Summary
Glykosyleringsmønsteret for et antistof bestemmer dets kliniske ydeevne, således at industrielle og akademiske bestræbelser på at kontrollere glykosylering vedvarer. Da typiske glykoengineeringskampagner er tids- og arbejdskrævende, ville genereringen af en hurtig protokol til at karakterisere virkningen af glykosyleringsgener ved hjælp af forbigående hæmning vise sig nyttig.
Abstract
Rekombinante monoklonale antistoffer binder specifikke molekylære mål og inducerer efterfølgende et immunrespons eller hæmmer bindingen af andre ligander. Monoklonal antistoffunktionalitet og halveringstid kan dog reduceres ved typen og fordelingen af værtsspecifik glykosylering. Forsøg på at producere overlegne antistoffer har inspireret udviklingen af genetisk modificerede producentceller, der syntetiserer glycooptimerede antistoffer. Glycoengineering kræver typisk generering af en stabil knockout- eller knockincellelinje ved hjælp af metoder såsom clustered regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) -associeret protein 9. Monoklonale antistoffer produceret af konstruerede celler karakteriseres derefter ved anvendelse af massespektrometriske metoder til bestemmelse af, om den ønskede glycoprofil er opnået. Denne strategi er tidskrævende, teknisk udfordrende og kræver specialister. Derfor kan en alternativ strategi, der anvender strømlinede protokoller til genetisk glycoengineering og glycandetektion, hjælpe bestræbelserne mod optimale antistoffer. I denne proof-of-concept-undersøgelse fungerede en IgG-producerende ovariecelle fra kinesisk hamster som en ideel vært for at optimere glycoengineering. Kort interfererende RNA rettet mod Fut8-genet blev leveret til ovarieceller fra kinesiske hamstere, og de resulterende ændringer i FUT8-proteinekspression blev kvantificeret. Resultaterne indikerer, at knockdown ved denne metode var effektiv, hvilket førte til en reduktion på ~ 60% i FUT8. Supplerende analyse af antistofglykoprofilen blev udført ved anvendelse af en hurtig, men meget følsom teknik: kapillærgelelektroforese og laserinduceret fluorescensdetektion. Alle knockdown-eksperimenter viste en stigning i afucosylerede glycaner; det største skift opnået i denne undersøgelse var imidlertid ~ 20%. Denne protokol forenkler glykoengineeringsindsatsen ved at udnytte silico-designværktøjer , kommercielt syntetiserede genmålretningsreagenser og hurtige kvantificeringsassays, der ikke kræver omfattende forudgående erfaring. Som sådan kan de tidseffektiviteter, der tilbydes af denne protokol, hjælpe undersøgelser af nye genmål.
Introduction
N-bundet glycosylering er en enzymatisk proces, hvorved oligosacchariddele er kovalent forbundet med Asn-rester. I modsætning til de novo proteinsyntese er glycansyntese en ikke-skabelonreaktion, der resulterer i heterogen glykosylering af proteiner. Strukturen, sammensætningen og fordelingen af glycaner kan påvirke proteinkonformation og funktion. Faktisk regulerer N-glycosylering i det krystalliserbare fragment (Fc) -region af immunoglobulin G (IgG) den terapeutiske virkning, immunogenicitet og halveringstid af antistoffet1. Som sådan identificerer kvalitetsparadigmet (QbD) for udvikling af rekombinante bioterapeutiske proteinprodukter naturligt glykosylering som en kritisk kvalitetsattribut (CQA)2,3. Pattedyrceller er ofte de foretrukne ekspressionssystemer, da de i sagens natur producerer menneskelignende glykosyleringsmønstre tættere end bakterier, gær, insekt eller planteceller. Desuden vælges ovarieceller (CHO) fra kinesiske hamstere frem for andre pattedyrcellelinjer, fordi de er resistente over for human virusinfektion, udskiller produkter ved høje titere og kan dyrkes i suspensionskultur til høje levedygtige celletætheder4. Med hensyn til glycandannelse genererer ikke-CHO-murinproduktionsceller immunogene glycaner (α (1-3) -bundet galactose [α (1-3) -Gal] og N-glycolylneuraminsyre [NeuGc]), der påvirker sikker anvendelse af monoklonale antistoffer (mAbs)5. Disse fordele gør CHO-celler til det førende ekspressionssystem, der er ansvarlig for produktionen af over 80% af ny bioterapi mellem 2014 og 20186. Imidlertid er skabelonuafhængig glykosylering en konserveret mekanisme, der fører til CHO-afledt bioterapi med en række glycoformer.
Bioterapeutiske udviklingsstrategier sigter mod at kontrollere heterogenitet i CHO-celler ved genteknologi. Nogle litteratureksempler inkluderer knockdown af sialidaser (Neu1, Neu3)7, GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) knockout8 og overekspression af glycosyltransferaser (GnTIII)9. Fremskridt inden for glycoengineering er mulige på grund af en kombination af offentligt tilgængelige ressourcer, som CHO-genomet10, og den igangværende udvikling af genteknologiske værktøjer, såsom transkriptionsaktivatorlignende effektornukleaser (TALEN'er), zinkfingernukleaser (ZFN'er) og grupperede regelmæssigt interspacede korte palindromiske gentagelser (CRISPR)-associeret protein 9 (CRISPR-Cas9)11,12,13,14 . Disse værktøjer leveres typisk til CHO-celler som plasmid-DNA eller som rensede ribonukleoproteinkomplekser (RNP). Omvendt er RNA-interferens (RNAi) en genteknologi, der i sin enkleste form kun kræver levering af oprensede kort interfererende RNA (siRNA) oligonukleotider. Endogene proteiner behandler dobbeltstrenget siRNA i enkeltstrenge, og nukleasen, RNA-induceret hæmningskompleks (RISC), danner et kompleks med siRNA til spaltning af mål-mRNA-sekvenser 15,16,17. Genhæmning via denne metode er forbigående på grund af RNA-ustabilitet, men undersøgelsen heri udnytter denne funktion til at hjælpe hurtig screening.
Det modelenzym, der er udvalgt til den aktuelle undersøgelse, α1,6-fucosyltransferase (FUT8), producerer N-glycaner med α-1,6 kernebundet L-fucose (Fuc). Denne modifikation er en primær determinant for antistofafhængig cellecytotoksicitet (ADCC) aktivitet, som det fremgår af undersøgelser af kommercielle antistoffer. I mangel af kernefukosylering øger Rituximab (anti-CD20 IgG1) ADCC 50 gange og øger ADCC i Trastuzumab (anti-Her2 IgG1) ved at forbedre FcgRIIIa-bindingen18,19. Kernefucosylering betragtes således som et uønsket træk ved mAbs, der berettiger bestræbelser på at vende denne fænotype. Der er eksempler på vellykket Fut8-genmålretning ved hjælp af siRNA med samtidige stigninger i ADCC 20,21,22, omend disse eksempler leverer Fut8 siRNA kodet på plasmid-DNA. Sådanne eksperimenter genererer stabil genhæmning, da plasmid-DNA tjener som en skabelon til siRNA-syntese. Dette gør det muligt for celler at genopbygge siRNA-molekyler, der nedbrydes af intracellulære RNaser og fosfataser. Omvendt tillader levering af eksogent syntetisk siRNA kun forbigående genhæmning, da siRNA ikke kan genopfyldes på grund af manglen på en intracellulær skabelon. Således bør brugerne overveje, om eksperimentelle designs er kompatible med plasmidafledt eller syntetisk siRNA. For eksempel kan undersøgelser med fokus på peak mAb-produktion, typisk dag seks i kulturen23,24, vælge syntetisk siRNA, der kan leveres til celler et par dage før peak-ekspression. Fordelene ved en forbigående tilgang ved hjælp af syntetisk siRNA inkluderer evnen til at outsource produktionen og det faktum, at flere siRNA-konstruktioner kan genereres på en brøkdel af den tid, det tager at generere konstruktioner i plasmider. Desuden er syntetisk siRNA effektivt, som det fremgår af litteratureksempler på Fut8-genhæmning, der er tilstrækkelige til at reducere FUT8-proteinekspression25 og give afucosylerede IgG'er med øget FCgRIIIa-binding og ADCC26.
