Summary
يحدد نمط الجليكوزيل للجسم المضاد أدائه السريري ، وبالتالي تستمر الجهود الصناعية والأكاديمية للسيطرة على الجليكوزيل. نظرا لأن حملات هندسة الجليكوزين النموذجية تتطلب وقتا طويلا وعمالة ، فإن إنشاء بروتوكول سريع لتوصيف تأثير جينات الجليكوزيل باستخدام إسكات عابر سيكون مفيدا.
Abstract
تربط الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المؤتلفة أهدافا جزيئية محددة ، وبالتالي تحفز استجابة مناعية أو تمنع ربط الأربطة الأخرى. ومع ذلك ، قد يتم تقليل وظائف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة وعمر النصف حسب نوع وتوزيع الجليكوسيل الخاص بالمضيف. ألهمت محاولات إنتاج أجسام مضادة متفوقة تطوير خلايا منتجة معدلة وراثيا تقوم بتوليف الأجسام المضادة المحسنة للجليكو. تتطلب هندسة الجليكوغرافيا عادة توليد خط خلية بالضربة القاضية أو الضربة القاضية المستقرة باستخدام طرق مثل البروتين 9 المرتبط باليندروميك القصير المتجمع بانتظام (CRISPR). ثم يتم وصف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تنتجها الخلايا الهندسية باستخدام طرق الطيف الكتلي لتحديد ما إذا كان قد تم الحصول على الجليكوبروفايل المطلوب. هذه الاستراتيجية تستغرق وقتا طويلا ، وتحديا تقنيا ، وتتطلب متخصصين. لذلك ، فإن الاستراتيجية البديلة التي تستخدم بروتوكولات مبسطة للهندسة الوراثية للجليكو والكشف عن الجليكان قد تساعد في المساعي نحو الأجسام المضادة المثلى. في دراسة إثبات المفهوم هذه ، كانت خلية مبيض الهامستر الصينية المنتجة ل IgG بمثابة مضيف مثالي لتحسين هندسة الجليكو. تم تسليم الحمض النووي الريبي قصير التداخل الذي يستهدف جين Fut8 إلى خلايا مبيض الهامستر الصيني ، وتم تحديد التغيرات الناتجة في تعبير بروتين FUT8. تشير النتائج إلى أن ضربة قاضية بهذه الطريقة كانت فعالة ، مما أدى إلى انخفاض بنسبة 60٪ تقريبا في FUT8. تم إجراء تحليل تكميلي لجليكو الجسم المضاد باستخدام تقنية سريعة ولكنها حساسة للغاية: الرحلان الكهربائي الهلامي الشعري والكشف عن التألق الناجم عن الليزر. أظهرت جميع تجارب الضربة القاضية زيادة في الجليكان الأفوكوسيلي. ومع ذلك ، فإن أكبر تحول تحقق في هذه الدراسة كان ~ 20 ٪. يبسط هذا البروتوكول جهود هندسة السكر من خلال تسخير أدوات تصميم سيليكو ، وكواشف استهداف الجينات المركبة تجاريا ، واختبارات القياس الكمي السريع التي لا تتطلب خبرة سابقة واسعة. على هذا النحو ، قد تساعد الكفاءة الزمنية التي يوفرها هذا البروتوكول في التحقيقات في أهداف الجينات الجديدة.
Introduction
الغليكوزيل المرتبط ب N هو عملية إنزيمية ترتبط من خلالها موليغوساكاريد موي تساهميا ببقايا Asn. على عكس تخليق البروتين دي نوفو ، فإن تخليق الجليكان هو تفاعل غير قالب يؤدي إلى غليكوزيل غير متجانس للبروتينات. يمكن أن يؤثر هيكل وتكوين وتوزيع الجليكان على تكوين البروتين ووظيفته. في الواقع ، ينظم N-glycosylation في منطقة الشظية القابلة للتبلور (Fc) من الغلوبولين المناعي G (IgG) الفعالية العلاجية والمناعة ونصف عمر الجسم المضاد1. على هذا النحو ، فإن نموذج الجودة حسب التصميم (QbD) لتطوير منتجات البروتين العلاجي الحيوي المؤتلف يحدد بشكل طبيعي الجليكوزيل كسمة جودة حرجة (CQA) 2,3. غالبا ما تكون خلايا الثدييات هي أنظمة التعبير المفضلة لأنها تنتج بطبيعتها أنماط غليكوزيل تشبه الإنسان بشكل أوثق من البكتيريا أو الخميرة أو الحشرات أو الخلايا النباتية. علاوة على ذلك ، يتم اختيار خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) على خطوط خلايا الثدييات الأخرى لأنها مقاومة للعدوى الفيروسية البشرية ، وتفرز المنتجات في عيارات عالية ، ويمكن زراعتها في ثقافة التعليق إلى كثافات خلايا عالية قابلة للحياة4. وفيما يتعلق بتكوين الجليكان، تولد خلايا إنتاج الفئران غير التابعة ل CHO جليكانات مناعية المنشأ (α (1-3) مرتبطة بالجالاكتوز [α(1-3)-Gal] وحمض N-glycolylneuraminic [NeuGc]) الذي يؤثر على الاستخدام الآمن للأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs)5. هذه الفوائد تجعل خلايا CHO نظام التعبير الأول ، المسؤول عن إنتاج أكثر من 80٪ من biotherapeutics الجديدة بين عامي 2014 و 20186. ومع ذلك ، فإن الجليكوزيل المستقل عن القالب هو آلية محفوظة تؤدي إلى biotherapeutics المشتقة من CHO مع مجموعة من glycoforms.
تهدف استراتيجيات تطوير العلاج الحيوي إلى التحكم في عدم التجانس في خلايا CHO عن طريق الهندسة الوراثية. تشمل بعض الأمثلة الأدبية ضربة قاضية من السياليداس (Neu1 ، Neu3)7 ، الناتج المحلي الإجمالي - مانوز 4،6-ديهيدراتاز (GMD) بالضربة القاضية8 ، والإفراط في التعبير عن الجليكوسيل ترانسفيراز (GnTIII)9. التقدم في هندسة السكر ممكن بسبب مزيج من الموارد المتاحة للجمهور، مثل جينوم CHO10، والتطوير المستمر لأدوات الهندسة الوراثية، مثل نوكلياز المستجيب الشبيه بمنشط النسخ (TALENs)، ونوكلياز إصبع الزنك (ZFNs)، والتكرارات الباليندرومية القصيرة المجمعة بانتظام (كريسبر) المرتبطة بالبروتين 9 (كريسبر-كاس9)11،12،13،14 . عادة ما يتم تسليم هذه الأدوات إلى خلايا CHO كحمض نووي بلازميد أو كمجمعات بروتين ريبي نووي منقى (RNP). وعلى العكس من ذلك، فإن تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) هو تقنية هندسة وراثية لا تتطلب في أبسط أشكالها سوى تسليم أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي الريبي قصيرة التداخل (siRNA). تقوم البروتينات الداخلية بمعالجة siRNA المزدوج الخيوط في خيوط مفردة ، ويشكل النوكليز ، مركب إسكات الحمض النووي الريبي الناجم عن الحمض النووي الريبي (RISC) ، معقدا مع siRNA لشق تسلسلات mRNA المستهدفة15,16,17. يعد إسكات الجينات عبر هذه الطريقة عابرا بسبب عدم استقرار الحمض النووي الريبي ، لكن التحقيق هنا يستفيد من هذه الميزة للمساعدة في الفحص السريع.
