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Bioengineering

Les réseaux d’hydrogel permettent d’augmenter le débit pour le dépistage des effets des composants matriciels et des thérapies dans les modèles tumoraux 3D

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/63791
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1University of California Los Angeles

Summary

Le présent protocole décrit une plate-forme expérimentale pour évaluer les effets des signaux mécaniques et biochimiques sur les réponses chimiothérapeutiques des cellules de glioblastome dérivées de patients dans des cultures mimétiques matricielles 3D à l’aide d’un dispositif d’éclairage UV sur mesure facilitant la photocroision à haut débit d’hydrogels avec des caractéristiques mécaniques accordables.

Abstract

Les interactions cellule-matrice interviennent dans des processus physiologiques complexes par le biais d’indices biochimiques, mécaniques et géométriques, influençant les changements pathologiques et les réponses thérapeutiques. La prise en compte des effets matriciels plus tôt dans le développement de médicaments devrait augmenter la probabilité de succès clinique de nouveaux traitements. Il existe des stratégies basées sur les biomatériaux récapitulant des microenvironnements tissulaires spécifiques en culture cellulaire 3D, mais leur intégration avec les méthodes de culture 2D principalement utilisées pour le dépistage des drogues a été difficile. Ainsi, le protocole présenté ici détaille le développement de méthodes de culture 3D au sein de matrices de biomatériaux miniaturisés dans un format de plaque multi-puits pour faciliter l’intégration avec les pipelines de dépistage de médicaments existants et les tests conventionnels pour la viabilité cellulaire. Étant donné que les caractéristiques matricielles essentielles à la préservation des phénotypes cliniquement pertinents dans les cellules cultivées devraient être hautement spécifiques aux tissus et aux maladies, un dépistage combinatoire des paramètres de la matrice sera nécessaire pour identifier les conditions appropriées pour des applications spécifiques. Les méthodes décrites ici utilisent un format de culture miniaturisé pour évaluer les réponses des cellules cancéreuses à la variation orthogonale de la mécanique matricielle et à la présentation des ligands. Plus précisément, cette étude démontre l’utilisation de cette plate-forme pour étudier les effets des paramètres de matrice sur les réponses des cellules de glioblastome dérivées du patient (GBM) à la chimiothérapie.

Introduction

Le coût prévu du développement d’un nouveau médicament n’a cessé d’augmenter au cours de la dernière décennie, avec plus de 1 milliard de dollars dans les estimations actuelles1. Une partie de cette dépense est due au taux élevé d’échec des médicaments entrant dans les essais cliniques. Environ 12% des candidats médicaments ont finalement obtenu l’approbation de la Food & Drug Administration (FDA) des États-Unis en 2019. De nombreux médicaments échouent en phase I en raison d’une toxicité imprévue2, tandis que d’autres qui réussissent les essais de sécurité peuvent échouer en raison d’un manque d’efficacité3. Cette attrition due à la non-efficacité peut s’expliquer en partie par le fait que les modèles de cancer utilisés lors du développement de médicaments sont notoirement non prédictifs de l’efficacité clinique4.

Les disparités fonctionnelles entre les modèles in vitro et in vivo peuvent être attribuées à l’élimination des cellules cancéreuses de leur microenvironnement natif, y compris les cellules non tumorales et l’ECMphysique 5,6. Généralement, les groupes de recherche utilisent des matrices de culture disponibles dans le commerce, telles que Matrigel (une matrice de membrane basale protéinée dérivée de sarcomes de souris) pour fournir aux cellules tumorales cultivées un microenvironnement matriciel 3D. Par rapport à la culture 2D, la culture 3D dans une matrice membranaire a amélioré la pertinence clinique des résultats in vitro 7,8. Cependant, les biomatériaux de culture à partir de tissus décellularisés, y compris la matrice membranaire, présentent généralement une variabilité d’un lot à l’autre qui peut compromettre la reproductibilité9. En outre, les matrices dérivées de tumeurs d’origine tissulaire différente de celles étudiées peuvent ne pas fournir les indices physiologiques appropriés10. Enfin, les cancers à haut degré d’hétérogénéité intratumorale ont des caractéristiques microenvironnementales qui varient sur une échelle submicronique et que la matrice membranaire ne peut pas être réglée pour récapituler11.

Le glioblastome (GBM), une tumeur cérébrale uniformément mortelle avec un temps de survie médian d’environ 15 mois, est un cancer pour lequel le développement du traitement a été particulièrement difficile12,13. La norme actuelle de soins pour le GBM consiste en une résection de la tumeur primaire, suivie d’une radiothérapie, puis d’une chimiothérapie à l’aide de témozolomide (TMZ)14. Pourtant, plus de la moitié des tumeurs CLINIQUES GBM présentent une résistance au traitement par divers mécanismes 15,16,17. Il est extrêmement difficile de prédire l’efficacité d’un schéma thérapeutique pour un patient individuel. Les modèles précliniques standard utilisés pour prédire les résultats individuels consistent en des cellules tumorales dérivées de patients xénogreffées orthotopiquement dans des souris immunodéprimées. Bien que les xénogreffes dérivées du patient puissent récapituler de nombreux aspects des tumeurs cliniques GBM et soient précieuses pour les modèles précliniques18, elles sont intrinsèquement coûteuses, à faible débit, prennent beaucoup de temps et impliquent des préoccupations éthiques19. Les cultures de cellules dérivées de patients, sur des surfaces en plastique 2D ou sous forme de sphéroïdes, évitent généralement ces problèmes. Alors que les cellules dérivées de patients préservent les aberrations génétiques, leurs cultures en 2D ou sous forme de sphéroïdes en suspension ont été en grande partie de mauvaises représentations de xénogreffes dérivées de patients chez des rongeurs et des tumeurs originalesde patients 20. Auparavant, nous, et d’autres, avons montré que les cellules GBM cultivées dans un ECM 3D qui imite les propriétés mécaniques et biochimiques du tissu cérébral peuvent préserver les phénotypes de résistance aux médicaments 10,21,22,23.

Les interactions entre l’acide hyaluronique (HA), un polysaccharide abondant dans l’ECM cérébral et surexprimé dans les tumeurs GBM, et son récepteur CD44 modulent l’acquisition de la résistance aux médicaments in vitro 21,24,25,26,27. Par exemple, l’inclusion de l’AH dans des cultures 3D molles a augmenté la capacité des cellules GBM dérivées du patient à acquérir une résistance thérapeutique. Cette mécano-réceptivité dépendait de la liaison de l’AH aux récepteurs CD44 sur les cellules GBM21. De plus, la liaison de l’intégrine aux peptides porteurs de RGD, incorporée dans des matrices de culture 3D, a amplifié la chimiorésistance médiée par CD44 d’une manière dépendante de la rigidité21. Au-delà de l’AH, l’expression de plusieurs protéines ECM, dont beaucoup contiennent des régions RGD, varie entre le cerveau normal et les tumeurs GBM28. Par exemple, une étude a rapporté que 28 protéines ECM distinctes étaient régulées à la hausse dans les tumeurs GBM29. Dans ce microenvironnement complexe de la matrice tumorale, les cellules cancéreuses intègrent des indices mécaniques et biochimiques pour produire un phénotype de résistance particulier, qui dépend de différences relativement faibles (par exemple, moins d’un ordre de grandeur) dans le module de Young ou la densité des peptides liant l’intégrine 28,29,30.

