Summary
In vitro-reaktivering af bevægelige celler er et afgørende eksperiment i forståelsen af mekanismerne for cellemotilitet. Protokollen beskriver genaktivering af de demembranerede cellemodeller af Chlamydomonas reinhardtii, en modelorganisme til undersøgelse af cilia/flagella.
Abstract
Siden det historiske eksperiment med sammentrækning af glycerinerede muskler ved tilsætning af ATP, som Szent-Györgyi demonstrerede i midten af det 20. århundrede, har in vitro-reaktivering af demembranerede celler været en traditionel og potent måde at undersøge cellemotilitet på. Den grundlæggende fordel ved denne eksperimentelle metode er, at sammensætningen af reaktiveringsopløsningen let kan ændres. For eksempel kan et miljø med høj Ca2+ koncentration, der kun forekommer midlertidigt på grund af membranexcitation in vivo , replikeres i laboratoriet. Eukaryote cilier (alias flagella) er udførlige motilitetsmaskiner, hvis reguleringsmekanismer endnu ikke er afklaret. Den encellede grønne alge Chlamydomonas reinhardtii er en fremragende modelorganisme inden for forskningsområdet cilia. Reaktiveringseksperimenterne ved hjælp af demembranerede cellemodeller af C. reinhardtii og deres derivater, såsom demembranerede axonæer af isolerede cilier, har bidraget væsentligt til at forstå de molekylære mekanismer for ciliær motilitet. Disse eksperimenter præciserede, at ATP aktiverer ciliær motilitet, og at forskellige cellulære signaler, herunder Ca2+, cAMP og reaktive iltarter, modulerer ciliære bevægelser. Den præcise metode til demembranering af C. reinhardtii-celler og reaktivering af cellemodellerne er beskrevet her.
Introduction
In vitro-reaktivering af demembranerede bevægelige celler er et værdifuldt redskab til at studere det molekylære grundlag for reguleringsmekanismen for cellemotilitet. Szent-Györgyi viste først in vitro-sammentrækning af kaninskeletmuskelfibre ekstraheret med 50% glycerol ved tilsætning af adenosintrifosfat (ATP)1. Dette eksperiment var det første til at bevise, at ATP giver energi til muskelkontraktion. Metoden blev hurtigt anvendt til undersøgelsen af ATP-aktiveret ciliary / flagellar motilitet, såsom sædflagella2, Paramecium cilia3 og Chlamydomonas reinhardtii cilia (også kaldet flagella)4 ved hjælp af ikke-ioniske vaskemidler til demembranering.
Den encellede grønne alge C. reinhardtii er en modelorganisme til at studere cilier: den svømmer med to cilier ved at slå dem som et menneskes brystsvømning5. Ciliary bevægelse drives af dynein, en minus-end rettet mikrotubuli-baseret motorprotein 6,7. Ciliary dyneiner kan klassificeres i ydre arm dyneiner og indre arm dyneiner. Mutanter, der mangler hver slags dynein, er blevet isoleret som langsomt svømmende mutanter med forskellige motilitetsabnormiteter. Detaljeret in vitro-motilitetsanalyse af disse mutanter har signifikant avanceret dyneinforskning8.
Mange vigtige resultater er opnået ved hjælp af denne metode og dens derivater siden in vitro-reaktiveringseksperimentet af demembranerede C. reinhardtii-celler (cellemodeller) blev etableret. Reaktivering af cellemodeller i en række Ca2+ buffere viste for eksempel9, at to cilier er forskelligt reguleret af submikrodolær Ca2+, og denne asymmetriske ciliekontrol muliggør den fototaktiske orientering af C. reinhardtii10. Desuden viser begge cilier bølgeformkonvertering fra fremadgående svømmetilstand (kaldet asymmetrisk bølgeform) til den bagudgående svømmetilstand (kaldet symmetrisk bølgeform, der vises i en kort periode, når celler er foto- eller mekano-chokerede)11,12. Denne bølgeformomdannelse reguleres af submillimolar Ca2+, som blev vist ved reaktivering af det såkaldte nukleoflagellarapparat (et kompleks indeholdende to cilier, basallegemerne, strukturerne, der forbinder basallegemerne med kernen og resterne af kernen)11 eller demembranerede axonomer af isolerede cilia13. Bortset fra Ca2+ er redox (reduktionsoxidation) poise et signal, der regulerer ciliary beatingfrekvensen, hvilket blev vist ved reaktivering af cellemodeller i redoxbuffere indeholdende forskellige forhold mellem reduceret glutathion vs. oxideret glutathion14. Derudover regulerer cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) asymmetrisk to cilier, hvilket blev vist ved reaktivering af axonomer med fotoklemaerbar bur cAMP15. Disse in vitro-fund kombineret med genetiske fund har ført til en dybere forståelse af de molekylære mekanismer for ciliaregulering i C. reinhardtii.
En protokol til genaktivering af cellemodellerne er beskrevet her. Metoden er enkel, giver mulighed for forskellige modifikationer og kan anvendes på flere organismer, der bevæger sig med cilier. Men fordi demembranerede celler er skrøbelige, kræver det nogle tip til at genaktivere motiliteten af cellemodeller med god effektivitet og samtidig forhindre deciliering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En vildtypestamme af Chlamydomonas reinhardtii, CC-125, blev brugt til denne undersøgelse. CC-125 blev opnået fra Chlamydomonas Resource Center (se tabel over materialer) og opretholdt på et Tris-acetatphosphat (TAP)16, 1,5% agarosemedium ved 20-25 ° C.
1. Cellekultur
- Kultur Chlamydomonas reinhardtii (CC-125) i TAP-medium16 i en 12 timer / 12 timer lys-mørk periode (lysforhold for lysperioden: ~ 50 μmol fotoner m-2 s-1 hvidt lys) ved 20-25 ° C i 2 dage (figur 1).
BEMÆRK: Cellerne skal være i en midtlogaritmisk vækstfase (Film 1). Lang kultur (>4 dage, i den senlogaritmiske vækst eller stationære fase) reducerer reaktiveringseffektiviteten af demembranerede cellemodeller.
Figur 1: Flydende kultur efter 2-dages dyrkning. Fra en TAP-1,5% agarplade blev en klump af vildtypeceller til at fylde platinsløjfen podet til ~ 150 ml TAP flydende medium i en kolbe. Celletætheden efter 2-dages dyrkning var 2,3 × 106 celler / ml. Klik her for at se en større version af denne figur.
Film 1: Svømning af levende celler. Celler blev observeret under et mikroskop med en 10x objektiv linse og en olie-nedsænkning mørkfeltkondensator. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at downloade denne film.
2. Fremstilling af demembranerede cellemodeller
BEMÆRK: Før du starter eksperimentet, skal du opbevare vaskebufferen ved stuetemperatur og demembranerings-, fortyndings-, reaktiveringsbuffere og ATP-opløsningen på is. Sammensætningen af disse buffere fremgår af supplerende tabel 1.
- Centrifuge ~ 10 ml flydende kultur ved 1000 × g ved 20 °C i 3 minutter.
BEMÆRK: I hele protokollen fra dette trin må du ikke bruge autoklaveret plastvarer (rør, pipettespidser osv.), Hvilket reducerer reaktiveringseffektiviteten. For koniske rør foretrækkes genbrugte. Celletætheden efter 2-dages dyrkning kan typisk være 1,0-5,0 × 106 celler/ml. Når celletætheden er lavere end dette, skal du tage nok kulturvolumen til at indeholde ~ 5 × 107 celler. - Kassér supernatanten, først ved dekantering og derefter ved en Pasteur-pipette, og genophænd bundfaldet i ~ 5 ml vaskebuffer.
- Centrifugeceller i vaskebufferen ved 1000 × g i 3 minutter ved 20 °C.
- Kassér supernatanten forsigtigt med en pipette (figur 2).
BEMÆRK: Pasteur pipetter foretrækkes. Når du bruger mikropipetter, skal du undgå at bruge pipettespidser, der er autoklaveret. - Overlejr ~ 0,5 ml demembraneringsbuffer på en cellepille, ryst røret forsigtigt i hånden for groft at suspendere cellerne i bufferen og læg røret på is (figur 3A).
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at suspendere pillen helt i øjeblikket. Øg koncentrationen af MgSO4 til 15 mM i demembranerings- og reaktiveringsbufferne, når cellemodellerne genaktiveres, med en endelig ATP-koncentration på >1 mM for stabil reaktivering17. - Suspender den resterende cellepille forsigtigt med en pipette, og læg røret på is igen (figur 3B).
- Tag 5-10 μL af cellemodellerne, fortynd 10 gange med fortyndingsbufferen, og observer under mikroskopet (film 2) for at bekræfte, at alle cellemodellerne er demembranerede og ikke svømmer (figur 4).
BEMÆRK: Hvis nogle celler stadig svømmer (i live), tilsættes det ikke-ioniske vaskemiddel, der anvendes i demembraneringsbufferen, direkte til cellemodelopløsningen til den endelige koncentration på ~ 0,15%. Alternativt gentages trin 2,1-2,5 med demembraneringsopløsningen, der indeholder 0,15% vaskemiddel.
Figur 2: Kassering af supernatanten. Resten af supernatanten blev forsigtigt fjernet med en Pasteur-pipette, efter at supernatanten blev fjernet ved dekantering af røret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Demembranering. (A) Efter overlejring af 0,5 ml demembranationsopløsning på cellepillen blev opløsningen blandet med en hånd for at suspendere cellerne groft. (B) Efter blanding blev resten af cellepillen helt suspenderet i opløsningen ved hjælp af en Pasteur-pipette. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Virkninger af demembranering. (A) En levende celle sidder fast på et glasglas. (B) En cellemodel, der sidder fast på en glasrutsjebane. Bemærk, at i cellemodellen blev cilia lidt tyndere. Billederne blev observeret under et mikroskop med en 20x objektivlinse og en olienedsænkningskondensator med mørkt felt. Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Film 2: Bekræftelse af demembranering. Cellemodelsuspension blev observeret under et mikroskop med en 10x objektivlinse og en mørkfeltkondensator til olienedsænkning. Ingen celle svømmede. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at downloade denne film.
3. Reaktivering af demembranerede cellemodeller
- Bland 80 μL reaktiveringsopløsning, 10 μL ATP-opløsning og 10 μL cellemodeller i et 0,5 ml rør ved at trykke på røret (figur 5).
BEMÆRK: Den endelige ATP-koncentration skal være <3 mM, fordi ciliary beating frekvens, en parameter for ciliary motion, stiger med ATP koncentration og mætter ved 2-3 mM ATP17.
FORSIGTIG: Blanding ved pipettering eller hvirvel forårsager deciliering og reducerer reaktiveringseffektiviteten.- Til genaktivering med <0,2 mM ATP tilsættes et ATP-regenereringssystem, såsom 70 U/ml kreatinkinase og 5 mM kreatinphosphat (se materialetabel).
BEMÆRK: Reaktiveringsopløsningen fremstilles ved en højere koncentration (1,125x, supplerende tabel 1) end fortyndingsopløsningen, således at indholdet efter blanding af ATP opløst i vand når følgende endelige koncentrationer: 30 mM Hepes (pH 7,4), 5 mM MgSO4, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM EGTA og 50 mM kaliumacetat (se materialetabel).
- Til genaktivering med <0,2 mM ATP tilsættes et ATP-regenereringssystem, såsom 70 U/ml kreatinkinase og 5 mM kreatinphosphat (se materialetabel).
- Sæt ~ 30 μL af den blandede opløsning på et glasglas, og læg forsigtigt et dækslip på det med afstandsstykke for at undgå mekanisk stød på cellemodellerne (figur 6).
BEMÆRK: Hvid petroleum eller dobbeltsidet tape kan bruges til at fremstille afstandsbåndene. - Overhold de genaktiverede cellemodeller under et mikroskop (Film 3).
Figur 5: Blandingsopløsning ved at tappe på røret. (A) Til 80 μL af reaktiveringsopløsningen blev 10 μL ATP-opløsning og 10 μL cellemodeller tilsat i sekventiel rækkefølge. (B) Opløsningen blev blandet ved at banke på røret med en finger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Fremstilling af afstands afstandstræk på dækslipkanter. (A) Et tyndt lag hvid petroleum blev påført bagsiden af en hånd. (B) En lille mængde hvid petroleum blev skrabet af med en kant af et dækslips. (C) Der blev lavet et afstandsrum på kanten af et dækslips. (D) En anden afstandsforing blev lavet på den modsatte kant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Film 3: Svømning af genaktiverede cellemodeller. Cellemodellernes bevægelighed blev genaktiveret ved at tilsætte ATP i en endelig koncentration på 1 mM og observeret under et mikroskop med en 10x objektivlinse og en mørkfeltskondensator til olienedsænkning. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at downloade denne film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Demembranerings- og reaktiveringsprocessen i C. reinhardtii vildtypestamme (CC-125) er vist her. Kulturen 2 dage efter podning blev en lysegrøn farve (trin 1.1) (figur 1). Celler blev indsamlet (trin 2.1), vasket (trin 2.2) og demembraneret (trin 2.5). Efter demembranering blev alle cellemodeller immotile (trin 2.7). De demembranerede cilier (kaldet axonæer) forbliver fastgjort til cellelegemet, hvilket viser, at cellemodellernes immotilitet ikke skyldes deciliering (figur 4). Efter blanding med reaktiveringsbufferen og ATP (trin 3.1) blev >50% af cellemodellerne bevægelige (trin 3.2). Reaktiveringshastigheden øges ved skånsom og grundig blanding ved trin 3.1. (% bevægelige celler). Selv uden ATP-regenereringssystemet (trin 3.1.1) fortsatte de genaktiverede celler med at bevæge sig i ~ 90 minutter med den endelige ATP-koncentration på 1 mM, før de gradvist stoppede bevægelsen.
