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Bioengineering

चीनी हैम्स्टर अंडाशय कोशिकाओं में रैपिड एंटीबॉडी ग्लाइकोइंजीनियरिंग

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63872
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,4, 5, 5, 4, 1,2, 1
1Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 2Imperial College Centre for Synthetic Biology, Imperial College London, 3BioPharm Process Research, GlaxoSmithKline Research and Development, 4Department of Life Science, Imperial College London, 5School of Chemical & Bioprocess Engineering, University College Dublin
* These authors contributed equally

Summary

एंटीबॉडी का ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न इसके नैदानिक प्रदर्शन को निर्धारित करता है, इस प्रकार ग्लाइकोसिलेशन को नियंत्रित करने के लिए औद्योगिक और अकादमिक प्रयास जारी रहते हैं। चूंकि विशिष्ट ग्लाइकोइंजीनियरिंग अभियान समय और श्रम-गहन होते हैं, इसलिए क्षणिक साइलेंसिंग का उपयोग करके ग्लाइकोसिलेशन जीन के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए एक तेजी से प्रोटोकॉल की पीढ़ी उपयोगी साबित होगी।

Abstract

पुनः संयोजक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विशिष्ट आणविक लक्ष्यों को बांधते हैं और बाद में, एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करते हैं या अन्य लिगेंड के बंधन को रोकते हैं। हालांकि, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कार्यक्षमता और आधा जीवन मेजबान-विशिष्ट ग्लाइकोसिलेशन के प्रकार और वितरण से कम हो सकता है। बेहतर एंटीबॉडी का उत्पादन करने के प्रयासों ने आनुवंशिक रूप से संशोधित निर्माता कोशिकाओं के विकास को प्रेरित किया है जो ग्लाइको-अनुकूलित एंटीबॉडी को संश्लेषित करते हैं। ग्लाइकोइंजीनियरिंग को आमतौर पर क्लस्टर किए गए नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर) से जुड़े प्रोटीन 9 जैसे तरीकों का उपयोग करके एक स्थिर नॉकआउट या नॉकिन सेल लाइन की पीढ़ी की आवश्यकता होती है। इंजीनियर कोशिकाओं द्वारा उत्पादित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को तब बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विधियों का उपयोग करके यह निर्धारित करने की विशेषता है कि वांछित ग्लाइकोप्रोफाइल प्राप्त किया गया है या नहीं। यह रणनीति समय लेने वाली, तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, और विशेषज्ञों की आवश्यकता है। इसलिए, एक वैकल्पिक रणनीति जो आनुवंशिक ग्लाइकोइंजीनियरिंग और ग्लाइकन का पता लगाने के लिए सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का उपयोग करती है, इष्टतम एंटीबॉडी की दिशा में प्रयासों में सहायता कर सकती है। इस प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट अध्ययन में, एक आईजीजी-उत्पादक चीनी हैम्स्टर अंडाशय सेल ने ग्लाइकोइंजीनियरिंग को अनुकूलित करने के लिए एक आदर्श मेजबान के रूप में कार्य किया। Fut8 जीन को लक्षित करने वाले लघु हस्तक्षेप आरएनए को चीनी हैम्स्टर अंडाशय कोशिकाओं को वितरित किया गया था, और एफयूटी 8 प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिणामी परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित की गई थी। परिणाम बताते हैं कि इस विधि द्वारा नॉकडाउन कुशल था, जिससे एफयूटी 8 में ~ 60% की कमी आई। एंटीबॉडी ग्लाइकोप्रोफाइल का पूरक विश्लेषण एक तेजी से अभी तक अत्यधिक संवेदनशील तकनीक का उपयोग करके किया गया था: केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन और लेजर प्रेरित प्रतिदीप्ति का पता लगाना। सभी नॉकडाउन प्रयोगों ने एफुकोसिलेटेड ग्लाइकन में वृद्धि देखी; हालाँकि, इस अध्ययन में हासिल की गई सबसे बड़ी पारी ~ 20% थी। यह प्रोटोकॉल सिलिको डिजाइन टूल, व्यावसायिक रूप से संश्लेषित जीन लक्ष्यीकरण अभिकर्मकों, और तेजी से मात्रा का ठहराव परख में दोहन करके ग्लाइकोइंजीनियरिंग प्रयासों को सरल बनाता है जिन्हें व्यापक पूर्व अनुभव की आवश्यकता नहीं होती है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल द्वारा दी गई समय क्षमता नए जीन लक्ष्यों में जांच में सहायता कर सकती है।

Introduction

एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन एक एंजाइमेटिक प्रक्रिया है जिसके द्वारा ओलिगोसेकेराइड मोइटीज़ एएसएन अवशेषों से सहसंयोजक रूप से जुड़े होते हैं। डे नोवो प्रोटीन संश्लेषण के विपरीत, ग्लाइकन संश्लेषण एक गैर-टेम्पलेटेड प्रतिक्रिया है जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन का विषम ग्लाइकोसिलेशन होता है। ग्लाइकन की संरचना, संरचना और वितरण प्रोटीन विरूपण और कार्य को प्रभावित कर सकता है। दरअसल, इम्युनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) के क्रिस्टलीय टुकड़े (एफसी) क्षेत्र में एन-ग्लाइकोसिलेशन एंटीबॉडी1 की चिकित्सीय प्रभावकारिता, इम्युनोजेनेसिटी और आधे जीवन को नियंत्रित करता है। इस प्रकार, पुनः संयोजक बायोथेरेप्यूटिक प्रोटीन उत्पादों के विकास के लिए डिजाइन (क्यूबीडी) प्रतिमान द्वारा गुणवत्ता स्वाभाविक रूप से ग्लाइकोसिलेशन को एक महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषता (सीक्यूए) 2,3 के रूप में पहचानती है। स्तनधारी कोशिकाएं अक्सर पसंदीदा अभिव्यक्ति प्रणाली होती हैं क्योंकि वे स्वाभाविक रूप से बैक्टीरिया, खमीर, कीट या पौधों की कोशिकाओं की तुलना में मानव जैसे ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न का अधिक बारीकी से उत्पादन करती हैं। इसके अलावा, चीनी हैम्स्टर अंडाशय (सीएचओ) कोशिकाओं को अन्य स्तनधारी सेल लाइनों पर चुना जाता है क्योंकि वे मानव वायरस संक्रमण के लिए प्रतिरोधी होते हैं, उच्च टाइटर्स पर उत्पादों का स्राव करते हैं, और निलंबन संस्कृति में उच्च व्यवहार्य सेल घनत्व4. ग्लाइकन गठन के संबंध में, गैर-सीएचओ म्यूरिन उत्पादन कोशिकाएं इम्यूनोजेनिक ग्लाइकन (α (1-3) -लिंक्ड गैलेक्टोज [α (1-3)-गैल] और एन-ग्लाइकोलिलन्यूरामिनिक एसिड [न्यूजीसी]) उत्पन्न करती हैं जो मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबीएस) 5 के सुरक्षित उपयोग पर प्रभाव डालती हैं। ये लाभ सीएचओ कोशिकाओं को सबसे महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति प्रणाली बनाते हैं, जो 2014 और 2018 के बीच 80% से अधिक नए बायोथेरेप्यूटिक्सके उत्पादन के लिए जिम्मेदार हैं। हालांकि, टेम्पलेट-स्वतंत्र ग्लाइकोसिलेशन एक संरक्षित तंत्र है जो ग्लाइकोफॉर्म की एक सरणी के साथ सीएचओ-व्युत्पन्न बायोथेरेप्यूटिक्स की ओर जाता है।

बायोथेरेप्यूटिक विकास रणनीतियों का उद्देश्य आनुवंशिक इंजीनियरिंग द्वारा सीएचओ कोशिकाओं में विषमता को नियंत्रित करना है। कुछ साहित्य उदाहरणों में सियालिडेस (एनईयू 1, एनईयू 3)7, जीडीपी-मैनोज़ 4,6-डिहाइड्रेटेज (जीएमडी) नॉकआउट8, और ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ (जीएनटीआईआईआईआई) 9 का ओवरएक्सप्रेशन शामिल है। ग्लाइकोइंजीनियरिंग में प्रगति सार्वजनिक रूप से उपलब्ध संसाधनों के संयोजन के कारण संभव है, जैसे कि सीएचओ जीनोम10, और आनुवंशिक इंजीनियरिंग उपकरणों के चल रहे विकास, जैसे प्रतिलेखन एक्टिवेटर जैसे प्रभावक न्यूक्लियस (टीएएलईएन), जस्ता उंगली न्यूक्लियस (जेडएफएन), और क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर) से जुड़े प्रोटीन 9 (सीआरआईएसपीआर-कैस 9) 11,12,13,13,14 . इन उपकरणों को आमतौर पर सीएचओ कोशिकाओं को प्लास्मिड डीएनए के रूप में या शुद्ध राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) परिसरों के रूप में वितरित किया जाता है। इसके विपरीत, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) एक आनुवंशिक इंजीनियरिंग तकनीक है, जो अपने सबसे सरल रूप में, केवल शुद्ध लघु हस्तक्षेप आरएनए (एसआईआरएनए) ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के वितरण की आवश्यकता होती है। अंतर्जात प्रोटीन डबल-फंसे हुए सीआरएनए को एकल किस्में में संसाधित करते हैं, और न्यूक्लियस, आरएनए-प्रेरित साइलेंसिंग कॉम्प्लेक्स (आरआईएससी), लक्ष्य एमआरएनएअनुक्रम15,16,17 को क्लीव करने के लिए एसआईआरएनए के साथ एक जटिल बनाता है। आरएनए अस्थिरता के कारण इस पद्धति के माध्यम से जीन साइलेंसिंग क्षणिक है, लेकिन यहां की जांच तेजी से स्क्रीनिंग की सहायता के लिए इस सुविधा का लाभ उठाती है।