ينتج الإنزيم النموذجي المختار للدراسة الحالية ، α1,6-fucosyltransferase (FUT8) ، N-glycans مع α-1,6 L-fucose المرتبط بالنواة (Fuc). هذا التعديل هو المحدد الرئيسي لنشاط السمية الخلوية للخلايا المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC) ، كما يتضح من دراسات الأجسام المضادة التجارية. في حالة عدم وجود fucosylation الأساسية ، Rituximab (anti-CD20 IgG1) يزيد من ADCC 50 ضعفا ويزيد ADCC في Trastuzumab (anti-Her2 IgG1) من خلال تحسين ربط FcgRIIIa18,19. وبالتالي ، يعتبر الفوكوسيل الأساسي سمة غير مرغوب فيها من mAbs التي تستدعي بذل جهود لعكس هذا النمط الظاهري. هناك أمثلة على استهداف جين Fut8 الناجح باستخدام siRNA مع الزيادات المصاحبة في ADCC20,21,22 ، على الرغم من أن هذه الأمثلة تقدم Fut8 siRNA المشفرة على الحمض النووي للبلازميد. تولد مثل هذه التجارب إسكات جينيا مستقرا حيث يعمل الحمض النووي البلازميد كقالب لتخليق siRNA. هذا يسمح للخلايا بتجديد جزيئات siRNA التي تتحلل بواسطة RNases داخل الخلايا والفوسفاتيز. وعلى العكس من ذلك، فإن تسليم الحمض النووي الريبوزي المرسال الاصطناعي الخارجي لا يسمح إلا بإسكات الجينات العابرة حيث لا يمكن تجديد الحمض النووي الريبوزي المرسال بسبب عدم وجود قالب داخل الخلايا. وبالتالي ، يجب على المستخدمين النظر فيما إذا كانت التصاميم التجريبية متوافقة مع siRNA المشتق من البلازميد أو الاصطناعي. على سبيل المثال ، قد تختار الدراسات التي تركز على ذروة إنتاج mAb ، عادة في اليوم السادس من الثقافة 23,24 ، siRNA الاصطناعية التي يمكن تسليمها إلى الخلايا قبل بضعة أيام من ذروة التعبير. تشمل فوائد النهج العابر باستخدام siRNA الاصطناعي القدرة على الاستعانة بمصادر خارجية للإنتاج وحقيقة أنه يمكن إنشاء تركيبات siRNA متعددة في جزء صغير من الوقت المستغرق لتوليد التركيبات في البلازميدات. علاوة على ذلك ، فإن siRNA الاصطناعي فعال ، كما يتضح من الأمثلة الأدبية لإسكات جين Fut8 الذي يكفي لتقليل تعبير بروتين FUT825 وإنتاج IgGs afucosylated مع زيادة ربط FCgRIIIa و ADCC26.
تم تحديد نجاح بروتوكول glycoengineering هذا من خلال درجة غليكوزيل Fc. عادة ما يكون قياس الطيف الكتلي هو الطريقة المفضلة لتحليلات الغليكوميك. ومع ذلك ، فإن الرحلان الكهربائي الهلامي الشعري والكشف عن التألق الناجم عن الليزر (CGE-LIF) قابل تماما لحل ملف تعريف الجليكوبروفايل ل IgGs المنقى ولديه ميزة السرعة والبساطة الأكبر. يجب أن تجمع بروتوكولات قياس الطيف الكتلي بين طرق الكروماتوغرافيا والاشتقاق المناسبة ومصادر التأين وأجهزة تحليل الكتلة27،28،29. بالإضافة إلى الحاجة إلى أخصائي مدرب ، فإن بروتوكولات قياس الطيف الكتلي طويلة ، وتنوع الأساليب يجعل من الصعب مقارنة البيانات بين المختبرات ذات الإعدادات المختلفة. في سياق المستحضرات الصيدلانية الحيوية ، تعد CGE-LIF طريقة حساسة يمكن أن توفر تفاصيل كافية عن جليكو الأجسام المضادة ويمكن تطويرها بسهولة للطرق عالية الإنتاجية. بالنسبة للوفرة المنخفضة ، والمخاليط المعقدة للغاية مع البروتينات السكرية سيئة الوصف ، قد تظل مزايا قياس الطيف الكتلي. ومع ذلك ، فإن تحليلات mAb عالية الدقة وعالية الحساسية التي يوفرها تحليل N-glycan القائم على CGE-LIF بمثابة الأساس المنطقي لتجربة هذه الطريقة. علاوة على ذلك ، يتم الانتهاء من إعداد العينات وتحليلها في غضون ساعات قليلة30. أظهرت الدراسات الحديثة أنه يمكن استخدام CGE-LIF لمراقبة الجليكان المشتقة من البلازما البشرية31 والفأر32 و CHO IgGs33. تسلط هذه الدراسات الضوء على استخدام CGE-LIF لتحليل العينات عالية الإنتاجية وأحجام العينات الصغيرة.
وتنطوي طريقة CGE-LIF على قيود ينبغي أخذها في الاعتبار. التكلفة هي حاجز كبير أمام استخدام هذا الجهاز وغيره من الأجهزة لتحليل الجليكان. ومع ذلك، فإن هذه التكاليف نموذجية في الميدان، ويعتقد أن CGE-LIF هو الخيار34 الفعال من حيث التكلفة. قد تجد المختبرات ذات الميزانيات الأصغر أنه من العملي استئجار الآلات أو الاستعانة بمصادر خارجية لتحليل العينات. اعتبار آخر لأي طريقة تحليلية هو التكرار. وأجري تقييم ل CGE-LIF باستخدام 48 نسخة طبق الأصل من نفس العينة التي تم فحصها في أيام مختلفة. تم تحديد الانحراف المعياري النسبي لكل شعيرة شعرية للتكرار داخل الدفعات وبين الدفعات. وجد أن المقارنة بين الدفعات من النسخ المتماثلة لها انحراف معياري نسبي بنسبة 6.2٪ ، مما يشير إلى أن الأداء الشعري ليس موحدا. علاوة على ذلك ، أظهرت مقارنة البيانات بين الدفعات انحرافا معياريا نسبيا بنسبة 15.8٪ 31 ، مما يشير إلى أن الأداء الشعري يتغير بمرور الوقت. وقد لا تنطبق أوجه القصور التشغيلية المحددة في الدراسة الحالية، التي تستخدم آلات مختلفة وكواشف مسجلة الملكية. إذا كان المستخدمون يعتزمون تطوير بروتوكول داخلي ، فسيكون من المفيد النظر في الدراسة التي أجراها Ruhaak et al. 31 ، الذي قيم بعناية الكواشف الخاصة ب CGE-LIF. على هذا النحو ، تم تحسين كواشف حقن العينات (Hi-Di Formamide و DMSO) ، ووضع العلامات على الجليكان (NaBH3CN أو 2-picoline borane)31 ، وغيرها.
تقدم هذه الدراسة بروتوكول هندسة جليكوهندسية فعال من حيث الوقت يجمع بين سرعة الحمض النووي الريبي المباشر وتحليل الغليكوميك في المراحل النهائية. يتم توضيح المنهجية باستخدام جين Fut8 كهدف للأسباب الموضحة أعلاه.
Protocol
1. تصميم DsiRNA وإعادة تشكيله
- استخدم Safari أو Firefox أو Microsoft Edge للوصول إلى موقع IDT على الويب (https://eu.idtdna.com). من الصفحة الرئيسية، حدد علامة التبويب المنتجات والخدمات متبوعة بتداخل الحمض النووي الريبي. لإنشاء ركائز ديكر مخصصة (DsiRNA) تستهدف جين Fut8 ، حدد أداة التصميم متبوعة بعلامة التبويب إنشاء DsiRNA مخصص .
- أدخل رقم انضمام Fut8 أو أدخل التسلسل الجيني يدويا للبدء. في هذه الدراسة ، تم الحصول على تسلسلات Fut8 المقترحة من كل من إدخالات "CHO-K1" و "الهامستر الصيني" من https://chogenome.org واستخدامها لإنشاء DsiRNA. تحتوي معظم الجينات على العديد من متغيرات النسخ ، ومن المهم التحقق من أن DsiRNA سيكون نشطا على جميع المتغيرات المبلغ عنها في التجميع الحالي.
- حدد خيار إجراء بحث "انفجار يدوي" لأن جينوم خلية CHO غير متوفر حاليا ك "جينوم مرجعي" على موقع IDT على الويب. تبحث هذه الخطوة عن التطابقات بين تسلسلات DsiRNA المخصصة والجينوم محل الاهتمام.
- انقر فوق بحث لإنشاء تسلسلات DsiRNA.
- في المقابل ، قم بتقييم خصوصية كل DsiRNA باستخدام وظيفة "Manual BLAST" مع معرف الضريبة: 10029 (خطوط خلايا CHO والهامستر الصيني). تشير نتائج تغطية الاستعلام إلى أن DsiRNA يبني مطابقة Fut8 (بما في ذلك متغيرات نص Fut8) بنسبة 100٪ ، في حين أن التكامل ضد الأهداف غير المقصودة هو ≤76٪ 35.
