Les réseaux d’hydrogel permettent d’augmenter le débit pour le dépistage des effets des composants matriciels et des thérapies dans les modèles tumoraux 3D

Summary

Le présent protocole décrit une plate-forme expérimentale pour évaluer les effets des signaux mécaniques et biochimiques sur les réponses chimiothérapeutiques des cellules de glioblastome dérivées de patients dans des cultures mimétiques matricielles 3D à l’aide d’un dispositif d’éclairage UV sur mesure facilitant la photocroision à haut débit d’hydrogels avec des caractéristiques mécaniques accordables.

Abstract

Les interactions cellule-matrice interviennent dans des processus physiologiques complexes par le biais d’indices biochimiques, mécaniques et géométriques, influençant les changements pathologiques et les réponses thérapeutiques. La prise en compte des effets matriciels plus tôt dans le développement de médicaments devrait augmenter la probabilité de succès clinique de nouveaux traitements. Il existe des stratégies basées sur les biomatériaux récapitulant des microenvironnements tissulaires spécifiques en culture cellulaire 3D, mais leur intégration avec les méthodes de culture 2D principalement utilisées pour le dépistage des drogues a été difficile. Ainsi, le protocole présenté ici détaille le développement de méthodes de culture 3D au sein de matrices de biomatériaux miniaturisés dans un format de plaque multi-puits pour faciliter l’intégration avec les pipelines de dépistage de médicaments existants et les tests conventionnels pour la viabilité cellulaire. Étant donné que les caractéristiques matricielles essentielles à la préservation des phénotypes cliniquement pertinents dans les cellules cultivées devraient être hautement spécifiques aux tissus et aux maladies, un dépistage combinatoire des paramètres de la matrice sera nécessaire pour identifier les conditions appropriées pour des applications spécifiques. Les méthodes décrites ici utilisent un format de culture miniaturisé pour évaluer les réponses des cellules cancéreuses à la variation orthogonale de la mécanique matricielle et à la présentation des ligands. Plus précisément, cette étude démontre l’utilisation de cette plate-forme pour étudier les effets des paramètres de matrice sur les réponses des cellules de glioblastome dérivées du patient (GBM) à la chimiothérapie.

Introduction

Le coût prévu du développement d’un nouveau médicament n’a cessé d’augmenter au cours de la dernière décennie, avec plus de 1 milliard de dollars dans les estimations actuelles¹. Une partie de cette dépense est due au taux élevé d’échec des médicaments entrant dans les essais cliniques. Environ 12% des candidats médicaments ont finalement obtenu l’approbation de la Food & Drug Administration (FDA) des États-Unis en 2019. De nombreux médicaments échouent en phase I en raison d’une toxicité imprévue², tandis que d’autres qui réussissent les essais de sécurité peuvent échouer en raison d’un manque d’efficacité

Protocol

Les lignées cellulaires GBM dérivées du patient (GS122 et GS304) ont été fournies par le professeur David Nathanson (notre collaborateur), qui a développé ces lignées selon un protocole approuvé par le Conseil d’examen institutionnel de l’UCLA (IRB # 10-000655). Les cellules ont été anonymisées afin que les lignées cellulaires ne puissent pas être reliées aux patients individuels.

1. Préparation de la solution d’hydrogel

1. Préparer la solution tamponnée HEPES en dissolvant la poudre HEPES à 20 mM dans la solution saline équilibrée (HBSS) de Hank. Ajuster le pH à 7 après la solvatation complète.
2. Dans la sol....

Results

Les mesures AFM ont confirmé un contrôle précis de la mécanique de l’hydrogel en fonction de l’irradiance UV (mW/cm²) lors de la photo-réticulation à l’aide d’un réseau de LED personnalisé contrôlé par Arduino (Figure 2A). La formulation d’hydrogel utilisée dans ce protocole se trouve dans le tableau 2. L’espacement des LED sur le gabarit fourni correspond à l’espacement pour tous les autres puits d’une plaque de 384 puits, ce qui permet la formation de gels à l’i.......

