Summary
항체의 글리코실화 패턴은 그의 임상 성능을 결정하고, 따라서 글리코실화를 조절하기 위한 산업적 및 학문적 노력이 지속된다. 전형적인 글리코엔지니어링 캠페인은 시간과 노동 집약적이기 때문에, 일시적 침묵을 사용하여 글리코실화 유전자의 영향을 특성화하는 신속한 프로토콜의 생성은 유용할 것이다.
Abstract
재조합 모노클로날 항체는 특정 분자 표적에 결합하고, 이어서, 면역 반응을 유도하거나 다른 리간드의 결합을 억제한다. 그러나, 모노클로날 항체 기능성 및 반감기는 숙주 특이적 글리코실화의 유형 및 분포에 의해 감소될 수 있다. 우수한 항체를 생산하려는 시도는 글리코 최적화 항체를 합성하는 유전자 변형 생산자 세포의 개발에 영감을 불어 넣었습니다. 당공학은 전형적으로 단백질 9-연관 단백질 9-클러스터링된 규칙적으로 간격이 짧은 팔린드로믹 반복(CRISPR)과 같은 방법을 사용하여 안정한 녹아웃 또는 녹인 세포주의 생성을 필요로 한다. 조작된 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체는 원하는 글리코프로파일이 수득되었는지를 결정하기 위해 질량 분광법을 사용하여 특성화된다. 이 전략은 시간이 많이 걸리고 기술적으로 도전적이며 전문가가 필요합니다. 따라서, 유전 글리코엔지니어링 및 글리칸 검출을 위해 간소화된 프로토콜을 이용하는 대안적인 전략은 최적의 항체를 향한 노력을 도울 수 있다. 이 개념 증명 연구에서, IgG를 생산하는 중국 햄스터 난소 세포는 당공학을 최적화하는 이상적인 숙주로 작용했다. Fut8 유전자를 표적으로 하는 짧은 간섭 RNA를 중국 햄스터 난소 세포에 전달하고, 그 결과 FUT8 단백질 발현의 변화를 정량화하였다. 결과는 이 방법에 의한 녹다운이 효율적이었으며, FUT8의 ~60% 감소로 이어졌다는 것을 나타낸다. 항체 글리코프로파일의 상보적 분석은 신속하면서도 매우 민감한 기술, 즉 모세관 겔 전기영동 및 레이저-유도된 형광 검출을 사용하여 수행되었다. 모든 녹다운 실험은 아푸코실화 글리칸의 증가를 보여주었다; 그러나이 연구에서 달성 된 가장 큰 변화는 ~ 20 %였습니다. 이 프로토콜은 실리코 설계 도구, 상업적으로 합성된 유전자 표적화 시약 및 광범위한 사전 경험이 필요하지 않은 신속한 정량화 분석을 활용하여 당공학 노력을 단순화합니다. 따라서, 이 프로토콜에 의해 제공되는 시간 효율성은 새로운 유전자 표적에 대한 조사를 도울 수 있다.
Introduction
N-연결된 글리코실화는 올리고당 잔기가 Asn 잔기에 공유적으로 연결되는 효소적 과정이다. de novo 단백질 합성과는 달리, 글리칸 합성은 단백질의 이질적인 글리코실화를 초래하는 비주형 반응이다. 글리칸의 구조, 구성 및 분포는 단백질 입체 형태 및 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 실제로, 면역글로불린 G(IgG)의 결정화가능한 단편 (Fc) 영역에서의 N-글리코실화는 항체1의 치료 효능, 면역원성 및 반감기를 조절한다. 이와 같이, 재조합 생물요법 단백질 제품의 개발을 위한 설계(QbD) 패러다임에 의한 품질은 자연스럽게 글리코실화를 임계 품질 특성(CQA)2,3으로서 식별한다. 포유동물 세포는 박테리아, 효모, 곤충 또는 식물 세포보다 본질적으로 인간 유사 글리코실화 패턴을 더 가깝게 생산하기 때문에 종종 바람직한 발현 시스템이다. 더욱이, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포는 인간 바이러스 감염에 내성이 있고, 높은 역가에서 생성물을 분비하고, 높은 생존 가능한 세포 밀도로 현탁 배양물에서 성장할 수 있기 때문에 다른 포유동물 세포주보다 선택된다4. 글리칸 형성과 관련하여, 비-CHO 뮤린 생산 세포는 모노클로날 항체 (mAbs)5의 안전한 사용에 영향을 미치는 면역원성 글리칸 (α(1-3)-연결된 갈락토오스 [α(1-3)-Gal] 및 N-글리콜릴뉴라민산 [NeuGc])을 생성한다. 이러한 이점은 CHO 세포를 가장 중요한 발현 시스템으로 만들어 주며 2014 년과 2018 년 사이에 새로운 생물 치료제의 80 % 이상을 생산합니다 6. 그러나, 주형-비의존성 글리코실화는 글리코폼의 어레이를 갖는 CHO 유래 생물치료제로 이어지는 보존된 메카니즘이다.
생물 치료 개발 전략은 유전 공학에 의해 CHO 세포의 이질성을 조절하는 것을 목표로합니다. 일부 문헌의 예는 시알리다제 (Neu1, Neu3)7, GDP-만노스 4,6-데하이드라타제 (GMD) 녹아웃8, 및 글리코실트랜스퍼라제 (GnTIII)9의 과발현의 녹다운을 포함한다. 글리코엔지니어링의 발전은 CHO 게놈 10과 같은 공개적으로 이용 가능한 자원의 조합과 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALENs), 징크 핑거 뉴클레아제(ZFNs) 및 클러스터링된 규칙적으로 간격이 짧은 구두체 반복(CRISPR)-관련 단백질 9(CRISPR-Cas9)11,12,13,14와 같은 유전 공학 도구의 지속적인 개발로 인해 가능하다. . 이들 도구는 전형적으로 플라스미드 DNA 또는 정제된 리보뉴클레오단백질 (RNP) 복합체로서 CHO 세포에 전달된다. 반대로, RNA 간섭 (RNAi)은 유전 공학 기술로, 가장 단순한 형태로 정제 된 짧은 간섭 RNA (siRNA) 올리고뉴클레오티드의 전달만을 필요로합니다. 내인성 단백질은 이중 가닥 siRNA를 단일 가닥으로 처리하고, 뉴클레아제, RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)는 표적 mRNA 서열15,16,17을 절단하기 위해 siRNA와 복합체를 형성한다. 이 방법을 통한 유전자 침묵은 RNA 불안정으로 인해 일시적이지만, 본 명세서에서 조사한 결과, 신속한 스크리닝을 돕기 위해 이 기능을 활용한다.