Succesen med denne glycoengineeringsprotokol blev bestemt af graden af Fc-glycosylering. Massespektrometri er normalt den valgte metode til glykæmiske analyser; kapillærgelelektroforese og laserinduceret fluorescensdetektion (CGE-LIF) er imidlertid perfekt egnet til at løse glykoprofilen af rensede IgG'er og har fordelen ved større hurtighed og enkelhed. Massespektrometriprotokoller skal kombinere de relevante kromatografiske og derivatiseringsmetoder, ioniseringskilder og masseanalysatorer 27,28,29. Ud over at kræve en uddannet specialist er massespektrometriprotokoller lange, og mangfoldigheden af metoder gør data vanskelige at sammenligne mellem laboratorier med forskellige opsætninger. I forbindelse med biofarmaceutiske produkter er CGE-LIF en følsom metode, der kan give tilstrækkelige detaljer om en antistofglykoprofil og er let skalerbar til metoder med høj kapacitet. For lav overflod, meget komplekse blandinger med dårligt karakteriserede glycoproteiner, kan fordelene ved massespektrometri forblive. Imidlertid tjener den højopløselige og højfølsomme mAb-analyse, der leveres af CGE-LIF-baseret N-glycananalyse, som en begrundelse for at afprøve denne metode. Desuden er prøveforberedelse og analyse afsluttet på få timer30. Nylige undersøgelser har vist, at CGE-LIF kan bruges til at overvåge glycaner afledt af human plasma31, mus32 og CHO IgGs33. Disse undersøgelser fremhæver brugen af CGE-LIF til analyse af prøver med høj kapacitet og små prøvemængder.
CGE-LIF-metoden har begrænsninger, der bør tages i betragtning. Omkostninger er en betydelig barriere for brugen af dette og andre enheder til glycananalyse. Disse omkostninger er imidlertid typiske inden for området, og CGE-LIF anses for at være en omkostningseffektiv løsning34. Laboratorier med mindre budgetter kan finde det mere praktisk at lease maskiner eller outsource prøveanalyse. En anden overvejelse af enhver analytisk metode er repeterbarhed. Evaluering af CGE-LIF blev udført ved hjælp af 48 replikater af den samme prøve, der blev analyseret på forskellige dage. Den relative standardafvigelse pr. kapillær blev bestemt for intrabatch og interbatch repeterbarhed. Intrabatch-sammenligningen af replikater viste sig at have en relativ standardafvigelse på 6,2%, hvilket indikerer, at kapillærydelsen ikke er ensartet. Endvidere viste en sammenligning af interbatch-data en relativ standardafvigelse på 15,8%31, hvilket indikerer, at kapillærydelsen ændrer sig over tid. De konstaterede operationelle mangler gælder muligvis ikke i den aktuelle undersøgelse, som anvender forskellige maskiner og proprietære reagenser. Hvis brugerne har til hensigt at udvikle en intern protokol, ville det være værd at overveje undersøgelsen af Ruhaak et al. 31, som omhyggeligt evaluerede reagenserne til CGE-LIF. Som sådan er reagenserne til prøveinjektion (Hi-Di Formamid og DMSO), glycanmærkning (NaBH3CN eller 2-picolin boran)31 og andre blevet optimeret.
Denne undersøgelse præsenterer en tidseffektiv glycoengineeringsprotokol, der kombinerer hurtigheden af direkte RNAi med downstream glykæmisk analyse. Metoden er illustreret ved hjælp af Fut8-genet som et mål af de grunde, der er skitseret ovenfor.
Protocol
1. DsiRNA-design og rekonstitution
- Brug Safari, Firefox eller Microsoft Edge til at få adgang til IDT-webstedet (https://eu.idtdna.com). Fra startsiden skal du vælge fanen Produkter og tjenester efterfulgt af RNA-interferens. Hvis du vil generere brugerdefinerede dicersubstrater (DsiRNA)-konstruktioner, der er målrettet mod Fut8-genet , skal du vælge Designværktøj efterfulgt af fanen Generer brugerdefineret DsiRNA .
- Indtast Fut8-tiltrædelsesnummeret , eller indtast gensekvensen manuelt for at begynde. I denne undersøgelse blev de foreslåede Fut8-sekvenser fra både "CHO-K1" og "Chinese Hamster" -poster opnået fra https://chogenome.org og brugt til at generere DsiRNA. De fleste gener har flere transkriptionsvarianter, og det er vigtigt at kontrollere, at DsiRNA ville være aktivt på alle rapporterede varianter i den aktuelle samling.
- Vælg muligheden for at udføre en "Manuel BLAST" -søgning, da CHO-cellegenomet i øjeblikket ikke er tilgængeligt som et "referencegenom" på IDT-webstedet. Dette trin søger efter matches mellem brugerdefinerede DsiRNA-sekvenser og genomet af interesse.
- Klik på Søg for at generere DsiRNA-sekvenser.
- Vurder igen specificiteten af hvert DsiRNA ved hjælp af funktionen "Manuel BLAST" med skatte-id:10029 (CHO-cellelinjer og kinesisk hamster). Resultater af forespørgselsdækning indikerer, at DsiRNA-konstruktioner matcher Fut8 (inklusive Fut8-transkriptionsvarianter ) med 100%, mens komplementariteten mod utilsigtede mål er ≤76%35.
- Kontroller, at DsiRNA specifikt er målrettet mod Fut8 for at sikre, at GC-indholdet er mellem 30% -50%. Et lavt GC-indhold er forbundet med svag og uspecifik binding, mens et højt GC-indhold hæmmer siRNA-afvikling og indlæsning i RISC-komplekset36.
- Vælg tre DsiRNA til brug i transfektionsstudier (tabel 1), der hver især er rettet mod en anden placering af Fut8-genet . Køb et foruddesignet ikke-målrettet eller krypteret DsiRNA fra IDT til kontroleksperimenter.
- Ved ankomsten centrifugeres DsiRNA ved 13.300 x g i 1 minut for at pelletere, inden røret åbnes. Rekonstituer hvert frysetørret DsiRNA i nukleasefri duplexbuffer (leveret af IDT) til en 100 μM stamopløsning. For eksempel tilsættes 20 μL buffer til 2 nmol DsiRNA for at opnå en 100 μM bestand.