वर्तमान अध्ययन के लिए चयनित मॉडल एंजाइम, α1,6-फ्यूकोसिलट्रांसफेरेज़ (एफयूटी 8), α-1,6 कोर-लिंक्ड एल-फ्यूकोस (एफयूसी) के साथ एन-ग्लाइकन का उत्पादन करता है। यह संशोधन एंटीबॉडी-निर्भर सेल साइटोटॉक्सिसिटी (एडीसीसी) गतिविधि का एक प्राथमिक निर्धारक है, जैसा कि वाणिज्यिक एंटीबॉडी के अध्ययन से स्पष्ट है। कोर फ्यूकोसिलेशन की अनुपस्थिति में, रितुक्सिमैब (एंटी-सीडी 20 आईजीजी 1) एडीसीसी 50 गुना बढ़ाता है और एफसीजीआरआईआईआईए बाइंडिंग 18,19 में सुधार करके ट्रास्टुज़ुमाब (एंटी-हर 2 आईजीजी1) में एडीसीसी बढ़ाता है। इस प्रकार, कोर फ्यूकोसिलेशन को एमएबीएस की एक अवांछनीय विशेषता माना जाता है जो इस फेनोटाइप को उलटने के प्रयासों को वारंट करता है। एडीसीसी20,21,22 में सहवर्ती वृद्धि के साथ एसआईआरएनए का उपयोग करके सफल फट 8 जीन लक्ष्यीकरण के उदाहरण हैं, हालांकि ये उदाहरण प्लास्मिड डीएनए पर एन्कोडेड फट 8 एसआईआरएनए प्रदान करते हैं। इस तरह के प्रयोग स्थिर जीन साइलेंसिंग उत्पन्न करते हैं क्योंकि प्लास्मिड डीएनए एसआईआरएनए संश्लेषण के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है। यह कोशिकाओं को सिआरएनए अणुओं को फिर से भरने की अनुमति देता है जो इंट्रासेल्युलर आरएनए और फॉस्फेटेस द्वारा अपमानित होते हैं। इसके विपरीत, बहिर्जात सिंथेटिक सीआरएनए की डिलीवरी केवल क्षणिक जीन साइलेंसिंग की अनुमति देती है क्योंकि इंट्रासेल्युलर टेम्पलेट की कमी के कारण एसआईआरएनए को फिर से नहीं भरा जा सकता है। इस प्रकार, उपयोगकर्ताओं को विचार करना चाहिए कि क्या प्रयोगात्मक डिजाइन प्लास्मिड-व्युत्पन्न या सिंथेटिक सिआरएनए के साथ संगत हैं। उदाहरण के लिए, पीक एमएबी उत्पादन पर केंद्रित अध्ययन, आमतौर पर संस्कृति23,24 के छठे दिन, सिंथेटिक सिरना का विकल्प चुन सकते हैं जिसे चोटी की अभिव्यक्ति से कुछ दिन पहले कोशिकाओं को दिया जा सकता है। सिंथेटिक सिआरएनए का उपयोग करके एक क्षणिक दृष्टिकोण के लाभों में उत्पादन को आउटसोर्स करने की क्षमता और तथ्य यह है कि प्लास्मिड में निर्माण उत्पन्न करने में लगने वाले समय के एक अंश में कई एसआईआरएनए निर्माण उत्पन्न किए जा सकते हैं। इसके अलावा, सिंथेटिक सिरना प्रभावशाली है, जैसा कि एफयूटी 8 जीन साइलेंसिंग के साहित्य उदाहरणों से स्पष्ट है जो एफयूटी 8 प्रोटीन अभिव्यक्ति25 को कम करने के लिए पर्याप्त हैं और बढ़े हुए एफसीजीआरआईआईआईए बाध्यकारी और एडीसीसी26 के साथ एफ्यूकोसिलेटेड आईजीजी उत्पन्न करते हैं।

इस ग्लाइकोइंजीनियरिंग प्रोटोकॉल की सफलता एफसी ग्लाइकोसिलेशन की डिग्री से निर्धारित की गई थी। मास स्पेक्ट्रोमेट्री आमतौर पर ग्लाइकोमिक विश्लेषण के लिए पसंद की विधि है; हालांकि, केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन और लेजर प्रेरित प्रतिदीप्ति का पता लगाने (सीजीई-एलआईएफ) शुद्ध आईजीजी के ग्लाइकोप्रोफाइल को हल करने के लिए पूरी तरह से उत्तरदायी है और इसमें अधिक तीव्रता और सादगी का लाभ है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटोकॉल उपयुक्त क्रोमैटोग्राफिक और व्युत्पन्न विधियों, आयनीकरण स्रोतों, और बड़े पैमाने परविश्लेषकों 27,28,29 गठबंधन करना चाहिए। एक प्रशिक्षित विशेषज्ञ की आवश्यकता के अलावा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटोकॉल लंबे होते हैं, और विधियों की विविधता विभिन्न सेटअपों के साथ प्रयोगशालाओं के बीच तुलना करना मुश्किल बनाती है। बायोफार्मास्यूटिकल्स के संदर्भ में, सीजीई-एलआईएफ एक संवेदनशील विधि है जो एंटीबॉडी ग्लाइकोप्रोफाइल का पर्याप्त विवरण प्रदान कर सकती है और उच्च-थ्रूपुट विधियों के लिए आसानी से स्केलेबल है। कम बहुतायत के लिए, खराब विशेषता वाले ग्लाइकोप्रोटीन के साथ अत्यधिक जटिल मिश्रण, मास स्पेक्ट्रोमेट्री के फायदे रह सकते हैं। हालांकि, सीजीई-एलआईएफ-आधारित एन-ग्लाइकन विश्लेषण द्वारा प्रदान किए गए उच्च-रिज़ॉल्यूशन और उच्च संवेदनशीलता एमएबी एनालिटिक्स इस पद्धति का परीक्षण करने के लिए एक तर्क के रूप में काम करते हैं। इसके अलावा, नमूना तैयारी और विश्लेषण केवल कुछ घंटों मेंपूरा हो जाता है 30. हाल के अध्ययनों से पता चला है कि सीजीई-एलआईएफ का उपयोग मानव प्लाज्मा 31, माउस32 और सीएचओ आईजीजी33 से प्राप्त ग्लाइकन की निगरानी के लिए किया जा सकताहै। ये अध्ययन उच्च-थ्रूपुट नमूना विश्लेषण और छोटे नमूना संस्करणों के लिए सीजीई-एलआईएफ के उपयोग को उजागर करते हैं।