Le présent protocole caractérise la façon dont les cellules tumorales interprètent des combinaisons uniques d’indices matriciels et identifient des microenvironnements matriciels complexes et spécifiques au patient qui favorisent la résistance au traitement (Figure 1A). Une méthode photochimique pour générer des matrices miniaturisées et réglées avec précision pour la culture 3D fournit un grand espace variable orthogonal. Une gamme de LED sur mesure, gérée par un microcontrôleur, a été incorporée aux hydrogels de photocroisillon dans un format de plaque à 384 puits pour augmenter l’automatisation et la reproductibilité. L’intensité de l’exposition a varié d’un puits à l’autre pour modifier les propriétés micromécaniques des hydrogels résultants, telles qu’évaluées à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM). Bien que ce manuscrit ne se concentre pas sur la construction du réseau d’éclairage lui-même, un schéma de circuit (Figure 1B) et une liste de pièces (Table des matériaux) sont fournis comme aides à la reproduction de l’appareil.

Ce rapport démontre la génération rapide d’un ensemble de cellules GBM cultivées dans des microenvironnements 3D uniques dans lesquels le module de Young (quatre niveaux sur un seul ordre de grandeur) et la teneur en peptides liant l’intégrine (dérivés de quatre protéines ECM différentes) ont varié orthogonalement. L’approche a ensuite été utilisée pour étudier les contributions relatives de la mécanique de l’hydrogel et de l’engagement de l’intégrine spécifique à l’ECM sur la viabilité et la prolifération des cellules GBM dérivées du patient à mesure qu’elles acquièrent une résistance à la chimiothérapie au témozolomide (TMZ).

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Protocol

Les lignées cellulaires GBM dérivées du patient (GS122 et GS304) ont été fournies par le professeur David Nathanson (notre collaborateur), qui a développé ces lignées selon un protocole approuvé par le Conseil d’examen institutionnel de l’UCLA (IRB # 10-000655). Les cellules ont été anonymisées afin que les lignées cellulaires ne puissent pas être reliées aux patients individuels.

1. Préparation de la solution d’hydrogel

  1. Préparer la solution tamponnée HEPES en dissolvant la poudre HEPES à 20 mM dans la solution saline équilibrée (HBSS) de Hank. Ajuster le pH à 7 après la solvatation complète.
  2. Dans la solution tamponnée HEPES, dissoudre l’HA thiolé (poids moléculaire nominal de 700 kDa, voir tableau des matériaux), préparé à la suite du rapport précédent31, de sorte que 6 % à 8 % des résidus d’acide carboxylique sur chaque acide glucuronique soient modifiés avec un thiol, à une concentration de 10 mg/mL dans une solution tampon.
    REMARQUE: Un flacon ambré est recommandé pour empêcher l’oxydation du thiol par la lumière ambiante.
    1. Remuer à l’aide d’une plaque magnétique (<1 000 tr/min) à température ambiante jusqu’à dissolution complète, généralement autour de 45 min.
  3. Pendant la dissolution de l’AH, préparer des solutions séparées de (1) 100 mg/mL de PEG-Norbornène à 8 bras (20 kDa), (2) 100 mg/mL de PEG-Thiol à 4 bras (20 kDa), (3) 4 mM de cystéine ou de peptide contenant de la cystéine (p. ex. GCGYGRGDSPG) et (4) 4 mg/mL de LAP dans des tubes de microcentrifugation (voir tableau des matériaux).
    1. Préparez chacune de ces quatre solutions dans la solution tamponnée HEPES préparée à l’étape 1.1. Vortex les solutions pour assurer la dissolution complète de chaque réactif avant d’effectuer l’étape 4.
      REMARQUE: Si vous testez plusieurs peptides différents, chacun doit contenir une cystéine ou une autre source de fraction thiol pour cette chimie de conjugaison.
    2. Préparer des solutions (4 mM de thiol disponible) de tous les peptides à attacher dans un seul hydrogel à ce stade.
      REMARQUE : Les séquences peptidiques et les protéines ECM à partir desquelles elles ont été dérivées et utilisées dans cette étude sont énumérées dans le tableau 1. La N-acétyl cystéine (voir Tableau des matériaux), à laquelle les cellules ne se lient pas, peut être substituée à un peptide bioactif contenant du thiol pour titrer la concentration d’un peptide adhésif ou agir comme un témoin négatif31.
  4. Mélanger les solutions individuelles de HA, peg-norbornène, PEG-thiol et peptides contenant de la cystéine/thiol (voir tableau des matériaux) pour obtenir les concentrations finales pour les matrices finales d’hydrogel énumérées dans le tableau 2. Remuer (<1 000 tr/min) sur une plaque magnétique pendant au moins 30 min pour mélanger complètement.
    REMARQUE: Les solutions HA sont très visqueuses et mieux manipulées à l’aide d’une pipette volumétrique (voir tableau des matériaux). Si une pipette volumétrique n’est pas disponible, les solutions visqueuses peuvent également être dispensées d’une micropipette standard en pipetant lentement à l’aide de pointes à orifice large.

2. Éclairage et photocroisillonnage d’hydrogels via un réseau de LED

ATTENTION: Portez des lunettes de protection UV et couvrez le champ d’éclairage avec un matériau absorbant les UV.

REMARQUE: Le réseau de LED décrit dans ce protocole se compose de six ensembles de huit LED placés en série, comme illustré par le schéma de circuit fourni (Figure 1A). Chaque ensemble de LED peut être alimenté indépendamment, ce qui permet jusqu’à six irradiances différentes par course. Le fichier supplémentaire 1 contient des captures d’écran correspondant aux instructions suivantes pour plus de conseils.