- For at sikre tilstrækkelig blanding inkuberes stamopløsningerne ved stuetemperatur i 30 minutter, mens der rystes forsigtigt på en orbitalryster (50 o / min, 16 mm kredsløb).
- Opret en masterblanding ved at kombinere 20 μL af hver DsiRNA-konstruktion, der er målrettet mod Fut8 (100 μM af hvert DsiRNA). Aliquoter forberedes og opbevares ved −20 °C.
| DsiRNA-mål | Sekvens | Klassementalitet (%) | ||
| Opbygning A | 5' GAGAAGAUAGAAACAGUCAAAUACC 3' | 36% | ||
| 5' GGUAUUUGACUGUUUCUAUCUUCUC 3' | ||||
| Opbygning B | 5' AGAAUGAGAAUGGAUGUUUUUCCTT 3' | 32% | ||
| 5' AAGGAAAAACAUCCAUUCUCAUUCUGA 3' | ||||
| Opbygning C | 5' AGAGAAGAUAGAAACAGUCAAAUAC 3' | 32% | ||
| 5' GUAUUUGACUGUUUCUAUUCUCUCG 3' | ||||
Tabel 1. DsiRNA-sekvenser, der bruges til Fut8-knockdown. Sekvenser genereret af IDT, der er målrettet mod Fut8 i kinesiske hamster- og CHO K1-cellegenomer. Sanse- og antisense-sekvenserne for hver konstruktion vises (henholdsvis), og GC-indholdet i hver struktur vises. Genoptrykt fra Kotidis et al. 52.
2. DsiRNA transfektion
- Genoplive CHO-celler, der udtrykker et IgG monoklonalt antistof37 ved hjælp af kulturbetingelser, der er egnede til cellelinjen af interesse.
BEMÆRK: Cellerne, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev genereret ved hjælp af glutaminsyntetase (GS) -systemet, hvor endogen GS hæmmes af L-methioninsulfoximin (MSX) for at forbedre udvælgelsen af sjældne højproducerende kloner. Brug derfor kun MSX, hvis det kræves af den valgte cellelinje.- Optø et hætteglas med celler i 2-3 minutter i et vandbad indstillet til 37 °C. Rengør hætteglassets ydre med 70 % (v/v) ethanol, og fortsæt alt arbejde i et klasse II biosikkerhedsskab.
- Cellesuspensionen overføres til et 15 ml centrifugeglas indeholdende 9 ml forvarmt medium, der passer til den valgte cellelinje. Pellet cellerne ved centrifugering ved 100 x g i 5 min.
- Fjern og kassér forsigtigt mediet uden at forstyrre cellepillen. Derefter resuspender cellepillen i 10 ml forvarmet medium og tag en aliquot til tælling.
- Pletter cellerne med Trypan blå, hvis du tæller med et hæmocytometer, eller en passende plet for at skelne levende / døde celler, når du bruger en automatiseret celletæller.
- Efter begge optællingsmetoder overføres et passende volumen cellesuspension til en 125 ml Erlenmeyer-rystekolbe ved en levedygtig celletæthed på 3 x 105 celler · ml-1 i 30 ml medium (med valgfri tilskud på 50 μM MSX).
- Overfør celler til en inkubator indstillet til 36,5 ° C, 5% CO2 og læg dem på en rysteplatform ved 150 o / min (16 mm kredsløb).
- Passageceller hver 3-4 dag ved en såtæthed på 2 x 105 celler · ml-1 og et arbejdsvolumen på 50 ml i en 250 ml Erlenmeyer rystekolbe. Hvis du bruger MSX, afbryde tilskud efter den første passage.
- Passageceller 2x ud over optøning.
- Transfektion
- Vurder celletætheden og sørg for, at cellens levedygtighed er større end 90%.
- Rengør forsigtigt biosikkerhedsskabet og alt udstyr med 70% (v/v) ethanol og en RNase-hæmmeropløsning for at undgå forurening.
- Pelletceller ved 100 x g i 5 minutter og resuspend i forvarmet medium til en levedygtig celletæthed på 5 x 106 celler · ml-1.
- Overfør 8 μL (svarende til 1 μM) af DsiRNA-masterblandingen eller -kontrollen til en steril (0,4 cm) elektroporationskuvette. Overfør derefter 800 μL af cellesuspensionen (svarende til 4 x 106 celler) til den samme kuvette og sørg for, at begge komponenter blandes.
- Lever følgende pulsbetingelser: 1200 V, 0,1 ms, firkantet bølgeform.
- Overfør cellesuspensionen fra kuvetten til en brønd på en 6-brøndplade, og sørg for at undgå skumlignende materiale. Cellerne i inkubatoren genvindes (36,5 °C, 5 % CO2) uden at ryste i 10 minutter.
- Der tilsættes 800 μL forvarmte medier for at opnå et endeligt volumen på 1,6 ml pr. brønd, og de transinficerede celler returneres til inkubatoren for vækst (36,5 °C, 5 % CO2), mens de rystes ved 150 o /min. (16 mm kredsløb).
- Høst supernatanterne og cellerne 48 timer efter transfektion.
Stoppested: Cellekultursupernatanten kan opbevares ved -20 °C; Det er dog tilrådeligt, at cellelyse skal udføres umiddelbart efter indsamling af cellepiller for at undgå proteinnedbrydning. Supernatanter anvendes i trin 3, trin 4 og trin 5, mens cellepiller anvendes i trin 6.
3. IgG kvantificering og rensning
- Mål IgG-koncentration ved hjælp af biolaginterferometri eller en anden metode efter eget valg.
- Hydratprotein En biosensor spidser i prøvefortyndingsmiddel i 10-30 min. I mellemtiden overføres cellesuspensioner til 15 ml centrifugerør og pelletceller ved 100 x g i 5 minutter eller fjernes celler ved filtrering gennem et 0,45 μm nitrocellulosefilter.
- Uden at forstyrre pelleten overføres forsigtigt det isolerede supernatant indeholdende IgG til et rent centrifugerør.
- Brug følgende indstillinger til biolaginterferometri: rystehastighed, 2200 o / min; køretid, 60 s. Disse parametre vil blive brugt til at måle alle prøver og kontroller.
- Når biosensorspidserne er hydreret, skal du oprette en standardkurve ved hjælp af en IgG-standard (4 μL af hver koncentration).
- Kvantiter prøvekoncentrationer ved at indlæse 4 μL af cellesupernatanten. Apparatet rengøres med fnugfri klude mellem hver prøve.
- Link standardkurven til de ukendte prøver for at interpolere bindingshastigheden for de ukendte prøver. Gem dataene, og eksporter som en csv- eller PDF-fil.
- IgG-rensning
- Elueringsbuffer indeholdende 0,2 M glycin (pH 2,5) fremstilles, og der steriliseres ved at føre gennem et filter på 0,22 μm.
- 1 ml af det isolerede supernatant filtreres ved stuetemperatur ved hjælp af 0,22 μm mikrocentrifugefilterrør, indtil hele supernatanten strømmer igennem.