Supplerende tabel 1: Sammensætning af opløsninger og buffere, der er anvendt i undersøgelsen. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er to kritiske trin i denne protokol. Den første er en proces kendt som demembranering, som skal udføres forsigtigt, men grundigt. Deciliering (dvs. frigørelse af cilier fra cellelegemet) induceres ved kraftig pipettering eller hvirvel, hvilket gør cellemodellerne ubevægelige, selv efter tilsætning af ATP. Typisk suspenderes 5 × 107 celler i ~ 0,5 ml demembraneringsbuffer (endelig celletæthed: 1 × 108 celler / ml). Reaktiveringshastigheden for cellemodellerne vil falde, hvis cellemodeltætheden er meget lavere end denne (f.eks. 1 × 106 celler / ml). Disse cellemodeldensitetseffekter på reaktivering er uklare, men celleekstrakterne indeholder sandsynligvis de faktorer, der hjælper med reaktivering. Jo højere celletætheden er, desto vanskeligere vil det naturligvis være for grundig demembranering. Utilstrækkelig demembranering kan resultere i forurening af levende celler med cellemodeller. Bevægelige celler kan sesi dette tilfælde i trin 2.7. Forurening af levende celler vil føre til fejlfortolkning af virkningerne af ATP eller andre komponenter (såsom Ca2+) tilføjet til reaktiveringsbufferen. Dette trin har brug for færdigheder.
Det andet kritiske trin er genaktivering. I lighed med demembraneringstrinnet inducerer kraftig pipettering til blanding af opløsningen også deciliering. Således foretrækkes blandingsopløsninger med tapperør. Dette trin har også brug for færdigheder. Derudover anbefales det at bruge 0,5 ml rør i dette trin, når opløsningens volumen er 100 μL (som beskrevet i denne protokol).
Som anført i indledningen er en fordel ved denne protokol, at den gør det muligt at undersøge virkningerne af forskellige biologiske signaler in vitro , hvis koncentrationer kun er forbigående forhøjet in vivo. For eksempel kan Ca2+ føjes til reaktiveringsløsningen. På grund af chelateringsvirkningerne af EGTA i dette tilfælde skal den endelige calciumkoncentration efter blanding af alle opløsningerne (trin 3.1) beregnes omhyggeligt. Til beregning af den endelige koncentration af fri Ca2+ i en buffer i nærværelse af chelatorer er programmet CALCON18 gyldigt. Et eksempel på den calciumholdige reaktiveringsbuffer er vist i en tidligere undersøgelse19. Det skal bemærkes, at en høj koncentration på Ca2+ (>10-5 M) inducerer deciliering20, og derfor skal effekten af Ca2+ på ciliær bevægelighed testes ved lavere koncentrationer som tidligere beskrevet21.
Metoden lider under visse begrænsninger. Sammensætningen af reaktiveringsbufferen afspejler ikke nødvendigvis de in vivo-ioniske forhold. Så hvis der blev observeret en vis forskel i ciliarybevægelsen mellem cellemodellerne og de levende celler, skulle man være forsigtig med at afgøre, om dette ikke er en artefakt på grund af buffersammensætningen. For eksempel, hvis vi eksperimenterer med denne klassiske buffersammensætning, er ciliary beatingfrekvensen lavere end forventet, når ATP-koncentrationen er >1 mM17. En løsning på dette problem er at øge Mg2+ koncentrationen og at tilføje adenosindiphosphat (ADP) sammen med ATP; derefter øges ciliary beatingfrekvensen som forventet17. Det er således nødvendigt at ændre buffersammensætningen i henhold til formålet med eksperimentet.