सीजीई-एलआईएफ विधि की सीमाएं हैं जिन्हें ध्यान में रखा जाना चाहिए। ग्लाइकन विश्लेषण के लिए इस और अन्य उपकरणों के उपयोग के लिए लागत एक महत्वपूर्ण बाधा है। हालांकि, ये लागत क्षेत्र के भीतर विशिष्ट हैं, और सीजीई-एलआईएफ को एक लागत प्रभावी विकल्प माना जाता है34. छोटे बजट वाली प्रयोगशालाओं को मशीनरी को पट्टे पर देना या नमूनों के विश्लेषण को आउटसोर्स करना अधिक व्यावहारिक लग सकता है। किसी भी विश्लेषणात्मक विधि का एक और विचार पुनरावृत्ति है। सीजीई-एलआईएफ का मूल्यांकन एक ही नमूने के 48 प्रतिकृतियों का उपयोग करके आयोजित किया गया था जो अलग-अलग दिनों में परख किए गए थे। इंट्राबैच और इंटरबैच पुनरावृत्ति के लिए प्रति केशिका सापेक्ष मानक विचलन निर्धारित किया गया था। प्रतिकृतियों की इंट्राबैच तुलना में 6.2% का सापेक्ष मानक विचलन पाया गया, यह दर्शाता है कि केशिका प्रदर्शन समान नहीं है। इसके अलावा, इंटरबैच डेटा की तुलना में 15.8% 31 का सापेक्ष मानक विचलन दिखाया गया, यह दर्शाता है कि केशिका प्रदर्शन समय के साथ बदलता है। पहचानकी गई परिचालन कमियां वर्तमान अध्ययन में लागू नहीं हो सकती हैं, जो विभिन्न मशीनरी और मालिकाना अभिकर्मकों का उपयोग करती हैं। यदि उपयोगकर्ता इन-हाउस प्रोटोकॉल विकसित करने का इरादा रखते हैं, तो यह रुहाक एट अल द्वारा अध्ययन पर विचार करने लायक होगा। 31, जिसने सीजीई-एलआईएफ के लिए अभिकर्मकों का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन किया। इस प्रकार, नमूना इंजेक्शन (हाय-डि फॉर्मामाइड और डीएमएसओ), ग्लाइकन लेबलिंग (एनएबीएच3सीएन या 2-पिकोलिन बोरेन) 31 के लिए अभिकर्मकों, और अन्य को अनुकूलित किया गया है।

यह अध्ययन एक समय-कुशल ग्लाइकोइंजीनियरिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो डाउनस्ट्रीम ग्लाइकोमिक विश्लेषण के साथ प्रत्यक्ष आरएनएआई की तीव्रता को जोड़ती है। पद्धति को ऊपर उल्लिखित कारणों के लिए एक लक्ष्य के रूप में Fut8 जीन का उपयोग करके सचित्र किया गया है।

Protocol

1. डीएसआईआरएनए डिजाइन और पुनर्गठन

  1. आईडीटी वेबसाइट (https://eu.idtdna.com) तक पहुंचने के लिए सफारी, फ़ायरफ़ॉक्स या माइक्रोसॉफ्ट एज का उपयोग करें। होम पेज से, आरएनए हस्तक्षेप के बाद उत्पाद और सेवा टैब का चयन करें। Fut8 जीन को लक्षित करने वाले कस्टम डाइसर-सब्सट्रेट (DsiRNA) निर्माण उत्पन्न करने के लिए, कस्टम DsiRNA टैब उत्पन्न करने के बाद डिज़ाइन टूल का चयन करें।
    1. Fut8 परिग्रहण संख्या दर्ज करें या मैन्युअल रूप से शुरू करने के लिए जीन अनुक्रम दर्ज करें। इस अध्ययन में, "सीएचओ-के 1" और "चीनी हैम्स्टर" प्रविष्टियों दोनों से प्रस्तावित एफयूटी 8 अनुक्रम https://chogenome.org से प्राप्त किए गए थे और डीएसआईआरएनए उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए गए थे। अधिकांश जीनों में कई ट्रांसक्रिप्ट वेरिएंट होते हैं, और यह सत्यापित करना महत्वपूर्ण है कि डीएसआईआरएनए वर्तमान असेंबली में सभी रिपोर्ट किए गए वेरिएंट पर सक्रिय होगा।
    2. "मैनुअल ब्लास्ट" खोज करने के विकल्प का चयन करें क्योंकि चो सेल जीनोम वर्तमान में आईडीटी वेबसाइट पर "संदर्भ जीनोम" के रूप में उपलब्ध नहीं है। यह चरण कस्टम डीएसआईआरएनए अनुक्रमों और ब्याज के जीनोम के बीच मैचों की खोज करता है।
    3. DsiRNA अनुक्रम जनरेट करने के लिए खोजें क्लिक करें।
    4. बदले में, टैक्स आईडी: 10029 (सीएचओ सेल लाइनों और चीनी हैम्स्टर) के साथ "मैनुअल ब्लास्ट" फ़ंक्शन का उपयोग करके प्रत्येक डीएसआईआरएनए की विशिष्टता का आकलन करें। क्वेरी कवरेज परिणाम इंगित करते हैं कि डीएसआईआरएनए निर्माण 100% पर एफयूटी 8 (एफयूटी 8 ट्रांसक्रिप्ट वेरिएंट सहित) से मेल खाते हैं, जबकि अनपेक्षित लक्ष्यों के खिलाफ पूरकता ≤76% 35 है।
    5. जांचें कि डीसी सामग्री 30% -50% के बीच है, यह सुनिश्चित करने के लिए डीएसआईआरएनए विशेष रूप से एफयूटी 8 को लक्षित करता है। एक कम जीसी सामग्री कमजोर और अविशिष्ट बाध्यकारी से जुड़ी होती है, जबकि एक उच्च जीसी सामग्री एसआईआरएनए को खोलने और आरआईएससी कॉम्प्लेक्स36 में लोड करने से रोकती है।
    6. अभिकर्मक अध्ययन (तालिका 1) में उपयोग के लिए तीन डीएसआईआरएनए का चयन करें, प्रत्येक Fut8 जीन के एक अलग स्थान को लक्षित करता है। नियंत्रण प्रयोगों के लिए आईडीटी से एक पूर्व-डिज़ाइन किए गए गैर-लक्ष्यीकरण या तले हुए डीएसआईआरएनए खरीदें।
  2. आगमन पर, ट्यूब खोलने से पहले गोली के लिए 1 मिनट के लिए 13,300 एक्स जी पर डीएसआईआरएनए अपकेंद्रित्र। न्यूक्लियस-मुक्त डुप्लेक्स बफर (आईडीटी द्वारा प्रदान की गई) में प्रत्येक लियोफिलाइज्ड डीएसआईआरएनए को 100 μM स्टॉक समाधान में पुनर्गठित करें। उदाहरण के लिए, 100 μM स्टॉक प्राप्त करने के लिए DsiRNA के 2 एनएमओएल में 20 μL बफर जोड़ें।
    1. पर्याप्त मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए, कक्षीय शेकर (50 आरपीएम, 16 मिमी कक्षा) पर धीरे-धीरे हिलाते हुए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्टॉक समाधान सेते हैं।
    2. प्रत्येक डीएसआईआरएनए निर्माण के 20 μL के संयोजन से एक मास्टर मिश्रण बनाएं जो Fut8 (प्रत्येक DSiRNA का 100 μM) को लक्षित करता है। विभाज्य तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
डीएसआईआरएनए लक्ष्य अनुक्रम जीसी (%)
संरचना ए 5' गागागौआकाकाएएएसीसी 3 ' 36%
5' 3'
संरचना बी 5' 3 साल की उम्र में बढ़ता है 32%
5' 3'
संरचना सी 5' अगागौगाकाओएएसीओएसी 3 ' 32%
5' 3'

तालिका 1. एफयूटी 8 नॉकडाउन के लिए उपयोग किए जाने वाले डीएसआईआरएनए अनुक्रम। आईडीटी द्वारा उत्पन्न अनुक्रम जो चीनी हैम्स्टर और सीएचओ के 1 सेल जीनोम में फुट 8 को लक्षित करते हैं। प्रत्येक निर्माण के लिए भावना और एंटीसेंस अनुक्रम दिखाए जाते हैं (क्रमशः), और प्रत्येक संरचना की जीसी सामग्री प्रदर्शित की जाती है। कोटिडिस एट अल से पुनर्मुद्रित। 52.

2. डीएसआईआरएनए अभिकर्मक

  1. ब्याज की सेल लाइन के लिए उपयुक्त संस्कृति की स्थिति का उपयोग करके आईजीजी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी37 व्यक्त करने वाली सीएचओ कोशिकाओं को पुनर्जीवित करें।
    नोट: इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं को ग्लूटामाइन सिंथेटेज (जीएस) प्रणाली का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था, जहां अंतर्जात जीएस दुर्लभ उच्च उत्पादक क्लोन के चयन को बढ़ाने के लिए एल-मेथियोनीन सल्फॉक्सीमाइन (एमएसएक्स) द्वारा बाधित होता है। इसलिए, पसंद की सेल लाइन द्वारा आवश्यक होने पर केवल एमएसएक्स का उपयोग करें।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी के स्नान में 2-3 मिनट के लिए कोशिकाओं की एक शीशी को डीफ्रॉस्ट करें। वी) इथेनॉल के साथ शीशी बाहरी को साफ करें और कक्षा द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी काम जारी रखें।
    2. पसंद की सेल लाइन के लिए उपयुक्त प्रीवर्म्ड माध्यम के 9 एमएल युक्त 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल निलंबन को स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 100 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं गोली।
    3. ध्यान से निकालें और सेल गोली परेशान किए बिना माध्यम त्यागें। फिर, प्रीवॉर्फ्ड माध्यम के 10 मिलीलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और गिनती के लिए एक विभाज्य लें।
    4. हेमोसाइटोमीटर के साथ गिनती करते समय ट्रिपैन ब्लू के साथ कोशिकाओं को दाग दें, या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करते समय जीवित / मृत कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक उपयुक्त दाग।
    5. गणना की किसी भी विधि के बाद, मध्यम के 30 एमएल (50 μM MSX के वैकल्पिक पूरक के साथ) में 3 x 105 कोशिकाओं · एमएल -1 के व्यवहार्य सेल घनत्व पर 125 एमएल एर्लेनमेयर शेक फ्लास्क में सेल निलंबन की एक उपयुक्त मात्रा को स्थानांतरित करें।
    6. 36.5 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर सेट एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और 150 आरपीएम (16 मिमी कक्षा) पर एक मिलाते हुए मंच पर रखें।
    7. 2 x 105 कोशिकाओं के बीजारोपण घनत्व पर हर 3-4 दिनों में मार्ग कोशिकाएं · एमएल -1 और 250 एमएल एर्लेनमेयर शेक फ्लास्क में 50 एमएल की कामकाजी मात्रा। यदि एमएसएक्स का उपयोग कर रहे हैं, तो पहले मार्ग के बाद पूरकता बंद कर दें।
    8. विगलन के अलावा मार्ग कोशिकाओं 2x.
  2. अभिकर्मक
    1. सेल घनत्व का आकलन करें और सुनिश्चित करें कि सेल व्यवहार्यता 90% से अधिक है।
    2. संदूषण से बचने के लिए 70% (वी / वी) इथेनॉल और एक आरएनएएसई अवरोधक समाधान के साथ जैव सुरक्षा कैबिनेट और सभी उपकरणों को सावधानीपूर्वक साफ करें।
    3. 5 मिनट के लिए 100 एक्स जी पर गोली कोशिकाओं और 5 x 106 कोशिकाओं · एमएल -1 के व्यवहार्य सेल घनत्व के लिए पूर्वनिर्मित माध्यम में पुन: निलंबित।
    4. एक बाँझ (0.4 सेमी) इलेक्ट्रोपोरेशन क्युवेट में डीएसआईआरएनए मास्टर मिश्रण या नियंत्रण के 8 μL (1 μM के बराबर) स्थानांतरित करें। फिर, सेल निलंबन के 800 μL (4 x 106 कोशिकाओं के बराबर) को एक ही क्युवेट में स्थानांतरित करें और सुनिश्चित करें कि दोनों घटक मिश्रित हैं।
    5. निम्नलिखित पल्स स्थितियों को वितरित करें: 1200 वी, 0.1 एमएस, वर्ग तरंग।
    6. फोम जैसी सामग्री से बचने के लिए ध्यान रखते हुए, क्युवेट से सेल निलंबन को 6-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें। 10 मिनट के लिए मिलाते बिना इनक्यूबेटर (36.5 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें।
    7. अच्छी तरह से प्रति 1.6 एमएल की अंतिम मात्रा बनाने के लिए प्रीवर्म्ड मीडिया के 800 μL जोड़ें और 150 आरपीएम (16 मिमी कक्षा) पर मिलाते हुए विकास (36.5 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) के लिए इनक्यूबेटर में ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं को वापस करें।
    8. 48 घंटे के बाद अभिकर्मक पर सतह पर तैरनेवाला और कोशिकाओं फसल।
      स्टॉपिंग पॉइंट: सेल कल्चर सतह पर तैरनेवाला -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है; हालांकि, यह सलाह दी जाती है कि प्रोटीन क्षरण से बचने के लिए सेल गोली संग्रह के तुरंत बाद सेल लिसिस किया जाना चाहिए। सतह पर तैरनेवालों का उपयोग चरण 3, चरण 4 और चरण 5 में किया जाता है, जबकि सेल छर्रों का उपयोग चरण 6 में किया जाता है।

3. आईजीजी परिमाणीकरण और शुद्धिकरण

  1. बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री या पसंद की किसी अन्य विधि का उपयोग करके आईजीजी एकाग्रता को मापें।
    1. हाइड्रेट प्रोटीन 10-30 मिनट के लिए नमूना पतला में एक बायोसेंसर युक्तियाँ। इस बीच, 5 मिनट के लिए 100 एक्स जी पर 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों और गोली कोशिकाओं में सेल निलंबन स्थानांतरित करें या 0.45 μm नाइट्रोसेल्यूलोज फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा कोशिकाओं को हटा दें।
    2. गोली को परेशान किए बिना, आईजीजी युक्त पृथक सतह पर तैरनेवाला को एक साफ अपकेंद्रित्र ट्यूब में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें।
    3. बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री के लिए निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: शेकर गति, 2200 आरपीएम; रन टाइम, 60 एस। इन मापदंडों का उपयोग सभी नमूनों और नियंत्रणों को मापने के लिए किया जाएगा।
    4. एक बार बायोसेंसर युक्तियों को हाइड्रेटेड करने के बाद, आईजीजी मानक (प्रत्येक एकाग्रता के 4 μL) का उपयोग करके एक मानक वक्र बनाएं।
    5. सेल सतह पर तैरनेवाला के 4 μL लोड करके नमूना सांद्रता मात्रा निर्धारित करें। प्रत्येक नमूने के बीच लिंट-मुक्त पोंछे के साथ उपकरण को साफ करें।
    6. अज्ञात नमूनों की बाध्यकारी दर को प्रक्षेपित करने के लिए अज्ञात नमूनों के लिए मानक वक्र लिंक करें। डेटा सहेजें और सीएसवी या पीडीएफ फाइल के रूप में निर्यात करें।
  2. आईजीजी शुद्धिकरण
    1. 0.2 एम ग्लाइसिन (पीएच 2.5) युक्त क्षालन बफर तैयार करें और 0.22 μm फिल्टर से गुजरकर निष्फल करें।
    2. 0.22 μm माइक्रोसेंट्रिफ्यूज फ़िल्टर ट्यूबों का उपयोग करके कमरे के तापमान पर पृथक सतह पर तैरनेवाला के 1 मिलीलीटर फ़िल्टर करें जब तक कि पूरे सतह पर तैरनेवाला प्रवाह न हो जाए।
    3. 3 मिनट के लिए 100 एक्स जी पर 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में प्रोटीन ए एगरोज मोती के गोली 150-200 μL और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। फिर, प्रोटीन ए मोती को सेल संस्कृति माध्यम के 150-200 μL के साथ धो लें और सेंट्रीफ्यूजेशन दोहराएं। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    4. चरण 3.2.3 से तैयार सतह पर तैरनेवालों के 1 मिलीलीटर के साथ संतुलित प्रोटीन ए मोती को फिर से निलंबित करें। और 1 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में लोड करें। पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब को रोटरी मिक्सर (15 मिमी कक्षा) में चिपकाएं और कमरे के तापमान पर 60-90 मिनट के लिए 30 आरपीएम पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्पिन करें।
    5. इनक्यूबेशन पूरा होने के बाद, प्रवाह-थ्रू इकट्ठा करें और किसी भी अनबाउंड प्रोटीन को हटाने के लिए 1 एक्स पीबीएस के 1 एमएल के साथ मोतियों को धो लें। धोने के अंश को भी इकट्ठा करें।
    6. पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम में 3 एमएल क्षालन बफर जोड़कर प्रोटीन ए मोती से एल्यूट आईजीजी। अनुक्रमिक अंशों को इकट्ठा करें जो कॉलम (500 μL प्रत्येक) से लेबल ट्यूबों में निकलते हैं।
    7. वैकल्पिक: यदि शुद्ध एंटीबॉडी को संग्रहीत किया जाना है, तो 1 एम ट्रिस पीएच 9.5 के 25 μL जोड़कर क्षालन बफर को बेअसर करें। इस चरण को छोड़ दें यदि एंटीबॉडी को बफर एक्सचेंज आदि के माध्यम से तुरंत संसाधित किया जाएगा।
      नोट: शुद्धिकरण के सभी हिस्सों (प्रवाह के माध्यम से, धोने, और सभी क्षालन अंश) यह सुनिश्चित करने के लिए रखा जाना चाहिए कि लक्ष्य प्रोटीन खो नहीं गया है। शुद्धिकरण सफल नहीं होने पर ये नमूने समस्या निवारण के दौरान भी मदद कर सकते हैं।
    8. डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए पहले क्षालन (क्षालन ए) का उपयोग करें लेकिन अन्य सभी अंशों को भविष्य में आवश्यक होना चाहिए।

4. बफर विनिमय और नमूना एकाग्रता

  1. 1x पीबीएस के साथ विनिमय आईजीजी क्षालन बफर।
    1. 3 केडीए आणविक भार कटऑफ केन्द्रापसारक पर क्षालन ए लोड करें। उपयुक्त एमडब्ल्यूसीओ कॉलम का चयन करते समय निर्माता की मार्गदर्शिका देखें। इस प्रयोग में, एक छोटा छिद्र आकार स्रावित प्रोटीन के अधिकतम प्रतिधारण को सुनिश्चित करता है लेकिन सेंट्रीफ्यूजेशन समय को भी बढ़ाता है।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 40-50 मिनट के लिए 13,300 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र। अवशिष्ट मात्रा 50 μL के बराबर या उससे कम होने के बाद सेंट्रीफ्यूजेशन पूरा हो जाता है।
    3. प्रवाह के माध्यम से त्यागें और अवशिष्ट सतह पर तैरनेवाला पतला करने के लिए पूर्वचिल्ड (4 डिग्री सेल्सियस) 1 एक्स पीबीएस के 500 μL जोड़ें। अवशिष्ट सतह पर तैरनेवाला रहता है के 50 μL रहता है जब तक एक ही शर्तों (4 डिग्री सेल्सियस पर 40-50 मिनट के लिए 13,300 x g) का उपयोग कर नमूना फिर से अपकेंद्रित्र।
    4. अवशिष्ट सतह पर तैरनेवाला पतला करने के लिए प्रीचिल्ड (4 डिग्री सेल्सियस) 1 एक्स पीबीएस के 500 μL जोड़ें और सतह पर तैरनेवाला के 100x कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए फिर से सेंट्रीफ्यूजेशन प्रक्रिया को दोहराएं।
    5. ~ 2.5 ग्राम की अंतिम एकाग्रता के लिए सतह पर तैरनेवाला ध्यान केंद्रित करें · ग्लाइकन विश्लेषण विधि के साथ संगतता सुनिश्चित करने के लिए 40 μL या उससे कम में एल -1 ।
      नोट: ग्लाइकन विश्लेषण के लिए 100 μg लोड किया जाना चाहिए।
      स्टॉपिंग पॉइंट: केंद्रित आईजीजी (1 एक्स पीबीएस में) को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और ग्लाइकन विश्लेषण से पहले पिघलाया जा सकता है।

5. ग्लाइकन विश्लेषण

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके ग्लाइकन विश्लेषण करें।
    1. चुंबकीय मनका समाधान के 200 μL को 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें और सतह पर तैरनेवाला से मोती को अलग करने के लिए चुंबकीय स्टैंड पर रखें।
    2. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला निकालें और चुंबकीय स्टैंड से ट्यूबों को हटा दें। पूर्ण मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए शुद्ध प्रोटीन नमूना और भंवर जोड़ें।
    3. नमूना ट्यूब के लिए विकृतीकरण बफर (आपूर्ति) जोड़ें और 60 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए सेते हैं। इष्टतम प्रतिक्रिया प्रदर्शन के लिए नमूना ट्यूबों को खुला रखें।
    4. पीएनजीएसई एफ (नमूना प्रति 500 इकाइयां) जोड़ें और शुद्ध एंटीबॉडी से ग्लाइकन को क्लीव करने के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
    5. एन-ग्लाइकन की रिहाई के बाद, नमूना ट्यूब और भंवर बंद करें। एसीटोनिट्राइल, भंवर जोड़ें, और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    6. समाधान से मोती को अलग करने के लिए चुंबकीय स्टैंड में नमूना ट्यूब रखें। ध्यान से मोती को छूने के बिना सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें।
    7. एक धूआं हुड में, नमूने में फ्लोरोफोर युक्त ग्लाइकन लेबलिंग समाधान जोड़ें। भंवर पर्याप्त मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए और 20 मिनट (खुले ढक्कन) के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    8. अतिरिक्त डाई को हटाने के लिए एसिटोनिट्राइल में नमूना 3 एक्स धो लें। फिर, डीडीआई पानी (आपूर्ति) में लेबल किए गए ग्लाइकन को हटा दें।
    9. शुद्ध और लेबल ग्लाइकन युक्त सतह पर तैरनेवाला से मोती अलग करने के लिए चुंबकीय स्टैंड में नमूना ट्यूब रखें।
    10. ग्लूकोज सीढ़ी मानक, ब्रैकेटिंग मानकों और नमूनों को निर्दिष्ट ट्रे पदों में तैयार करें और लोड करें। ग्लाइकन विश्लेषण प्रोटोकॉल चलाएँ।
    11. नमूने में मौजूद ग्लाइकन का विश्लेषण और पहचान करने के लिए उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि गर्मी ब्लॉक में तापमान कुशल इनक्यूबेशन के लिए सटीक है।

6. पश्चिमी धब्बा

  1. एंटी-α -1,6-फ्यूकोसिलट्रांसफेरेज़ एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग करके नॉकडाउन दक्षता की मात्रा निर्धारित करें। पॉलीक्रिलामाइड जैल और बफर व्यंजनों वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं38,39 से उपलब्ध हैं।
    1. अभिकर्मक के बाद 48 घंटे पर, एक हेमोसाइटोमीटर या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती करें और 5 x 106 कोशिकाओं के बराबर सेल निलंबन की मात्रा निर्धारित करें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 13,200 एक्स जी पर एक बाँझ 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब और गोली के लिए प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति से सेल निलंबन की उचित मात्रा हस्तांतरण। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    3. लाइसिस बफर (स्तनधारी कोशिकाओं से प्रोटीन के निष्कर्षण के लिए उपयुक्त) के 200 μL के साथ कोशिकाओं को लाइसे करें जिसमें 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1% वी / इनक्यूबेशन (50 आरपीएम, 16 मिमी कक्षा) के दौरान मिश्रण को धीरे से हिलाएं।
    4. सेलुलर मलबे को हटाने के लिए, 10 मिनट के लिए 13,200 एक्स जी पर लाइसेट को अपकेंद्रित्र करें और फिर साफ़ किए गए लाइसेट को बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. 280 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके प्रत्येक लाइसेट की प्रोटीन एकाग्रता को मापें। इसके बाद, एक ही प्रोटीन एकाग्रता रखने के लिए समायोजित प्रत्येक नमूने के विभाज्य तैयार करें।
    6. डीटीटी-एसडीएस नमूना लोडिंग डाई में 10-15 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन द्वारा प्रोटीन नमूनों को विकृत करें; अंतिम डाई एकाग्रता 1x है।
    7. कुशल जुदाई के लिए 12.5% समाधान जेल के साथ एक एसडीएस-पेज जेल में विकृत नमूनों के 15 μL और प्रीस्टेन प्रोटीन सीढ़ी के 5 μL लोड करें। 90 मिनट के लिए जेल प्रति 25 एमए पर नमूने चलाएं या जब तक डाई फ्रंट जेल के अंत तक नहीं पहुंच जाता।
    8. ध्यान से कैसेट से जेल को हटा दें और मेथनॉल युक्त 1 एक्स ट्रांसफर बफर में सेते हैं।
    9. गीला हस्तांतरण प्रणाली तैयार करें और मेथनॉल के साथ एक पीवीडीएफ झिल्ली को सक्रिय करें। गीले हस्तांतरण के लिए जेल और पीवीडीएफ झिल्ली को इकट्ठा करें, स्थानांतरण टैंक में एक बर्फ ब्लॉक रखें, और हस्तांतरण की स्थिति को ठंडा रखने के लिए पूरे टैंक को बर्फ में डुबो दें। 60 मिनट के लिए 350 एमए / 100 वी पर चलाएं।
    10. 50 आरपीएम (16 मिमी कक्षा) पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर धीरे-धीरे मिलाते हुए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक अवरुद्ध समाधान में इनक्यूबेट करके झिल्ली को अवरुद्ध करें।
    11. 5 मिनट के लिए बाँझ पानी के साथ झिल्ली कुल्ला और दोहराने। फिर, एक गाइड के रूप में दृश्यमान प्रोटीन सीढ़ी का उपयोग करके ~ 50 केडीए पर क्षैतिज रूप से झिल्ली को सावधानीपूर्वक काटने के लिए एक साफ स्केलपेल का उपयोग करें।
    12. एंटीबॉडी पतला बफर में 1:1000 पर एंटी-α-1,6-फ्यूकोसिलट्रांसफेरेज़ एंटीबॉडी के साथ 50 केडीए से अधिक प्रोटीन को आश्रय देने वाली झिल्ली सेते हैं। पतला बफर में 1: 10,000 पर एंटी-जीएपीडीएच के साथ 50 केडीए से कम स्थिर प्रोटीन के साथ झिल्ली सेते हैं। झिल्ली को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ऊष्मायन किया जा सकता है।
    13. 5 मिनट (x3) के लिए झिल्ली धो लें और फिर कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए एक उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं।
    14. 5 मिनट के लिए एक धोने बफर के साथ 3x धोया प्रदर्शन, पानी के साथ 3x धोने के बाद। फिर, एक क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट (या उचित पहचान अभिकर्मक) के साथ झिल्ली विकसित करें जब तक कि बैंड दिखाई न दें (1-60 मिनट)।
    15. झिल्ली 2x पानी के साथ कुल्ला, और फिर इसे सूखने के लिए अनुमति दें। झिल्ली की एक छवि पर कब्जा और घनत्वमितीय विश्लेषण40 प्रदर्शन।
    16. प्रत्येक नमूने में सापेक्ष प्रोटीन अभिव्यक्ति की गणना करने के लिए, पहले नमूनों में जीएपीडीएच सिग्नल के अनुपात की गणना करें। यह प्रत्येक नमूने के लिए सामान्यीकरण कारक है जो नमूना लोडिंग में विसंगतियों के लिए सही है।
      Equation 1
    17. रिश्तेदार एफयूटी 8 प्रोटीन अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए संबंधित लेन के सामान्यीकरण कारक द्वारा एफयूटी 8 सिग्नल तीव्रता (प्रत्येक लेन के लिए) को विभाजित करें।
      Equation 2