- Pellet 150-200 μL protein A agaroseperler i 1,5 ml centrifugerør ved 100 x g i 3 minutter og kassér supernatanten. Derefter vaskes proteinet A perler med 150-200 μL cellekulturmedium og gentages centrifugering. Kassér supernatanten.
- Det ligevægtede protein A-perler resuspenderes med 1 ml af de tilberedte supernatanter fra trin 3.2.3. og læg i et 1 ml polypropylenrør. Polypropylenrøret anbringes på en roterende mixer (15 mm kredsløb) og spindes ved 30 o / min i 60-90 minutter ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- Når inkubationen er afsluttet, opsamles gennemstrømningen og perlerne vaskes med 1 ml 1x PBS for at fjerne eventuelle ubundne proteiner. Saml også vaskefraktionen.
- Elute IgG fra proteinet A perler ved tilsætning af 3 ml elueringsbuffer til polypropylensøjlen. Saml sekventielle fraktioner, der dræner fra søjlen (500 μL hver) i mærkede rør.
- Valgfrit: Hvis det oprensede antistof skal opbevares, neutraliseres elueringsbufferen ved tilsætning af 25 μL 1 M Tris pH 9,5. Spring dette trin over, hvis antistoffet behandles straks via bufferudveksling osv.
BEMÆRK: Alle dele af rensningen (gennemstrømning, vaske og alle elueringsfraktioner) skal opbevares for at sikre, at målproteinet ikke går tabt. Disse prøver kan også hjælpe under fejlfinding, hvis rensningen ikke lykkes. - Brug den første eluering (elution A) til downstream-behandling, men behold alle andre fraktioner, hvis de skulle blive nødvendige i fremtiden.
4. Bufferudveksling og prøvekoncentration
- Exchange IgG elution buffer med 1x PBS.
- Indlæs eluering A på en 3 kDa molekylvægt cutoff centrifugalkoncentrator. Se producentens vejledning, når du vælger en passende MWCO-kolonne. I dette eksperiment sikrer en mindre porestørrelse maksimal tilbageholdelse af udskilt protein, men øger også centrifugeringstiden.
- Centrifuger ved 13.300 x g i 40-50 min ved 4 °C. Centrifugeringen er afsluttet, når restvolumenet er lig med eller mindre end 50 μL.
- Gennemstrømningen kasseres, og der tilsættes 500 μL præchilled (4 °C) 1x PBS for at fortynde det resterende supernatant. Prøven centrifugeres igen under de samme betingelser (13 300 x g i 40-50 min ved 4 °C), indtil der er 50 μL resterende supernatant tilbage.
- Der tilsættes 500 μL præchilled (4 °C) 1x PBS for at fortynde det resterende supernatant og gentage centrifugeringsprocessen igen for at opnå en 100x fortynding af supernatanten.
- Koncentrer supernatanten til en slutkoncentration på ~2,5 g· L-1 i 40 μL eller mindre for at sikre kompatibilitet med glycananalysemetoden.
BEMÆRK: 100 μg skal indlæses til glycananalyse.
Stoppested: Den koncentrerede IgG (i 1x PBS) kan opbevares ved -20 °C og optøes inden glycananalyse.
5. Glycan analyse
- Udfør glycananalyse ved hjælp af kapillærgelelektroforese i henhold til producentens anvisninger.
- Overfør 200 μL af den magnetiske perleopløsning til et 0,2 ml PCR-rør og placer det på magnetstativet for at adskille perlerne fra supernatanten.
- Fjern forsigtigt supernatanten og fjern rørene fra magnetstativet. Tilsæt den rensede proteinprøve og hvirvel for at sikre fuldstændig blanding.
- Der tilsættes denatureringsbuffer (medfølgende) til prøverøret og inkuberes i 8 minutter ved 60 °C. Hold prøverørene åbne for optimal reaktionsydelse.
- Der tilsættes PNGase F (500 enheder pr. prøve), og der inkuberes i 20 minutter ved 60 °C for at spalte glycaner fra de oprensede antistoffer.
- Efter frigivelse af N-glycaner lukkes prøverøret og hvirvelen. Tilsæt acetonitril, hvirvel og inkuberes ved stuetemperatur i 1 min.
- Prøverørene anbringes i magnetstativet for at adskille perlerne fra opløsningen. Brug en pipette til forsigtigt at fjerne supernatanten uden at røre perlerne.
- I en røghætte tilsættes glycanmærkningsopløsningen indeholdende en fluorofor til prøven. Vortex for at sikre tilstrækkelig blanding og inkuberes ved 60 °C i 20 min (åbne låg).
- Prøven vaskes 3x i acetonitril for at fjerne overskydende farvestof. Eluter derefter de mærkede glycaner i DDI-vand (leveret).
- Prøverøret anbringes i magnetstativet for at adskille perlerne fra supernatanten indeholdende rensede og mærkede glycaner.
- Forbered og læg glukosestigestandarden, beslagstandarderne og prøverne i de udpegede bakkepositioner. Kør glycananalyseprotokollen.
- Brug passende software til at analysere og identificere de glycaner, der er til stede i prøven.
BEMÆRK: Sørg for, at temperaturen i varmeblokken er nøjagtig for effektiv inkubation.
6. Western blot
- Kvantificer knockdown-effektivitet ved hjælp af western blot-analyse med et anti-α-1,6-fucosyltransferase-antistof. Polyacrylamidgeler og bufferopskrifter fås hos kommercielle leverandører 38,39.
- Ved 48 timer efter transfektion skal du tælle cellerne ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller og bestemme volumenet af cellesuspension svarende til 5 x 106 celler.
- Overfør det passende volumen cellesuspension fra hver forsøgstilstand til et sterilt 1,5 ml centrifugerør og pellet ved 13,200 x g i 10 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Lyse cellerne med 200 μL lysis buffer (egnet til ekstraktion af proteiner fra pattedyrceller) indeholdende 1% v / v proteasehæmmer cocktail ved stuetemperatur i 10 min. Ryst blandingen forsigtigt under inkubation (50 o / min, 16 mm kredsløb).
- For at fjerne celleaffaldet centrifugeres lysatet ved 13.200 x g i 10 minutter og overføres derefter det ryddede lysat til et sterilt 1,5 ml rør.
- Proteinkoncentrationen af hvert lysat måles ved hjælp af et spektrofotometer ved 280 nm. Derefter fremstilles alikvoter af hver prøve justeret til at have den samme proteinkoncentration.
- Denaturer proteinprøverne ved inkubation ved 100 °C i 10-15 minutter i DTT-SDS-prøveindlæssende farvestof; den endelige farvestofkoncentration er 1x.
- 15 μL af de denaturerede prøver og 5 μL præpareret proteinstige hældes i en SDS-PAGE gel med 12,5% opløsningsgel for effektiv separation. Kør prøverne ved 25 mA pr. gel i 90 minutter, eller indtil farvestoffronten når enden af gelen.
- Fjern forsigtigt gelen fra kassetten og inkuber i 1x transferbuffer indeholdende methanol.
- Forbered vådoverførselssystemet, og aktiver en PVDF-membran med methanol. Saml gelen og PVDF-membranen til vådoverførsel, læg en isblok i overførselstanken, og nedsænk hele tanken i is for at sikre, at overførselsforholdene forbliver kolde. Kør ved 350 mA/100 V i 60 min.