현재 연구를 위해 선택된 모델 효소인 α1,6-fucosyltransferase (FUT8)는 α-1,6 코어 결합 L-푸코스(Fuc)를 갖는 N-글리칸을 생산한다. 이러한 변형은 상업적 항체의 연구에 의해 입증된 바와 같이, 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 활성의 일차적인 결정인자이다. 코어 푸코실화의 부재 하에서, 리툭시맙 (항-CD20 IgG1)은 ADCC를 50배 증가시키고, FcgRIIIa 결합 18,19를 개선함으로써 트라스투주맙 (항-Her2IgG1)에서 ADCC를 증가시킨다. 따라서 코어 fucosylation은이 표현형을 역전시키려는 노력을 보증하는 mAbs의 바람직하지 않은 특징으로 간주됩니다. ADCC20,21,22에서 수반되는 증가와 함께 siRNA를 사용한 성공적인 Fut8 유전자 표적화의 예가 있지만, 이들 예는 플라스미드 DNA에 암호화된 Fut8 siRNA를 전달한다. 이러한 실험은 플라스미드 DNA가 siRNA 합성을 위한 주형으로서 기능함에 따라 안정한 유전자 침묵을 생성한다. 이를 통해 세포는 세포내 RNases 및 포스파타제에 의해 분해되는 siRNA 분자를 보충할 수 있습니다. 반대로, 외인성 합성 siRNA의 전달은 siRNA가 세포내 주형의 부족으로 인해 보충될 수 없기 때문에 일시적인 유전자 침묵만을 허용한다. 따라서 사용자는 실험 설계가 플라스미드 유래 또는 합성 siRNA와 호환되는지 여부를 고려해야합니다. 예를 들어, 피크 mAb 생산에 초점을 맞춘 연구들, 전형적으로 배양23,24일의 육일째에, 피크 발현 며칠 전에 세포에 전달될 수 있는 합성 siRNA를 선택할 수 있다. 합성 siRNA를 이용한 일시적 접근법의 이점은 생산을 아웃소싱하는 능력 및 플라스미드에서 구축물을 생성하는 데 걸리는 시간의 일부분으로 다수의 siRNA 구축물이 생성될 수 있다는 사실을 포함한다. 더욱이, 합성 siRNA는 FUT8 단백질 발현25를 감소시키고 증가된 FCgRIIIa 결합 및 ADCC26을 갖는 아푸코실화된 IgGs를 수득하기에 충분한 Fut8 유전자 침묵의 문헌 예에 의해 입증된 바와 같이 효과적이다.
이러한 당공학 프로토콜의 성공은 Fc 글리코실화의 정도에 의해 결정되었다. 질량 분광법은 일반적으로 글리코믹 분석을 위해 선택되는 방법입니다. 그러나, 모세관 겔 전기영동 및 레이저-유도 형광 검출 (CGE-LIF)은 정제된 IgGs의 글리코프로파일을 분해하는데 완벽하게 순응할 수 있고, 더 빠른 속도 및 단순성의 이점을 갖는다. 질량 분광법 프로토콜은 적절한 크로마토그래피 및 유도체화 방법, 이온화 공급원 및 질량 분석기(27,28,29)를 결합해야 한다. 숙련 된 전문가가 필요한 것 외에도 질량 분광법 프로토콜은 길며 방법의 다양성으로 인해 서로 다른 설정을 가진 실험실간에 데이터를 비교하기가 어렵습니다. 바이오 의약품의 맥락에서, CGE-LIF는 항체 글리코 프로파일의 충분한 세부 사항을 제공 할 수있는 민감한 방법이며 고 처리량 방법에 대해 쉽게 확장 할 수 있습니다. 저조한 특성화 된 당단백질과 낮은 풍부하고 매우 복잡한 혼합물의 경우, 질량 분광법의 이점이 남아있을 수 있습니다. 그러나, CGE-LIF 기반 N-글리칸 분석에 의해 제공되는 고분해능 및 고감도 mAb 분석은 이 방법을 시험하기 위한 이론적 근거가 된다. 또한, 샘플 준비 및 분석은 단 몇 시간 만에 완료됩니다30. 최근 연구에 따르면 CGE-LIF는 인간 혈장31, 마우스 32 및 CHOIgGs 33에서 유래 된 글리 칸을 모니터링하는 데 사용될 수 있습니다. 이 연구는 높은 처리량의 샘플 분석 및 작은 샘플 부피에 CGE-LIF의 사용을 강조합니다.
CGE-LIF 방법에는 고려해야 할 제한 사항이 있습니다. 비용은 글리칸 분석을 위해이 장치 및 다른 장치의 사용에 대한 중요한 장벽입니다. 그러나, 이러한 비용은 현장 내에서 전형적이며, CGE-LIF는 비용 효율적인 옵션(34)으로 생각된다. 예산이 적은 실험실은 기계를 임대하거나 샘플 분석을 아웃소싱하는 것이 더 실용적일 수 있습니다. 분석 방법의 또 다른 고려 사항은 반복성입니다. CGE-LIF의 평가는 상이한 날에 검정되었던 동일한 샘플의 48개의 반복실험을 사용하여 수행되었다. 모세관 당 상대적 표준 편차는 배치내 및 인터배치 반복성에 대해 결정되었다. 반복실험의 배치내 비교는 6.2%의 상대적 표준 편차를 갖는 것으로 나타났으며, 이는 모세관 성능이 균일하지 않음을 나타낸다. 또한, 인터배치 데이터의 비교는 15.8%31의 상대적 표준 편차를 나타내었으며, 이는 모세관 성능이 시간에 따라 변화함을 나타낸다. 확인 된 운영 단점은 다른 기계 및 독점 시약을 사용하는 현재 연구에는 적용되지 않을 수 있습니다. 사용자가 사내 프로토콜을 개발하려는 경우 Ruhaak et al.의 연구를 고려할 가치가 있습니다. 도 31을 참조하면, CGE-LIF에 대한 시약을 신중하게 평가하였다. 이와 같이, 시료 주입을 위한 시약 (Hi-Di Formamide 및 DMSO), 글리칸 라벨링 (NaBH3CN또는 2-피콜린 보란)31, 및 다른 것들이 최적화되었다.
이 연구는 직접 RNAi의 신속성과 다운스트림 글리코믹 분석을 결합한 시간 효율적인 당공학 프로토콜을 제시합니다. 상기 방법론은 상기 요약된 이유들 때문에 Fut8 유전자를 표적으로 사용하여 예시된다.
Protocol
1. DsiRNA 설계 및 재구성
- Safari, Firefox 또는 Microsoft Edge를 사용하여 IDT 웹 사이트(https://eu.idtdna.com)에 액세스합니다. 홈 페이지에서 제품 및 서비스 탭을 선택한 다음 RNA 간섭을 선택합니다. Fut8 유전자를 대상으로 하는 맞춤형 다이서 기판(DsiRNA) 구문을 생성하려면 설계 도구를 선택한 다음 사용자 지정 DsiRNA 생성 탭을 선택합니다.
- Fut8 기탁 번호를 입력하거나 수동으로 유전자 서열을 입력하여 시작하십시오. 본 연구에서, "CHO-K1" 및 "차이니즈 햄스터" 엔트리 둘 다로부터 제안된 Fut8 서열을 https://chogenome.org 로부터 수득하고 DsiRNA를 생성하는데 사용하였다. 대부분의 유전자에는 여러 전사체 변이체가 있으며, DsiRNA가 현재 어셈블리에서 보고된 모든 변이체에서 활성일 것임을 확인하는 것이 중요하다.
- CHO 세포 게놈이 현재 IDT 웹 사이트에서 "참조 게놈"으로 사용할 수 없으므로 "수동 BLAST"검색을 수행하는 옵션을 선택하십시오. 이 단계는 커스텀 DsiRNA 서열과 관심있는 게놈 사이의 일치를 검색한다.
- 검색을 클릭하여 DsiRNA 서열을 생성합니다.
- 차례로, 세금 ID : 10029 (CHO 세포주 및 중국 햄스터)와 함께 "수동 BLAST"기능을 사용하여 각 DsiRNA의 특이성을 평가하십시오. 질의 커버리지 결과는 DsiRNA 구축물이 Fut8(Fut8 전사 체 변이체 포함)과 100%에서 일치하는 반면, 의도하지 않은 표적에 대한 상보성은 ≤76%35임을 나타냅니다.
- DsiRNA가 Fut8 을 특이적으로 표적하는지 확인하여 GC 함량이 30 % -50 % 사이인지 확인하십시오. 낮은 GC 함량은 약하고 비특이적 결합과 관련이있는 반면, 높은 GC 함량은 siRNA가 RISC 복합체36으로 풀리고 로딩되는 것을 억제합니다.
- 형질감염 연구에 사용할 세 개의 DsiRNA를 선택하고(표 1), 각각 Fut8 유전자의 다른 위치를 표적화한다. 제어 실험을 위해 IDT로부터 미리 설계된 비표적화 또는 스크램블링된 DsiRNA를 구입하십시오.
- 도착하자마자 DsiRNA를 13,300 x g에서 1분 동안 원심분리하여 튜브를 열기 전에 펠릿화한다. 각각의 동결건조된 DsiRNA를 뉴클레아제가 없는 듀플렉스 완충액(IDT에 의해 제공됨)에서 100 μM 원액으로 재구성한다. 예를 들어, 20 μL의 완충액을 2 nmol의 DsiRNA에 첨가하여 100 μM 스톡을 얻었다.
- 충분한 혼합을 보장하기 위해, 원료 용액을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하면서 오비탈 진탕기(50 rpm, 16 mm 궤도)에서 부드럽게 흔들어라.
- Fut8(각 DsiRNA의 100 μM)을 표적으로 하는 각 DsiRNA 구축물 20 μL를 조합하여 마스터 믹스를 생성한다. 분취량을 준비하고 -20°C에서 보관한다.
| DsiRNA 표적 | 순서 | GC (%) | ||
| 구조 A | 5' GAGAAGAUAGAAACAGUCAAAUACC 3' | 36% | ||
| 5' GGUAUUUGACUGUUUCUAUCUUCUC 3' | ||||
| 구조 B | 5' AGAAUGAGAAUGGAUGUUUUUCCTT 3' | 32% | ||
| 5' AAGGAAAAACAUCCAUUCUCAUUCUGA 3' | ||||
| 구조 C | 5' AGAGAAGAUAGAAACAGUCAAAUAC 3' | 32% | ||
| 5' GUAUUUGACUGUUUCUAUCUUCUCUCG 3' | ||||
표 1. Fut8 녹다운에 사용되는 DsiRNA 서열. 중국 햄스터 및 CHO K1 세포 게놈에서 Fut8을 표적으로 하는 IDT에 의해 생성된 서열. 각 구축물에 대한 센스 및 안티센스 서열이 (각각) 도시되고, 각 구조체의 GC 내용이 표시된다. Kotidis et al.에서 재인쇄되었습니다. 52년.
2. DsiRNA 형질감염
- IgG 모노클로날 항체37 을 발현하는 CHO 세포를 부활시키고 관심있는 세포주에 적합한 배양 조건을 사용한다.
참고: 본 연구에 사용된 세포는 글루타민 합성효소(GS) 시스템을 사용하여 생성되었으며, 여기서 내인성 GS는 L-메티오닌 설폭스이민(MSX)에 의해 억제되어 희귀한 고생산 클론의 선택을 강화한다. 따라서 선택한 세포주에서 필요한 경우에만 MSX를 사용하십시오.- 세포 바이알을 37°C로 설정된 수조에서 2-3분 동안 해동시킨다. 바이알 외부를 70% (v/v) 에탄올로 청소하고 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 모든 작업을 계속하십시오.
- 세포 현탁액을 선택한 세포주에 적합한 9 mL의 예열 배지를 함유하는 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다. 세포를 5분 동안 100 x g에서 원심분리하여 펠릿화한다.
- 세포 펠릿을 방해하지 않고 배지를 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. 이어서, 세포 펠릿을 예열 배지 10 mL에 재현탁시키고 계수를 위한 분취량을 취한다.
- 혈구계로 계산하거나 자동화 된 세포 카운터를 사용할 때 살아있는 / 죽은 세포를 구별하기위한 적절한 염색으로 계산하는 경우 Trypan 파란색으로 세포를 얼룩지게하십시오.
- 열거의 두 방법 중 하나에 따라, 적절한 부피의 세포 현탁액을 30 mL의 배지 중 3 x 10 5 세포·mL-1의 생존 가능한 세포 밀도로125 mL 삼각 진탕 플라스크로 옮깁니다 (50 μM MSX의 선택적 보충 포함).
- 세포를 36.5°C, 5%CO2 로 설정된 인큐베이터로 옮기고 150 rpm (16 mm 궤도)에서 진탕 플랫폼 상에 놓는다.
- 250 mL 삼각 진탕 플라스크에서 2 x 105 세포·mL-1의 시딩 밀도와 50 mL의 작업 부피로 3-4 일마다 계대 세포. MSX를 사용하는 경우 첫 번째 통과 후 보충을 중단하십시오.
- 해동 이외에 2x 통과 세포.
- 형질감염
- 세포 밀도를 평가하고 세포 생존율이 90%보다 큰지 확인하십시오.
- 오염을 피하기 위해 70 % (v / v) 에탄올과 RNase 억제제 용액으로 생물 안전 캐비닛 및 모든 장비를 조심스럽게 청소하십시오.
- 펠릿 세포를 100 x g에서 5분 동안 재현탁시키고, 예열된 배지에서 5 x 106 세포·mL-1의 생존 가능한 세포 밀도로 재현탁시킨다.
- 8 μL (1 μM에 상당함)의 DsiRNA 마스터 믹스 또는 대조군을 멸균 (0.4 cm) 전기천공 큐벳으로 옮긴다. 그런 다음 800 μL의 세포 현탁액 (4 x 106 세포에 해당)을 동일한 큐벳으로 옮기고 두 성분이 혼합되었는지 확인하십시오.
- 다음과 같은 펄스 조건을 제공합니다: 1200V, 0.1ms, 정사각형 파형.
- 셀 서스펜션을 큐벳에서 6웰 플레이트의 한 웰로 옮기고 거품과 같은 물질을 피하십시오. 세포를 10분 동안 진탕 없이 인큐베이터(36.5°C, 5%CO2)에서 회수하였다.
- 800 μL의 예열 배지를 첨가하여 웰 당 1.6 mL의 최종 부피를 만들고, 형질감염된 세포를 150 rpm (16 mm 궤도)에서 진탕하면서 성장을 위해 인큐베이터 (36.5°C, 5%CO2)로 복귀시킨다.
- 형질감염 후 48 h에서 상청액 및 세포를 수확한다.
정지점: 세포 배양 상청액은 -20°C에서 유지될 수 있고; 그러나 단백질 분해를 피하기 위해 세포 펠릿 수집 직후에 세포 용해를 수행하는 것이 좋습니다. 상청액은 단계 3, 단계 4 및 단계 5에서 사용되는 반면, 세포 펠릿은 단계 6에서 사용된다.
3. IgG 정량화 및 정제
- 생물층 간섭 측정 또는 다른 선택 방법을 사용하여 IgG 농도를 측정하십시오.
- 수화물 단백질 A 바이오 센서는 10-30 분 동안 샘플 희석제에 팁을줍니다. 그 동안, 세포 현탁액을 15 mL 원심분리 튜브 내로 옮기고 5분 동안 100 x g에서 펠릿 세포를 옮기거나 0.45 μm 니트로셀룰로스 필터를 통해 여과하여 세포를 제거하였다.
- 펠렛을 교란시키지 않고, IgG를 함유하는 분리된 상청액을 깨끗한 원심분리 튜브 내로 조심스럽게 옮긴다.
- 바이오층 간섭 측정에 다음 설정을 사용하십시오 : 쉐이커 속도, 2200 rpm; 런타임, 60 초. 이 매개 변수는 모든 샘플 및 컨트롤을 측정하는 데 사용됩니다.
- 바이오센서 팁이 수화되면 IgG 표준(각 농도의 4μL)을 사용하여 표준 곡선을 만듭니다.
- 세포 상청액 4 μL를 로딩하여 샘플 농도를 정량화한다. 각 샘플 사이에 보풀이 없는 물티슈로 장치를 청소합니다.
- 표준 곡선을 알 수 없는 샘플에 연결하여 알 수 없는 샘플의 결합 속도를 보간합니다. 데이터를 저장하고 csv 또는 PDF 파일로 내보냅니다.
- IgG 정제
- 0.2 M 글리신 (pH 2.5)을 함유하는 용출 완충액을 준비하고 0.22 μm 필터를 통과시켜 멸균한다.
- 분리된 상청액 1 mL를 전체 상청액이 통과할 때까지 0.22 μm 마이크로원심분리 필터 튜브를 사용하여 실온에서 여과한다.
- 펠릿 150-200 μL의 단백질 A 아가로스 비드를 1.5 mL 원심분리 튜브에서 3분 동안 100 x g에서 상청액을 버린다. 이어서, 단백질 A 비드를 150-200 μL의 세포 배양 배지로 세척하고 원심분리를 반복한다. 상층액을 버리십시오.
- 평형화된 단백질 A 비드를 단계 3.2.3으로부터 제조된 상청액 1 mL와 재현탁시킨다. 1 mL 폴리프로필렌 튜브에 로딩한다. 폴리프로필렌 튜브를 회전식 혼합기 (15 mm 궤도)에 부착하고 실온에서 60-90분 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 30 rpm으로 회전시킨다.
- 인큐베이션이 완료된 후, 플로스루를 수집하고, 비드를 1 mL의 1x PBS로 세척하여 임의의 결합되지 않은 단백질을 제거하였다. 세척 분율도 수집하십시오.
- 3 mL의 용출 완충액을 폴리프로필렌 컬럼에 첨가함으로써 단백질 A 비드로부터 IgG를 떼어낸다. 컬럼으로부터 배출되는 순차적 분획(각각 500 μL)을 표지된 튜브로 수집한다.
- 선택사항: 정제된 항체가 저장될 경우, 1 M 트리스 pH 9.5의 25 μL를 첨가하여 용출 완충액을 중화시킨다. 항체가 완충액 교환 등을 통해 즉시 처리되는 경우이 단계를 건너 뜁니다.
참고: 정제의 모든 부분(유동, 세척 및 모든 용출 분획)은 표적 단백질이 손실되지 않도록 유지되어야 합니다. 이러한 샘플은 또한 정제가 성공적이지 않은 경우 문제 해결 중에 도움이 될 수 있습니다. - 다운스트림 처리를 위해 첫 번째 용출 (용출 A)을 사용하지만 나중에 필요할 경우 다른 모든 분획을 유지하십시오.
4. 버퍼 교환 및 샘플 농도
- IgG 용출 완충액을 1x PBS로 교환한다.
- 하중 용리 A를 3 kDa 분자량 컷오프 원심 농축기 상에 로딩한다. 적절한 MWCO 컬럼을 선택할 때 제조업체 가이드를 참조하십시오. 이 실험에서, 더 작은 기공 크기는 분비된 단백질의 최대 보유를 보장하지만 또한 원심분리 시간을 증가시킨다.
- 4°C에서 40-50분 동안 13,300 x g에서 원심분리한다. 원심분리는 일단 잔류 부피가 50 μL 이하이면 완료된다.
- 유동을 버리고 500 μL의 예비냉각된(4°C) 1x PBS를 첨가하여 잔류 상청액을 희석시킨다. 50 μL의 잔류 상청액이 남아있을 때까지 동일한 조건(4°C에서 40-50분 동안 13,300 x g)을 사용하여 샘플을 다시 원심분리한다.
- 500 μL의 예비 냉각된 (4°C) 1x PBS를 첨가하여 잔류 상층액을 희석하고 다시 원심분리 과정을 반복하여 상층액의 100x 희석액을 얻었다.
- 상층액을 ~2.5 g· L-1을 40 μL 이하에서 글리칸 분석 방법과의 상용성을 보장한다.
참고: 글리칸 분석을 위해 100μg를 로딩해야 합니다.
정지점: 농축된 IgG (1x PBS 중)는 -20°C에서 저장될 수 있고 글리칸 분석 전에 해동될 수 있다.
