., Epperson, M., Rad, L. M., Tamura, K., Sathialingam, M., Skandakumar, T., Lue, P., Huang, J., Popoli, J., Yackly, A., Bick, M., Wang, Z. Z., Chen, C. C., Varuzhanyan, G., Damoiseaux, R., Seidlits, S. K. Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models. J. Vis. Exp. (184), e63791, doi:10.3791/63791 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter