Summary
Bu protokol, farelerde çoklu intravenöz bolus dozu uygulaması ve invaziv hemodinamik izleme yürütmek için adım adım bir prosedür sağlar. Araştırmacılar bu protokolü pulmoner arter hipertansiyonu için gelecekteki terapötik bileşik taraması için kullanabilirler.
Abstract
Pulmoner arteriyel hipertansiyon (PAH), primer olarak akciğerin küçük pulmoner arteriyollerini etkileyen, ilerleyici, hayatı tehdit eden bir hastalıktır. Şu anda, PAH için bir tedavi yoktur. PAH'ı tedavi etmek için kullanılabilecek yeni bileşiklerin keşfedilmesi önemlidir. Fare hipoksisinin neden olduğu PAH modeli, PAH araştırmaları için yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Bu model, PAH Grup 3 hastalığının insan klinik belirtilerini özetlemektedir ve PAH için yeni deneysel tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için önemli bir araştırma aracıdır. Bu modeli kullanan araştırmalar genellikle farelerde bileşiklerin uygulanmasını gerektirir. Doğrudan kan dolaşımına verilmesi gereken bir bileşik için, intravenöz (IV) uygulamanın optimize edilmesi, deneysel prosedürlerin önemli bir parçasıdır. İdeal olarak, IV enjeksiyon sistemi, belirli bir süre boyunca birden fazla enjeksiyona izin vermelidir. Fare hipoksisinin neden olduğu PAH modeli birçok laboratuvarda çok popüler olmasına rağmen, bu modelde çoklu IV bolus dozu ve invaziv hemodinamik değerlendirme yapmak teknik olarak zordur. Bu protokolde, fare hipoksi ile indüklenen PAH modelinde hemodinamik değerlendirme için fare juguler veni yoluyla çoklu IV bolus dozlamasının nasıl yapılacağı ve arteriyel ve sağ ventrikül kateterizasyonunun nasıl yapılacağı hakkında adım adım talimatlar sunuyoruz.
Introduction
Pulmoner arter hipertansiyonu (PAH), istirahatte ortalama pulmoner arter sistolik basıncının 20 mmHg'dan yüksekolması ile tanımlanır 1,2. Pulmoner arter basıncında sürekli yükselme ile karakterize, sağ ventrikül aşırı yüklenmesine ve sonuçta sağ ventrikül yetmezliğine bağlı ölüme yol açan ilerleyici ve ölümcül bir hastalıktır1. Şu anda, PAH için bir tedavi yoktur.
Deneysel PAH tedavilerinin etkinliğini test etmek için pulmoner hipertansiyonun hayvan modellerinin kullanılması önemlidir. Bu modeller arasında, fare hipoksisinin neden olduğu PAH modeli, insan PAH grup 3 hastalık gelişimi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır 3,4. Bu modeli kullanan araştırmalar, genellikle yeni bileşiğin etkinliğini ve güvenliğini değerlendirmek için farelerde bileşiklerin uygulanmasını gerektirir. Bu nedenle, araştırmacılar, enjeksiyon tutarlılığını ve kan basıncı ölçümünün baştan sona tekrarlanabilirliğini sağlamak için bileşik dozlama ve hemodinamik ölçümler için ayrıntılı bir deneysel prosedüre ihtiyaç duyarlar.
Literatürde intravenöz (IV) enjeksiyon ve kan basıncı ölçme yöntemleri bildirilmiştir 5,6. Bununla birlikte, metodoloji görsel illüstrasyon ve ayrıntılı açıklamadan yoksundur. Burada başarılı bir IV bolus enjeksiyonu ve sistemik ve sağ ventrikül kan basıncının doğru ölçümü ve kaydı için temel adımları gösteriyoruz. Burada sunulan prosedürler, PAH için bir tedavi geliştirmek için bileşik uygulama platformunun IV yolu ile ilgilenen araştırmacılar için önemli bir kaynaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri, Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanan protokoller kapsamında gerçekleştirildi.
1. Hayvanların, aletlerin, kan basıncı ölçüm cihazlarının ve hipoksi odasının hazırlanması
- Hayvan iklimi.
NOT: Bu çalışma için kullanılan deney hayvanları, 25-27 g ağırlığındaki erkek, 8 haftalık C57BL/6 farelerdi. Deney için gerekli hayvan sayısını tahmin ederken, ameliyata bağlı mortalite, beklenmedik cerrahi komplikasyonlar ve ani beklenmedik ölüm dahil olmak üzere çeşitli faktörler göz önünde bulundurulmalıdır. İstatistiksel güce ulaşmak ve yetersiz çalışmalardan kaçınmak için grup başına en az 10 fare kullanın.- Kabul edildikten sonra, hayvanları uygun yatak, kemirgen yemi ve su ile sağlanan havalandırmalı kemirgen kafeslerinde (kafes başına beş hayvandan oluşan gruplar) barındırın. Hayvanların en az 3 gün boyunca yeni ortama alışmasına izin verin (18-20 ° C'de 12 saat aydınlık-karanlık döngüsü).
- Bunları rastgele şu gruplara atayın: Normoksi (Grup 1), hipoksi (Grup 2) ve hipoksi + 7C1/let-7 miRNA (Grup 3).
- Cerrahi aletler ve tansiyon ölçüm cihazlarının hazırlanması.
- Tüm cerrahi aletleri otoklavlayarak sterilize edin (Şekil 1A).
- Ev yapımı anestezi burun konisi (Şekil 1B), dikiş paketleri (Şekil 1C) ve PAH prosedürü için ekipman (Şekil 1D-F) ile derme çatma bir enjeksiyon platformu hazırlayın.
- Pulmoner arter hipertansiyonu (PAH) indüksiyonu için deneysel ortam.
- N2 tankını, oksijen sensörünü ve yarı kapatılabilir hipoksi odasını ayarlayın (Şekil 2A).
- Oksijen sensöründe %10O2'lik bir ayar noktası oluşturun ve sistemin kararlı duruma ulaşmasına izin verin (Şekil 2B, C).
- Hipoksi (Grup 2) ve hipoksi + 7C1/let-7 miRNA (Grup 3) hayvanlarını 3 hafta boyunca hipokside (%10 O2) tutun. 3 haftalık hipoksiden sonra, hayvanları 1 hafta boyunca normoksik koşullar altında yerleştirin (Şekil 2D). Normolik grup (Grup 1) 4 hafta boyunca normokside kalır.
NOT: (1) 3 haftalık hipoksi ve ardından 1 haftalık normoksi, PAH ve sağ ventrikül kalp yetmezliği gelişimi için iyi bilinen bir yöntemdir7. Oksijen sensörü, yarı kapatılabilir hipoksi odasının içindekiO2 konsantrasyonunu algılar ve gaz infüzyon tüpündenN2 gazı infüze ederek düzeltir. - Deney süresince (3 hafta) hayvanları günlük olarak inceleyin. Hayvanlar dramatik kilo kaybı ve nefes almada zorluk gibi sıkıntı belirtileri gösteriyorsa bir veterinere danışın. Şiddetli sıkıntı içindeki hayvanlar için ötenazi gerekliyse, hayvanı çalışmadan hariç tutun.
NOT: Hipoksiye maruz kalma, farenin vücut ağırlığının azalmasına neden olur. Vücut ağırlığının %10'luk bir kaybı tipik olarak PAH gelişiminin güvenilir bir göstergesi olarak kullanılır. - Hipoksi odasının geniş açılmasından kaçının. Kafes temizliği, yiyeceklerin yenilenmesi, su şişelerinin değiştirilmesi ve bileşik uygulama için odaları haftada 1 saatten fazla açmayın.
2. Juguler ven yoluyla intravenöz bolus enjeksiyonu
- Fare hazırlığı ve anestezi.
- Hipoksi odasından hipoksi (Grup 2) ve hipoksi + 7C1/let-7 miRNA (Grup 3) fare kafeslerini çıkarın ve hayvanı yavaşça kafesten çıkarın.
NOT: 7C1 / let-7 miRNA (1.5 mg / kg IV / doz) için dozaj rejimi, 4 haftalık tedavi için haftada iki kezdir. Araştırmacıların, tüm hayvanların zaman aralığı başına aynı büyüklükte hipoksi maruziyeti aldığından emin olmak için IV enjeksiyonu sırasında hipoksi odasından hem hipoksi hem de hipoksi + bileşik tedavi kafeslerini çıkarmaları önerilir. - Fareyi hassas bir terazi kullanarak tartın ve ağırlığını kaydedin (Şekil 3A).
- Fareyi anestezik buharlaştırıcıya bağlı bir anestezi indüksiyon odasına yerleştirin ve kapatın (Şekil 3B). Anestezi sırasında kurumayı önlemek için termal destek sağlayın ve her iki göze de göz kayganlaştırıcı uygulayın. Fareyi bilinçsiz olana kadar% 3 izoflurana maruz bırakın (Şekil 3C-D).
- Fareyi hazneden çıkarın ve kürkü çeneden kaudal olarak sternumun ortasına kadar kraniyal olarak tıraş edin. Yanal olarak, kürkü çene açılarından, boynun yanlarından ve omuzlara doğru tıraş edin (Şekil 3E).
- İzofluran anestezi uygulanmış fareyi sırtüstü pozisyonda (göbek tarafı yukarı bakacak şekilde) diseksiyon mikroskobunun altındaki bir enjeksiyon platformuna yerleştirin. Anesteziyi %1.5 izofluran içeren bir burun konisi ile koruyun ve vücudu hareketsiz hale getirmek için dört bacağı yapışkan bantla hafifçe sabitleyin (Şekil 3F).
- Yeterli düzeyde anestezi sağlamak için düz forseps ile zararlı bir uyaran (yani ayak parmağı sıkıştırma) uygulayın. Anestezi uygulanan fare, cerrahi prosedür öncesinde ve sırasında stimülasyona yanıt vermemelidir.
- Hipoksi odasından hipoksi (Grup 2) ve hipoksi + 7C1/let-7 miRNA (Grup 3) fare kafeslerini çıkarın ve hayvanı yavaşça kafesten çıkarın.
- Enjeksiyon ajanı hazırlama.
- Steril koşullar altında 1.5 mg / kg'lık bir dozda tek dozluk bir enjeksiyon bileşiği hazırlayın.
NOT: Soğuk maddelerin enjeksiyonu rahatsızlığa ve fare vücut sıcaklığının düşmesine neden olabileceğinden (bu bileşiğe zarar vermiyorsa) enjeksiyon bileşiğini oda sıcaklığına (RT) ısıtın. Bu çalışmada kullanılan 7C1/let-7 miRNA bileşiğinin optimal dozu ve süresi önceki yayınlaradayanmaktadır 8,9. - Steril tek kullanımlık şırıngaya enjekte edilecek hacmi yükleyin. Şırıngayı dik tutun ve havayı şırıngadan dışarı atmak için pistonu ilerletin. Şırıngayı tekrar kullanmayın.
- Hayvanlar üzerinde hemodilüsyon ve anormal kardiyak etki insidansını azaltmak için enjeksiyon hacmini 25 g'lık bir farede 200 μL ile sınırlayın. Daha büyük bir hacim gerekiyorsa, enjeksiyon bileşiğini 10 dakika aralıklarla iki enjeksiyona bölün.
- Steril koşullar altında 1.5 mg / kg'lık bir dozda tek dozluk bir enjeksiyon bileşiği hazırlayın.
- Fareyi IV enjeksiyonu için hazırlayın.
- Cerrahi alanı üç alternatif tur povidon-iyot çözeltisi ve% 70 etanol ile üç kez nazikçe ovalayın. Cerrahi işlemden 30 dakika önce buprenorfin (0.05 mg / kg, SQ) uygulayın.
- Bir neşter bıçağı kullanarak boynun orta hattının hafifçe sağında 0,5 cm uzunlamasına bir kesim yapın (Şekil 3G).
- Sağ eksternal juguler veni bulmak için kas ve yağ dokularını ayırmak için forseps kullanın (Şekil 3H).
NOT: Yara izi oluşumunu önlemek için enjeksiyon bölgelerini her seferinde döndürün. - Enjeksiyon alanının kolay görselleştirilmesini sağlamak için yüksek güçlü bir objektif lens kullanın (Şekil 3I).
- IV enjeksiyon
- İğne eğimi yukarı bakacak şekilde juguler damara 28 G'lik steril bir iğne yerleştirin (Şekil 3J, K).
NOT: Kuyruk damar enjeksiyonu, juguler ven enjeksiyonuna bir alternatiftir. Bununla birlikte, damar derinliği, fare kuyruğu deri rengi ve cilt sertliğindeki değişkenlik nedeniyle bu tekniğin tekrarlanan dozlamayı gerçekleştirmesi zordur. - Bileşiği damara enjekte etmek için şırınga pistonuna yavaşça bastırın. Enjekte edicinin geri akışını önlemek için iğnenin damar içinde 10 saniye daha kalmasına izin verin (Şekil 3L).
NOT: Mavimsi boya, enjeksiyonun kolay görselleştirilmesini sağlar. Test malzemelerini enjekte ederken boyayı dahil etmeyin. Yanlış bir enjeksiyon, IV enjeksiyon bölgesi çevresinde mavimsi boya birikmesine neden olacaktır. - İğneyi çıkarın ve kanamayı önlemek için enjeksiyon bölgesine basınç uygulamak için pamuklu çubuk kullanın (Şekil 3M).
- Cildi 5-0 sütür ile dikin (Şekil 3N). Ameliyattan sonra hayvanı ılık, temiz ve kuru bir alana taşıyın ve Meloksikam (1 mg/kg, SQ, q24h) sağlayın. Hayvanı, yatağı olmayan, ancak alt kısmı bir kağıt havluyla kaplı temiz bir kurtarma kafesine yerleştirin.
NOT: Fare anesteziden uyanmalı ve kurtarma kafesine geri döndüğünde 5 dakika içinde bilincini geri kazanmalıdır. Fareyi tehlike belirtileri açısından izleyin. - Hayvanları ev kafeslerine geri koyun ve fare kafesini hipoksi odasına geri koyun.
NOT: Bir farenin uyuşturulmasından juguler ven enjeksiyonunun bitirilmesine kadar tüm prosedür, tek bir deneyci tarafından yaklaşık 10-15 dakika sürer. Farelerde normoksi maruziyetini kısaltmak için, en az iki araştırmacının juguler ven enjeksiyon prosedürünü gerçekleştirmek için işbirliği yapması önerilir.
- İğne eğimi yukarı bakacak şekilde juguler damara 28 G'lik steril bir iğne yerleştirin (Şekil 3J, K).
3. Kan basıncı ölçümü
- Kan basıncı ölçümü için aletler hazırlayın.
- Hemodinamik ölçümden en az 30 dakika önce 1.0 F kateterin ucunu 37 °C önceden ısıtılmış PBS'ye batırın (Şekil 4A).
- Kateter yerleştirme bölgesinden istenen kateter ucu konumuna olan mesafeyi ölçün. Örneğin farenin aort damarına çıkması ile boynun ortasına kadar olan mesafe yaklaşık 1-1,2 cm'dir. Kalbin sağ karıncığı ile boynun ortası arasındaki mesafe yaklaşık 2,3-2,8 cm'dir.
- Yerleştirme derinliğinin görsel bir göstergesini sağlamak için iki kateter mesafe işaretini işaretleyin (Şekil 4B).
- Kateteri basınç dönüştürücüsüne takın, basınç dönüştürücüyü veri toplama cihazındaki giriş kanalı 1'e bağlayın, basınç-hacim kontrol ünitesini açın ve veri toplama kan basıncı analiz yazılımını başlatın. Yeni bir kan basıncı analiz belgesi oluşturun ve kanal 1'i basınç için ayarlayın.
- Üreticinin protokolüne göre bir basınç kalibrasyonu yapın. Tüm kurulumun en az 5 dakika stabilize olmasına izin verin (Şekil 4C).
- Kan basıncı analiz yazılımında, Kanal 1 açılır menüsünden Birim Dönüştürme'yi seçin (Şekil 4D, kırmızı ok).
- Varsayılan Birim Dönüştürme Değerlerini ayarlayın (Şekil 4E).
NOT: Kan basıncı milimetre cıva (mmHg) olarak temsil edilir. Basınç Kontrol Ünitesinden standartlaştırılmış basınç çıkışı 100 mmHg'de 1 V'tur. 25 mmHg, 0,25 V çıkışa karşılık gelir ve 100 mm Hg, 1 V çıkışa karşılık gelir.
- Fareyi kan basıncı ölçüm prosedürü için hazırlayın.
- Fareyi bir burun konisi aracılığıyla% 3 izofluran inhalasyonu ile uyuşturun.
- Fare anestezi altında gözlerini kapatamayacağından, kuruluğu önlemek için veteriner merhemini doğrudan fare gözlerinin oküler yüzeyine uygulayın. Anestezi altındayken farenin boynundaki kürkü tıraş edin.
- Traş edilen bölgeyi üç alternatif tur povidon-iyot çözeltisi ve% 70 etanol çubuğu ile ovalayın. Anestezi uygulanmış fareyi diseksiyon mikroskobunun altındaki bir enjeksiyon platformuna sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Cerrahi prosedür boyunca anesteziyi (% 1.5 izofluran) korumak için farenin burnunu burun konisine yerleştirin.