5. 글리칸 분석
- 제조업체의 지시에 따라 모세관 겔 전기영동을 사용하여 글리칸 분석을 수행하십시오.
- 자성 비드 용액 200 μL를 0.2 mL PCR 튜브에 옮기고 자기 스탠드 상에 올려 놓고 상청액으로부터 비드를 분리한다.
- 조심스럽게 상층액을 제거하고 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하십시오. 정제 된 단백질 샘플과 와류를 추가하여 완전한 혼합을 보장합니다.
- 변성 완충액(제공됨)을 샘플 튜브에 첨가하고, 60°C에서 8분 동안 인큐베이션한다. 최적의 반응 성능을 위해 시료 튜브를 열어 두십시오.
- PNGase F (샘플 당 500 유닛)를 첨가하고, 정제된 항체로부터 글리칸을 절단하기 위해 60°C에서 20분 동안 인큐베이션한다.
- N- 글리 칸의 방출 후, 샘플 튜브와 소용돌이를 닫으십시오. 아세토니트릴, 소용돌이를 첨가하고, 실온에서 1분 동안 인큐베이션한다.
- 샘플 튜브를 자기 스탠드에 놓고 용액에서 비드를 분리하십시오. 피펫을 사용하여 비드를 만지지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.
- 흄 후드에서 형광단을 포함하는 글리칸 표지 용액을 샘플에 첨가하십시오. 충분한 혼합을 보장하기 위해 소용돌이(open lids)를 60°C에서 20분 동안 인큐베이션한다.
- 샘플을 아세토니트릴로 3x 세척하여 과량의 염료를 제거한다. 이어서, 표지된 글리칸을 DDI 물(공급됨)에서 용출시킨다.
- 샘플 튜브를 자기 스탠드에 두어 정제되고 표지된 글리칸을 함유하는 상등액으로부터 비드를 분리한다.
- 포도당 사다리 표준, 브라케팅 표준 및 샘플을 준비하고 지정된 트레이 위치에 로드합니다. 글리칸 분석 프로토콜을 실행하십시오.
- 적절한 소프트웨어를 사용하여 샘플에 존재하는 글리 칸을 분석하고 확인하십시오.
주: 효율적인 인큐베이션을 위해 열 블록의 온도가 정확한지 확인하십시오.
6. 웨스턴 블롯
- 항-α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 녹다운 효율을 정량화한다. 폴리아크릴아미드 겔 및 완충제 제조법은 상업적 공급업체38,39로부터 입수할 수 있다.
- 형질감염 후 48 h에서, 혈구측정기 또는 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고, 5 x 106 세포에 상응하는 세포 현탁액의 부피를 결정한다.
- 각 실험 조건으로부터 적절한 부피의 세포 현탁액을 멸균된 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮기고 펠렛을 4°C에서 10분 동안 13,200 x g로 옮긴다. 상층액을 버리십시오.
- 세포를 실온에서 10분 동안 1% v/v 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 용해 완충액 200μL(포유동물 세포로부터 단백질 추출에 적합함)로 용해시킨다. 인큐베이션 동안 혼합물을 부드럽게 흔들어 준다 (50 rpm, 16 mm 궤도).
- 세포 파편을 제거하기 위해, 용해물을 13,200 x g에서 10분 동안 원심분리한 다음, 클리어링된 용해물을 멸균된 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
- 280 nm에서 분광광도계를 사용하여 각 용해물의 단백질 농도를 측정하였다. 이어서, 동일한 단백질 농도를 갖도록 조정된 각 샘플의 분취량을 준비한다.
- 단백질 샘플을 DTT-SDS 샘플 로딩 염료에서 10-15분 동안 100°C에서 인큐베이션하여 변성시키는 단계; 최종 염료 농도는 1x이다.
- 15 μL의 변성된 샘플과 5 μL의 예비염색된 단백질 사다리를 효율적인 분리를 위해 12.5% 분해능 겔이 있는 SDS-PAGE 겔에 로딩한다. 샘플을 겔 당 25mA에서 90분 동안 또는 염료 전면이 겔의 끝에 도달할 때까지 실행한다.
- 카세트로부터 겔을 조심스럽게 제거하고 메탄올을 함유하는 1x 전사 완충액에서 인큐베이션한다.
- 습식 이송 시스템을 준비하고 메탄올로 PVDF 막을 활성화시킨다. 습식 이송을 위해 젤과 PVDF 멤브레인을 조립하고, 이송 탱크에 얼음 블록을 놓고, 이송 조건이 차가워 지도록 탱크 전체를 얼음에 잠기십시오. 350mA/100V에서 60분 동안 작동합니다.
- 블로킹 용액에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하면서 50 rpm (16 mm 궤도)의 오비탈 진탕기 상에서 부드럽게 진탕함으로써 멤브레인을 차단한다.
- 멤브레인을 멸균수로 5 분 동안 헹구고 반복하십시오. 그런 다음 깨끗한 메스를 사용하여 눈에 보이는 단백질 사다리를 가이드로 사용하여 ~ 50kDa에서 수평으로 멤브레인을 조심스럽게 자릅니다.
- 막 보유 단백질을 50 kDa 초과의 항-α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 항체와 함께 항체 희석제 완충액에서 1:1000에 인큐베이션한다. 멤브레인을 희석제 완충액 중 1:10,000에 항-GAPDH와 함께 50 kDa 미만의 고정화된 단백질로 인큐베이션한다. 멤브레인은 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 밤새 인큐베이션될 수 있다.
- 멤브레인을 5분 동안 세척한 다음(x3) 실온에서 적어도 30분 동안 적절한 이차 항체와 함께 인큐베이션한다.
- 5 분 동안 세척 완충액으로 3x 세척을 수행 한 다음 물로 3x 세척하십시오. 그런 다음 밴드가 나타날 때까지 발색 기질 (또는 적절한 검출 시약)으로 멤브레인을 개발하십시오 (1-60 분).
- 멤브레인을 물로 2x 헹구고 건조시킵니다. 멤브레인의 이미지를 캡처하고 밀도 분석(40)을 수행한다.
- 각 샘플에서 상대적 단백질 발현을 계산하려면 먼저 샘플에서 GAPDH 신호의 비율을 계산하십시오. 이는 샘플 로딩의 불일치를 보정하는 각 샘플의 정규화 계수입니다.
- FUT8 신호 세기(각 레인에 대해)를 해당 레인의 정규화 인자로 나누어 상대적인 FUT8 단백질 발현을 얻는다.