- تحقق من أن DsiRNA يستهدف Fut8 على وجه التحديد لضمان أن محتوى GC يتراوح بين 30٪ و 50٪. يرتبط محتوى GC المنخفض بربط ضعيف وغير محدد ، في حين أن محتوى GC العالي يمنع siRNA من التفكك والتحميل في مجمع RISC36.
- حدد ثلاثة DsiRNA لاستخدامها في دراسات النقل (الجدول 1) ، كل منها يستهدف موقعا مختلفا لجين Fut8 . قم بشراء DsiRNA غير مستهدف أو مخلوط مصمم مسبقا من IDT لتجارب التحكم.
- عند الوصول ، قم بالطرد المركزي ل DsiRNA عند 13300 × g لمدة 1 دقيقة للحبيبات قبل فتح الأنبوب. أعد تشكيل كل DsiRNA مجفف بالتجميد في مخزن مؤقت مزدوج خال من النوكليز (مقدم من IDT) إلى حل مخزون 100 ميكرومتر. على سبيل المثال، أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت إلى 2 نانومول من DsiRNA للحصول على مخزون 100 ميكرومتر.
- لضمان الخلط الكافي، احتضن محاليل المخزون في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أثناء الاهتزاز بلطف على الاهتزاز المداري (50 دورة في الدقيقة، مدار 16 مم).
- قم بإنشاء مزيج رئيسي من خلال الجمع بين 20 ميكرولتر من كل بنية DsiRNA تستهدف Fut8 (100 ميكرومتر من كل DsiRNA). تحضير الأليكوتات وتخزينها في -20 درجة مئوية.
| هدف DsiRNA | تسلسل | GC (٪) | ||
| الهيكل أ | 5' غاغاواغاواغاأكاكاوك 3' | 36% | ||
| 5' غغواووغاكوو | ||||
| الهيكل باء | 5' أغاوغاوغوغووكت 3' | 32% | ||
| 5' أغااا | ||||
| الهيكل جيم | 5' أغاغاواغاأكاجاكوكاواك 3' | 32% | ||
| 5' غواووغاكووكو أوكووكوغ 3' | ||||
الجدول 1. تسلسلات DsiRNA المستخدمة في ضربة قاضية Fut8. التسلسلات التي تم إنشاؤها بواسطة IDT والتي تستهدف Fut8 في جينومات خلايا الهامستر الصينية و CHO K1. يتم عرض تسلسلات الحس ومضاد الإحساس لكل بنية (على التوالي) ، ويتم عرض محتوى GC لكل هيكل. أعيد طبعها من كوتيديس وآخرون. 52.
2. نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال
- إحياء خلايا CHO التي تعبر عن جسم مضاد أحادي النسيلة IgG37 باستخدام ظروف الثقافة المناسبة لخط اهتمام الخلية.
ملاحظة: تم إنشاء الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة باستخدام نظام سينثيتاز الجلوتامين (GS) ، حيث يتم تثبيط GS الداخلي بواسطة L-methionine sulfoximine (MSX) لتعزيز اختيار الحيوانات المستنسخة النادرة عالية الإنتاج. لذلك، استخدم MSX فقط إذا كان ذلك مطلوبا من قبل خط الخلية من اختيار.- قم بإذابة قارورة من الخلايا لمدة 2-3 دقائق في حمام مائي مضبوط على 37 درجة مئوية. نظف الجزء الخارجي من القارورة باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪ (v / v) واستمر في جميع الأعمال في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.
- انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 9 مل من الوسط المسخن مسبقا المناسب لخط الخلية الذي تختاره. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 100 × غرام لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة الوسط بعناية والتخلص منه دون إزعاج حبيبات الخلية. ثم ، أعد تعليق بيليه الخلية في 10 مل من الوسط المسخن مسبقا وخذ أليكوت للعد.
- قم بتلطيخ الخلايا باللون الأزرق المثقبي عند العد باستخدام مقياس الدم ، أو بقعة مناسبة للتمييز بين الخلايا الحية / الميتة عند استخدام عداد الخلايا الآلي.
- باتباع أي من طريقتي التعداد ، انقل حجما مناسبا من تعليق الخلية إلى قارورة مخفوق Erlenmeyer سعة 125 مل بكثافة خلية قابلة للحياة تبلغ 3 × 105 خلايا·mL-1 في 30 مل من الوسط (مع مكملات اختيارية تبلغ 50 ميكرومتر MSX).
- انقل الخلايا إلى حاضنة تم ضبطها على 36.5 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ووضعها على منصة تهتز عند 150 دورة في الدقيقة (مدار 16 مم).
- خلايا المرور كل 3-4 أيام بكثافة بذر 2 × 105 خلايا·mL-1 وحجم عمل 50 مل في قارورة اهتزاز Erlenmeyer 250 مل. في حالة استخدام MSX، توقف عن تناول المكملات الغذائية بعد المقطع الأول.
- خلايا المرور 2x بالإضافة إلى الذوبان.
- النقل
- تقييم كثافة الخلية والتأكد من بقاء الخلية أكبر من 90٪.
- قم بتنظيف خزانة السلامة الأحيائية وجميع المعدات بعناية باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪ (v / v) ومحلول مثبط RNase لتجنب التلوث.
- خلايا الكريات عند 100 × جم لمدة 5 دقائق وإعادة تعليقها في وسط مسخن مسبقا إلى كثافة خلية قابلة للحياة تبلغ 5 × 106 خلايا·mL-1.
- انقل 8 ميكرولتر (أي ما يعادل 1 ميكرومتر) من المزيج الرئيسي ل DsiRNA أو عنصر التحكم إلى كوفيت كهربائي معقم (0.4 سم). ثم ، انقل 800 ميكرولتر من تعليق الخلية (أي ما يعادل 4 × 106 خلايا) إلى نفس الكوفيت وتأكد من خلط كلا المكونين.
- قم بتوصيل ظروف النبض التالية: 1200 فولت ، 0.1 مللي ثانية ، الشكل الموجي المربع.
- انقل تعليق الخلية من الكوفيت إلى بئر واحد من لوحة من 6 آبار ، مع الحرص على تجنب المواد الشبيهة بالرغوة. استعادة الخلايا في الحاضنة (36.5 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2) دون اهتزاز لمدة 10 دقائق.
- أضف 800 ميكرولتر من الوسائط المسببة للاحترار المسبق لجعل الحجم النهائي 1.6 مل لكل بئر وإعادة الخلايا المنقولة إلى الحاضنة للنمو (36.5 درجة مئوية ، 5٪ CO2) أثناء الاهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة (مدار 16 مم).
- حصاد supernatants والخلايا في 48 ساعة بعد النقل.
نقطة التوقف: يمكن الاحتفاظ ب supernatant زراعة الخلايا عند -20 درجة مئوية ؛ ومع ذلك ، فمن المستحسن أن يتم إجراء تحلل الخلايا مباشرة بعد جمع حبيبات الخلايا لتجنب تدهور البروتين. يتم استخدام Supernatants في الخطوة 3 والخطوة 4 والخطوة 5 ، بينما يتم استخدام كريات الخلايا في الخطوة 6.
3. IgG القياس الكمي والتنقية
- قم بقياس تركيز IgG باستخدام قياس تداخل الطبقة الحيوية أو طريقة أخرى من اختيارك.
- بروتين الترطيب نصائح المستشعر الحيوي في عينة مخففة لمدة 10-30 دقيقة. في غضون ذلك ، قم بنقل معلقات الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل وخلايا بيليه عند 100 × g لمدة 5 دقائق أو إزالة الخلايا عن طريق الترشيح من خلال مرشح نيتروسليلوز 0.45 ميكرومتر.
- دون إزعاج الكريات ، انقل بعناية المادة الفائقة المعزولة التي تحتوي على IgG إلى أنبوب طرد مركزي نظيف.
- استخدم الإعدادات التالية لقياس تداخل الطبقة الحيوية: سرعة الاهتزاز ، 2200 دورة في الدقيقة ؛ وقت التشغيل ، 60 ثانية. سيتم استخدام هذه المعلمات لقياس جميع العينات والضوابط.
- بمجرد ترطيب أطراف المستشعر الحيوي ، قم بإنشاء منحنى قياسي باستخدام معيار IgG (4 ميكرولتر من كل تركيز).