- Bloker membranen ved at inkubere i en blokeringsopløsning i 30 minutter ved stuetemperatur, mens du ryster forsigtigt på en orbitalryster ved 50 o / min (16 mm kredsløb).
- Skyl membranen med sterilt vand i 5 minutter og gentag. Brug derefter en ren skalpel til forsigtigt at skære membranen vandret ved ~ 50 kDa ved hjælp af den synlige proteinstige som vejledning.
- Membranen med proteiner større end 50 kDa inkuberes med anti-α-1,6-fucosyltransferaseantistof ved 1:1000 i en antistoffortyndeluentbuffer. Membranen inkuberes med immobiliserede proteiner mindre end 50 kDa med anti-GAPDH ved 1:10.000 i fortyndingsbuffer. Membraner kan inkuberes i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
- Membranerne vaskes i 5 min (x3) og inkuberes derefter med et passende sekundært antistof i mindst 30 minutter ved stuetemperatur.
- Udfør 3x vaske med en vaskebuffer i 5 min, efterfulgt af 3x vaske med vand. Derefter udvikles membranen med et kromogent substrat (eller passende detektionsreagens), indtil der vises bånd (1-60 min).
- Skyl membranen 2x med vand, og lad den tørre. Tag et billede af membranen, og udfør densitometrisk analyse40.
- For at beregne det relative proteinekspression i hver prøve skal du først beregne forholdet mellem GAPDH-signalet i prøver. Dette er normaliseringsfaktoren for hver prøve, der korrigerer for uoverensstemmelser i prøvebelastningen.
- Opdel FUT8-signalintensiteten (for hver bane) med normaliseringsfaktoren for den tilsvarende bane for at opnå det relative FUT8-proteinudtryk.
Representative Results
Western blot-analyse viste reduceret FUT8-proteinekspression i celler transficeret med en blanding af tre Fut8 DsiRNA-konstruktioner. I kontrolprøver transficeret med ikke-målrettet DsiRNA optrådte FUT8 som et dobbeltbånd ved ~65 og 70 kDa. Da den forudsagte molekylvægt af FUT8 er 66 kDa, er en reduktion i signalintensiteten af det lavere molekylvægtbånd tegn på genhæmning. For at bekræfte og kvantificere genhæmning blev niveauet af FUT8-protein normaliseret til det relative GAPDH-proteinniveau. Western blot-analyse påviste to bånd for GAPDH ved ~37 og 35 kDa. Det højere molekylvægtbånd svarer til den forudsagte proteinstørrelse og anvendes derfor i normaliseringsberegninger. Når FUT8-proteinekspressionen blev normaliseret i forhold til GAPDH-proteinniveauet, blev den reduceret med op til 60 % (figur 1).
I overensstemmelse med observationen af gen knockdown ved 48 timer efter transfektion blev tilsvarende mAb-prøver behandlet til analyse af CGE- LIF. Glycanstrukturer fra knockdown-celler viste et fald i fucosylering. Denne tendens var mest udtalt i agalactosylerede strukturer (G0F) og observeret i mindre grad i galactosylerede strukturer (G1F, G1F 'og G2F). Fra dette datasæt faldt den samlede IgG-kernefukosylering til ~ 75%, ned fra ~ 95% kernefucosylering observeret for den negative kontroltilstand (figur 2). En større reduktion i kernefukosylering var forventet i betragtning af ~ 60% fald i FUT8-proteinniveauer. Ved refleksion er det bemærkelsesværdigt, at glycoprofilen repræsenterer glycosylerede mAbs, der akkumuleres over en periode på 48 timer siden transfektion, mens genhæmning kun repræsenterer proteinniveauer, der er til stede på høsttidspunktet.
Yderligere undersøgelse af denne knockdown-metode involverede differentiering af DsiRNA-koncentrationen, høsttiden og elektroporationsbetingelserne. Hver faktor blev individuelt undersøgt for at bestemme dens relevans. Virkningen af elektroporationspulsbetingelser på kernefukosylering og cellelevedygtighed er fanget i eksperimenter B, C, D og E. Disse resultater viser en dobbelt reduktion i kernefukosylering fra elektroporation ved hjælp af to firkantede bølgeimpulser (eksperiment C) sammenlignet med en enkelt kvadratbølgepuls (eksperiment B) uden signifikante forskelle i cellelevedygtighed (tabel 2). Elektroporationstilstand e3 (eksperiment D) førte til den laveste cellelevedygtighed (~ 90%) og IgG-udbytte på dette tidspunkt. Celler, der overlevede elektroporationshændelsen, blev imidlertid moderat transficeret, hvilket fremgår af ~ 10% fald i kernefucosylering (tabel 2). Interessant nok anvendte eksperiment D elektroporationsbetingelser, der gav den største reduktion i kernefucosylering (14,7%), men var åbenbart skadelige for cellelevedygtighed (91% -93% levedygtighed). Dette begrænsede sæt eksperimenter illustrerer behovet for at bestemme elektroporationsindstillinger, der muliggør tilstrækkelig permeabilisering af cellemembranen uden at forårsage uigenkaldelig skade. Det er også interessant at bemærke rollen som siRNA-koncentration og høsttid på kernefucosylering. Samlet set har stigende siRNA-koncentration større indflydelse på kernefukosylering end at øge høsttiden (eksperimenter B, F, G versus eksperimenter A, B, H). I fremtidige eksperimenter ville det være interessant at titrere siRNA-koncentrationerne leveret af elektroporationsmetoden e2.