- Anestezi uygulanmış farenin zararlı uyarana motor tepkisini test edin. Anestezi uygulanan fare, ameliyattan önce ve ameliyat sırasında zararlı bir uyarana yanıt vermemelidir.
NOT: Solunabilir (izofluran) ve enjekte edilebilir (ketamin / ksilazin) anestezikler kan basıncını düşürebilir. Genel olarak, izofluran inhalasyon anestezisi, kan basıncını düşürmede ketamin / ksilazinden daha hafif bir etkiye sahiptir. Bu nedenle, izofluran, ketamin / ksilazin yerine tercih edilen inhalan anesteziktir. Uygun anestezi derinliğine ulaşmak, doğru ve tekrarlanabilir hemodinamik ölçümler için kritik öneme sahiptir. Araştırmacının her fare için anestezi derinliğini sabit tutması gerekir.
- Asendan aort kateterizasyonu
- Yeterli düzeyde anestezi sağlamak için düz forseps ile zararlı bir uyaran (yani ayak parmağı sıkıştırma) uygulayın. Mandibuladan sternuma kadar cildin orta hat insizyonunu yapın (Şekil 5A).
- Tükürük bezlerini ayırın ve soluk borusunu ortaya çıkarın (Şekil 5B).
- Sağ karotis arteri ve sağ eksternal juguler veni ortaya çıkarmak için damarlar boyunca yumuşak dokuyu temizlemek için forseps kullanın (Şekil 5C).
- Karotis arteri manipüle ederken vazospazm gelişimini yavaşlatmak için boşluğa 0.5 mL PBS koyun.
- Sağ karotis arterin 5 mm'lik bir bölümünü dikkatlice izole edin. Arteri daha görünür hale getirmek için arka plan olarak damarın altına bir parça steril beyaz kağıt yerleştirin (Şekil 5D).
NOT: Vagus sinirini (beyaz) arterden dikkatlice ayırın ve siniri veya arteri kesmemeye veya zarar vermemeye dikkat edin. - 8-0 sütür, damarın kraniyal ucunu kapatmak için kalıcı bir düğüm (# 1) bağlayın (Şekil 5E).
- Aorttan kan akışını geçici olarak engellemek için ilk gevşek düğümü (# 2) bağlayın. Ardından, ilk iki dikiş arasına ikinci bir gevşek düğüm (# 3) bağlayın (Şekil 5F). İkinci gevşek düğüm (# 3), yerleştirildikten sonra kateteri hızlı bir şekilde sabitlemek için kullanılacaktır.
- 25 G'lik bir iğne kullanarak, #3 ve #1 ligatürleri arasındaki damarla aynı hizada kateteri geçecek kadar büyük küçük bir delik açın (Şekil 5G).
NOT: Karotis arterler kalpten oksijenli kan taşır ve çok yüksek basınca sahiptir. Karotis arter kesilirse, bu basınç kanın dışarı fışkırmasına neden olur (Şekil 5H). - Kateteri uçtan 1,5 inç uzakta tutun ve kateterin ucunu arter deliğinden (X işareti) yavaşça sokun. Kateterin geçişine izin veren kateter ve damarın etrafındaki orta sütür düğümünü (# 3) sıkın (Şekil 5I-J).
NOT: Bu adım pratik gerektirir. Bu adımla ilgili potansiyel komplikasyonlar arasında kateter yerleştirme yerinde kanama ve vazospazm yer alır. Kanama meydana geldiğinde, kanayan arterden kan kaybı kan hacmini azaltır ve sistemik kan basıncında ciddi bir düşüşe neden olur. Ciddiyeti nedeniyle, hayvan insancıl bir son noktaya ulaştı ve ötenazi yapılması gerekiyor. Mekanik olarak indüklenen vazospazm için, genellikle kan damarlarının kalıcı bir şekilde kasılmasından kaynaklanan kateter yerleştirme sırasında ortaya çıkar. Bu, kan damarı açıklığını küçültür ve kateterin karotis artere ilerlemesini önler. Kateteri ilerletmek için dirence karşı aşırı güç uygulamayın. Orta veya şiddetli vazospazm direnci ile karşılaşıldığında, kısa bir süre sonra tekrar deneyin veya daha küçük bir kateter kullanın (ör., 1.0 F). Deneyimli mikrocerrahlar, asendan aort kateterizasyonu için %100 başarı oranlarına ulaşabilirler. - Kateter sensör ucuyla ilk gevşek düğümü (# 2) geçtikten sonra, kateteri sabitlemek için ikinci gevşek düğümü (# 3) daha sıkı sabitleyin ve ilk gevşek düğümü (# 2) nazikçe serbest bırakın (Şekil 5K, L).
- Basınç analizi arteriyel kan basıncı profili gösterene kadar kateteri kateter üzerindeki işarete göre (Şekil 4B) çıkan aorta doğru yerleştirmeye devam edin (Şekil 5M). Veri toplama sistemini ve yazılımını kullanarak sistemik kan basıncı (SBP) verilerini kaydedin.
- Kateterin dışarı çekilmesine izin vermek için orta dikiş düğümünü (# 3) gevşetin (Şekil 5N).
- Kateteri karotis arterden dışarı çekmeden önce orta sütür düğümünü (# 3) damarın etrafına bağlayın (Şekil 5O-P).
- Kateteri PBS'ye yerleştirin.
- Sağ kalp kateterizasyonu.
- Sağ dış juguler veni çevreleyen bağ dokusundan dikkatlice izole edin ve tüm küçük dalları 8-0 ile bağlayın sütür (mavi ok uçları) (Şekil 6A).