- قياس تركيزات العينة عن طريق تحميل 4 ميكرولتر من الخلية الفائقة. نظف الجهاز باستخدام مناديل خالية من الوبر بين كل عينة.
- ربط المنحنى القياسي بالعينات غير المعروفة لاستبانة معدل ربط العينات غير المعروفة. احفظ البيانات وقم بتصديرها كملف csv أو PDF.
- تنقية IgG
- تحضير المخزن المؤقت للإزالة الذي يحتوي على 0.2 مليون جليسين (الرقم الهيدروجيني 2.5) والتعقيم عن طريق المرور عبر مرشح 0.22 ميكرومتر.
- قم بتصفية 1 مل من المادة الفائقة المعزولة في درجة حرارة الغرفة باستخدام أنابيب مرشح أجهزة الطرد المركزي الدقيقة 0.22 ميكرومتر حتى يتدفق السوبرنات بأكمله.
- بيليه 150-200 ميكرولتر من البروتين حبات الأغاروز في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل في 100 × غرام لمدة 3 دقائق والتخلص من supernatant. ثم ، اغسل حبات البروتين A مع 150-200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا وكرر الطرد المركزي. تخلص من السوبرناتانت.
- أعد تعليق حبات البروتين A المتوازنة مع 1 مل من المواد الفائقة المحضرة من الخطوة 3.2.3. وتحميلها في أنبوب البولي بروبلين 1 مل. قم بتثبيت أنبوب البولي بروبيلين على خلاط دوار (مدار 15 مم) وتدور عند 30 دورة في الدقيقة لمدة 60-90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
- بعد اكتمال الحضانة ، اجمع التدفق واغسل الخرز ب 1 مل من 1x PBS لإزالة أي بروتينات غير مقيدة. جمع جزء الغسيل كذلك.
- Elute IgG من البروتين A الخرز عن طريق إضافة 3 مل من العازلة للتخليق إلى عمود البولي بروبلين. اجمع الكسور المتسلسلة التي تستنزف من العمود (500 ميكرولتر لكل منها) في أنابيب مسماة.
- اختياري: إذا كان سيتم تخزين الجسم المضاد النقي ، فقم بتحييد المخزن المؤقت للإزالة عن طريق إضافة 25 ميكرولتر من 1 M Tris pH 9.5. تخطي هذه الخطوة إذا كان سيتم معالجة الجسم المضاد على الفور عبر تبادل المخزن المؤقت ، إلخ.
ملاحظة: يجب الاحتفاظ بجميع أجزاء التنقية (التدفق من خلال ، والغسيل ، وجميع كسور الاستخراج) لضمان عدم فقدان البروتين المستهدف. يمكن أن تساعد هذه العينات أيضا أثناء استكشاف الأخطاء وإصلاحها إذا لم تنجح عملية التنقية. - استخدم الإزالة الأولى (elution A) للمعالجة النهائية ولكن احتفظ بجميع الكسور الأخرى إذا كانت مطلوبة في المستقبل.
4. تبادل المخزن المؤقت وتركيز العينة
- تبادل المخزن المؤقت IgG elution مع 1x PBS.
- تحميل الاستخلاص A على 3 كيلو دالتون الجزيئي الوزن القاطع الطرد المركزي المركز. ارجع إلى دليل الشركة المصنعة عند تحديد عمود MWCO مناسب. في هذه التجربة ، يضمن حجم المسام الأصغر أقصى قدر من الاحتفاظ بالبروتين المفرز ولكنه يزيد أيضا من وقت الطرد المركزي.
- جهاز طرد مركزي عند 13,300 × g لمدة 40-50 دقيقة عند 4 درجات مئوية. يكتمل الطرد المركزي بمجرد أن يكون الحجم المتبقي مساويا أو أقل من 50 ميكرولتر.
- تخلص من التدفق وأضف 500 ميكرولتر من 1x PBS المبرد مسبقا (4 درجات مئوية) لتخفيف الفائض المتبقي. قم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى باستخدام نفس الظروف (13,300 × g لمدة 40-50 دقيقة عند 4 درجات مئوية) حتى تبقى 50 ميكرولتر من المواد الفائقة المتبقية.
- أضف 500 ميكرولتر من 1x PBS المبرد مسبقا (4 درجات مئوية) لتخفيف المادة الفائقة المتبقية وكرر عملية الطرد المركزي مرة أخرى للحصول على تخفيف 100x للجهاز الفائق.
- ركز السوبرناتانت على تركيز نهائي ~ 2.5 جم· L-1 في 40 ميكرولتر أو أقل لضمان التوافق مع طريقة تحليل الجليكان.
ملاحظة: يجب تحميل 100 ميكروغرام لتحليل الجليكان.
نقطة التوقف: يمكن تخزين IgG المركز (في 1x PBS) عند -20 درجة مئوية وإذابته قبل تحليل الجليكان.
5. تحليل الجليكان
- قم بإجراء تحليل الجليكان باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي الشعري وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- انقل 200 ميكرولتر من محلول الخرز المغناطيسي إلى أنبوب PCR سعة 0.2 مل وضعه على الحامل المغناطيسي لفصل الخرز عن السوبرناتانت.
- قم بإزالة supernatant بعناية وإزالة الأنابيب من الحامل المغناطيسي. أضف عينة البروتين النقية والدوامة لضمان الخلط الكامل.
- أضف المخزن المؤقت للتمسخ (المرفق) إلى أنبوب العينة واحتضنه لمدة 8 دقائق عند 60 درجة مئوية. حافظ على أنابيب العينة مفتوحة للحصول على أفضل أداء للتفاعل.
- أضف PNGase F (500 وحدة لكل عينة) واحتضنه لمدة 20 دقيقة عند 60 درجة مئوية لشق الجليكان من الأجسام المضادة النقية.
- بعد إطلاق N-glycans ، أغلق أنبوب العينة والدوامة. يضاف الأسيتونيتريل والدوامة ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
- ضع أنابيب العينة في الحامل المغناطيسي لفصل الخرز عن المحلول. استخدم ماصة لإزالة supernatant بعناية دون لمس الخرز.
- في غطاء الدخان ، أضف محلول وضع العلامات على الجليكان الذي يحتوي على فلوروفور إلى العينة. دوامة لضمان خلط كاف واحتضان في 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة (أغطية مفتوحة).
- اغسل العينة 3x في الأسيتونيتريل لإزالة الصبغة الزائدة. ثم ، قم بالتخلص من الجليكان المسمى في ماء DDI (المورد).
- ضع أنبوب العينة في الحامل المغناطيسي لفصل الخرز عن السوبرناتانت الذي يحتوي على جليكان منقى وملصق.
- قم بإعداد وتحميل معيار سلم الجلوكوز ومعايير الأقواس والعينات في مواضع الدرج المحددة. قم بتشغيل بروتوكول تحليل الجليكان.
- استخدم البرامج المناسبة لتحليل وتحديد الجليكان الموجود في العينة.
ملاحظة: تأكد من أن درجة الحرارة في كتلة الحرارة دقيقة للحضانة الفعالة.
6. لطخة غربية
- حدد كفاءة الضربة القاضية باستخدام تحليل اللطخة الغربية باستخدام جسم مضاد مضاد α-1,6-fucosyltransferase. تتوفر المواد الهلامية بولي أكريلاميد والوصفات العازلة من الموردين التجاريين38,39.
- في 48 ساعة بعد النقل ، عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي وحدد حجم تعليق الخلية بما يعادل 5 × 106 خلايا.
- انقل الحجم المناسب من تعليق الخلايا من كل حالة تجريبية إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 مل وحبيبات عند 13200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
- قم بتحليل الخلايا التي تحتوي على 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل (مناسب لاستخراج البروتينات من خلايا الثدييات) التي تحتوي على كوكتيل مثبط للأنزيم البروتيني v / v بنسبة 1٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. هز الخليط بلطف أثناء الحضانة (50 دورة في الدقيقة ، مدار 16 مم).
- لإزالة الحطام الخلوي، قم بالطرد المركزي للليزات عند 13200 × جم لمدة 10 دقائق ثم انقل المحلول الذي تم تطهيره إلى أنبوب معقم بسعة 1.5 مل.