Representative Results
웨스턴 블롯 분석은 세 개의 Fut8 DsiRNA 구축물의 혼합물로 형질감염된 세포에서 감소된 FUT8 단백질 발현을 나타냈다. 비표적화 DsiRNA로 형질감염된 대조군 샘플에서, FUT8은 ∼65 및 70 kDa에서 이중 밴드로서 나타났다. FUT8의 예측된 분자량이 66 kDa이기 때문에, 더 낮은 분자량 밴드의 신호 강도의 감소는 유전자 침묵을 나타낸다. 유전자 침묵을 확인하고 정량하기 위해, FUT8 단백질의 수준을 상대적인 GAPDH 단백질 수준으로 정규화하였다. 웨스턴 블롯 분석은 ~37 및 35 kDa에서 GAPDH에 대한 두 개의 밴드를 검출하였다. 더 높은 분자량 밴드는 예측된 단백질 크기에 상응하고, 따라서, 정규화 계산에 사용된다. GAPDH 단백질 수준에 대해 정규화하였을 때, FUT8 단백질 발현은 최대 60%까지 감소하였다(도 1).
형질감염 후 48 h에서의 유전자 녹다운의 관찰에 따라, 상응하는 mAb 샘플을 CGE-LIF에 의한 분석을 위해 처리하였다. 녹다운 세포로부터의 글리칸 구조는 푸코실화의 감소를 나타냈다. 이러한 경향은 아갈락토실화 구조 (G0F)에서 가장 두드러졌으며 갈락토실화 구조 (G1F, G1F' 및 G2F)에서 덜 관찰되었다. 이 데이터세트로부터, 총 IgG 코어 푸코실화는 음성 대조군 조건에 대해 관찰된 코어 푸코실화로부터 ∼95%로 감소하여 ~75%로 감소하였다(도 2). 코어 푸코실화의 더 큰 감소는 FUT8 단백질 수준의 ~60% 감소를 고려할 때 예상되었다. 반성시, 글리코프로파일은 형질감염 이후 48 h의 기간에 걸쳐 축적된 글리코실화된 mAbs를 나타내는 반면, 유전자 침묵은 수확시에만 존재하는 단백질 수준을 나타낸다는 것이 주목할 만하다.
이 녹다운 방법에 대한 추가 조사는 DsiRNA 농도, 수확 시간 및 전기 천공 조건을 변화시키는 것과 관련이 있습니다. 각 요인은 관련성을 결정하기 위해 개별적으로 조사되었습니다. 전기 천공 펄스 조건이 코어 푸코실화 및 세포 생존력에 미치는 영향은 실험 B, C, D 및 E에서 포착됩니다. 이러한 결과는 세포 생존율에 큰 차이 없이 단일 구형파 펄스(실험 B)에 비해 2개의 구형파 펄스(실험 C)를 사용한 전기천공으로부터 코어 푸코실화의 2배 감소를 입증한다(표 2). 전기천공 조건 e3(실험 D)는 이 시점에서 가장 낮은 세포 생존율(∼90%) 및 IgG 수율을 가져왔다. 그러나, 전기천공 사건에서 살아남은 세포는 코어 푸코실화의 ∼10% 감소에 의해 입증된 바와 같이 적당히 형질감염되었다(표 2). 흥미롭게도, 실험 D는 코어 푸코실화의 가장 큰 감소 (14.7 %)를 제공하는 전기 천공 조건을 사용했지만 세포 생존력 (91 % -93 % 생존력)에 분명히 해로웠다. 이러한 제한된 실험 세트는 돌이킬 수 없는 손상을 일으키지 않으면서 세포막의 충분한 투과를 가능하게 하는 전기천공 설정을 결정할 필요성을 보여준다. 코어 fucosylation에서 siRNA 농도 및 수확 시간의 역할을 주목하는 것도 흥미 롭습니다. 전반적으로, siRNA 농도의 증가는 수확 시간을 증가시키는 것보다 코어 푸코실화에 더 큰 영향을 미친다(실험 B, F, G 대 실험 A, B, H). 앞으로의 실험에서, 전기천공법 e2에 의해 전달된 siRNA 농도를 적정하는 것은 흥미로울 것이다.
그림 1. 실험 순서도. 글리코엔지니어링 및 샘플 분석 단계는 각 단계에 필요한 관련 시간과 함께 묘사된다. SiRNA 설계는 유전자 표적 당 유전자 표적 또는 구축물의 수에 따라 몇 시간이 소요된다. siRNA로 CHO 세포 형질감염은 몇 시간 내에 완료되고, 형질전환된 세포는 48시간 동안 성장하도록 방치된다. 세포 펠릿 및 상청액은 몇 시간 내에 수확된다. 세포 펠릿은 용해되고, 세포내 단백질은 SDS PAGE 상에서 분리되고, 이어서 표적 유전자에 대한 항체로 블롯팅되고 프로브된다. 글리칸은 정제된 항체로부터 절단되고 CGE-LIF에 의해 분석된다. 이들 분석은 각각 1일을 필요로 할 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. RNA 간섭의 확인. Fut8 또는 비표적화 대조군 DsiRNA로 처리된 샘플에서 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 단백질 수준의 웨스턴 블롯 검출. FUT8에 해당하는 밴드는 Fut8 녹다운 샘플보다 제어력이 더 강합니다. GAPDH 단백질 수준은 또한 표적 유전자 발현을 정상화하기 위해 평가되었다. 모든 샘플을 실험 G로부터 취하였다(표 2 참조). Kotidis et al.에서 재인쇄되었습니다. 52. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 48 h에서의 누적 IgG 글리코실화에 대한 Fut8 녹다운의 효과. 글리칸 분포의 변화는 녹다운 샘플에서 검출된다. 특히, 주요 코어-푸코실화 구조 (G0F)의 상대적 풍부도는 감소되는 반면, 아푸코실화된 종은 녹다운 실험에서 증가한다. 측정은 실험 G 샘플로부터 수행되었다(표 2 참조). 각 실험에 대해 수행된 생물학적 삼중항은 하류 분석의 부담을 줄이기 위해 수확 후에 혼합되었다. Kotidis et al.에서 재인쇄되었습니다. 52. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 실험 이름 | 전기천공법 | DsiRNA 농도 (nΜ) | 수확 시간(h) | 생존율(%) | Xv (106 세포·mL-1) | IgG 역가 (mg· L-1) | 코어-푸코실화의 차이(%) | ||||||
| ExpA_Negative | e1 | 500 | 24 | 98.3 | 4.71 | 122.5 | - | ||||||
| ExpA_Knockdown | e1 | 500 | 24 | 98.3 | 4.9 | 110.3 | 4.08 | ||||||
| ExpB_Negative | e1 | 500 | 48 | 95.6 | 9.55 | 453.3 | - | ||||||
| ExpB_Knockdown | e1 | 500 | 48 | 96.7 | 9.61 | 469 | 5.38 | ||||||
| ExpC_Negative | e2 | 500 | 48 | 96.3 | 9.91 | 449.3 | - | ||||||