  1. Téléchargez le fichier illumination device.zip à partir des fichiers de codage supplémentaires. Ce répertoire contient les fichiers suivants : Arduino.zip (fichier de codage supplémentaire 1), Drivers.zip (fichier de codage supplémentaire 2), GUI.zip (fichier de codage supplémentaire 3) et Holder.zip (fichier de codage supplémentaire 4).
    REMARQUE: Imprimez en 3D les parties supérieure et inférieure pour maintenir la carte de circuit imprimé en place (voir Fichiers de codage supplémentaires pour plus de détails).
  2. Téléchargez et installez le logiciel du microcontrôleur (voir tableau des matériaux).
  3. Téléchargez et installez le logiciel GUI (voir Tableau des matériaux). Reportez-vous au fichier supplémentaire 1 pour obtenir des instructions d’utilisation du logiciel.
  4. Ouvrez Traitement et installez la bibliothèque controlIP5 en cliquant sur Esquisse > Importer la bibliothèque > Ajouter une bibliothèque. Ensuite, recherchez controlIP5 dans les bibliothèques et cliquez sur Installer. Effectuez cela pour la toute première fois.
  5. Alimentez le dispositif d’éclairage (voir tableau des matériaux) à l’aide de l’alimentation 36 volts et connectez-le à un PC à l’aide d’un câble micro-USB.
    REMARQUE: Certains périphériques n’installeront pas automatiquement les pilotes pour diverses cartes nano Arduino. Un ensemble de pilotes est fourni dans le fichier zip du périphérique.
  6. Ouvrez le fichier Arduino.ino, situé dans le dossier Adruino.zip, à l’aide de l’IDE Arduino.
  7. Compilez le fichier Arduino.ino en cliquant sur le bouton Coche . Téléchargez le code compilé en cliquant sur le bouton Fléché .
  8. Ouvrez le fichier GUI.pde, situé dans le dossier GUI.zip, à l’aide de Traitement.
  9. Cliquez sur Exécuter dans le programme de traitement pour lancer l’interface utilisateur graphique pour contrôler le dispositif d’éclairage.
  10. Dans la fenêtre de l’interface utilisateur graphique, cliquez sur Intensité pour que la colonne contenant la solution de précurseur d’hydrogel soit réticulée et entre l’intensité souhaitée. Cliquez sur la case Heure et entrez l’heure souhaitée. Pour la solution fournie dans le tableau 2, ce sera 15 s.
    REMARQUE: Les utilisateurs finaux doivent calibrer les valeurs d’intensité numériques en fonction de l’irradiance à l’aide d’un radiomètre. Des exemples d’intensités typiques sont fournis à la figure 2A.
  11. Alignez les échantillons avec le dispositif d’éclairage (Figure 2B) avec toutes les autres LED dans une seule colonne des moules en silicone (voir Tableau des matériaux) ou une plaque à 384 puits. Cliquez sur Terminer pour commencer l’illumination. Répétez ce processus si nécessaire pour l’éclairage de plusieurs lames ou d’autres puits d’une plaque de 384 puits.
    REMARQUE: Le support est conçu de telle sorte que la plaque de 384 puits se trouve au ras d’un coin de la chambre intérieure pendant l’éclairage.
    1. Après l’éclairage, lorsqu’il est placé dans un coin, déplacez la plaque de puits vers le coin suivant et répétez. Pour éclairer les puits sur l’autre moitié de la plaque, soulevez la plaque hors du support et faites pivoter de 180 °.
  12. Générez des hydrogels avec une mécanique variable pour la caractérisation mécanique en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Nettoyez les lames de verre et les moules en silicone à l’aide de ruban adhésif pour enlever les débris. Collez les moules en silicone à la glissière en verre, appuyez vers le bas pour assurer une bonne étanchéité et déplacez les bulles d’air.
    2. Pipette 80 μL de solution de précurseur d’hydrogel, telle que préparée à l’étape 1.4, dans chaque moule en silicone sur la lame de verre.
    3. Placez la glissière en verre sur le dispositif d’éclairage aligné avec toutes les autres LED dans une seule colonne. Exposez les précurseurs de l’hydrogel à la lumière UV pendant 15 s, comme décrit à l’étape 2, à la photocroisillon.
    4. Une fois l’éclairage arrêté, récupérez les lames et desserrez les gels des moules en traçant la circonférence interne du moule avec une pointe fine (pointe de pipette de 10 μL, aiguille de 30 G, etc.). Retirez les moules en silicone avec une pince à épiler /pince.
    5. Déplacez les hydrogels réticulés dans les puits individuels d’une plaque de 12 puits en mouillant une spatule et en les poussant doucement hors de la glissière de verre. Remplissez chaque puits avec 2 mL de DPBS (voir tableau des matériaux) avant d’ajouter l’hydrogel. Gonfler les gels en solution de DPBS pendant au moins 12 h (généralement pendant la nuit) à température ambiante (pour la caractérisation mécanique du lendemain).

3. Mesures de microscopie à force atomique (AFM)

  1. Allumez le microscope à force atomique (AFM) conformément aux instructions du fabricant (voir tableau des matériaux). Ce protocole fournit de brèves instructions pour l’utilisation de l’instrument et du logiciel associé.
  2. Installez la sonde AFM (voir tableau des matériaux).
    NOTE: Pour la présente étude, un porte-à-faux triangulaire en nitrure de silicium avec une constante nominale de ressort de 0,01 N/m a été modifié avec une particule sphérique de dioxyde de silicium de 2,5 μm.
  3. Après l’installation, alignez le laser sur le sommet de la sonde triangulaire, puis ajustez la déviation du miroir et du laser pour maximiser la somme du signal (généralement entre 1,5 et 2,2 volts).
  4. Immergez la sonde dans DPBS et attendez jusqu’à 15 minutes pour obtenir l’équilibre thermique. Cliquez sur le bouton Calibration et sélectionnez Étalonnage dépendant du contact. Cliquez sur le bouton Collect Thermal Tuning , et après la collecte des données, sélectionnez le pic autour de 3 kHz pour l’étalonnage.
    REMARQUE: Un léger ajustement du miroir et des déflecteurs laser peut être nécessaire après une immersion dans un liquide en raison de changements d’indice de réfraction.
  5. Approchez la surface d’une boîte de Petri (plastique) en réglant les paramètres d’approche sur vitesse constante, une hauteur cible de 7,5 μm et une vitesse d’approche de 15 μm/s. Activez la mesure de référence par course pour l’approche afin que l’approche s’exécute en continu et ne s’arrête pas prématurément en raison de la dérive dans le déflecteur.
  6. Lors de l’approche, définissez les paramètres d’acquisition pour la cartographie de la force sur des rotations de 4 nN, une distance d’indentation de 2 μm, une vitesse de 1 μm/s et un temps de contact de 0 s. Appuyez sur le bouton Démarrer pour commencer à collecter une courbe de force sur la surface en plastique (par exemple, une plaque de puits).
  7. Revenez à la fenêtre d’étalonnage et sélectionnez la partie de la courbe de force correspondant au contact et à l’indentation du plastique. Acceptez les valeurs de sensibilité et de rigidité calculées pour que la sonde termine l’étalonnage.
  8. Après l’étalonnage, soulevez la sonde AFM et placez l’échantillon d’hydrogel pour interrogatoire. Approchez l’hydrogel en suivant les paramètres fournis à l’étape 5.
    REMARQUE: Au cours de la procédure d’approche vers la surface de l’hydrogel, l’unité peut déclencher par erreur l’état approché. Pour vérifier l’approche réelle, obtenez une courbe de force comme à l’étape 4.6. Répétez la procédure d’approche si la courbe résultante ne montre pas le contact et l’indentation résultante.
  9. Lorsque l’approche de surface réussit, passez en mode De mappage de force et définissez les paramètres d’acquisition sur une carte de taille 8 x 8 avec une longueur de 40 μm par axe. Obtenez des cartes de force dans diverses régions pour évaluer l’uniformité des mesures de rigidité.
    1. Interpréter les courbes de force à l’aide du logiciel JPK SPM Data Processing à l’aide d’un ajustement de modèle Hertz/Sneddon (équations 1 et 2, voir le tableau 3 pour la définition de toutes les variables) avec la géométrie sphérique sélectionnée 32,33,3 4.
      Equation 1Équation 132
      Equation 2Équation 232