Representative Results

पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ने तीन फुट 8 डीएसआईआरएनए निर्माणों के मिश्रण से संक्रमित कोशिकाओं में कम एफयूटी 8 प्रोटीन अभिव्यक्ति दिखाई। गैर-लक्षित डीएसआईआरएनए से संक्रमित नियंत्रण नमूनों में, एफयूटी 8 ~ 65 और 70 केडीए पर डबल बैंड के रूप में दिखाई दिया। चूंकि एफयूटी 8 का अनुमानित आणविक भार 66 केडीए है, इसलिए कम आणविक भार बैंड की सिग्नल तीव्रता में कमी जीन साइलेंसिंग का संकेत है। जीन साइलेंसिंग की पुष्टि और मात्रा निर्धारित करने के लिए, एफयूटी 8 प्रोटीन का स्तर सापेक्ष जीएपीडीएच प्रोटीन स्तर तक सामान्यीकृत किया गया था। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ने ~ 37 और 35 केडीए पर जीएपीडीएच के लिए दो बैंड का पता लगाया। उच्च आणविक भार बैंड अनुमानित प्रोटीन आकार से मेल खाता है और इसलिए, सामान्यीकरण गणना में उपयोग किया जाता है। जब जीएपीडीएच प्रोटीन के स्तर के खिलाफ सामान्यीकृत किया जाता है, तो एफयूटी 8 प्रोटीन अभिव्यक्ति 60% (चित्रा 1) तक कम हो गई थी।

अभिकर्मक के बाद 48 घंटे में जीन नॉकडाउन के अवलोकन के अनुरूप, सीजीई- एलआईएफ द्वारा विश्लेषण के लिए संबंधित एमएबी नमूनों को संसाधित किया गया था। नॉकडाउन कोशिकाओं से ग्लाइकन संरचनाओं ने फ्यूकोसिलेशन में कमी देखी। यह प्रवृत्ति अगालेक्टोसिलेटेड संरचनाओं (जी 0 एफ) में सबसे अधिक स्पष्ट थी और गैलेक्टोसिलेटेड संरचनाओं (जी 1 एफ, जी 1 एफ ' और जी 2 एफ) में कुछ हद तक देखी गई थी। इस डेटासेट से, कुल आईजीजी कोर फ्यूकोसिलेशन ~ 75% तक कम हो गया, नकारात्मक नियंत्रण स्थिति (चित्रा 2) के लिए मनाया ~ 95% कोर फ्यूकोसिलेशन से नीचे। एफयूटी 8 प्रोटीन के स्तर में ~ 60% की कमी को देखते हुए कोर फ्यूकोसिलेशन में अधिक कमी का अनुमान लगाया गया था। प्रतिबिंब पर, यह उल्लेखनीय है कि ग्लाइकोप्रोफाइल ग्लाइकोसिलेटेड एमएबीएस का प्रतिनिधित्व करता है जो अभिकर्मक के बाद से 48 घंटे की अवधि में जमा होता है, जबकि जीन साइलेंसिंग केवल कटाई के समय मौजूद प्रोटीन के स्तर का प्रतिनिधित्व करता है।

इस नॉकडाउन विधि की आगे की जांच में डीएसआईआरएनए एकाग्रता, फसल के समय और इलेक्ट्रोपोरेशन स्थितियों को अलग करना शामिल था। प्रत्येक कारक की प्रासंगिकता निर्धारित करने के लिए व्यक्तिगत रूप से जांच की गई थी। कोर फ्यूकोसिलेशन और सेल व्यवहार्यता पर इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स स्थितियों का प्रभाव प्रयोग बी, सी, डी और ई में कब्जा कर लिया गया है। ये परिणाम सेल व्यवहार्यता (तालिका 2) में महत्वपूर्ण अंतर के बिना, एक एकल वर्ग तरंग पल्स (प्रयोग बी) की तुलना में दो वर्ग तरंग दालों (प्रयोग सी) का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेशन से कोर फ्यूकोसिलेशन में दो गुना कमी प्रदर्शित करते हैं। इलेक्ट्रोपोरेशन स्थिति ई 3 (प्रयोग डी) ने इस समय बिंदु पर सबसे कम सेल व्यवहार्यता (~ 90%) और आईजीजी उपज का नेतृत्व किया। हालांकि, इलेक्ट्रोपोरेशन घटना से बचने वाली कोशिकाएं मामूली रूप से ट्रांसफेक्टेड थीं, जैसा कि कोर फ्यूकोसिलेशन (तालिका 2) में ~ 10% की कमी से स्पष्ट है। दिलचस्प बात यह है कि प्रयोग डी ने इलेक्ट्रोपोरेशन स्थितियों का उपयोग किया जो कोर फ्यूकोसिलेशन (14.7%) में सबसे बड़ी कमी प्रदान करते थे, लेकिन स्पष्ट रूप से सेल व्यवहार्यता (91% -93% व्यवहार्यता) के लिए हानिकारक थे। प्रयोगों का यह सीमित सेट इलेक्ट्रोपोरेशन सेटिंग्स को निर्धारित करने की आवश्यकता को दर्शाता है जो अपरिवर्तनीय क्षति के बिना कोशिका झिल्ली के पर्याप्त पारगम्यता को सक्षम करता है। कोर फ्यूकोसिलेशन पर एसआईआरएनए एकाग्रता और फसल के समय की भूमिका को नोट करना भी दिलचस्प है। कुल मिलाकर, बढ़ती सिरना एकाग्रता का फसल के समय (प्रयोग बी, एफ, जी बनाम प्रयोग ए, बी, एच) की तुलना में कोर फ्यूकोसिलेशन पर अधिक प्रभाव पड़ता है। भविष्य के प्रयोगों में, इलेक्ट्रोपोरेशन विधि ई 2 द्वारा वितरित एसआईआरएनए सांद्रता को टाइट्रेट करना दिलचस्प होगा।