Figur 1. Eksperimentelt rutediagram. Glycoengineering og prøveanalysetrin er afbildet med den tilhørende tid, der kræves for hvert trin. SiRNA-design tager et par timer, afhængigt af antallet af genmål eller konstruktioner pr. Genmål. CHO-celletransfektion med siRNA er afsluttet om få timer, og transformerede celler får lov til at vokse i 48 timer. Cellepiller og supernatanter høstes inden for få timer. Cellepiller lyses, og de intracellulære proteiner adskilles på en SDS PAGE og derefter blottes og undersøges med antistoffer mod målgenet. Glycaner spaltes fra oprensede antistoffer og analyseres af CGE-LIF. Disse assays kan kræve 1 dag hver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Bekræftelse af RNA-interferens. Western blot påvisning af α-1,6-fucosyltransferase (FUT8) proteinniveauer i prøver behandlet med Fut8 eller ikke-målrettet kontrol DsiRNA. Bånd, der svarer til FUT8, er mere intense i kontrol end Fut8 knockdown-prøver. GAPDH-proteinniveauet blev også vurderet for at normalisere målgenekspression. Alle prøver blev taget fra eksperiment G (se tabel 2). Genoptrykt fra Kotidis et al. 52. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Effekt af Fut8 knockdown på kumulativ IgG glykosylering ved 48 timer. Et skift i glycanfordeling detekteres i knockdown-prøver. Især reduceres den relative overflod af de vigtigste kernefucosylerede strukturer (G0F), mens de afucosylerede arter øges i knockdown-eksperimentet. Målingerne blev udført ud fra forsøg G-prøver (se tabel 2). Biologiske triplikater udført for hvert eksperiment blev blandet efter høst for at reducere byrden af downstream-analyse. Genoptrykt fra Kotidis et al. 52. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Eksperimentets navn | Elektroporation metode | DsiRNA-koncentration (nΜ) | Høsttid (h) | Levedygtighed (%) | Xv (106 celler·ml-1) | IgG-titer (mg· L-1) | Forskel i kerne-fucosylering (%) | ||||||
| ExpA_Negative | E1 | 500 | 24 | 98.3 | 4.71 | 122.5 | - | ||||||
| ExpA_Knockdown | E1 | 500 | 24 | 98.3 | 4.9 | 110.3 | 4.08 | ||||||
| ExpB_Negative | E1 | 500 | 48 | 95.6 | 9.55 | 453.3 | - | ||||||
| ExpB_Knockdown | E1 | 500 | 48 | 96.7 | 9.61 | 469 | 5.38 | ||||||
| ExpC_Negative | E2 | 500 | 48 | 96.3 | 9.91 | 449.3 | - | ||||||
| ExpC_Knockdown | E2 | 500 | 48 | 96.7 | 11 | 454.6 | 11.42 | ||||||
| ExpD_Negative | E3 | 500 | 48 | 90.6 | 6.25 | 318.5 | - | ||||||
| ExpD_Knockdown | E3 | 500 | 48 | 89.1 | 6.09 | 311.85 | 9.71 | ||||||
| ExpE_Negative | E4 | 500 | 48 | 91.1 | 7.2 | 380.3 | - | ||||||
| ExpE_Knockdown | E4 | 500 | 48 | 93.3 | 7.79 | 422.8 | 14.7 | ||||||
| ExpF_Negative | E1 | 750 | 48 | 96.2 | 9.7 | 501 | - | ||||||
| ExpF_Knockdown | E1 | 750 | 48 | 95.7 | 9.76 | 504.6 | 9.9 | ||||||
| ExpG_Negative | E1 | 1000 | 48 | 96.1 | 11.1 | 422.6 | - | ||||||
| ExpG_Knockdown | E1 | 1000 | 48 | 95.9 | 9.73 | 499.3 | 17.26 | ||||||
| ExpH_Negative | E1 | 500 | 72 | 94.4 | 14.3 | 925.8 | - | ||||||
| ExpH_Knockdown | E1 | 500 | 72 | 95 | 13.5 | 1018.4 | 7.37 | ||||||
Tabel 2. Optimering af transfektion. Iterative modifikationer af elektroporationsmetoden, DsiRNA-koncentration og høsttid førte til ændringer i cellelevedygtighed, levedygtig celletæthed, IgG-titer ved høsttidspunktet og forskelle i kernefucosylering. Hvert eksperiment sammenlignede knockdown og den respektive negative kontrol for at afgøre, om modifikationen giver den ønskede effekt (dvs. et fald i fucosylering). Elektroporationsindstillinger var som følger: e1: 1200 V, 0,1 ms, firkantet bølgeform; e2: 1200 V, 2x 0,1 ms, 5 s mellem impulser, firkantet bølgeform; e3: 150 V, 20 ms, firkantet bølgeform; e4: 250 V, 500 μF, eksponentielt henfald. Genoptrykt fra Kotidis et al. 52.
Discussion
Glykosyleringsveje involverer et komplekst metabolisk netværk af enzymer og tilbehørsproteiner. Dissekering af funktionen af vejbestanddele er skræmmende, hvis den er afhængig af konventionelle knockout- eller knockin-genteknologiske strategier alene. En alternativ tilgang er foreløbigt at screene medlemmer af en vej ved hjælp af et forbigående funktionstabsassay. Til dette formål blev to hurtige protokoller kombineret, RNAi og CGE-LIF detektion, for at skabe en mere effektiv måde at karakterisere glycosyleringsgener på. Den beskrevne metode kræver 5-7 dage til færdiggørelse sammenlignet med konventionelle metoder, der potentielt tager flere uger at afslutte. Desuden kan forskningsmiljøer med automatiseringsfunktioner udnytte denne metode til at screene flere genkandidater end muligt med manuel håndtering.
Succesen med en forbigående glycoengineering-kampagne afhænger i høj grad af siRNA-designet. Brugerdefinerede DsiRNA-designs skal følge de tidligere skitserede regler, eller for nemheds skyld kan brugerne vælge kommercielt tilgængelige foruddesignede sekvenser. Ligesom andre genmodifikationsstrategier har RNAi potentialet for off-target effekter. Derfor opfordres brugerne til at vurdere utilsigtet genmålretning ved hjælp af beregningsmetoder41. Eksperimentelle designvalg kan også hjælpe med at begrænse off-target effekter. Kittler et al. viste, at den multipleksede levering af siRNA førte til en reduktion i off-target effekter42. Selvom dette virker kontraintuitivt, foreslås det, at en masterblanding reducerer koncentrationen af hver siRNA-konstruktion og dermed begrænser muligheden for off-target genhæmning. En yderligere fordel er, at den samtidige transfektion af siRNA-strukturer, der er målrettet mod det samme gen, øger sandsynligheden for vellykket RNAi. Brugen af en masterblanding sikrer også konsistens mellem prøver og replikater og fremskynder transfektionsprocessen. Efter en indledende screening af blandede siRNA-konstruktioner kan et andet eksperiment udføres ved hjælp af individuelle konstruktioner for at fastslå RNAi-effektiviteten af hver sekvens. I denne og andre knockdown-undersøgelser er op til tre siRNA blevet samlet og leveret til celler 43,44,45. Det kan dog være ønskeligt at screene mere end tre siRNA samtidigt for effektivt at målrette mod et enkelt gen eller for at målrette mod flere gener. Faktisk viste en undersøgelse multiplekset siRNA-medieret hæmning af op til seks gener på niveauer, der kan sammenlignes med hæmning af individuelle gener46. Imidlertid er der behov for yderligere undersøgelser for at bestemme det maksimale antal siRNA-konstruktioner, der kan bruges i en pool uden at gå på kompromis med lyddæmpningseffektiviteten. Multiplexstrategien blev foreslået af Martin et al. for at forbedre tempoet i RNAi-biblioteksscreeningseksperimenter46, og et lignende koncept kan vise sig nyttigt til at screene glykosyleringsgener.
Protokollen beskrevet heri fungerer som et proof-of-concept med forventning om, at efterfølgende eksperimenter vil blive udført for at validere andre glykosyleringsgener. Nye gener af interesse kan være ukarakteriserede eller mindre populære end Fut8, og primære antistoffer til påvisning af genhæmning kan være dårlige eller utilgængelige. I dette scenario kan alternative metoder såsom RT-PCR anvendes til at kvantificere genhæmning47, men det skal bemærkes, at RT-PCR detekterer mRNA snarere end protein. Når antistoffer til western blotting er tilgængelige, er et almindeligt problem dårlig påvisning eller tilstedeværelsen af ikke-specifikke bånd. Fejlfindingsvejledninger til at hjælpe brugerne med at løse almindelige problemer er tilgængelige, og disse har tendens til at omfatte en række løsninger såsom primær antistoftitrering, alternativ blokering og detektionsbetingelser48,49. I denne undersøgelse optrådte FUT8 uventet som et dobbeltbånd ved ~65 og ~70 kDa. Det er muligt, at ~70 kDa-båndet repræsenterer glykosyleret FUT8. Litteraturbeviser fra humane cellelinjer beskriver O-bundet glykosylering ved Thr 56450,51, et sted, der er bevaret i kinesisk hamster, og CHO K1 FUT8-sekvenser.