| ExpC_Knockdown | e2 | 500 | 48 | 96.7 | 11 | 454.6 | 11.42 | ||||||
| ExpD_Negative | e3 | 500 | 48 | 90.6 | 6.25 | 318.5 | - | ||||||
| ExpD_Knockdown | e3 | 500 | 48 | 89.1 | 6.09 | 311.85 | 9.71 | ||||||
| ExpE_Negative | e4 | 500 | 48 | 91.1 | 7.2 | 380.3 | - | ||||||
| ExpE_Knockdown | e4 | 500 | 48 | 93.3 | 7.79 | 422.8 | 14.7 | ||||||
| ExpF_Negative | e1 | 750 | 48 | 96.2 | 9.7 | 501 | - | ||||||
| ExpF_Knockdown | e1 | 750 | 48 | 95.7 | 9.76 | 504.6 | 9.9 | ||||||
| ExpG_Negative | e1 | 1000 | 48 | 96.1 | 11.1 | 422.6 | - | ||||||
| ExpG_Knockdown | e1 | 1000 | 48 | 95.9 | 9.73 | 499.3 | 17.26 | ||||||
| ExpH_Negative | e1 | 500 | 72 | 94.4 | 14.3 | 925.8 | - | ||||||
| ExpH_Knockdown | e1 | 500 | 72 | 95 | 13.5 | 1018.4 | 7.37 | ||||||
표 2. 트랜스펙션 최적화. 전기천공법, DsiRNA 농도 및 수확 시간의 반복적인 변형은 세포 생존력, 생존 가능한 세포 밀도, 수확 시간에서의 IgG 역가, 및 코어 푸코실화의 차이의 변화를 가져왔다. 각 실험은 넉다운과 각각의 음성 대조군을 비교하여 변형이 원하는 효과(즉, 푸코실화의 감소)를 생성하는지 여부를 결정하였다. 전기천공 설정은 다음과 같았다: e1: 1200 V, 0.1 ms, 정사각형 파형; e2: 1200 V, 2x 0.1 ms, 펄스 간 5 s, 구형 파형; e3: 150V, 20ms, 정사각형 파형; e4: 250V, 500μF, 지수 감쇠. Kotidis et al.에서 재인쇄되었습니다. 52년.
Discussion
글리코실화 경로는 효소 및 부속 단백질의 복잡한 대사 네트워크를 수반한다. 경로 구성 요소의 기능을 해부하는 것은 기존의 녹아웃 또는 녹인 유전 공학 전략에만 의존하는 경우 어려운 일입니다. 대안적인 접근법은 일시적인 기능 손실 검정을 사용하여 경로의 구성원을 미리 스크리닝하는 것입니다. 이를 위해 RNAi 및 CGE-LIF 검출이라는 두 가지 신속한 프로토콜을 결합하여 글리코실화 유전자를 특성화하는 보다 효율적인 방법을 만들었습니다. 설명 된 방법은 완료에 몇 주가 걸릴 가능성이있는 기존 방법과 비교하여 완료에 5-7 일이 필요합니다. 또한 자동화 기능을 갖춘 연구 환경은이 방법을 활용하여 수동 처리로 실현 가능한 것보다 더 많은 유전자 후보를 선별 할 수 있습니다.
일시적인 글리코엔지니어링 캠페인의 성공은 siRNA 설계에 크게 의존한다. 맞춤형 DsiRNA 설계는 이전에 설명된 규칙을 따라야 하며, 또는 쉽게 사용자가 상업적으로 이용가능한 사전 설계된 서열을 선택할 수 있다. 다른 유전자 변형 전략과 마찬가지로, RNAi는 오프 타겟 효과에 대한 잠재력을 가지고 있습니다. 따라서, 사용자는 계산 방법(41)에 의해 의도하지 않은 유전자 표적화를 평가하도록 권장된다. 실험적 설계 선택은 또한 오프 타겟 효과를 제한하는 데 도움이 될 수 있습니다. Kittler 등은 siRNA의 다중화된 전달이 오프 타겟 효과의 감소를 유도한다는 것을 보여주었다42. 이것은 직관에 어긋나는 것처럼 보이지만, 마스터 믹스는 각 siRNA 구축물의 농도를 감소시켜 오프 표적 유전자 침묵의 기회를 제한하는 것이 제안된다. 또 다른 이점은 동일한 유전자를 표적으로 하는 siRNA 구조의 동시 형질감염이 성공적인 RNAi의 가능성을 증가시킨다는 것이다. 마스터 믹스를 사용하면 샘플과 반복실험 간의 일관성이 보장되고 트랜스펙션 프로세스가 빨라집니다. 혼합된 siRNA 구축물의 초기 스크린에 이어서, 각 서열의 RNAi 효율을 확인하기 위해 개별 구축물을 사용하여 또 다른 실험을 수행할 수 있다. 이 및 다른 녹다운 연구에서, 최대 세 개의 siRNA가 풀링되어 세포(43,44,45)로 전달되었다. 그러나, 단일 유전자를 효율적으로 표적화하거나 여러 유전자를 표적화하기 위해 세 개 이상의 siRNA를 동시에 스크리닝하는 것이 바람직할 수 있다. 실제로, 한 연구는 개별 유전자의 침묵과 비슷한 수준에서 최대 6 개의 유전자의 다중화 siRNA 매개 침묵을 입증했다46. 그러나, 침묵 효율을 손상시키지 않으면서 풀에서 사용될 수 있는 siRNA 구축물의 최대 수를 결정하기 위해서는 추가적인 연구가 필요하다. 멀티플렉스 전략은 RNAi 라이브러리 스크리닝 실험46의 속도를 향상시키기 위해 Martin et al.에 의해 제안되었으며, 유사한 개념은 글리코실화 유전자를 스크리닝하는데 유용한 것으로 입증될 수 있다.
본원에 기재된 프로토콜은 다른 글리코실화 유전자를 검증하기 위해 후속 실험이 수행될 것이라는 기대와 함께 개념 증명으로서 작용한다. 관심있는 새로운 유전자는 Fut8보다 특성화되지 않거나 덜 대중적일 수 있으며, 유전자 침묵을 검출하는 일차 항체는 불량하거나 이용가능하지 않을 수 있다. 이 시나리오에서, RT-PCR과 같은 대안적인 방법은 유전자 침묵(47)을 정량화하는데 사용될 수 있지만, RT-PCR은 단백질보다는 mRNA를 검출한다는 점에 유의해야 한다. 웨스턴 블롯팅에 대한 항체를 사용할 수 있을 때, 일반적인 문제는 불량한 검출 또는 비특이적 밴드의 존재이다. 사용자가 일반적인 문제를 해결하는 데 도움이 되는 문제 해결 가이드를 사용할 수 있으며, 여기에는 일차 항체 적정, 대체 차단 및 검출 조건(48,49)과 같은 다양한 솔루션이 포함되는 경향이 있다. 이 연구에서, FUT8은 예기치 않게 ~65 및 ~70 kDa에서 더블 밴드로 나타났다. ∼70 kDa 밴드가 글리코실화 FUT8을 나타낼 수 있다. 인간 세포주로부터의 문헌 증거는 Thr 56450,51, 중국 햄스터에서 보존되는 부위, 및 CHO K1 FUT8 서열에서의 O-연결된 글리코실화를 기술한다.