Figure 1
चित्र 1. प्रायोगिक प्रवाह चार्ट। ग्लाइकोइंजीनियरिंग और नमूना विश्लेषण चरणों को प्रत्येक चरण के लिए आवश्यक संबंधित समय के साथ दर्शाया गया है। जीन लक्ष्य या प्रति जीन लक्ष्य निर्माण की संख्या के आधार पर एसआईआरएनए डिजाइन में कुछ घंटे लगते हैं। सीआरएनए के साथ सीएचओ सेल अभिकर्मक कुछ घंटों में पूरा हो जाता है, और परिवर्तित कोशिकाओं को 48 घंटे तक बढ़ने के लिए छोड़ दिया जाता है। सेल छर्रों और सतह पर तैरनेवालों को कुछ घंटों के भीतर काटा जाता है। सेल छर्रों को लाइज़ किया जाता है, और इंट्रासेल्युलर प्रोटीन को एसडीएस पेज पर अलग किया जाता है और बाद में लक्ष्य जीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ धब्बा और जांच की जाती है। ग्लाइकन को शुद्ध एंटीबॉडी से क्लीव किया जाता है और सीजीई-एलआईएफ द्वारा विश्लेषण किया जाता है। इन परखों को प्रत्येक 1 दिन की आवश्यकता हो सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2. आरएनए हस्तक्षेप की पुष्टि। "एफयूटी 8 या गैर-लक्षित नियंत्रण डीएसआईआरएनए के साथ इलाज किए गए नमूनों में α-1,6-फ्यूकोसिलट्रांसफेरेज़ (एफयूटी 8) प्रोटीन के स्तर का पश्चिमी धब्बा पता लगाना"." एफयूटी 8 के अनुरूप बैंड एफयूटी 8 नॉकडाउन नमूनों की तुलना में नियंत्रण में अधिक तीव्र हैं। लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति को सामान्य करने के लिए जीएपीडीएच प्रोटीन स्तर का भी मूल्यांकन किया गया था। सभी नमूने प्रयोग जी से लिए गए थे (तालिका 2 देखें)। कोटिडिस एट अल से पुनर्मुद्रित। 52. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3. "48 घंटे में संचयी आईजीजी ग्लाइकोसिलेशन पर फट 8 नॉकडाउन का प्रभाव"। नॉकडाउन नमूनों में ग्लाइकन वितरण में बदलाव का पता चला है। विशेष रूप से, मुख्य कोर-फ्यूकोसिलेटेड संरचनाओं (जी 0 एफ) की सापेक्ष बहुतायत कम हो जाती है जबकि नॉकडाउन प्रयोग में एफुकोसिलेटेड प्रजातियों को बढ़ाया जाता है। प्रयोग जी नमूनों से माप किए गए थे (तालिका 2 देखें)। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के बोझ को कम करने के लिए कटाई के बाद प्रत्येक प्रयोग के लिए किए गए जैविक ट्रिप्लिकेट्स को मिलाया गया था। कोटिडिस एट अल से पुनर्मुद्रित। 52. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रयोग का नाम इलेक्ट्रोपोरेशन विधि डीएसआईआरएनए एकाग्रता (एनΜ) फसल का समय (ज) व्यवहार्यता (%) एक्सवी (106 कोशिकाओं ·एमएल -1) आईजीजी टिटर (मिलीग्राम · एल -1) कोर-फ्यूकोसिलेशन में अंतर (%)
ExpA_Negative ई 1 500 24 98.3 4.71 122.5 -
ExpA_Knockdown ई 1 500 24 98.3 4.9 110.3 4.08
ExpB_Negative ई 1 500 48 95.6 9.55 453.3 -
ExpB_Knockdown ई 1 500 48 96.7 9.61 469 5.38
ExpC_Negative ई 2 500 48 96.3 9.91 449.3 -
ExpC_Knockdown ई 2 500 48 96.7 11 454.6 11.42
ExpD_Negative ई 3 500 48 90.6 6.25 318.5 -
ExpD_Knockdown ई 3 500 48 89.1 6.09 311.85 9.71
ExpE_Negative ई 4 500 48 91.1 7.2 380.3 -
ExpE_Knockdown ई 4 500 48 93.3 7.79 422.8 14.7
ExpF_Negative ई 1 750 48 96.2 9.7 501 -
ExpF_Knockdown ई 1 750 48 95.7 9.76 504.6 9.9
ExpG_Negative ई 1 1000 48 96.1 11.1 422.6 -
ExpG_Knockdown ई 1 1000 48 95.9 9.73 499.3 17.26
ExpH_Negative ई 1 500 72 94.4 14.3 925.8 -
ExpH_Knockdown ई 1 500 72 95 13.5 1018.4 7.37

तालिका 2. अभिकर्मक अनुकूलन। इलेक्ट्रोपोरेशन विधि, डीएसआईआरएनए एकाग्रता और फसल के समय के पुनरावृत्ति संशोधनों ने सेल व्यवहार्यता, व्यवहार्य सेल घनत्व, फसल के समय आईजीजी टिटर और कोर फ्यूकोसिलेशन में अंतर में परिवर्तन किया। प्रत्येक प्रयोग ने नॉकडाउन और संबंधित नकारात्मक नियंत्रण की तुलना यह निर्धारित करने के लिए की कि क्या संशोधन वांछित प्रभाव पैदा करता है (यानी, फ्यूकोसिलेशन में कमी)। इलेक्ट्रोपोरेशन सेटिंग्स निम्नानुसार थीं: ई 1: 1200 वी, 0.1 एमएस, वर्ग तरंग; ई 2: 1200 वी, 2x 0.1 एमएस, दालों के बीच 5 एस, वर्ग तरंग; ई 3: 150 वी, 20 एमएस, वर्ग तरंग; ई 4: 250 वी, 500 μF, घातीय क्षय। कोटिडिस एट अल से पुनर्मुद्रित। 52.

Discussion

ग्लाइकोसिलेशन मार्गों में एंजाइमों और सहायक प्रोटीन का एक जटिल चयापचय नेटवर्क शामिल है। मार्ग घटकों के कार्य को विच्छेदन करना चुनौतीपूर्ण है यदि पारंपरिक नॉकआउट या अकेले आनुवंशिक इंजीनियरिंग रणनीतियों पर निर्भर है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रारंभिक रूप से एक क्षणिक हानि-ऑफ-फ़ंक्शन परख का उपयोग करके एक मार्ग के सदस्यों को स्क्रीन करना है। इस अंत में, ग्लाइकोसिलेशन जीन को चिह्नित करने के लिए एक अधिक कुशल तरीका बनाने के लिए दो रैपिड प्रोटोकॉल, आरएनएआई और सीजीई-एलआईएफ डिटेक्शन को जोड़ा गया था। वर्णित विधि को पारंपरिक तरीकों की तुलना में पूरा होने के लिए 5-7 दिनों की आवश्यकता होती है जो संभावित रूप से पूरा होने में कई सप्ताह लगते हैं। इसके अलावा, स्वचालन क्षमताओं के साथ अनुसंधान वातावरण मैनुअल हैंडलिंग के साथ संभव से अधिक जीन उम्मीदवारों को स्क्रीन करने के लिए इस पद्धति का फायदा उठा सकता है।

एक क्षणिक ग्लाइकोइंजीनियरिंग अभियान की सफलता काफी हद तक सीआरएनए डिजाइन पर निर्भर है। कस्टम DsiRNA डिज़ाइन को पहले उल्लिखित नियमों का पालन करना चाहिए, या आसानी के लिए, उपयोगकर्ता व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूर्व डिज़ाइन किए गए अनुक्रमों का विकल्प चुन सकते हैं। अन्य जीन संशोधन रणनीतियों की तरह, आरएनएआई में ऑफ-टारगेट प्रभावों की क्षमता है। इसलिए, उपयोगकर्ताओं को कम्प्यूटेशनल विधियों द्वारा अनजाने जीन लक्ष्यीकरण का आकलन करने के लिए प्रोत्साहितकिया जाता है 41. प्रायोगिक डिजाइन विकल्प ऑफ-टारगेट प्रभावों को सीमित करने में भी मदद कर सकते हैं। किटलर एट अल से पता चला है कि एसआईआरएनए की मल्टीप्लेक्स डिलीवरी ने ऑफ-टारगेट प्रभाव42 में कमी का नेतृत्व किया। यद्यपि यह प्रतिकूल लगता है, यह सुझाव दिया जाता है कि एक मास्टर मिश्रण प्रत्येक सिरना निर्माण की एकाग्रता को कम करता है, इस प्रकार ऑफ-टारगेट जीन साइलेंसिंग के अवसर को सीमित करता है। एक और लाभ यह है कि एक ही जीन को लक्षित करने वाली एसआईआरएनए संरचनाओं का एक साथ अभिकर्मक सफल आरएनएआई की संभावना को बढ़ाता है। एक मास्टर मिश्रण का उपयोग नमूनों और प्रतिकृतियों के बीच स्थिरता भी सुनिश्चित करता है और अभिकर्मक प्रक्रिया को गति देता है। मिश्रित एसआईआरएनए निर्माणों की प्रारंभिक स्क्रीन के बाद, प्रत्येक अनुक्रम की आरएनएआई दक्षता का पता लगाने के लिए व्यक्तिगत निर्माणों का उपयोग करके एक और प्रयोग किया जा सकता है। इस और अन्य नॉकडाउन अध्ययनों में, तीन एसआईआरएनए को पूल किया गया है औरकोशिकाओं 43,44,45 तक पहुंचाया गया है। हालांकि, एक जीन को कुशलतापूर्वक लक्षित करने या कई जीनों को लक्षित करने के लिए एक साथ तीन से अधिक एसआईआरएनए को स्क्रीन करना वांछनीय हो सकता है। दरअसल, एक अध्ययन ने व्यक्तिगत जीन46 के चुप्पी के बराबर स्तर पर छह जीनों तक के मल्टीप्लेक्स सिआरएनए-मध्यस्थता चुप्पी का प्रदर्शन किया। हालांकि, सिआरएनए निर्माणों की अधिकतम संख्या निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है जिनका उपयोग साइलेंसिंग दक्षता से समझौता किए बिना पूल में किया जा सकता है। मल्टीप्लेक्स रणनीति मार्टिन एट अल द्वारा प्रस्तावित की गई थी आरएनएआई लाइब्रेरी स्क्रीनिंग प्रयोगों46 की गति को बढ़ाने के लिए, और इसी तरह की अवधारणा ग्लाइकोसिलेशन जीन को स्क्रीन करने के लिए उपयोगी साबित हो सकती है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल इस उम्मीद के साथ एक सबूत-अवधारणा के रूप में कार्य करता है कि बाद के प्रयोगों को अन्य ग्लाइकोसिलेशन जीन को मान्य करने के लिए किया जाएगा। ब्याज के नए जीन Fut8 की तुलना में अनिर्दिष्ट या कम लोकप्रिय हो सकते हैं, और जीन साइलेंसिंग का पता लगाने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी खराब या अनुपलब्ध हो सकते हैं। इस परिदृश्य में, आरटी-पीसीआर जैसे वैकल्पिक तरीकों का उपयोग जीन साइलेंसिंग47 को मापने के लिए किया जा सकता है, लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आरटी-पीसीआर प्रोटीन के बजाय एमआरएनए का पता लगाता है। जब पश्चिमी सोख्ता के लिए एंटीबॉडी उपलब्ध होते हैं, तो एक सामान्य मुद्दा खराब पहचान या गैर-विशिष्ट बैंड की उपस्थिति है। उपयोगकर्ताओं को सामान्य समस्याओं को हल करने में मदद करने के लिए समस्या निवारण मार्गदर्शिकाएँ उपलब्ध हैं, और इनमें प्राथमिक एंटीबॉडी अनुमापन, वैकल्पिक अवरुद्ध और पता लगाने की स्थिति48,49 जैसे समाधानों की एक श्रृंखला शामिल है। इस अध्ययन में, एफयूटी 8 अप्रत्याशित रूप से ~ 65 और ~ 70 केडीए पर डबल बैंड के रूप में दिखाई दिया। यह संभव है कि ~ 70 केडीए बैंड ग्लाइकोसिलेटेड एफयूटी 8 का प्रतिनिधित्व करता है। मानव कोशिका रेखाओं से साहित्य साक्ष्य थ्र 56450,51 पर ओ-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन का वर्णन करता है, एक साइट जो चीनी हैम्स्टर में संरक्षित है, और सीएचओ के 1 एफयूटी 8 अनुक्रम।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, ग्लाइकोसिलेशन मार्गों में अक्सर एंजाइमों की एक जटिल सरणी शामिल होती है। वर्तमान प्रोटोकॉल को Fut8 द्वारा नियंत्रित मोनोजेनिक ग्लाइकोसिलेशन प्रतिक्रिया का उपयोग करके विकसित, अनुकूलित और प्रदर्शित किया गया है। इसलिए, इस पद्धति की मजबूती की पुष्टि करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता होती है जब लक्ष्य जीन वैकल्पिक कैनेटीक्स और अभिव्यक्ति के स्तर के साथ एक एंजाइम को एन्कोड करता है या अनावश्यक कार्यों के साथ आइसोएंजाइम द्वारा विनियमित मार्ग होता है।