4. Mise en place et traitement médicamenteux de cultures 3D intégrées à une matrice

  1. Préparez les cellules souhaitées sous forme de solution à cellule unique.
    REMARQUE: Différents types de cellules peuvent nécessiter différentes méthodes de passage. Un protocole typique pour le passage d’une culture en suspension de sphéroïdes GBM à partir d’une fiole T-75 est rapporté à la référence31.
  2. Recueillir les sphéroïdes GBM (environ 150 μm de diamètre) d’une culture en suspension de flacon T-75 dans un tube conique de 15 mL. Rincez la fiole de culture avec 5 mL de DPBS pour éliminer les cellules et les milieux résiduels et ajoutez ce volume au tube conique.
  3. Centrifuger le tube conique contenant des cellules à 200 x g pendant 5 min à température ambiante. Après centrifugation, retirer le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, en prenant soin de ne pas perturber la pastille cellulaire, et remettre en suspension 5 mL de DPBS.
  4. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à température ambiante pour laver les cellules. Aspirer le surnageant avec une pipette sérologique de 5 mL, en prenant soin de ne pas perturber la pastille cellulaire, puis remettre les cellules en suspension dans 2 mL de réactif de dissociation cellulaire (voir Tableau des matériaux).
  5. Incuber à température ambiante pendant 10-15 min. Ajouter 3 mL de milieu complet (voir tableau des matériaux) et pipeter doucement 3 à 5 fois pour décomposer les sphéroïdes en une suspension à cellule unique31.
  6. Centrifuger la suspension monocellulaire à 400 x g (les suspensions à cellule unique peuvent être filées plus rapidement pour la formation de granulés) pendant 5 min pour les cellules à granulés à température ambiante. Aspirer le surnageant avec une pipette sérologique de 5 mL, en prenant soin de ne pas déranger la pastille cellulaire. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de milieu complet.
    REMARQUE: Si les cellules restent en touffes, plutôt que sous forme de cellules individuelles en suspension, après le passage, les cellules peuvent être passées à travers une passoire cellulaire de 40 μm pour obtenir une suspension à cellule unique.
  7. Retirez une partie des cellules pour le comptage à l’aide d’un hémocytomètre. Diluer cette portion deux fois avec du bleu de trypan, qui imprègne les cellules dont la viabilité est compromise. Ne comptez que les cellules vivantes et incolores. Typiquement, un T-75 ensemencé à 800 000 cellules par flacon donne 2 à 3 millions de cellules après une semaine de culture.
  8. Déterminez le nombre de cellules nécessaires à l’encapsulation. Transférer un volume de milieu contenant le nombre total de cellules nécessaires dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,7 mL. Tourner vers le bas à 400 x g pendant 5 min à température ambiante.
    REMARQUE: Par exemple, un minimum de 2,5 millions de cellules remises en suspension dans 1 mL de volume de gel est nécessaire pour encapsuler les cellules à 2,5 millions de cellules / mL. Un volume de gel de 1 mL permet aux utilisateurs de distribuer 100 gouttes de gel, où chaque goutte de gel est de 10 μL de volume. Il est recommandé de préparer un volume supplémentaire d’environ 20% de cellules en suspension dans une solution d’hydrogel pour tenir compte de la perte lors du transfert de la pipette. Ainsi, on préparerait 3 millions de cellules et 1,2 mL de solution précurseur d’hydrogel dans cet exemple. Une densité minimale de 500 000 cellules/mL est recommandée.
  9. Aspirer le surnageant avec une micropipette, en prenant soin de ne pas déranger la pastille cellulaire. Remettre en suspension la pastille de cellule dans la solution de précurseur d’hydrogel, telle que préparée à l’étape 1.4, en mélangeant bien en pipetant de haut en bas avec une micropipette de 1 000 μL 4 à 5 fois.
  10. Chargez les cellules dans un pipetteur répétitif (voir Tableau des matériaux) réglé pour distribuer 10 μL. Pour éviter les bulles et la distribution inégale, amorcez le pipetteur répétitif en distribuant 1 à 2 fois de plus dans un conteneur à déchets.
  11. Dans chaque puits d’une plaque de 384 puits, distribuer 10 μL de cellules en suspension dans une solution d’hydrogel du pipetteur répétitif. À l’aide du réseau de LED, éclairer chaque puits contenant des cellules (étape 2) pendant 15 s avec des intensités (exemple, résultats de la figure 2A , intensités utilisées de 1,14, 1,55, 2,15, 2,74 mW/cm2) pour obtenir les propriétés mécaniques souhaitées.
    REMARQUE : Il est suggéré de commencer par cinq réplications par condition expérimentale et d’augmenter ou de réduire la taille en fonction du débit souhaité et de la variance du test de point de terminaison.
  12. Ajouter 40 μL de milieu complet à chaque puits contenant les cellules. Ajouter 50 μL de DPBS aux puits secs non expérimentaux entourant les gels pour minimiser les pertes dues à l’évaporation.
  13. Pour les cellules GBM, ajouter 40 μL du médicament contenant du milieu (p. ex., TMZ, voir Tableau des matériaux) pour atteindre la concentration finale souhaitée (10 μM-100 μM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou le véhicule (DMSO), en conséquence, à partir de 3 jours après l’encapsulation.

5. Essai de prolifération CCK8

  1. Ajouter 10 μL de réactif CCK8 (voir Tableau des matériaux) à chaque puits contenant les cellules.
    REMARQUE: Si vous effectuez ce test pour la première fois, incluez des puits de contrôle négatifs tels que des milieux uniquement ou de l’hydrogel sans cellules dans les milieux.
  2. Incuber pendant 1-4 h selon les instructions du fabricant.
    REMARQUE: Ce temps peut varier en fonction du type de cellule et de la densité, et les temps d’incubation doivent donc être testés pour chaque application afin que les valeurs d’absorbance se situent dans une plage linéaire, une exigence pour l’application de la loi35 de Beer.
  3. Lire les absorbances à 450 nm pour tous les puits après l’incubation.
  4. Calculer l’absorbance moyenne à 450 nm obtenue à l’étape 3 pour l’état du véhicule pour chaque groupe. Divisez chaque médicament bien traité par la moyenne du véhicule témoin par groupe.
  5. Calculez les intervalles de confiance en générant des distributions bootstrap (N = 10 000) via la méthode du centile36.
    REMARQUE : En général, on peut utiliser des intervalles de confiance à 95 % et interpréter des conditions dont les intervalles de confiance ne dépassent pas 1 comme étant significatives et justifiant une enquête plus approfondie. La définition d’intervalles de confiance à 95 % est compatible avec la définition d’un seuil de signification de p = 0,05. Pour les données présentées dans les résultats, il est utile de distinguer les conditions qui favorisent ou inhibent la résistance aux médicaments à médiation matricielle, ce qui nécessite une analyse bilatérale.