- قم بقياس تركيز البروتين لكل ليسات باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند 280 نانومتر. بعد ذلك ، قم بإعداد الأليكوتات لكل عينة معدلة للحصول على نفس تركيز البروتين.
- تشويه عينات البروتين عن طريق الحضانة عند 100 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة في صبغة تحميل عينة DTT-SDS ؛ تركيز الصبغة النهائي هو 1x.
- قم بتحميل 15 ميكرولتر من العينات المشوهة و 5 ميكرولتر من سلم البروتين الملطخ مسبقا في جل SDS-PAGE مع جل حل بنسبة 12.5٪ للفصل الفعال. قم بتشغيل العينات بسرعة 25 مللي أمبير لكل جل لمدة 90 دقيقة أو حتى تصل جبهة الصبغة إلى نهاية الجل.
- قم بإزالة الجل بعناية من الكاسيت واحتضنه في مخزن مؤقت لنقل 1x يحتوي على الميثانول.
- قم بإعداد نظام النقل الرطب وتنشيط غشاء PVDF بالميثانول. قم بتجميع الجل وغشاء PVDF للنقل الرطب ، ووضع كتلة ثلج في خزان النقل ، وغمر الخزان بأكمله في الثلج لضمان بقاء ظروف النقل باردة. تشغيل في 350 مللي أمبير / 100 فولت لمدة 60 دقيقة.
- قم بسد الغشاء عن طريق الحضانة في محلول مانع لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أثناء الاهتزاز بلطف على الاهتزاز المداري عند 50 دورة في الدقيقة (مدار 16 مم).
- شطف الغشاء بالماء المعقم لمدة 5 دقائق وتكرار. ثم ، استخدم مشرطا نظيفا لقطع الغشاء بعناية أفقيا عند ~ 50 كيلو دال ، باستخدام سلم البروتين المرئي كدليل.
- احتضان الغشاء الذي يؤوي البروتينات التي تزيد عن 50 كيلو دال مع الجسم المضاد α-1,6-fucosyltransferase في 1:1000 في مخزن مؤقت مخفف للأجسام المضادة. احتضان الغشاء مع البروتينات المجمدة أقل من 50 كيلو دال مع مضاد GAPDH في 1: 10000 في المخزن المؤقت المخفف. يمكن تحضين الأغشية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
- اغسل الأغشية لمدة 5 دقائق (x3) ثم احتضنها بجسم مضاد ثانوي مناسب لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإجراء غسلات 3x باستخدام مخزن مؤقت للغسيل لمدة 5 دقائق ، تليها غسلات 3x بالماء. ثم ، قم بتطوير الغشاء باستخدام ركيزة كروموجينية (أو كاشف الكشف المناسب) حتى تظهر النطاقات (1-60 دقيقة).
- شطف الغشاء 2x بالماء ، ثم اتركه حتى يجف. التقاط صورة للغشاء وإجراء تحليل قياس الكثافة40.
- لحساب التعبير البروتيني النسبي في كل عينة، احسب أولا نسبة إشارة GAPDH في العينات. هذا هو عامل التطبيع لكل عينة الذي يصحح التناقضات في تحميل العينة.
- اقسم شدة إشارة FUT8 (لكل مسار) على عامل التطبيع للحارة المقابلة للحصول على تعبير بروتين FUT8 النسبي.
Representative Results
أظهر تحليل اللطخة الغربية انخفاض تعبير بروتين FUT8 في الخلايا المنقولة بمزيج من ثلاثة تركيبات Fut8 DsiRNA. في عينات التحكم المنقولة باستخدام DsiRNA غير المستهدفة ، ظهر FUT8 كنطاق مزدوج عند ~ 65 و 70 kDa. نظرا لأن الوزن الجزيئي المتوقع ل FUT8 هو 66 kDa ، فإن انخفاض كثافة الإشارة لنطاق الوزن الجزيئي المنخفض يدل على إسكات الجينات. لتأكيد وقياس إسكات الجينات ، تم تطبيع مستوى بروتين FUT8 إلى مستوى بروتين GAPDH النسبي. كشف تحليل اللطخة الغربية عن نطاقين ل GAPDH عند ~ 37 و 35 kDa. يتوافق نطاق الوزن الجزيئي الأعلى مع حجم البروتين المتوقع ، وبالتالي فهو يستخدم في حسابات التطبيع. عند تطبيعه ضد مستويات بروتين GAPDH ، تم تقليل تعبير بروتين FUT8 بنسبة تصل إلى 60٪ (الشكل 1).
تمشيا مع ملاحظة الضربة القاضية للجين عند 48 ساعة بعد النقل ، تمت معالجة عينات mAb المقابلة للتحليل من قبل CGE- LIF. أظهرت هياكل الجليكان من الخلايا القاضية انخفاضا في الفيوكسيلات. كان هذا الاتجاه أكثر وضوحا في هياكل agalactosylated (G0F) ولوحظ بدرجة أقل في الهياكل galactosylated (G1F و G1F و G2F). من مجموعة البيانات هذه ، انخفض إجمالي فوكوسيل IgG الأساسي إلى ~ 75٪ ، بانخفاض من ~ 95٪ من fucosylation الأساسية التي لوحظت لحالة التحكم السلبية (الشكل 2). كان من المتوقع حدوث انخفاض أكبر في الفوكوزيل الأساسي نظرا للانخفاض بنسبة 60٪ تقريبا في مستويات بروتين FUT8. عند التفكير ، من الجدير بالذكر أن glycoprofile يمثل mAbs الغليكوزيلاتي التي تراكمت على مدى فترة 48 ساعة منذ النقل ، في حين أن إسكات الجينات يمثل مستويات البروتين الموجودة في وقت الحصاد فقط.
تضمن مزيد من التدقيق في طريقة الضربة القاضية هذه تغيير تركيز DsiRNA ووقت الحصاد وظروف الكهربية. تم فحص كل عامل على حدة لتحديد أهميته. يتم التقاط تأثير ظروف نبض الكهربية على الفوكوسيل الأساسي وجدوى الخلية في التجارب B و C و D و E. وتظهر هذه النتائج انخفاضا بمقدار ضعفين في الفوكوسيل الأساسي من الكهربية باستخدام نبضتين موجيتين مربعتين (التجربة ج) مقارنة بنبضة موجة مربعة واحدة (التجربة ب)، دون وجود اختلافات كبيرة في صلاحية الخلية (الجدول 2). أدت حالة الكهربية e3 (التجربة D) إلى أدنى صلاحية للخلية (~ 90٪) وإنتاجية IgG في هذه المرحلة الزمنية. ومع ذلك ، تم نقل الخلايا التي نجت من حدث الكهربية بشكل معتدل ، كما يتضح من انخفاض ~ 10٪ في fucosylation الأساسية (الجدول 2). ومن المثير للاهتمام أن التجربة D استخدمت ظروف الكهربية التي وفرت أكبر انخفاض في الفوكوسيل الأساسي (14.7٪) ولكنها كانت ضارة بشكل واضح بصلاحية الخلية (91٪ -93٪ من قابلية البقاء). توضح هذه المجموعة المحدودة من التجارب الحاجة إلى تحديد إعدادات الكهربية التي تمكن من النفاذية الكافية لغشاء الخلية دون التسبب في ضرر لا رجعة فيه. ومن المثير للاهتمام أيضا أن نلاحظ دور تركيز siRNA ووقت الحصاد على fucosylation الأساسية. بشكل عام ، فإن زيادة تركيز SIRNA له تأثير أكبر على الفوكوسيل الأساسي من زيادة وقت الحصاد (التجارب B و F و G مقابل التجارب A و B و H). في التجارب المستقبلية ، سيكون من المثير للاهتمام معايرة تركيزات siRNA التي تقدمها طريقة الكهربية e2.