NOT: Sağ kalp kateterizasyonu için kalbe genellikle sağ juguler ven yoluyla girilir. - 8-0 dikiş, damarın kraniyal ucunu kapatmak için kalıcı bir düğüm (# 1) bağlayın (Şekil 6B). Ardından, kabın kuyruk ucuna gevşek bir düğüm (# 2) bağlayın (Şekil 6C).
- Kalıcı düğüme (# 1) yakın küçük bir delik açmak için 25 G'lik bir iğne kullanın (Şekil 6D).
NOT: Juguler venler oksijensiz kanı kalbe taşır ve düşük basınca sahiptir. Şah damarı kesilirse, kan dışarı fışkırmaz (Şekil 6D, E). - Kateteri tutun ve kateteri damarın kesiğine (X işareti) yerleştirin (Şekil 6E) ve kateter ve damarın etrafındaki kaudal düğümü (# 2) sıkın (Şekil 6F).
- Kateteri yavaşça ve nazikçe sağ kalbe itin. Kateter işaretine göre kateter ucu derinliğini izleyin (Şekil 4B).
NOT: Kapalı göğüs farelerinde sağ ventrikül sistolik basıncının (RVSP) değerlendirilmesi, karmaşık RV anatomisi ve yapısı nedeniyle zor bir iştir. Bu adım, yüksek düzeyde uzmanlık ve çok fazla pratik gerektirir. Deneyimli bir mikrocerrahın elinde sağ ventrikül kateterizasyonunun başarı oranı %90'a yaklaşabilir. - Kateter ucu pozisyonunu yazılımdaki basınç dalgası izlemesine göre değerlendirin. Kateterin ucu sağ ventrikülde olduğunda, monitör tipik bir RVSP izlemesi gösterecektir (Şekil 6G, H).
NOT: Pulmoner basınç eğrilerinin şekli atipik göründüğünde (örneğin, dikenli eğriler), bu, kateterin yanlış konumlandırılması anlamına gelir. Kateteri hafifçe biraz geriye çekerek ve ardından kateteri yavaşça sağ ventrikül içinde daha merkezi bir konuma ilerleterek kateter pozisyonunu ayarlayın. Araştırma verilerinde artefakt oluşumunu önlemek için, araştırmacı sağ ventrikül kateterizasyonunda uzun süreli (1 dakikadan fazla değil) veya tekrarlanan girişimlerden (iki denemeden fazla değil) kaçınmalıdır. - Kateteri hareketsiz tutun ve verileri 5 dakika boyunca toplayın.
- Kayıt tamamlandıktan sonra, kateteri dikkatlice dışarı çekin ve kuyruk düğümünü (# 2) damarın etrafına bağlayın (Şekil 6I). Kateteri tekrar PBS solüsyonuna yerleştirin.
NOT: Deneyin tamamlanmasından sonra, kateteri üreticinin talimatlarına göre% 1 sindirim enzimi çözeltisi ile temizleyin. Hemodinamik durumu değerlendirmeye ek olarak, araştırmacılar PAH histopatolojik incelemesi için kalpleri ve akciğerleri toplayabilirler. Çoklu IV bolus dozlamasının etkinliğini sağlamak için, araştırmacılar akciğer endotel hücrelerini izole edebilir ve let-7 miRNA seviyelerini ölçebilir.
- Sağ dış juguler veni çevreleyen bağ dokusundan dikkatlice izole edin ve tüm küçük dalları 8-0 ile bağlayın sütür (mavi ok uçları) (Şekil 6A).
4. Kan basıncı veri analizi
- Kan basıncı kaydını inceleyin.
- Kan basıncı analizi yazılım veri dosyasını (PAH JOVE.adicht) açın.
- Kanal 1'de, basınç sinyalini temsil eden bir alan seçin ve basınç genliğini ölçmek için Dalga Biçimi İmlecini Tepe Noktasına (X işareti) yerleştirin (Şekil 7A).
- Basınç dalgasının maksimum genliğini belirleyin. Bu, sistolik basıncı temsil eder (Şekil 7A, kırmızı ok).
- Shift + Command + 3 (Mac için) veya Windows + Shift + S (Windows PC için) tuşlarına basarak ilgilendiğiniz bölgeyi (Şekil 7B gri alan) görüntüden çıkarın ve bir grafik dosyasına yapıştırın.
- Kan basıncı verilerinin istatistiksel analizi.
- Bireysel fare kan basıncı verilerini istatistiksel analiz yazılımına girin.
- İki çalışma grubunun istatistiksel analizi için eşleştirilmemiş bir Öğrenci t-testi gerçekleştirin (normoksi ve hipoksi; hipoksi ve hipoksi + 7C1 / let-7 miRNA). Ortalama değerlerdeki farklılıkları p < 0.05 kadar anlamlı olarak düşünün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anestezi genellikle kan basıncını düşürür. Bu nedenle, zararlı bir uyarana yanıt olarak hareketleri ortadan kaldırmak için minimum anestezi dozu kullanıldı. Başarılı sağ ventrikül odası erişimi, venöz sistemlerin farklı bölgelerinde hemodinamik dalga formu değişiklikleri olarak görselleştirilebilir (Şekil 8).
Bu çalışmada, fareler rastgele normoksik (% 21O2) grubuna (n = 10), hipoksi (% 10O2) grubuna (n = 10) veya hipoksi + 7C1 / let-7 tedavi grubuna (n = 10) atandı. let-7 miRNA'nın hipoksi kaynaklı PAH gelişiminin baskılanmasındaki etkisini incelemek için, formüle edilmiş 7C1/let-7 miRNA, C57BL/6 farelerine 4 hafta boyunca haftada iki kez 1.5 mg/kg'lık bir dozda intravenöz olarak uygulandı (Şekil 2D).