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Representative Results

Les mesures AFM ont confirmé un contrôle précis de la mécanique de l’hydrogel en fonction de l’irradiance UV (mW/cm2) lors de la photo-réticulation à l’aide d’un réseau de LED personnalisé contrôlé par Arduino (Figure 2A). La formulation d’hydrogel utilisée dans ce protocole se trouve dans le tableau 2. L’espacement des LED sur le gabarit fourni correspond à l’espacement pour tous les autres puits d’une plaque de 384 puits, ce qui permet la formation de gels à l’intérieur de la plaque (Figure 2B). L’interrogation par l’AFM de régions à l’échelle du micron à la surface d’hydrogels simples a montré que les hydrogels avec des modules de Young moyens plus mous avaient également des gammes de modules plus petites que les hydrogels plus rigides (Figure 2C-E).

Les densités d’ensemencement cellulaire qui maximisent la viabilité doivent être déterminées empiriquement pour chaque type de cellule. Cette étude démontre que les cultures 3D de cellules GS122 ensemencées à des densités de 2 500 000 cellules/mL présentaient des viabilités significativement plus élevées lorsqu’elles étaient évaluées après 7 jours en culture par rapport à celles ensemencées à des densités de 500 000 cellules/mL (Figure 3A). De plus, les cellules GS122 et GS304 ont été utilisées comme modèles pour la culture de cellules GBM dérivées de patients afin d’étudier la dépendance de la réponse à la chimiothérapie sur la rigidité et la composition biochimique du microenvironnement matriciel (Figure 3B-D). La viabilité cellulaire a été évaluée par le test CCK8 après un traitement par TMZ pendant 4 jours, ce qui a conduit à un temps de culture total de 7 jours en mettant à l’échelle la mesure de l’OD450 par un contrôle de véhicule correspondant et en générant des intervalles de confiance de 95% par amorçage (N = 10 000) avec la méthode centile36. Avec ces distributions, les conditions dans lesquelles les intervalles de confiance ne se chevauchaient pas avec une valeur de 1 (ligne pointillée) ont été considérées comme significatives. Par rapport aux méthodes statistiques plus couramment utilisées telles que les tests t ou l’ANOVA, l’estimation des intervalles de confiance, en utilisant l’amorçage pour estimer les distributions qui seraient présentes pour des échantillons de plus grande taille, est préférable pour les tests de dépistage dont l’objectif est d’identifier un plus petit sous-ensemble de conditions pour une étude plus approfondie. Un autre avantage de cette méthode est que les conditions avec un écart plus petit dans un intervalle de confiance peuvent être priorisées par rapport à d’autres conditions avec une valeur moyenne similaire mais un écart plus élevé dans l’intervalle de confiance. Cette étude a indiqué que les cellules GS122 ont obtenu des avantages de survie grâce aux interactions microenvironnementales (Figure 3B). Ce bénéfice de survie était significatif dans les conditions de 0,8, 1 et 4 kPa, mais pas dans la condition de 8 kPa pour les cellules GS122. Les cellules GS304 étaient insensibles à la fois à la rigidité et au traitement TMZ.

L’effet de la composition biochimique du microenvironnement matriciel a ensuite été examiné en faisant varier l’inclusion de peptides dérivés de l’ECM, liant l’intégrine (tableau 1), connus pour être régulés à la hausse dans le microenvironnement tumoral GBM à deux rigidités, 0,8 kPa et 8 kPa. Encore une fois, les cellules GS304 n’ont reçu aucun bénéfice significatif en termes de survie de l’inclusion de la matrice et étaient insensibles à la TMZ. Cependant, les cellules GS122 ont montré des gains de survie dans la condition de 8 kPa lorsque des peptides dérivés de l’ostéopontine ont été inclus dans la matrice, tandis que l’incorporation de sialoprotéines liant l’intégrine (IBSP) ou de peptides dérivés de la ténascine-C a fourni des avantages minimes en termes de survie, tels que la culture dans des matrices avec le peptide RGD général (Figure 3C). En revanche, aucun peptide n’a conféré de gains de survie dans la condition de culture de 0,8 kPa (Figure 3D). Ensemble, les résultats suggèrent des différences intrinsèques dans les réponses matricielles et médicamenteuses entre les deux lignées cellulaires dérivées de patients évaluées.

Les cultures d’hydrogel 3D peuvent être visualisées à l’aide de la microscopie optique standard pour évaluer comment la morphologie cellulaire et les comportements invasifs sont affectés par les conditions de culture d’une manière dépendante de la lignée cellulaire (Figure 4). Les cellules GS122 et GS304 se propagent lorsqu’elles sont cultivées dans des matrices d’hydrogel souples ou rigides, y compris des peptides contenant du RGD (Figure 4A). Alors que les peptides affectaient la propagation cellulaire, la capacité d’une cellule à se propager ne prédisait pas nécessairement la capacité de la culture à acquérir une résistance TMZ. Par exemple, les cellules GS122 montrent un manque similaire de propagation dans 0,8 et 8 kPa avec l’ostéopontine; cependant, le GS122 n’a montré une résistance accrue à la TMZ que dans la condition de 8 kPa (Figure 4B). Enfin, cette plateforme de culture 3D miniaturisée peut être utilisée pour cultiver des cellules humaines à partir d’autres types de tumeurs, y compris des organoïdes viables de cellules cancéreuses neuroendocrines de la prostate différenciées en phase terminale (Figure 4C).