الشكل 1. مخطط التدفق التجريبي. يتم تصوير خطوات هندسة السكر وتحليل العينات مع الوقت المرتبط المطلوب لكل خطوة. يستغرق تصميم SiRNA بضع ساعات ، اعتمادا على عدد الأهداف الجينية أو التركيبات لكل هدف جيني. يكتمل نقل خلايا CHO مع siRNA في غضون ساعات قليلة ، وتترك الخلايا المحولة لتنمو لمدة 48 ساعة. يتم حصاد الكريات الخلوية و supernatants في غضون ساعات قليلة. يتم تحليل الكريات الخلوية ، ويتم فصل البروتينات داخل الخلايا على صفحة SDS وبعد ذلك يتم مسحها وفحصها بالأجسام المضادة ضد الجين المستهدف. يتم شق الجليكان من الأجسام المضادة النقية وتحليلها بواسطة CGE-LIF. قد تتطلب هذه الفحوصات 1 يوم لكل منهما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تأكيد تداخل الحمض النووي الريبي. الكشف الغربي عن بقع مستويات البروتين α-1,6-fucosyltransferase (FUT8) في العينات المعالجة باستخدام Fut8 أو DsiRNA للتحكم غير الاستهدافي. النطاقات المقابلة ل FUT8 أكثر كثافة في التحكم من عينات ضربة قاضية Fut8. كما تم تقييم مستوى بروتين GAPDH من أجل تطبيع التعبير الجيني المستهدف. وقد أخذت جميع العينات من التجربة زاي (انظر الجدول 2). أعيد طبعها من كوتيديس وآخرون. 52. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تأثير ضربة قاضية Fut8 على غليكوزيل IgG التراكمي عند 48 ساعة. تم الكشف عن تحول في توزيع الجليكان في عينات ضربة قاضية. على وجه الخصوص ، يتم تقليل الوفرة النسبية للهياكل الرئيسية الأساسية (G0F) بينما يتم زيادة الأنواع الأفوسيلية في تجربة الضربة القاضية. وأجريت القياسات من عينات التجربة G (انظر الجدول 2). تم خلط الثلاثية البيولوجية التي أجريت لكل تجربة بعد الحصاد لتقليل عبء التحليل النهائي. أعيد طبعها من كوتيديس وآخرون. 52. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم التجربة | طريقة الكهربية | تركيز الحمض النووي الريبوزي المرسال (nΜ) | وقت الحصاد (ح) | الجدوى (٪) | الخامس عشر (106 خلايا·مل-1) | عيار IgG (ملغ· L-1) | الفرق في قلب فوكوسيل (٪) | ||||||
| ExpA_Negative | ه1 | 500 | 24 | 98.3 | 4.71 | 122.5 | - | ||||||
| ExpA_Knockdown | ه1 | 500 | 24 | 98.3 | 4.9 | 110.3 | 4.08 | ||||||
| ExpB_Negative | ه1 | 500 | 48 | 95.6 | 9.55 | 453.3 | - | ||||||
| ExpB_Knockdown | ه1 | 500 | 48 | 96.7 | 9.61 | 469 | 5.38 | ||||||
| ExpC_Negative | ه2 | 500 | 48 | 96.3 | 9.91 | 449.3 | - | ||||||
| ExpC_Knockdown | ه2 | 500 | 48 | 96.7 | 11 | 454.6 | 11.42 | ||||||
| ExpD_Negative | ه3 | 500 | 48 | 90.6 | 6.25 | 318.5 | - | ||||||
| ExpD_Knockdown | ه3 | 500 | 48 | 89.1 | 6.09 | 311.85 | 9.71 | ||||||
| ExpE_Negative | ه٤ | 500 | 48 | 91.1 | 7.2 | 380.3 | - | ||||||
| ExpE_Knockdown | ه٤ | 500 | 48 | 93.3 | 7.79 | 422.8 | 14.7 | ||||||
| ExpF_Negative | ه1 | 750 | 48 | 96.2 | 9.7 | 501 | - | ||||||
| ExpF_Knockdown | ه1 | 750 | 48 | 95.7 | 9.76 | 504.6 | 9.9 | ||||||
| ExpG_Negative | ه1 | 1000 | 48 | 96.1 | 11.1 | 422.6 | - | ||||||
| ExpG_Knockdown | ه1 | 1000 | 48 | 95.9 | 9.73 | 499.3 | 17.26 | ||||||
| ExpH_Negative | ه1 | 500 | 72 | 94.4 | 14.3 | 925.8 | - | ||||||
| ExpH_Knockdown | ه1 | 500 | 72 | 95 | 13.5 | 1018.4 | 7.37 | ||||||
الجدول 2. تحسين النقل. أدت التعديلات التكرارية لطريقة الكهربية ، وتركيز DsiRNA ، ووقت الحصاد إلى تغييرات في صلاحية الخلية ، وكثافة الخلايا القابلة للحياة ، وعيار IgG في وقت الحصاد ، والاختلافات في fucosylation الأساسية. قارنت كل تجربة بين الضربة القاضية والتحكم السلبي المعني لتحديد ما إذا كان التعديل ينتج التأثير المطلوب (أي انخفاض في الفيكوزيلج). وكانت إعدادات الكهربية على النحو التالي: e1: 1200 فولت ، 0.1 مللي ثانية ، الشكل الموجي المربع. e2: 1200 فولت ، 2 × 0.1 مللي ثانية ، 5 ثانية بين النبضات ، الشكل الموجي المربع ؛ e3: 150 فولت ، 20 مللي ثانية ، الشكل الموجي المربع ؛ e4: 250 فولت ، 500 ميكروفهرنهايت ، الاضمحلال الأسي. أعيد طبعها من كوتيديس وآخرون. 52.
Discussion
تتضمن مسارات الغليكوزيل شبكة استقلابية معقدة من الإنزيمات والبروتينات الملحقة. إن تشريح وظيفة مكونات المسار أمر شاق إذا كان يعتمد على استراتيجيات الهندسة الوراثية التقليدية بالضربة القاضية أو الطرق السريعة وحدها. هناك نهج بديل يتمثل في الفحص الأولي لأعضاء المسار باستخدام فحص عابر لفقدان الوظيفة. وتحقيقا لهذه الغاية ، تم الجمع بين بروتوكولين سريعين ، وهما الكشف عن RNAi و CGE-LIF ، لإنشاء طريقة أكثر كفاءة لتوصيف جينات الغليكوزيل. تتطلب الطريقة الموصوفة 5-7 أيام لإكمالها مقارنة بالطرق التقليدية التي قد تستغرق عدة أسابيع لإكمالها. علاوة على ذلك ، يمكن لبيئات البحث ذات قدرات الأتمتة استغلال هذه الطريقة لفحص المزيد من الجينات المرشحة أكثر مما هو ممكن مع المعالجة اليدوية.
يعتمد نجاح حملة هندسة السكر العابرة إلى حد كبير على تصميم siRNA. يجب أن تتبع تصميمات DsiRNA المخصصة القواعد الموضحة مسبقا ، أو للسهولة ، يمكن للمستخدمين اختيار التسلسلات المصممة مسبقا المتاحة تجاريا. مثل استراتيجيات تعديل الجينات الأخرى ، فإن RNAi لديه القدرة على تأثيرات غير مستهدفة. لذلك ، يتم تشجيع المستخدمين على تقييم استهداف الجينات غير المقصود بالطرق الحسابية41. يمكن أن تساعد خيارات التصميم التجريبية أيضا في الحد من التأثيرات غير المستهدفة. أظهر Kittler et al. أن التسليم المتعدد الإرسال ل siRNA أدى إلى انخفاض في التأثيرات غير المستهدفة42. على الرغم من أن هذا يبدو غير بديهي ، إلا أنه يقترح أن المزيج الرئيسي يقلل من تركيز كل بنية siRNA ، مما يحد من فرصة إسكات الجينات خارج الهدف. فائدة أخرى هي أن النقل المتزامن لهياكل siRNA التي تستهدف نفس الجين يزيد من احتمال نجاح الحمض النووي الريبي. كما يضمن استخدام المزيج الرئيسي الاتساق بين العينات وتكرار عملية النقل وتسريعها. بعد فحص أولي لبنى siRNA المختلطة ، يمكن إجراء تجربة أخرى باستخدام تركيبات فردية للتأكد من كفاءة RNAi لكل تسلسل. في هذه الدراسة وغيرها من الدراسات القاضية ، تم تجميع ما يصل إلى ثلاثة siRNA وتسليمها إلى الخلايا43،44،45. ومع ذلك ، قد يكون من المستحسن فحص أكثر من ثلاثة siRNA في وقت واحد لاستهداف جين واحد بكفاءة أو لاستهداف العديد من الجينات. في الواقع، أظهرت إحدى الدراسات إسكات ما يصل إلى ستة جينات بوساطة الحمض النووي الريبوزي المرسال بمستويات مماثلة لإسكات الجينات الفردية46. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد الحد الأقصى لعدد هياكل siRNA التي يمكن استخدامها في تجمع دون المساس بكفاءة إسكات الصوت. تم اقتراح استراتيجية تعدد الإرسال من قبل مارتن وآخرون لتعزيز وتيرة تجارب فحص مكتبة RNAi46 ، وقد يكون مفهوم مماثل مفيدا لفحص جينات الغليكوزيل.