Den nuværende protokol kan anvendes på andre algearter, der svømmer med cilier. For eksempel kunne motiliteten af demembraneret Volvox rousseletii, den flercellede Volvocales grønne alge indeholdende 5.000-10.000 Chlamydomonas-lignende celler, genaktiveres ved at tilføje ATP som C. reinhardtii cellemodeller22. Flere modifikationer var påkrævet i dette tilfælde: polyethylenglycol (PEG) blev udeladt for at bevare den sfæriske form af demembraneret V. rousseletii, og koncentrationerne af Igepal CA-630 (vaskemiddel) blev ændret på grund af en gradient i vaskemiddelfølsomheden fra den forreste pol til den bageste pol, idet den var højest ved førstnævnte og lavest ved sidstnævnte. Med modifikationer blev denne protokol også anvendt på de mindste flercellede Volvocales-arter, firecellet Tetrabaena socialis23. Hvis det foreliggende forsøg skal afprøves med en ny organisme, vil optimering være nødvendig ved at ændre typerne og koncentrationerne af komponenterne i demembranerings- og reaktiveringsbufferne, især vaskemidler og PEG. Afhængigt af organismens størrelse og morfologi skal centrifugeringsindstillingerne indstilles. Perfusion er også en mulighed for demembranering i stedet for centrifugering22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) til N.U. (19K23758, 21K06295) og K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), fra Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) til K.W. og fra Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) til N.U. og K.W. Vi takker fru Miyuki Shinohara (Hosei Univ.) for hendes hjælp med at forberede tallene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
| Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
| Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
| GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
| Hepes | Dojindo | GB70 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
| MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
| Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Szent-Gyorgyi, A. Free-energy relations and contraction of actomyosin. Biological Bulletin. 96 (2), 140-161 (1949).
- Hoffman-Berling, H. Adenosintriphosphat als betriebsstoff von zellbewegungen. Biochimica et Biophysica Acta. 14, 182-194 (1954).
- Naitoh, Y., Kaneko, H. Reactivated Triton-extracted models of Paramecium: modification of ciliary movement by calcium ions. Science. 176 (4034), 523-524 (1972).
- Witman, G. B., Plummer, J., Sander, G. Chlamydomonas flagellar mutants lacking radial spokes and central tubules. Structure, composition, and function of specific axonemal components. Journal of Cell Biology. 76 (3), 729-747 (1978).
- Rüffer, U., Nultsch, W. Flagellar coordination in Chlamydomonas cells held on micropipettes. Cell Motility and the Cytoskeleton. 41 (4), 297-307 (1998).
- Sale, W. S., Satir, P. Direction of active sliding of microtubules in Tetrahymena cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (5), 2045-2049 (1977).
- Fox, L. A., Sale, W. S. Direction of force generated by the inner row of dynein arms on flagellar microtubules. Journal of Cell Biology. 105 (4), 1781-1787 (1987).
- Kamiya, R., Yagi, T. Functional diversity of axonemal dyneins as assessed by in vitro and in vivo motility assays of Chlamydomonas mutants. Zoolog Science. 31 (10), 633-644 (2014).
- Kamiya, R., Witman, G. B. Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).
- Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein. Journal of Cell Science. 118, Pt 3 529-537 (2005).
- Hyams, J. S., Borisy, G. G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro. Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).
- Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion. Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).
- Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).
- Wakabayashi, K., King, S. M. Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).
- Saegusa, Y., Yoshimura, K. cAMP controls the balance of the propulsive forces generated by the two flagella of Chlamydomonas. Cytoskeleton. 72 (8), 412-421 (2015).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Takano, W., Hisabori, T., Wakabayashi, K. Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Journal of Biological Chemistry. 296, 100156 (2021).
- bio.chuo-u. , Available from: http://www.bio.chuo-u.ac.jp/nano/calcon.html (2022).
- Wakabayashi, K., Yagi, T., Kamiya, R. Ca2+-dependent waveform conversion in the flagellar axoneme of Chlamydomonas mutants lacking the central-pair/radial spoke system. Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (1), 22-28 (1997).
- Yueh, Y. G., Crain, R. C. Deflagellation of Chlamydomonas reinhardtii follows a rapid transitory accumulation of inositol 1,4,5-trisphosphate and requires Ca2+ entry. Journal of Cell Biology. 123 (4), 869-875 (1993).
- Wakabayashi, K., Ide, T., Kamiya, R. Calcium-dependent flagellar motility activation in Chlamydomonas reinhardtii in response to mechanical agitation. Cell Motility and the Cytoskeleton. 66 (9), 736-742 (2009).
- Ueki, N., Wakabayashi, K. Detergent-extracted Volvox model exhibits an anterior-posterior gradient in flagellar Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1061-1068 (2018).
- Tanno, A., et al. The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability. PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).