Figure 1
Figure 1 : Représentation du protocole par dessin animé. (A) Représentation par dessin animé du processus de génération et de surveillance de la culture 3D. (1) Des solutions d’hydrogel à base d’AH sont préparées. (2) Les solutions d’hydrogel sont ensuite réticulées avec une intensité variable à travers des LED contrôlées par un microcontrôleur Arduino. (3) La mécanique de l’hydrogel résultante est évaluée par l’AFM pour vérifier la différence dans la mécanique du gel. (4) Des solutions correspondant à la formulation de l’étape 1 sont ensuite utilisées pour encapsuler des cellules GBM dérivées du patient et traitées avec le médicament. (5) Après 7 jours, la viabilité cellulaire est lue via le test colorimétrique CCK8. (B) Schéma de circuit pour le réseau d’éclairage LED personnalisé utilisé dans ce protocole. Les composants individuels sont répertoriés dans le tableau des matériaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Hydrogels fabriqués avec une rigidité variable à l’aide de LED accordables pour modifier l’irradiance. (A) Les diagrammes de violon montrent le module de Young calculé à partir des courbes de force générées par AFM sur trois régions de surface, couvrant 40 μm x 40 μm, d’hydrogels individuels. Le module de Young de chaque hydrogel est montré en fonction de l’irradiance UV lors de la photocroisillonnage. Les lignes blanches horizontales indiquent la médiane de chaque groupe expérimental. (B) Réseau de LED avec espacement correspondant au pas des plaques multi-puits (384 puits). (C) Carte thermique montrant la variation régionale du module de Young (moyenne = 0,8 kPa) pour un gel typique réticulé par exposition à 1,55 mW/cm2 pendant 15 s. (D) Carte thermique montrant la variation régionale du module de Young (moyenne = 8 kPa) pour un gel typique réticulé lors d’une exposition à 2,74 mW/cm2 pendant 15 s. (E) Histogramme illustrant la gamme des mesures du module de Young sur la surface des hydrogels indiquées en C et D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : La présentation orthogonale de la rigidité et du peptide liant l’intégrine révèle des différences biologiques intrinsèques entre les lignées cellulaires GBM. (A) Valeurs d’absorbance typiques pour les cellules GS122 encapsulées dans un hydrogel de 10 μL à une densité de 500 000 ou 2 500 000 cellules par mL. (B) Les données sur la réponse aux médicaments pour les lignées cellulaires GS122 et GS304 sont visualisées en normalisant la valeur OD450 des puits traités par médicament (N = 5) par la moyenne des puits traités par véhicule (N = 5). La viabilité dans le contexte du traitement médicamenteux a été observée pour varier de manière non linéaire pour la rigidité de l’hydrogel, démontrant une variation entre les lignées cellulaires. (C,D) Données sur la réponse aux médicaments pour les lignées cellulaires GS122 et GS304 lorsque le type de peptide liant l’intégrine a été inclus et que la rigidité de la matrice a varié orthogonalement. Toutes les barres d’erreur représentent les intervalles de confiance à 95 % obtenus en amorçant chaque condition par N = 10 000. La ligne pointillée (axe des y = 1) correspond au cas où OD450 pour les conditions de traitement est égal au véhicule. Toutes les valeurs expérimentales ont été obtenues après 7 jours en culture; TMZ a été ajouté 3 jours après l’encapsulation initiale pour les études de médicaments. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Différences morphologiques entre les cellules encapsulées dans différents environnements d’hydrogel à base d’HA. (A) Les images à contraste de phase de GS122 et GS304, lorsqu’elles sont cultivées dans un hydrogel (0,8 et 8 kPa), montrent un motif RGD. Les flèches blanches indiquent les cellules avec des morphologies étalées. (B) Les images de phase de GS122 et GS304, lorsqu’elles sont cultivées dans un hydrogel (0,8 et 8 kPa), ont montré un peptide dérivé de l’ostéopontine. Les flèches blanches indiquent les cellules avec des morphologies étalées. Les flèches noires indiquent les cellules aux morphologies arrondies. Après 7 jours de culture, des images ont été prises et TMZ a été ajouté 3 jours après l’encapsulation initiale. (C) Image de phase d’un organoïde neuroendocrinien de la prostate différencié en phase terminale. Barres d’échelle = 200 μm (pour A,B); 100 μm (pour C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protéine Séquence peptidique
RGD GCGYGRGDSPG
Tenascin-C GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIRGV
Sialoprotéine liant l’intégrine (IBSP) GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Ostéopontine GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG

Tableau 1 : Protéines ECM et séquences peptidiques dérivées.

Réactif Concentration initiale Volume (μL) Concentration finale
HA-SH Solution 10 mg/mL 2300 5 mg/mL
PEG-SH 100 mg/mL 503 Varie selon l’expérience
PEG-Norbornene 100 mg/mL 443 Varie selon l’expérience
Peptide 4 μM 288 0,250 μM
Giron 4 mg/mL 288 0,25 mg/mL
HEPES-HBSS N/a 798

Tableau 2 : Composants typiques de la formulation finale de l’hydrogel.

Variable Paramètre
F Force
E Module de Young
ν Ratio de Poissons
δ Indentation (position verticale de la pointe)
un Rayon du cercle de contact
RS Rayon de la sphère

Tableau 3 : Variables et paramètres correspondants pour les calculs AFM.

Fichier supplémentaire 1 : Conseils concernant l’utilisation du réseau de LED pour l’éclairage et la photoréticulation des hydrogels. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 1: Fichier Arduino pour microcontrôleur à matrice LED (Arduino.zip). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 2: Pilotes tiers pour Arduino nano (Pilotes.zip). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 3: Fichier de traitement pour le contrôle GUI du microcontrôleur à matrice LED (GUI.zip). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 4: Fichier pour l’impression 3D support externe pour microcontrôleur à matrice LED (Support.zip). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Les travaux actuels présentent des méthodes pour générer des cultures miniaturisées 3D à base d’AH tout en modifiant simultanément la rigidité de la matrice et les peptides disponibles pour l’engagement de l’intégrine. Cette technique permet d’étudier systématiquement comment les paramètres de la matrice affectent les phénotypes cellulaires (par exemple, la viabilité des cellules cancéreuses exposées à la chimiothérapie) avec un débit accru. Les approches précédentes, y compris celle présentée ici, ont réglé la rigidité de l’hydrogel en faisant varier le pourcentage de polymère total dans la formulation finale, où les hydrogels plus rigides ont une teneur en polymère plus élevée21,31. Cependant, cette approche nécessite la préparation d’une formulation d’hydrogel unique pour chaque rigidité souhaitée, un processus qui réduit intrinsèquement le débit. Ici, la rigidité de l’hydrogel est réglée en faisant varier l’irradiance UV pendant la réticulation afin que des hydrogels de rigidités multiples puissent être obtenus à partir d’une seule solution précurseur. Les futurs praticiens qui n’auront peut-être pas la possibilité de construire l’illuminateur personnalisé décrit ici peuvent facilement remplacer un dispositif de durcissement par points UV disponible dans le commerce et ajuster l’éclairage au fur et à mesure que différents secteurs d’une plaque de puits sont durcis. L’inconvénient de l’utilisation d’un dispositif commercial de durcissement ponctuel est une diminution du débit par rapport à l’illuminateur personnalisé. Une limitation des méthodes actuelles est que des solutions uniques doivent encore être préparées pour chaque condition peptidique. Des méthodes similaires ont déjà été utilisées par d’autres groupes pour produire des hydrogels contenant un gradient de rigidité37,38. Cependant, cette étude démontre comment la photocroisillonnage peut permettre la miniaturisation d’échantillons expérimentaux et réduire la complexité des configurations expérimentales. Dans l’ensemble, ces améliorations permettront aux chercheurs d’augmenter le débit expérimental lors de la réalisation de cultures 3D dans des biomatériaux mimétiques matriciels et auront une utilité dans plusieurs domaines de la science biomédicale au-delà de la neuro-oncologie.