Som tidligere nævnt involverer glycosyleringsveje ofte et komplekst udvalg af enzymer. Den nuværende protokol er udviklet, optimeret og demonstreret ved hjælp af en monogen glykosyleringsreaktion kontrolleret af Fut8. Derfor er der behov for yderligere undersøgelser for at bekræfte robustheden af denne metode, når målgenet koder for et enzym med alternative kinetik- og ekspressionsniveauer eller en vej reguleret af isoenzymer med overflødige funktioner.
Samlet set er evnen til hurtigt at tavse gener og detektere modificerede IgG-glycoprofiler et nyttigt værktøj i bestræbelserne på at tilpasse glycoengineered antistoffer. Indsigt fra lignende kortsigtede undersøgelser kan anvendes til at generere stabile glycoengineered celler til brug i langsigtede assays som fed-batch kultur. Uden for den farmaceutiske kontekst bidrager denne metode til studiet af glycanbiologi og fremhæver glycans vigtige funktion i udvikling, sundhed og sygdom.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
PK takker Institut for Kemiteknik, Imperial College London, for hans stipendium. RD takker det britiske bioteknologiske og biologiske videnskabsforskningsråd for hans studietid. MM er finansieret af U.K. Biotechnology and Biological Sciences Research Council (Tilskudsreference: BB/S006206/1). IAG takker det irske forskningsråd (stipendie nr. GOIPG/2017/1049) og CONACyT (stipendie nr. 438330).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32 Karat software | SCIEX | contact manufacturer | Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method. |
| Acetonitrile, HPLC grade | Sigma Aldrich | 34851 | Solvent. |
| Anti-FUT8 antibody | AbCam | ab198741 | Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene. |
| Anti-GAPDH antibody | AbCam | ab181602 | Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user. |
| BioDrop Spectrophotometer | Biochrom | 80 3006 55 | Instrument used to quantify protein concentration. |
| BLItz | ForteBio | 45 5000 | Instrument. Label-Free Protein Analysis System. |
| BRAND Haemocytometer | Sigma Alrich | BR717810 | Counting chamber device |
| Capillary cartridge | SCIEX | A55625 | Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 µm outer diameter (o.d), x 50 µm inner diameter (i.d). |
| C100HT Glycan analysis—capillary electrophoresis | SCIEX | contact manufacturer | Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used. |
| CD CHO Medium | Thermo Fisher Scientific | 10743029 | Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice. |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Greiner Bio | 188261 | Sterile polypropylene tube. |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Greiner Bio | 227270 | Sterile polypropylene tube. |
| CHO IgG | MedImmune | Gift | Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system. |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x PBS, without calcium or magnesium. |
| Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL | Corning | 431143 | Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice. |
| Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL | Corning | 431144 | Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice. |
| Fast Glycan Labelling and Analysis kit | SCIEX | B94499PTO | Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS. |
| Fut8 DsiRNA | IDT | Custom | Custom designed DsiRNA targetting Fut8. |
| Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm | Bio-Rad | 1652088 | Electroporation cuvette. |
| Gene Pulser Xcell Eukaryotic System | Bio-Rad | 165 2661 | Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod. |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck-Millipore | IPFL00010 | Immunoblot transfer membrane, low background. |
| L-Methionine sulfoximine (MSX) | Sigma Aldrich | M5379 | Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system. |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 10623111 | Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes. |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 78505 | Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | 10365710 | Solvent. |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 616201 | Autoclavable tubes. |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system | Bio-Rad | 1658035FC | Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply. |
| NC-Slide A8 | ChemoMetec | 942 0003 | 8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250. |
| Negative Control DsiRNA, 5 nmol | IDT | 51 01 14 04 | Non-targeting DsiRNA. |
| Nuclease-free duplex buffer | IDT | 11-01-03-01 | Reconstitution buffer for DsiRNA. |
| NucleoCounter NC-250 | Chemometec | contact manufacturer | Instrument. Automated Cell Analyzer |
| Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa | Thermo Fisher Scientific | 26616 | Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting. |
| PCR tubes | Greiner Bio | 608281 | Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation. |
| Pipette filter tips sterilised (10, 200, 1000 µL) | Gibson | F171203, F171503, F171703 | Sterile filter tips to avoid RNA contamination. |
| PNGase F enzyme | New England Biolabs | P0704S | Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins. |
| Polypropylene columns, 1 mL | Qiagen | 34924 | Columns for gravity-flow chromatography. |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases |
| Protein-A Agarose Beads | Merck-Millipore | 16 125 | For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins. |
| Protein-A biosensor | ForteBio | 18 5010 | Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification. |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | Removes RNAse contamination. |
| Sample dilutent | ForteBio | 18 1104 | Activate Protein A tips. |
| Serological pipets (5, 10, 25 mL) | Corning | 4487, 4488, 4489 | Used for sterile cell culture tecniques. |
| Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF | Sigma Aldrich | 296813 | Reducing agent. |
| Solution 18 | ChemoMetec | 910-3018 | Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) |
| Spin-X Centrifuge Tube Filters | Corning | 8161 | 0.22 µm pore, Cellulose Acetate membrane. |
| Suspension plate with lid, 6-well | Greiner Bio | 657 185 | Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures. |
| Syringe filters, 0.22 μm | Sartorius | 514 7011 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) |
| Syringes with Luer lock tip, 20 mL | Fisher Scientific | 10569215 | For secure connection with syringe filter. |
| Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | Stains dead and dying cells. |
| Vivaspin 500, 3,000 MWCO | Sartorius | VS0191 | Polyethersulfone |
| WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | WB7105 | Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online. |
References
- Jefferis, R. Glycosylation as a strategy to improve antibody-based therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 226-234 (2009).
- Rathore, A. S., Winkle, H. Quality by design for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 27 (1), 26-34 (2009).
- Eon-Duval, A., Broly, H., Gleixner, R. Quality attributes of recombinant therapeutic proteins: An assessment of impact on safety and efficacy as part of a quality by design development approach. Biotechnology Progress. 28 (3), 608-622 (2012).
- Lalonde, M. -E., Durocher, Y.
- Mimura, Y., et al. Glycosylation engineering of therapeutic IgG antibodies: challenges for the safety, functionality and efficacy. Protein & Cell. 9 (1), 47-62 (2018).
- Walsh, G.
- Zhang, M., Koskie, K., Ross, J. S., Kayser, K. J., Caple, M. V. Enhancing glycoprotein sialylation by targeted gene silencing in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. , (2010).
- Kanda, Y., et al. et al. of a GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) knockout host cell line: a new strategy for generating completely non-fucosylated recombinant therapeutics. Journal of Biotechnology. 130 (3), 300-310 (2007).
- Umaña, P., Jean-Mairet, J., Moudry, R., Amstutz, H., Bailey, J. E. Engineered glycoforms of an antineuroblastoma IgG1 with optimized antibody-dependent cellular cytotoxic activity. Nature Biotechnology. 17 (2), 176-180 (1999).