يعمل البروتوكول الموصوف هنا كدليل على المفهوم مع توقع إجراء تجارب لاحقة للتحقق من صحة جينات الجليكوزيل الأخرى. قد تكون الجينات الجديدة ذات الأهمية غير مميزة أو أقل شعبية من Fut8 ، وقد تكون الأجسام المضادة الأولية للكشف عن إسكات الجينات ضعيفة أو غير متوفرة. في هذا السيناريو ، يمكن استخدام طرق بديلة مثل RT-PCR لتحديد كمية إسكات الجينات47 ، ولكن تجدر الإشارة إلى أن RT-PCR يكتشف mRNA بدلا من البروتين. عندما تتوفر الأجسام المضادة للنشاف الغربي ، فإن المشكلة الشائعة هي ضعف الكشف أو وجود نطاقات غير محددة. تتوفر أدلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها لمساعدة المستخدمين على حل المشكلات الشائعة، وتميل إلى تضمين مجموعة من الحلول مثل معايرة الأجسام المضادة الأولية والحظر البديل وشروط الكشف48,49. في هذه الدراسة ، ظهر FUT8 بشكل غير متوقع كنطاق مزدوج عند ~ 65 و ~ 70 kDa. من الممكن أن يمثل النطاق ~ 70 kDa FUT8 الغليكوزيلي. تصف الأدلة الأدبية من خطوط الخلايا البشرية الجليكوزيل المرتبط ب O في Thr 564 50,51 ، وهو موقع محفوظ في الهامستر الصيني ، وتسلسلات CHO K1 FUT8.
كما ذكرنا سابقا ، غالبا ما تتضمن مسارات الجليكوزيل مجموعة معقدة من الإنزيمات. تم تطوير البروتوكول الحالي وتحسينه وإثباته باستخدام تفاعل جليكوزيل أحادي المنشأ يتم التحكم فيه بواسطة Fut8. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتأكيد متانة هذه الطريقة عندما يقوم الجين المستهدف بتشفير إنزيم بمستويات حركة وتعبير بديلة أو مسار تنظمه إيزوزيمات ذات وظائف زائدة عن الحاجة.
وإذا ما أخذنا ذلك في الحسبان، فإن القدرة على إسكات الجينات بسرعة والكشف عن الجليكوبروفايلات المعدلة من IgG هي أداة مفيدة في الجهود المبذولة نحو الأجسام المضادة المصممة خصيصا للجليكو. يمكن تطبيق رؤى من دراسات مماثلة قصيرة الأجل لتوليد خلايا مستقرة مصممة بالسكر لاستخدامها في الفحوصات طويلة الأجل مثل ثقافة الدفعات الغذائية. خارج السياق الصيدلاني ، تساهم هذه الطريقة في دراسة بيولوجيا الجليكان وتسلط الضوء على الوظيفة المهمة للجليكان في التنمية والصحة والمرض.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يشكر PK قسم الهندسة الكيميائية ، إمبريال كوليدج لندن ، على منحته الدراسية. يشكر RD مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية في المملكة المتحدة على طلابه. يتم تمويل MM من قبل مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية في المملكة المتحدة (مرجع المنحة: BB/S006206/1). IAG تشكر مجلس البحوث الأيرلندي (رقم المنحة. GOIPG/2017/1049) و CONACyT (منحة رقم 438330).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32 Karat software | SCIEX | contact manufacturer | Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method. |
| Acetonitrile, HPLC grade | Sigma Aldrich | 34851 | Solvent. |
| Anti-FUT8 antibody | AbCam | ab198741 | Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene. |
| Anti-GAPDH antibody | AbCam | ab181602 | Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user. |
| BioDrop Spectrophotometer | Biochrom | 80 3006 55 | Instrument used to quantify protein concentration. |
| BLItz | ForteBio | 45 5000 | Instrument. Label-Free Protein Analysis System. |
| BRAND Haemocytometer | Sigma Alrich | BR717810 | Counting chamber device |
| Capillary cartridge | SCIEX | A55625 | Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 µm outer diameter (o.d), x 50 µm inner diameter (i.d). |
| C100HT Glycan analysis—capillary electrophoresis | SCIEX | contact manufacturer | Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used. |
| CD CHO Medium | Thermo Fisher Scientific | 10743029 | Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice. |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Greiner Bio | 188261 | Sterile polypropylene tube. |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Greiner Bio | 227270 | Sterile polypropylene tube. |
| CHO IgG | MedImmune | Gift | Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system. |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x PBS, without calcium or magnesium. |
| Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL | Corning | 431143 | Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice. |
| Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL | Corning | 431144 | Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice. |
| Fast Glycan Labelling and Analysis kit | SCIEX | B94499PTO | Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS. |
| Fut8 DsiRNA | IDT | Custom | Custom designed DsiRNA targetting Fut8. |
| Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm | Bio-Rad | 1652088 | Electroporation cuvette. |
| Gene Pulser Xcell Eukaryotic System | Bio-Rad | 165 2661 | Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod. |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck-Millipore | IPFL00010 | Immunoblot transfer membrane, low background. |
| L-Methionine sulfoximine (MSX) | Sigma Aldrich | M5379 | Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system. |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 10623111 | Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes. |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 78505 | Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | 10365710 | Solvent. |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 616201 | Autoclavable tubes. |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system | Bio-Rad | 1658035FC | Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply. |
| NC-Slide A8 | ChemoMetec | 942 0003 | 8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250. |
| Negative Control DsiRNA, 5 nmol | IDT | 51 01 14 04 | Non-targeting DsiRNA. |
| Nuclease-free duplex buffer | IDT | 11-01-03-01 | Reconstitution buffer for DsiRNA. |
| NucleoCounter NC-250 | Chemometec | contact manufacturer | Instrument. Automated Cell Analyzer |
| Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa | Thermo Fisher Scientific | 26616 | Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting. |
| PCR tubes | Greiner Bio | 608281 | Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation. |
| Pipette filter tips sterilised (10, 200, 1000 µL) | Gibson | F171203, F171503, F171703 | Sterile filter tips to avoid RNA contamination. |
| PNGase F enzyme | New England Biolabs | P0704S | Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins. |
| Polypropylene columns, 1 mL | Qiagen | 34924 | Columns for gravity-flow chromatography. |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases |
| Protein-A Agarose Beads | Merck-Millipore | 16 125 | For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins. |
| Protein-A biosensor | ForteBio | 18 5010 | Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification. |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | Removes RNAse contamination. |
| Sample dilutent | ForteBio | 18 1104 | Activate Protein A tips. |
| Serological pipets (5, 10, 25 mL) | Corning | 4487, 4488, 4489 | Used for sterile cell culture tecniques. |
| Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF | Sigma Aldrich | 296813 | Reducing agent. |
| Solution 18 | ChemoMetec | 910-3018 | Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) |
| Spin-X Centrifuge Tube Filters | Corning | 8161 | 0.22 µm pore, Cellulose Acetate membrane. |
| Suspension plate with lid, 6-well | Greiner Bio | 657 185 | Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures. |
| Syringe filters, 0.22 μm | Sartorius | 514 7011 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) |
| Syringes with Luer lock tip, 20 mL | Fisher Scientific | 10569215 | For secure connection with syringe filter. |
| Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | Stains dead and dying cells. |
| Vivaspin 500, 3,000 MWCO | Sartorius | VS0191 | Polyethersulfone |
| WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | WB7105 | Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online. |
References
- Jefferis, R. Glycosylation as a strategy to improve antibody-based therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 226-234 (2009).
- Rathore, A. S., Winkle, H. Quality by design for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 27 (1), 26-34 (2009).
- Eon-Duval, A., Broly, H., Gleixner, R. Quality attributes of recombinant therapeutic proteins: An assessment of impact on safety and efficacy as part of a quality by design development approach. Biotechnology Progress. 28 (3), 608-622 (2012).