Les résultats représentatifs démontrent comment cette technique peut être utilisée pour mettre en place des cultures 3D miniaturisées de cellules GBM dérivées du patient dans des matrices définies, dans lesquelles les peptides et les rigidités de liaison à l’intégrine disponibles sont variés, dans une plaque standard de 384 puits appropriée pour plusieurs tests standard. Cette méthode présente des résultats représentatifs pour dépister comment les paramètres de la matrice affectent les réponses à la chimiothérapie TMZ dans les cellules GBM dérivées de deux patients uniques, désignés comme des cellules GS122 et GS304. Parmi les deux lignées cellulaires dérivées de patients évaluées ici, la réponse des cellules GS122 au traitement TMZ était sensible au microenvironnement de la matrice, tandis que celle des cellules GS304 était insensible. En ce qui concerne la rigidité de la matrice, les cellules GS122 cultivées dans des hydrogels 3D avec un module micro-compressif de 4 kPa ont maximisé la résistance TMZ, dans laquelle les cellules traitées ont augmenté en nombre plus que les cellules non traitées au cours d’un cours expérimental de 7 jours. Les propriétés mécaniques ont eu des effets plus importants sur la résistance à la TMZ que les peptides de liaison à l’intégrine inclus. Ainsi, on s’attend à ce que l’impact de la variation des concentrations de peptides, seul et en combinaison, permette la découverte de conditions matricielles favorisant la résistance aux médicaments à l’avenir. L’insensibilité des cellules GS304 à leur matrice environnante peut indiquer que la matrice est plus influente sur les cellules, comme les cellules GS122, qui sont à l’origine sensibles à la TMZ mais acquièrent une résistance pendant le traitement. En revanche, la mesure dans laquelle les signaux de matrice affectent les cellules qui sont déjà résistantes au traitement au début de l’expérience n’est pas claire, comme avec les cellules GS304.

Les résultats de cette étude s’écartaient quelque peu des résultats précédemment rapportés. Les hydrogels à base de HA les plus mous évalués (module de Young de 1 kPa en vrac, imitant la rigidité du cerveau natif) ont favorisé une résistance maximale aux TMZ des cellules GBM dérivées de quatre tumeurs de patients différents de ceux évalués ici21. Il y a plusieurs raisons possibles à cet écart. Tout d’abord, une gamme élargie de rigidités d’hydrogel a été interrogée dans la présente étude, qui a comparé les hydrogels sur une plage de modules micro-compressifs de 0,8 kPa à 8 kPa, tandis que des études antérieures n’ont comparé que des hydrogels avec des modules de 1 kPa et 2 kPa de Young. De plus, dans les études précédentes, la caractérisation mécanique a été effectuée à l’échelle en vrac en utilisant la compression mécanique linéaire pour estimer le module de Young, alors que, dans cette étude, l’AFM a été utilisée pour mesurer un module de micro-compression. Pour les chercheurs qui cherchent à mettre en œuvre les méthodes présentes ici et qui ne nécessitent pas de mesures mécaniques à micro-échelle, les modules d’échelle en vrac, utilisant la rhéométrie ou les essais mécaniques linéaires, sont des substituts parfaitement acceptables à l’AFM. Notamment, des analyses micromécaniques ont révélé les modules hétérogènes à la surface d’un seul gel. Des mesures AFM comparables sur les hydrogels formulés dans des études antérieures n’ont pas été effectuées, mais on s’attend à ce que la variance des rigidités présentées dans un seul hydrogel ait été supérieure à celles de la présente étude. Les hydrogels des études précédentes ont été générés à l’aide d’une réticulation d’addition de type Michael reposant sur un mélange cinétique à 37 degrés C 10,21,24. En revanche, la photocroérection permet un mélange complet des précurseurs de l’hydrogel avant l’exposition à la lumière, ce qui améliore l’homogénéité au sein de l’hydrogel 3D et, à son tour, réduit la variabilité des réponses cellulaires. Enfin, les tumeurs GBM présentent un comportement notoirement hétérogène et imprévisible39 et, par conséquent, il est raisonnable de s’attendre à ce que les cellules dérivées de tumeurs individuelles aient également des propriétés uniques. Ce manque de cohérence entre les échantillons de patients motive le besoin d’une plate-forme à haut débit pour élucider les caractéristiques tumorales spécifiques au patient.

Les pièges courants lors de l’exécution de la procédure de photoréticulation d’hydrogel miniaturisée comprennent le mélange incomplet de précurseurs d’hydrogel, entraînant une mauvaise reproductibilité et la gélification spontanée de la solution d’HA pendant le mélange. Ces problèmes peuvent être atténués en remuant le HA-thiol pendant au moins 45 min et la solution précurseur complète pendant au moins 30 minutes supplémentaires tout en surveillant de près le pH des solutions précurseurs d’hydrogel pour s’assurer qu’il reste inférieur à 7 pour empêcher l’oxydation du thiol et la formation de disulfure en réticulations. Contrairement aux méthodes de réticulation utilisant un mécanisme d’addition cinétique de type Michael10,21, la méthode de photocroisillonnage utilisée dans ce protocole réduit la probabilité de gélification spontanée lorsque tous les réactifs sont combinés21. Les points de contrôle de la qualité sont fortement recommandés, tels que la mesure du pourcentage de thiolation HA31 et la fabrication d’hydrogels supplémentaires pour des tests mécaniques parallèles à chaque lot de cultures 3D. Enfin, les densités d’ensemencement pour l’encapsulation 3D dans des hydrogels doivent être identifiées pour chaque type de cellule ou lignée utilisée. En général, les résultats montrent qu’une concentration minimale de 1 million de cellules/mL est suffisante pour la culture 3D de la plupart des cellules, qui forment des sphéroïdes, y compris les cellules GBM dérivées du patient, les cellules souches embryonnaires humaines (H9) et les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (données non présentées). L’inclusion d’un traitement inhibiteur de ROCK avant l’encapsulation (étape 4.1) lors de l’utilisation de cellules particulièrement sensibles est également recommandée40.