Hipoksi veya normoksiye maruz kaldıktan 4 hafta sonra, kapalı göğüslü bir farede SBP ve RVSP ölçüldü. Şekil 9A , normoksik, hipoksi veya hipoksi + 7C1/let-7 miRNA tedavi gruplarından temsili kan basıncı eğrisini göstermektedir. Normodoksi kontrol grubundakilerle karşılaştırıldığında, hipoksi grubunda RVSP anlamlı olarak artmıştır. Ek olarak, hipoksi grubu ile karşılaştırıldığında, farelerde 7C1 / let-7 miRNA bileşiği ile tedavi, RVSP'nin önemli ölçüde azalmasına neden oldu (Şekil 9B). SBP, önceki raporlarla tutarlı olarak hiçbir grupta değişmedi7. 7C1/let-7 miRNA, endotel hücrelerini hedefler ve TGFβ sinyal kaskadı8'i azaltır. Veriler, 7C1/let-7 miRNA 1.5 mg/kg'ın sağ ventriküldeki kan basıncını düşürmede oldukça etkili olduğunu ve çoklu IV bolus dozlamasının etkinliğini gösterdiğini göstermektedir.
Şekil 1: Pulmoner arter hipertansiyon prosedürleri için gerekli cerrahi aletler ve kan basıncı ölçüm ekipmanı. (A) PAH prosedürü için kullanılan cerrahi aletler. (B) 50 mL'lik konik bir paketten bir Strafor rafın etrafına sarılmış emici bir pedden yapılmış derme çatma bir enjeksiyon platformu. Enjeksiyon platformuna 10 cm uzunluğunda anestezi tüpünün burun konisi olarak takılması. (C) Sütür paketleri. Kesi kapatma için 5-0 sütür ve 8-0 ligasyon için sütür. (D-F) PAH prosedürü için kullanılan kan basıncı ölçüm ekipmanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PAH indüksiyonu için deneysel ayar. (A) BioSpherix hipoksik sisteminin kurulumunun fotoğrafı. İndüksiyon sisteminin farklı parçaları belirtilmiştir. (İ.Ö.) Hipoksi odasıO2 konsantrasyonunu izleyen oksijen sensörü. (D) PAH indüksiyonu sırasında tüm hayvan grupları için 7C1/let-7 miRNA bileşik tedavisi ve oksijen seviyesine maruz kalma için deneysel zaman çizelgesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Juguler ven enjeksiyonu için önemli cerrahi adımların fotoğrafları. (A) Ağırlık ölçeğinde fare. (B) Kemirgen anestezi indüksiyon sistemi kurulumu. İndüksiyon sisteminin farklı parçaları belirtilmiştir. (C-D) Bir indüksiyon odasında izofluran anestezi uygulanmış bir farenin resimleri. (E) Kürk çıkarılmış cerrahi bölge. (F) Bir enjeksiyon platformuna yerleştirilen ve bir buharlaştırıcıdan gelen bir burun konisi aracılığıyla% 1.5 izofluran soluyan bir fare. (G) Şah damarı yaklaşımı için cilt kesisi. (H) Sağ eksternal juguler venin cerrahi diseksiyonu. (I) İzole sağ juguler veni gösteren daha yüksek büyütmeli görüntüleme. Damarın altına, damarı daha görünür hale getiren beyaz bir kağıda dikkat edin. (J-K) Eğim yukarı bakacak şekilde sağ juguler ven iğnesi yerleştirilmesi. (L) Mavimsi boya içeren bir bileşiğin juguler ven içine enjeksiyonu. (M) İğneyi çektikten sonra pamuklu çubuk kullanarak enjeksiyon bölgesine basınç uygulamak. (N) Yaranın 5-0 dikişle dikilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kateter kalibrasyonu. (A) 1.0 F kateter ucunun 37 °C önceden ısıtılmış PBS'ye batırılması. (B) Kateterin asendan aort ve sağ ventriküle yerleştirilme derinliğini tahmin etmeye yardımcı olmak için kateter üzerindeki mesafe işaretleri. (C) Sıfır taban çizgisi kalibrasyonuna tabi tutulan kan basıncı ölçüm ekipmanı. (Ca') Kan basıncı analizi yazılımı tabanlı kateter taban çizgisi analizinin ekran görüntüsü. (D) Kanal 1 açılır menüsü altında, kan basıncı analiz yazılımındaki Birim Dönüştürme iletişim kutusunu seçin. (E) Giriş voltajı sinyalini mmHg birimine dönüştürmek için varsayılan Birimler Dönüştürme değerlerini ayarlama. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Sistemik kan basıncı (SBP) ölçümleri için cerrahi prosedürler. (A) Boyun derisinde mandibuladan sternuma orta hat kesisi. (B) Trakeayı açığa çıkarmak için tükürük bezinin ayrılması. (C) Doku diseksiyonu sonrası sağ karotis arter ve sağ eksternal juguler ven açıkta kaldı. (D) Karotis arterin izole edilmiş 5 mm'lik bir bölümü. (E,F) Kraniyal ekstremitede kalıcı düğüm ve kaudal ekstremitede iki gevşek düğüm dikin. (G,H) Karotis arter üzerinde küçük bir delik (X-işareti) yapmak, kalıcı düğüme (# 1) sadece kaudal. (I) Kateterin karotis artere yerleştirilmesi. (J) Kateterin orta dikiş düğümü (# 3) ile sabitlenmesi. (K,L) İlk gevşek düğümü (# 2) nazikçe serbest bırakmak. (M) Temsili arteriyel basınç dalgaları. (N) Orta sütür düğümünün gevşetilmesi (# 3). (O,P) Damarın etrafındaki orta dikiş düğümünün (# 3) sıkılması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Sağ ventrikül sistolik basıncı (RVSP) ölçümleri için cerrahi prosedürler. (A) Sağ juguler venin küçük dallarının bağlanması (mavi ok uçları). (B) Şah damarının kraniyal ucunda kalıcı bir düğüm (# 1). (C) Şah damarının kaudal ucunda gevşek bir düğüm (# 2). (D) Sağ juguler ven kaudalinde kalıcı düğüme küçük bir delik açmak (# 1). (E) Küçük bir delikten (X-işareti) juguler ven içine bir kateter yerleştirilmesi. (F) Kateter ve damar etrafındaki kuyruk düğümünü (# 2) sıkın. (G) Kateteri kalbin sağ ventrikülüne itmek. (H) Temsilci RVSP. (I) Damarın etrafındaki kuyruk düğümünü (# 2) sıkmak. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Kayıttan sonra kan basıncı analiz yazılımı veri analizi. (A) Kanal 1'deki ham kan basıncı analiz yazılımı verilerinden basınç genliğini ölçmek için Dalga Formu İmlecini kullanma. (B) Ham kan basıncı analiz yazılımı veri görüntüsünden ilgilenilen bölgenin çıkarılması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Sağ ventrikül kateterizasyonu sırasında hemodinamik dalga formu geçişi. (AD) Bir C57BL/6 farenin fare sağ ventrikül kateterizasyonu sırasında basınç değişikliklerinin temsili izleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Kan basıncı analizi gösterim rakamları ve veri analizi. (A) Normoksi, hipoksi ve hipoksi + 7C1/let-7 miRNA ile tedavi edilen farelerde temsili SBP ve RVSP eğrileri. (B) Normoksi, hipoksi ve hipoksi + 7C1/let-7 miRNA ile tedavi edilen farelerde SBP ve RVSP'nin özet grafikleri (NS: önemli değil; **p < 0.01; ***p < 0.001; eşleşmemiş iki kuyruklu Öğrenci t-testi). N = grup başına 10. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İnsan deneklerde artmış pulmoner vasküler direnç olaylarını taklit etmek için çeşitli pulmoner hipertansiyon hayvan modelleri oluşturulmuştur. Bunlar arasında, fare hipoksisinin neden olduğu PAH modeli, PAH için yeni deneysel tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu modeli kullanan araştırmalar genellikle bileşiklerin farelere uygulanmasını gerektirir. Yayınlanmış diğer intravenöz (IV) enjeksiyon ve invaziv hemodinamik değerlendirme protokolleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntem hem görsel gösterim hem de ayrıntılı açıklama sağlar.
Prosedürün başarılı bir şekilde yürütülmesi ve doğru ve tekrarlanabilir kan basıncı ölçümlerinin elde edilmesi için üç kritik adım vardır. İlk olarak, şırınga iğnesinin şah damarına doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Yanlış juguler ven enjeksiyonu deri altı enjeksiyonuna neden olabilir. İkincisi, yeterli anestezi derinliğini sağlayın. Her farede tutarlı anestezik derinliği, gruplar arasında karşılaştırılabilir verilerin üretilmesi için önemlidir. Çok derin anestezi, kan basıncı seviyelerinde önemli bir düşüşe neden olabilir. İzofluran inhalasyon anestezisine ek olarak, intraperitoneal ketamin / ksilazin enjeksiyonu, fare cerrahisi için yaygın olarak kullanılan bir başka anestezik yöntemdir. Her iki yöntemin de avantajları ve dezavantajları vardır. İzofluran inhalasyon anestezisi, enjekte edilebilir ketamin / ksilazine göre hızlı başlangıç, kontrollü ilaç yok, hızlı iyileşme dahil olmak üzere çeşitli avantajlara sahiptir ve anestezi derinliğini kontrol etmek çok daha kolaydır. Dezavantajları, ekipmanın maliyeti, hoş olmayan koku ve insanların atık anestezik gazlara maruz kalmasıdır. Üçüncüsü, kateterin kalbin sağ ventrikülünün içinde olduğundan emin olun. Sağ ventrikül kateterizasyonunda uzun süreli veya birden fazla başarısız girişim yanlış kan basıncı ölçümlerine neden olabilir.
Farelerde IV enjeksiyonu ağırlıklı olarak lateral kuyruk damarları yoluyla uygulanır. Bu rotaya iğnelerle ulaşmak kolay olsa da, bu tekniğin bazen çoklu IV bolus dozlaması yapması zordur. Bu tekniğin uygulanmasındaki iki büyük zorluk, damar derinliğindeki değişkenlik ve farelerin kuyruğu cilt rengi ve cilt sertliği nedeniyle iğne görselleştirmenin zorluğudur. Daha da önemlisi, enjeksiyonun tüm içeriğinin kan dolaşımına başarılı bir şekilde girip girmediğini ve çevre dokulara girip girmediğini doğrulamanın bir yolu yoktur. Şah damarı tercih edilen bir erişim bölgesidir, çünkü (1) klinik olarak önemlidir, (2) enjekte edilenin damara verilmesinin görsel olarak doğrulanmasını sağlar, (3) deney sırasında bir grup hayvanın çoklu enjeksiyonlarına izin verir ve (4) bu enjeksiyon tekniği güvenlidir ve prosedür herhangi bir yan etkiye neden olmaz.
Farelerde kan basıncını kaydetmenin üç yolu vardır: (1) Non-invaziv kuyruk manşet pletismografisi10. Sistemler, uzunlamasına bir çalışma boyunca tekrarlanan ölçümleri mümkün kılar. (2) Radyo telemetrisi11. Sistemler, uyanık ve serbestçe hareket eden laboratuvar hayvanlarında gerçek zamanlı kan basınçlarının izlenmesini sağlar. (3) İnvaziv intra-arteriyel kateterler12. Sistemler, akut SBP ve RVSP ölçümlerini mümkün kılar. Bu protokolde, yüksek doğrulukta sistemik ve sağ ventrikül basınç ölçümleri için bir basınç kateteri seçtik. Ancak, bu yöntemin bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, basınç kateteri ve kan basıncı ölçüm ekipmanı pahalıdır (Şekil 1E-F). İkincisi, hayvanların uyuşturulmasını gerektirir, bu da kan basıncının düşmesine neden olur. Üçüncüsü, sağ kalp kateterizasyonu seri ölçümlere izin vermeyen terminal bir prosedürdür. Dördüncüsü, prosedürün iyi eğitimli bir mikrocerrah tarafından bile öğrenilmesi kolay değildir.