- Lalonde, M. -E., Durocher, Y. Therapeutic glycoprotein production in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 251, 128-140 (2017).
- Mimura, Y., et al. Glycosylation engineering of therapeutic IgG antibodies: challenges for the safety, functionality and efficacy. Protein & Cell. 9 (1), 47-62 (2018).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36 (12), 1136-1145 (2018).
- Zhang, M., Koskie, K., Ross, J. S., Kayser, K. J., Caple, M. V. Enhancing glycoprotein sialylation by targeted gene silencing in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. , (2010).
- Kanda, Y., et al. et al. of a GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) knockout host cell line: a new strategy for generating completely non-fucosylated recombinant therapeutics. Journal of Biotechnology. 130 (3), 300-310 (2007).
- Umaña, P., Jean-Mairet, J., Moudry, R., Amstutz, H., Bailey, J. E. Engineered glycoforms of an antineuroblastoma IgG1 with optimized antibody-dependent cellular cytotoxic activity. Nature Biotechnology. 17 (2), 176-180 (1999).
- Xu, X., et al. et al. genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).
- Chan, K. F., et al. et al. of GDP-fucose transporter gene (Slc35c1) in CHO cells by ZFNs, TALENs and CRISPR-Cas9 for production of fucose-free antibodies. Biotechnology Journal. 11 (3), 399-414 (2016).
- Zhang, P., et al. Identification of functional elements of the GDP-fucose transporter SLC35C1 using a novel Chinese hamster ovary mutant. Glycobiology. 22 (7), 897-911 (2012).
- Amann, T., et al. Genetic engineering approaches to improve posttranslational modification of biopharmaceuticals in different production platforms. Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2778-2796 (2019).
- Karottki, K. J., et al. Awakening dormant glycosyltransferases in CHO cells with CRISPRa. Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 593-598 (2020).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Hammond, S. M., Bernstein, E., Beach, D., Hannon, G. J. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature. 404 (6775), 293-296 (2000).
- Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., Hannon, G. J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409 (6818), 363-366 (2001).
- Shields, R. L., et al. et al. of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human FcγRIII and antibody-dependent cellular toxicity. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 26733-26740 (2002).
- Shinkawa, T., et al. et al. Absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 3466-3473 (2003).
- Mori, K., et al. Engineering Chinese hamster ovary cells to maximize effector function of produced antibodies using FUT8 siRNA. Biotechnology and Bioengineering. 88 (7), 901-908 (2004).
- Imai-Nishiya, H., et al. Double knockdown of alpha1,6-fucosyltransferase (FUT8) and GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) in antibody-producing cells: a new strategy for generating fully non-fucosylated therapeutic antibodies with enhanced ADCC. BMC Biotechnology. 7, 84 (2007).
- Beuger, V., et al. et al. silencing of fucosyltransferase 8 in Chinese-hamster ovary cells for the production of antibodies with enhanced antibody immune effector function. Biotechnology and Applied Biochemistry. 53 (1), 31 (2009).
- Templeton, N., Dean, J., Reddy, P., Young, J. D. Peak antibody production is associated with increased oxidative metabolism in an industrially relevant fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 2013-2024 (2013).
- Hussain, H., et al. A comparative analysis of recombinant Fab and full-length antibody production in Chinese hamster ovary cells. Biotechnology and Bioengineering. 118 (12), 4815-4828 (2021).
- Shimoyama, H., et al. Partial silencing of fucosyltransferase 8 gene expression inhibits proliferation of Ishikawa cells, a cell line of endometrial cancer. Biochemistry and Biophysics Reports. 22, 100740 (2020).
- Tummala, S., et al. Evaluation of exogenous siRNA addition as a metabolic engineering tool for modifying biopharmaceuticals. Biotechnology Progress. 29 (2), 415-424 (2013).
- Carillo, S., et al. Comparing different domains of analysis for the characterisation of N-glycans on monoclonal antibodies. Journal of Pharmaceutical Analysis. 10 (1), 23-34 (2020).
- Reusch, D., et al. Comparison of methods for the analysis of therapeutic immunoglobulin G Fc-glycosylation profiles-Part 2: Mass spectrometric methods. mAbs. 7 (4), 732-742 (2015).
- Donini, R., Haslam, S. M., Kontoravdi, C. Glycoengineering Chinese hamster ovary cells: a short history. Biochemical Society Transactions. 49 (2), 915-931 (2021).
- Szigeti, M., Chapman, J., Borza, B., Guttman, A. Quantitative assessment of mAb Fc glycosylation of CQA importance by capillary electrophoresis. ELECTROPHORESIS. 39 (18), 2340-2343 (2018).
- Ruhaak, L. R., et al. Optimized workflow for preparation of APTS-labeled N-glycans allowing high-throughput analysis of human plasma glycomes using 48-channel multiplexed CGE-LIF. Journal of Proteome Research. 9 (12), 6655-6664 (2010).
- Patenaude, A. -M., et al. N-glycosylation analysis of mouse immunoglobulin G isolated from dried blood spots. Electrophoresis. 42 (24), 2615-2618 (2021).
- Karst, D. J., et al. Modulation and modeling of monoclonal antibody N-linked glycosylation in mammalian cell perfusion reactors. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 1978-1990 (2017).
- Dadouch, M., Ladner, Y., Perrin, C. Analysis of monoclonal antibodies by capillary electrophoresis: sample preparation, separation, and detection. Separations. 8 (1), 4 (2021).
- Fakhr, E., Zare, F., Teimoori-Toolabi, L. Precise and efficient siRNA design: a key point in competent gene silencing. Cancer Gene Therapy. 23 (4), 73-82 (2016).
- Birmingham, A., et al. A protocol for designing siRNAs with high functionality and specificity. Nature Protocols. 2 (9), 2068-2078 (2007).
- Makrydaki, E., et al. Immobilised enzyme cascade for targeted glycosylation. , (2022).
- Bulletin_6201.pdf. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6201.pdf (2022).
- Bulletin_6376.pdf. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2022).
- Dot Blot Analysis. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/dot-blot/index.html (2022).
- Yilmazel, B., et al. Online GESS: prediction of miRNA-like off-target effects in large-scale RNAi screen data by seed region analysis. BMC Bioinformatics. 15 (1), 192 (2014).
- Kittler, R., et al. Genome-wide resources of endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nature Methods. 4 (4), 337-344 (2007).
- Stec, E., et al. A multiplexed siRNA screening strategy to identify genes in the PARP pathway. Journal of Biomolecular Screening. 17 (10), 1316-1328 (2012).
- Brown, J. M., et al. Ligand conjugated multimeric siRNAs enable enhanced uptake and multiplexed gene silencing. Nucleic Acid Therapeutics. 29 (5), 231-244 (2019).
- Parsons, B. D., Schindler, A., Evans, D. H., Foley, E. A direct phenotypic comparison of siRNA pools and multiple individual duplexes in a functional assay. PLoS One. 4 (12), 8471 (2009).
- Martin, S. E., et al. Multiplexing siRNAs to compress RNAi-based screen size in human cells. Nucleic Acids Research. 35 (8), 57 (2007).
- Popp, O., Moser, S., Zielonka, J., Rüger, P., Hansen, S., Plöttner, O. Development of a pre-glycoengineered CHO-K1 host cell line for the expression of antibodies with enhanced Fc mediated effector function. mAbs. 10 (2), 290-303 (2018).
- Yang, P. -C., Mahmood, T. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
- Troubleshooting Western Blots with the Western Blot Doctor. Bio-Rad Laboratories. , Available from: https://www.bio-rad.com/en-uk/applications-technologies/troubleshooting-western-blots-with-western-blot-doctor?ID=MIW4HR15 (2022).
- Steentoft, C., et al. Precision mapping of the human O-GalNAc glycoproteome through SimpleCell technology. EMBO. 32 (10), 1478-1488 (2013).
- FUT8 - Alpha-(1,6)-fucosyltransferase - Proteomics. , Available from: https://www.nextprot.org/entry/NX_Q9BYC5/proteomics (2022).
- Kotidis, P., et al. Rapid antibody glycoengineering in CHO cells via RNA interference and CGE-LIF N-glycomics. Methods in Molecular Biology. 2370, 147-167 (2022).