Dans le contexte du développement de nouvelles approches de traitement pour le GBM, le protocole présenté ici fournit des méthodes de dépistage fonctionnel des réponses médicamenteuses des cellules GBM dérivées du patient dans un microenvironnement physiologiquement pertinent. Un riche référentiel de données génétiques, épigénétiques et cliniques sur l’expression de l’ARNm pour le GBM (et d’autres cancers) est accessible au public grâce aux efforts de l’Atlas du génome du cancer (TCGA) et d’autres15. Utilisées conjointement avec ces grands ensembles de données, on s’attend à ce que les données générées à partir d’écrans fonctionnels de cultures 3D miniaturisées puissent révéler de nouvelles corrélations, améliorant ainsi la prédiction des résultats cliniques chez les patients individuels. Par exemple, des sous-populations de tumeurs de patients peuvent être identifiées pour lesquelles certains traitements, comme les composés perturbateurs de matrice tels que le cilengitide, peuvent améliorer les résultats cliniques41. En plus de la réponse médicamenteuse, cette plate-forme de culture permet d’évaluer l’invasion des cellules tumorales à l’aide d’imageurs à haute teneur compatibles avec les plaques. La flexibilité de cette plate-forme pour incorporer de nombreux peptides différents, seuls ou en combinaison, tout en variant orthogonalement des rigidités peut aider à identifier les caractéristiques de la matrice conduisant à l’agression tumorale GBM.

Au-delà du GBM, ces méthodes peuvent être adaptées pour étudier les effets des paramètres de matrice sur d’autres types de cellules dans le contexte d’autres maladies, du développement tissulaire et de la fonction tissulaire normale. À l’avenir, il sera facile d’augmenter encore le débit de ces méthodes, car elles ont été spécialement conçues pour être réalisées dans le contexte de plaques multipuits afin de faciliter l’adoption dans les flux de travail existants pour la découverte de médicaments en utilisant des manipulateurs de liquides automatisés et des imageurs à haut contenu disponibles dans le commerce. L’intégration facile avec l’infrastructure existante et l’automatisation accrue, qui diminuent les compétences techniques requises pour produire et maintenir des cultures d’hydrogel 3D chargées de cellules, réduiront considérablement les obstacles à l’adoption de cette méthode. Bien que les travaux ici présentent spécifiquement des cultures dans les hydrogels à base d’AH, on s’attend à ce que cette méthode puisse être facilement traduite en d’autres matériaux photoréticables couramment utilisés pour la culture cellulaire 3D, tels que la gélatine méthacrylée, et que les méthodes décrites ici fourniront une ligne directrice utile pour d’autres applications.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier spécifiquement Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore et Itay Solomon pour leurs contributions aux itérations précédentes du schéma de photogelation. Les lignées cellulaires GS122 et GS304 ont été généreusement fournies par David Nathanson. Toutes les figurines ont été créées avec BioRender.com. Les installations de base de l’UCLA, les ressources partagées de criblage moléculaire et le laboratoire de caractérisation nano et pico ont joué un rôle déterminant dans le travail. Chen-Chun a été soutenu par le programme de formation Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research de l’UCLA. Grigor Varuzhanyan a été soutenu par un programme de formation en biologie des cellules tumorales NIH Grant (T32 CA 009056).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.1 kOhm resistors, 6 W Digikey 35601k1ft
1.7 mL microcentrifuge tube Genesse Scientific 21-108
15 mL conical tube Fisher Scientific 14-959-70C
365 nm LED Digikey ltpl-c034uvh365
384 well plate Bio Greiner One 781090
40 µm cell strainer MTC bio C4040
4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) Laysan Bio 4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTs Digikey 2n5550ta
80 Ohm resistors, 0.125 W Digikey erjj-6enf80r6v
8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) Jenkem Technology A7025-1
Accutase Innovative Cell Technologies AT104500  cell dissociation  reagent
AFM Probes Novascan 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle
Arduino IDE Arduino 1.8.19
Arduino Nano Makerfire Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board
bFGF Peprotech 100-18B 20 ng/mL
CCK8 Abcam ab228554
Centrifuge Thermoscientific sorvall legend xtr
CP100ST Gilson F148415 Pipette tips for positive displacement pipette
Cubis Semi-Micro Balance Sartorius MSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50) Life Technologies 11330057 1x
DMSO Fisher Scientific BP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-) Genesse Scientific 25-508
EGF Peprotech AF100-15 50 ng/mL
Ethanol, Anhydrous Fisher Scientific A405P Add DI water to dilute to 70%
Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials Fisher Scientific 03-339-23C
Fisherbrand Weighing Paper Fisher Scientific 09-898-12B
G21 Supplement Gemini Bio 400-160 50x
Hanks Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific 14175095
HCl, ACS, 12M Sigma Aldrich S25838A Add DI water to dilute to 1 M
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma Aldrich H3149-100Ku 25 µg/mL
HEPES Sigma Aldrich H7006-100G
Hot Air Gun Wagner HT1000
Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide Genscript Custom Order GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% Sigma Aldrich 900889-1G
Magnetic stir plate Thermo Scientific SP194715
Microcentrifuge Thermo Scientific Sorvall legend micro 21R
Microman E single Channel Pipettor Gilson FD10004 Positive displacement pipette
Micropipette Tips Various Manufacturs Various sizes
mLine micropipette Sartorious
N-acetyl Cysteine Sigma Aldrich A7250-10G
Nanowizard 4 Bruker AFM microscope
NaOH Fisher Scientific ss255-1 Add DI water to dilute to 1 M
Normoicin Invivogen ant-nr-1 500x
Osteopontin Peptide Genscript Custom Order GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet Aid Drummond 4000102
Plain Microscope Slides Globe Scientific 1301
Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep Grace Bio Labs 664201-A Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet
Processing Processing 3.5.4
Repeater M4 Eppendorf 4982000322
Repeater Pipette Tips Sartorious 30089430 1 mL sizes
RGD Peptide Genscript GCGYGRGDSPG
Scoth Tape
Serological Pipettes Genesse Scientific 12-102,12-104 5,10 mL Pipettes
Solder Paste Digikey 315-NC191LT15T5-ND
Solder Wire
Straight dissecting forceps VWR Scientific 82027-408
Synergy H1 Plate Reader Biotek
T-75 Cell Culture Treated Flask Genesee Scientific 25-209
Temozolomide Sigma Aldrich T2577 Typically used from 10 µM to 100 µM
Tenascin-C Peptide Genscript GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR
GV
Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified Lifecore Biomedical HA700K5
VWR Spinbar, Flea Micro VWR 58948-375

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References

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Bioingénierie numéro 184
Les réseaux d’hydrogel permettent d’augmenter le débit pour le dépistage des effets des composants matriciels et des thérapies dans les modèles tumoraux 3D
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Liang, J., Sohrabi, A., Epperson,… More

Liang, J., Sohrabi, A., Epperson, M., Rad, L. M., Tamura, K., Sathialingam, M., Skandakumar, T., Lue, P., Huang, J., Popoli, J., Yackly, A., Bick, M., Wang, Z. Z., Chen, C. C., Varuzhanyan, G., Damoiseaux, R., Seidlits, S. K. Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models. J. Vis. Exp. (184), e63791, doi:10.3791/63791 (2022).

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