- Xu, X., et al. et al. genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).
- Chan, K. F., et al. et al. of GDP-fucose transporter gene (Slc35c1) in CHO cells by ZFNs, TALENs and CRISPR-Cas9 for production of fucose-free antibodies. Biotechnology Journal. 11 (3), 399-414 (2016).
- Zhang, P., et al. Identification of functional elements of the GDP-fucose transporter SLC35C1 using a novel Chinese hamster ovary mutant. Glycobiology. 22 (7), 897-911 (2012).
- Amann, T., et al. Genetic engineering approaches to improve posttranslational modification of biopharmaceuticals in different production platforms. Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2778-2796 (2019).
- Karottki, K. J., et al. Awakening dormant glycosyltransferases in CHO cells with CRISPRa. Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 593-598 (2020).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Hammond, S. M., Bernstein, E., Beach, D., Hannon, G. J. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature. 404 (6775), 293-296 (2000).
- Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., Hannon, G. J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409 (6818), 363-366 (2001).
- Shields, R. L., et al. et al. of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human FcγRIII and antibody-dependent cellular toxicity. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 26733-26740 (2002).
- Shinkawa, T., et al. et al. Absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 3466-3473 (2003).
- Mori, K., et al. Engineering Chinese hamster ovary cells to maximize effector function of produced antibodies using FUT8 siRNA. Biotechnology and Bioengineering. 88 (7), 901-908 (2004).
- Imai-Nishiya, H., et al. Double knockdown of alpha1,6-fucosyltransferase (FUT8) and GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) in antibody-producing cells: a new strategy for generating fully non-fucosylated therapeutic antibodies with enhanced ADCC. BMC Biotechnology. 7, 84 (2007).
- Beuger, V., et al. et al. silencing of fucosyltransferase 8 in Chinese-hamster ovary cells for the production of antibodies with enhanced antibody immune effector function. Biotechnology and Applied Biochemistry. 53 (1), 31 (2009).
- Templeton, N., Dean, J., Reddy, P., Young, J. D. Peak antibody production is associated with increased oxidative metabolism in an industrially relevant fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 2013-2024 (2013).
- Hussain, H., et al. A comparative analysis of recombinant Fab and full-length antibody production in Chinese hamster ovary cells. Biotechnology and Bioengineering. 118 (12), 4815-4828 (2021).
- Shimoyama, H., et al. Partial silencing of fucosyltransferase 8 gene expression inhibits proliferation of Ishikawa cells, a cell line of endometrial cancer. Biochemistry and Biophysics Reports. 22, 100740 (2020).
- Tummala, S., et al. Evaluation of exogenous siRNA addition as a metabolic engineering tool for modifying biopharmaceuticals. Biotechnology Progress. 29 (2), 415-424 (2013).
- Carillo, S., et al. Comparing different domains of analysis for the characterisation of N-glycans on monoclonal antibodies. Journal of Pharmaceutical Analysis. 10 (1), 23-34 (2020).
- Reusch, D., et al. Comparison of methods for the analysis of therapeutic immunoglobulin G Fc-glycosylation profiles-Part 2: Mass spectrometric methods. mAbs. 7 (4), 732-742 (2015).
- Donini, R., Haslam, S. M., Kontoravdi, C. Glycoengineering Chinese hamster ovary cells: a short history. Biochemical Society Transactions. 49 (2), 915-931 (2021).
- Szigeti, M., Chapman, J., Borza, B., Guttman, A. Quantitative assessment of mAb Fc glycosylation of CQA importance by capillary electrophoresis. ELECTROPHORESIS. 39 (18), 2340-2343 (2018).
- Ruhaak, L. R., et al. Optimized workflow for preparation of APTS-labeled N-glycans allowing high-throughput analysis of human plasma glycomes using 48-channel multiplexed CGE-LIF. Journal of Proteome Research. 9 (12), 6655-6664 (2010).
- Patenaude, A. -M., et al. N-glycosylation analysis of mouse immunoglobulin G isolated from dried blood spots. Electrophoresis. 42 (24), 2615-2618 (2021).
- Karst, D. J., et al. Modulation and modeling of monoclonal antibody N-linked glycosylation in mammalian cell perfusion reactors. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 1978-1990 (2017).
- Dadouch, M., Ladner, Y., Perrin, C. Analysis of monoclonal antibodies by capillary electrophoresis: sample preparation, separation, and detection. Separations. 8 (1), 4 (2021).
- Fakhr, E., Zare, F., Teimoori-Toolabi, L. Precise and efficient siRNA design: a key point in competent gene silencing. Cancer Gene Therapy. 23 (4), 73-82 (2016).
- Birmingham, A., et al. A protocol for designing siRNAs with high functionality and specificity. Nature Protocols. 2 (9), 2068-2078 (2007).
- Makrydaki, E., et al. Immobilised enzyme cascade for targeted glycosylation. , (2022).
- Bulletin_6201.pdf. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6201.pdf (2022).
- Bulletin_6376.pdf. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2022).
- Dot Blot Analysis. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/dot-blot/index.html (2022).
- Yilmazel, B., et al. Online GESS: prediction of miRNA-like off-target effects in large-scale RNAi screen data by seed region analysis. BMC Bioinformatics. 15 (1), 192 (2014).
- Kittler, R., et al. Genome-wide resources of endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nature Methods. 4 (4), 337-344 (2007).
- Stec, E., et al. A multiplexed siRNA screening strategy to identify genes in the PARP pathway. Journal of Biomolecular Screening. 17 (10), 1316-1328 (2012).
- Brown, J. M., et al. Ligand conjugated multimeric siRNAs enable enhanced uptake and multiplexed gene silencing. Nucleic Acid Therapeutics. 29 (5), 231-244 (2019).
- Parsons, B. D., Schindler, A., Evans, D. H., Foley, E. A direct phenotypic comparison of siRNA pools and multiple individual duplexes in a functional assay. PLoS One. 4 (12), 8471 (2009).
- Martin, S. E., et al. Multiplexing siRNAs to compress RNAi-based screen size in human cells. Nucleic Acids Research. 35 (8), 57 (2007).
- Popp, O., Moser, S., Zielonka, J., Rüger, P., Hansen, S., Plöttner, O. Development of a pre-glycoengineered CHO-K1 host cell line for the expression of antibodies with enhanced Fc mediated effector function. mAbs. 10 (2), 290-303 (2018).
- Yang, P. -C., Mahmood, T. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
- Troubleshooting Western Blots with the Western Blot Doctor. Bio-Rad Laboratories. , Available from: https://www.bio-rad.com/en-uk/applications-technologies/troubleshooting-western-blots-with-western-blot-doctor?ID=MIW4HR15 (2022).
- Steentoft, C., et al. Precision mapping of the human O-GalNAc glycoproteome through SimpleCell technology. EMBO. 32 (10), 1478-1488 (2013).
- FUT8 - Alpha-(1,6)-fucosyltransferase - Proteomics. , Available from: https://www.nextprot.org/entry/NX_Q9BYC5/proteomics (2022).
- Kotidis, P., et al. Rapid antibody glycoengineering in CHO cells via RNA interference and CGE-LIF N-glycomics. Methods in Molecular Biology. 2370, 147-167 (2022).