Kan basıncı kaydedildikten sonra, araştırmacı histolojik PAH karakterizasyonu için kalpleri ve akciğerleri hayvanlardan izole edebilir. Örneğin, sağ ventrikül hipertrofisi için sağ ventrikül duvar kalınlığı ölçümleri ve kas pulmoner arter yeniden şekillenmesi için muskülarize pulmoner distal damar analizi. Veriler, 7C1/let-7 miRNA'nın pulmoner kan basıncını düşürmede oldukça etkili olduğunu ve çoklu IV bolus dozumuzun etkinliğini gösterdiğini göstermektedir. Ek olarak, araştırmacılar, enjekte edilen materyallerin etkinliğini değerlendirmek için akciğer endotel hücrelerini yeni izole edilmiş tüm akciğerden izole edebilir.
Özetle, bu protokol, fare hipoksisinin neden olduğu bir PAH modelinde çoklu IV bolus dozu ve invaziv hemodinamik izlemenin yürütülmesi için adım adım bir prosedür sağlar. Araştırmacılar, IV enjeksiyonu ve hemodinamik izleme gerektiren çok çeşitli kemirgen modelleri için burada açıklanan juguler ven enjeksiyonu ve arteriyel / sağ ventrikül kateterizasyon tekniklerini kullanabilirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M Simons, VasoRx, Inc.'in Bilimsel Danışma Kurulu üyesidir. Diğer yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma, kısmen, NIH hibe P30AR070253 (PYC), Kardiyovasküler Tıbbi Araştırma Eğitim Fonu (PYC), VasoRx, Inc. Fonu (MS) ve NIH hibeleri HL135582 (MS), HL152197 (MS) kapsamında sağlanan bir Ortak Biyoloji Konsorsiyumu Microgrant tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 prolene suture pack | Ethicon | 8698G | for incision closure |
| 8-0 nylon suture pack | AROSurgical Instruments | T06A08N14-13 | for ligation |
| Anesthesia induction chamber | VETEQUIP | #941444 | Holds the animal during anesthesia exposure |
| Catheter Interface Cable PEC-4D | Millar | for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PCU-2000 | |
| Charcoal canister filters | VETEQUIP | #931401 | to help remove waste anesthetic gases |
| Cotton swabs | McKesson | 24-106 | for applying pressure to the injection site to prevent bleeding |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Surgical tools |
| Insulin syringe 28 G | EXEL | 26027 | for jugular vein IV injection |
| Isoflurane | COVETRUS | #029405 | for mouse anesthesia |
| LabChart 8 Software | ADInstruments | for data analysis | |
| Mikro-Tip Pressure Catheter SPR-1000 (1.0 F) | Millar | for invasive blood pressure measurement | |
| Needle-25 G | BD | 305124 | for making a samll hole in a vessel |
| Oxygen controller ProOx Oxygen Sensor | BioSpherix | E702 | for oxygen concentration monitoring |
| PCU-2000 Pressure Control Unit | Millar | for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PowerLab 4/35 | |
| PowerLab 4/35 | ADInstruments | for Data Acquisition. Investigator needs to connect the PowerLab 4/35 to a personal laptop containing LabChart 8 software for operation. |
|
| Prism 8 | GraphPad | for statistics and scientific graphing | |
| Semisealable hypoxia chamber | BioSpherix | an artificial environment that simulates high-altitude conditions for animals | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | Surgical tools |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | Surgical tools |
| VasoRx compound 7C1/let-7 miRNA | VasoRx, Inc. | Lot# B2-L-16Apr | IV injection compound |
| VIP 3000 Veterinary Vaporizer | COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC. | for accurate anesthesia delivery |
References
- McLaughlin, V. V., McGoon, M. D.
- Hoeper, M. M., Humbert, M. The new haemodynamic definition of pulmonary hypertension: evidence prevails, finally. European Respiratory Journal. 53 (3), 1900038 (2019).
- Chen, Y., et al. A novel rat model of pulmonary hypertension induced by mono treatment with SU5416. Hypertension Research. 43 (8), 754-764 (2020).
- Xiong, M., et al. Mouse model of experimental pulmonary hypertension: Lung angiogram and right heart catheterization. Pulmonary Circulation. 11 (4), 20458940211041512 (2021).
- Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for intravenous self administration in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (70), e3739 (2012).
- Potus, F., Martin, A. Y., Snetsinger, B., Archer, S. L. Biventricular assessment of cardiac function and pressure-volume loops by closed-chest catheterization in mice. Journal of Visualized Experiments. (160), e61088 (2020).
- Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension. Experimental Models of Cardiovascular Diseases. 1816, 243-252 (2018).
- Chen, P. Y., et al. FGF regulates TGF-beta signaling and endothelial-to-mesenchymal transition via control of let-7 miRNA expression. Cell Reports. 2 (6), 1684-1696 (2012).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1 (9), 912-926 (2019).
- Daugherty, A., Rateri, D., Hong, L., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. Journal of Visualized Experiments. (27), e1291 (2009).
- Alam, M. A., Parks, C., Mancarella, S. Long-term blood pressure measurement in freely moving mice using telemetry. Journal of Visualized Experiments. (111), e53991 (2016).
- Luo, F., et al. Invasive hemodynamic assessment for the right ventricular system and hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension in mice. Journal of Visualized Experiments. (152), e60090 (2019).