앞서 언급한 바와 같이, 글리코실화 경로는 종종 복잡한 효소 배열을 수반한다. 현재의 프로토콜은 Fut8에 의해 조절되는 단발성 글리코실화 반응을 사용하여 개발, 최적화 및 입증되었다. 따라서, 표적 유전자가 대체 동역학 및 발현 수준을 갖는 효소를 인코딩하거나 중복 기능을 갖는 이소효소에 의해 조절되는 경로를 갖는 이 방법의 견고성을 확인하기 위해서는 추가적인 연구가 요구된다.
종합하면, 유전자를 신속하게 침묵시키고 변형된 IgG 글리코프로파일을 검출하는 능력은 맞춤형 글리코엔지니어링된 항체를 향한 노력에 유용한 도구이다. 유사한 단기 연구의 통찰력은 유가식 배양과 같은 장기 분석에 사용하기 위해 안정적인 당공학적 세포를 생성하는데 적용될 수 있다. 제약 맥락 밖에서이 방법은 글리 칸 생물학 연구에 기여하고 발달, 건강 및 질병에서 글리 칸의 중요한 기능을 강조합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
PK는 임페리얼 칼리지 런던의 화학 공학과에 장학금을 주신 것에 감사드립니다. RD는 영국 생명 공학 및 생물 과학 연구위원회에 그의 학생들에 감사드립니다. MM은 영국 생명 공학 및 생물 과학 연구위원회 (보조금 참조 : BB / S006206 / 1)가 자금을 지원합니다. IAG는 아일랜드 연구위원회 (장학금 번호)에 감사드립니다. GOIPG/2017/1049) 및 CONACyT (장학금 번호 438330).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32 Karat software | SCIEX | contact manufacturer | Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method. |
| Acetonitrile, HPLC grade | Sigma Aldrich | 34851 | Solvent. |
| Anti-FUT8 antibody | AbCam | ab198741 | Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene. |
| Anti-GAPDH antibody | AbCam | ab181602 | Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user. |
| BioDrop Spectrophotometer | Biochrom | 80 3006 55 | Instrument used to quantify protein concentration. |
| BLItz | ForteBio | 45 5000 | Instrument. Label-Free Protein Analysis System. |
| BRAND Haemocytometer | Sigma Alrich | BR717810 | Counting chamber device |
| Capillary cartridge | SCIEX | A55625 | Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 µm outer diameter (o.d), x 50 µm inner diameter (i.d). |
| C100HT Glycan analysis—capillary electrophoresis | SCIEX | contact manufacturer | Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used. |
| CD CHO Medium | Thermo Fisher Scientific | 10743029 | Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice. |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Greiner Bio | 188261 | Sterile polypropylene tube. |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Greiner Bio | 227270 | Sterile polypropylene tube. |
| CHO IgG | MedImmune | Gift | Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system. |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x PBS, without calcium or magnesium. |
| Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL | Corning | 431143 | Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice. |
| Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL | Corning | 431144 | Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice. |
| Fast Glycan Labelling and Analysis kit | SCIEX | B94499PTO | Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS. |
| Fut8 DsiRNA | IDT | Custom | Custom designed DsiRNA targetting Fut8. |
| Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm | Bio-Rad | 1652088 | Electroporation cuvette. |
| Gene Pulser Xcell Eukaryotic System | Bio-Rad | 165 2661 | Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod. |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck-Millipore | IPFL00010 | Immunoblot transfer membrane, low background. |
| L-Methionine sulfoximine (MSX) | Sigma Aldrich | M5379 | Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system. |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 10623111 | Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes. |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 78505 | Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | 10365710 | Solvent. |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 616201 | Autoclavable tubes. |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system | Bio-Rad | 1658035FC | Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply. |
| NC-Slide A8 | ChemoMetec | 942 0003 | 8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250. |
| Negative Control DsiRNA, 5 nmol | IDT | 51 01 14 04 | Non-targeting DsiRNA. |
| Nuclease-free duplex buffer | IDT | 11-01-03-01 | Reconstitution buffer for DsiRNA. |
| NucleoCounter NC-250 | Chemometec | contact manufacturer | Instrument. Automated Cell Analyzer |
| Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa | Thermo Fisher Scientific | 26616 | Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting. |
| PCR tubes | Greiner Bio | 608281 | Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation. |
| Pipette filter tips sterilised (10, 200, 1000 µL) | Gibson | F171203, F171503, F171703 | Sterile filter tips to avoid RNA contamination. |
| PNGase F enzyme | New England Biolabs | P0704S | Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins. |
| Polypropylene columns, 1 mL | Qiagen | 34924 | Columns for gravity-flow chromatography. |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases |
| Protein-A Agarose Beads | Merck-Millipore | 16 125 | For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins. |
| Protein-A biosensor | ForteBio | 18 5010 | Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification. |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | Removes RNAse contamination. |
| Sample dilutent | ForteBio | 18 1104 | Activate Protein A tips. |
| Serological pipets (5, 10, 25 mL) | Corning | 4487, 4488, 4489 | Used for sterile cell culture tecniques. |
| Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF | Sigma Aldrich | 296813 | Reducing agent. |
| Solution 18 | ChemoMetec | 910-3018 | Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) |
| Spin-X Centrifuge Tube Filters | Corning | 8161 | 0.22 µm pore, Cellulose Acetate membrane. |
| Suspension plate with lid, 6-well | Greiner Bio | 657 185 | Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures. |
| Syringe filters, 0.22 μm | Sartorius | 514 7011 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) |
| Syringes with Luer lock tip, 20 mL | Fisher Scientific | 10569215 | For secure connection with syringe filter. |
| Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | Stains dead and dying cells. |
| Vivaspin 500, 3,000 MWCO | Sartorius | VS0191 | Polyethersulfone |
| WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | WB7105 | Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online. |
References
- Jefferis, R. Glycosylation as a strategy to improve antibody-based therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 226-234 (2009).
- Rathore, A. S., Winkle, H. Quality by design for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 27 (1), 26-34 (2009).
- Eon-Duval, A., Broly, H., Gleixner, R. Quality attributes of recombinant therapeutic proteins: An assessment of impact on safety and efficacy as part of a quality by design development approach. Biotechnology Progress. 28 (3), 608-622 (2012).
- Lalonde, M. -E., Durocher, Y. Therapeutic glycoprotein production in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 251, 128-140 (2017).
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