एक साथ लिया गया, जीन को तेजी से चुप कराने और संशोधित आईजीजी ग्लाइकोप्रोफाइल्स का पता लगाने की क्षमता कस्टम ग्लाइकोइंजिनियर एंटीबॉडी के प्रयास में एक उपयोगी उपकरण है। इसी तरह के अल्पकालिक अध्ययनों से अंतर्दृष्टि को फेड-बैच संस्कृति जैसे दीर्घकालिक परखों में उपयोग के लिए स्थिर ग्लाइकोइंजिनियर कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए लागू किया जा सकता है। दवा संदर्भ के बाहर, यह विधि ग्लाइकन जीव विज्ञान के अध्ययन में योगदान देती है और विकास, स्वास्थ्य और बीमारी में ग्लाइकन के महत्वपूर्ण कार्य पर प्रकाश डालती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

पीके ने अपनी छात्रवृत्ति के लिए इंपीरियल कॉलेज लंदन के केमिकल इंजीनियरिंग विभाग को धन्यवाद दिया। आरएंडडी ने अपनी छात्रवृत्ति के लिए यूके बायोटेक्नोलॉजी एंड बायोलॉजिकल साइंसेज रिसर्च काउंसिल को धन्यवाद दिया। एमएम यूके जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (अनुदान संदर्भ: बीबी / आईएजी आयरिश अनुसंधान परिषद (छात्रवृत्ति सं। जीओआईपीजी/2017/1049) और कोनासाइट (छात्रवृत्ति संख्या 438330)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32 Karat software SCIEX contact manufacturer Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method.
Acetonitrile, HPLC grade Sigma Aldrich 34851 Solvent.
Anti-FUT8 antibody AbCam ab198741 Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene.
Anti-GAPDH antibody AbCam ab181602 Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user.
BioDrop Spectrophotometer Biochrom 80 3006 55 Instrument used to quantify protein concentration.
BLItz ForteBio 45 5000 Instrument. Label-Free Protein Analysis System.
BRAND Haemocytometer Sigma Alrich BR717810 Counting chamber device
Capillary cartridge SCIEX A55625 Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 µm outer diameter (o.d), x 50 µm inner diameter (i.d).
C100HT Glycan analysis—capillary electrophoresis SCIEX contact manufacturer Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used.
CD CHO Medium Thermo Fisher Scientific 10743029 Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice.
Centrifuge tubes, 15 mL Greiner Bio 188261 Sterile polypropylene tube.
Centrifuge tubes, 50 mL Greiner Bio 227270 Sterile polypropylene tube.
CHO IgG MedImmune Gift Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190144 1x PBS, without calcium or magnesium.
Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL Corning 431143 Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.
Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL Corning 431144 Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.
Fast Glycan Labelling and Analysis kit SCIEX B94499PTO Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS.
Fut8 DsiRNA IDT Custom Custom designed DsiRNA targetting Fut8.
Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm Bio-Rad 1652088 Electroporation cuvette.
Gene Pulser Xcell Eukaryotic System Bio-Rad 165 2661 Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod.
Immobilon-FL PVDF  membrane Merck-Millipore IPFL00010 Immunoblot transfer membrane, low background.
L-Methionine sulfoximine (MSX) Sigma Aldrich M5379 Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system.
Kimwipes Thermo Fisher Scientific 10623111 Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent Thermo Fisher Scientific 78505 Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate.
Methanol, HPLC grade Fisher Scientific 10365710 Solvent.
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 616201 Autoclavable tubes.
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system Bio-Rad 1658035FC Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply.
NC-Slide A8 ChemoMetec 942 0003 8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250.
Negative Control DsiRNA, 5 nmol IDT 51 01 14 04 Non-targeting DsiRNA.
Nuclease-free duplex buffer IDT 11-01-03-01 Reconstitution buffer for DsiRNA.
NucleoCounter NC-250 Chemometec contact manufacturer Instrument. Automated Cell Analyzer
Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa Thermo Fisher Scientific 26616 Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting.
PCR tubes Greiner Bio 608281 Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation.
Pipette filter tips sterilised  (10, 200, 1000 µL) Gibson F171203, F171503, F171703 Sterile filter tips to avoid RNA contamination.
PNGase F enzyme New England Biolabs P0704S Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins.
Polypropylene columns, 1 mL Qiagen 34924 Columns for gravity-flow chromatography.
Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich P8340 Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases
Protein-A Agarose Beads Merck-Millipore 16 125 For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins.
Protein-A biosensor ForteBio 18 5010 Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification.
RNaseZap Invitrogen AM9780 Removes RNAse contamination.
Sample dilutent ForteBio 18 1104 Activate Protein A tips.
Serological pipets (5, 10, 25 mL) Corning 4487, 4488, 4489 Used for sterile cell culture tecniques.
Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF Sigma Aldrich 296813 Reducing agent.
Solution 18 ChemoMetec 910-3018 Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)
Spin-X Centrifuge Tube Filters Corning 8161  0.22 µm pore, Cellulose Acetate membrane.
Suspension plate with lid, 6-well Greiner Bio 657 185 Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures.
Syringe filters,  0.22 μm Sartorius 514 7011 Surfactant-free cellulose acetate (SFCA)
Syringes with Luer lock tip, 20 mL Fisher Scientific 10569215 For secure connection with syringe filter.
Trypan Blue solution Gibco 15250061 Stains dead and dying cells.
Vivaspin 500, 3,000 MWCO Sartorius VS0191 Polyethersulfone
WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit Thermo Fisher Scientific WB7105 Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online.

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बायोइंजीनियरिंग अंक 184
चीनी हैम्स्टर अंडाशय कोशिकाओं में रैपिड एंटीबॉडी ग्लाइकोइंजीनियरिंग
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Marbiah, M., Kotidis, P., Donini,… More

Marbiah, M., Kotidis, P., Donini, R., Gómez, I. A., Jimenez del Val, I., Haslam, S. M., Polizzi, K. M., Kontoravdi, C. Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells. J. Vis. Exp. (184), e63872, doi:10.3791/63872 (2022).

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