Discussion

Les travaux actuels présentent des méthodes pour générer des cultures miniaturisées 3D à base d’AH tout en modifiant simultanément la rigidité de la matrice et les peptides disponibles pour l’engagement de l’intégrine. Cette technique permet d’étudier systématiquement comment les paramètres de la matrice affectent les phénotypes cellulaires (par exemple, la viabilité des cellules cancéreuses exposées à la chimiothérapie) avec un débit accru. Les approches précédentes, y compris celle présentée ici, ont réglé la rigidité .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Résistances 1,1 kOhm, 6 W	Digikey	35601k1ft
Tube de microcentrifugeuse de 1,7 mL	Genesse Scientific	21-108
Tube conique de 15 mL	Fisher Scientific	14-959-70C
LED 365 nm Digikey		ltpl-c034uvh365
384 plaque de puits	Bio Greiner One	781090
40 µ ; Filtre à cellules m	MTC bio	C4040
Polyéthylène glycol à 4 bras à terminaison thiol (20 kDa)	Laysan Bio	4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTs	Digikey	2n5550ta
80 Ohm résistances, 0.125 W	Digikey	erjj-6enf80r6v
8-Armed norbornene ended polyethylene glycol (20 kDa)	Jenkem Technology	A7025-1
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104500	dissociation cellulaire  ; réactif
Sondes AFM	Novascan		0,01 N/m Constante nominale du ressort, 2,5 & micro ; m SiO2 particule
Arduino IDE	Arduino	1.8.19
Arduino Nano Makerfire		Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontrôleur Board
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/mL
CCK8	Abcam	ab228554
Centrifugeuse	Thermoscientific	sorvall legend xtr
CP100ST	Gilson	F148415	Pointes de pipette pour pipette à déplacement positif
Cubis Semi-Micro Balance	Sartorius	MSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50)	Life Technologies	11330057	1x
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-)	Genesse Scientific	25-508
EGF	Peprotech	AF100-15	50 ng/mL
Éthanol anhydre	Fisher Scientific	A405P	Ajouter de l’eau DI à diluer à 70 %
Fisherbrand Classe B Flacons filetés en verre ambré	Fisher Scientific	03-339-23C
Fisherbrand Papier de pesée	Fisher Scientific	09-898-12B
G21 Supplément	Gemini Bio	400-160	50x
Hanks Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14175095
HCl, ACS, 12M	Sigma Aldrich	S25838A	Ajouter de l’eau DI à diluer à 1 M
Sel d’héparine sodique de la muqueuse intestinale porcine	Sigma Aldrich	H3149-100Ku	25 µ ; g/mL
HEPES	Sigma Aldrich	H7006-100G
Pistolet à air chaud	Wagner	HT1000
Peptide de sialoprotéine liant l’intégrine (IBSP)	Genscript	Commande personnalisée	GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Lithium phényl-2,4,6 triméthylbenzoylphosphinate (LAP) , >95 %	Sigma Aldrich	900889-1G
Plaque d’agitation magnétique	Thermo	SP194715
Microcentrifugeuse	Thermo Scientific	Sorvall legend micro 21R
Microman E pipette monocanal	Gilson	FD10004	Pipette à déplacement positif
Pointes de micropipette Divers	Manufacturs		Différentes tailles
micropipette mLine	Sartorious
N-acetyl Cysteine	Sigma Aldrich	A7250-10G
Nanowizard 4	Bruker		AFM microscope
NaOH	Fisher Scientific	ss255-1	Ajouter de l’eau DI à diluer à 1 M
Normoicin	Invivogen	ant-nr-1	500x
Osteopontin Peptide	Genscript	Custom Order	GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet Aid	Drummond	4000102
Lames de microscope simples	Globe Scientific	1301
Press-To-Seal Isolateur en silicone, 12-4,5 mm de diamètre x 2 mm de profondeur	Grace Bio Labs	664201-A	Coupez de manière à ce que 8 moules individuels soient fabriqués à partir d’une seule feuille
Traitement	Traitement	3.5.4
Répéteur M4	Eppendorf	4982000322
Répéteur Pointes	de pipetteSartorious	30089430	1 mL formats
RGD Peptide	Genscript		GCGYGRGDSPG
Scoth Tape
Pipettes sérologiques	Genesse Scientific	12-102,12-104	5,10 mL Pipettes
Pâte à souder	Digikey	315-NC191LT15T5-ND
Fil
droit pince à dissection	VWR Scientific	82027-408
Synergy H1 Lecteur de plaques	Biotek
T-75 Flacon traité pour culture cellulaire	Genesee Scientific	25-209
Temozolomide	Sigma Aldrich	T2577	Généralement utilisé à partir de 10 µ ; M à 100 & micro ; M
Tenascin-C Peptide	Genscript		GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV
Acide hyaluronique thiolé (700 kDa), modifié à 6-8 %	Lifecore Biomedical	HA700K5
VWR Spinbar, Flea Micro	VWR	58948-375