Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Rask antistoffglykoengineering i kinesiske hamsterovarieceller

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63872
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,4, 5, 5, 4, 1,2, 1
1Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 2Imperial College Centre for Synthetic Biology, Imperial College London, 3BioPharm Process Research, GlaxoSmithKline Research and Development, 4Department of Life Science, Imperial College London, 5School of Chemical & Bioprocess Engineering, University College Dublin
* These authors contributed equally

Summary

Glykosyleringsmønsteret til et antistoff bestemmer dens kliniske ytelse, og dermed vedvarer industriell og akademisk innsats for å kontrollere glykosylering. Siden typiske glykoengineeringskampanjer er tids- og arbeidskrevende, vil genereringen av en rask protokoll for å karakterisere effekten av glykosyleringsgener ved hjelp av forbigående silencing være nyttig.

Abstract

Rekombinante monoklonale antistoffer binder spesifikke molekylære mål og induserer deretter en immunrespons eller hemmer bindingen av andre ligander. Imidlertid kan monoklonal antistofffunksjonalitet og halveringstid reduseres ved type og distribusjon av vertsspesifikk glykosylering. Forsøk på å produsere overlegne antistoffer har inspirert utviklingen av genmodifiserte produsentceller som syntetiserer glykooptimaliserte antistoffer. Glykoengineering krever vanligvis generering av en stabil knockout eller knockin celle linje ved hjelp av metoder som klynger regelmessig interspaced korte palindromic repetisjoner (CRISPR)-assosiert protein 9. Monoklonale antistoffer produsert av konstruerte celler blir deretter karakterisert ved hjelp av massespektrometriske metoder for å avgjøre om ønsket glykoprofil er oppnådd. Denne strategien er tidkrevende, teknisk utfordrende og krever spesialister. Derfor kan en alternativ strategi som benytter strømlinjeformede protokoller for genetisk glykoengineering og glykandeteksjon hjelpe bestrebelser mot optimale antistoffer. I denne konseptgodkjenningsstudien fungerte en IgG-produserende kinesisk hamsterovariecelle som en ideell vert for å optimalisere glykoengineering. Kort forstyrrende RNA rettet mot Fut8-genet ble levert til kinesiske hamsterovarieceller, og de resulterende endringene i FUT8-proteinuttrykket ble kvantifisert. Resultatene indikerer at knockdown med denne metoden var effektiv, noe som førte til en reduksjon på ~ 60% i FUT8. Komplementær analyse av antistoffglykoprofil ble utført ved hjelp av en rask, men svært følsom teknikk: kapillær geleelektroforese og laserindusert fluorescensdeteksjon. Alle knockdown-eksperimenter viste en økning i afukosylerte glykaner; Imidlertid var det største skiftet oppnådd i denne studien ~ 20%. Denne protokollen forenkler glykoengineering innsats ved å utnytte i silico design verktøy, kommersielt syntetisert gen rettet mot reagenser, og rask kvantifisering analyser som ikke krever omfattende tidligere erfaring. Som sådan kan tidseffektiviteten som tilbys av denne protokollen hjelpe undersøkelser av nye genmål.

Introduction

N-koblet glykosylering er en enzymatisk prosess der oligosakkaridmoieties er kovalent knyttet til Asn-rester. I motsetning til de novoproteinsyntese er glykansyntese en ikke-mald reaksjon som resulterer i heterogen glykosylering av proteiner. Strukturen, sammensetningen og fordelingen av glykaner kan påvirke proteinkonformasjon og funksjon. Faktisk regulerer N-glykosylering i det krystalliliserbare fragmentet (Fc) regionen immunoglobulin G (IgG) den terapeutiske effekten, immunogenisiteten og halveringstiden til antistoffet1. Som sådan identifiserer kvaliteten etter design (QbD) paradigme for utvikling av rekombinante bioterapeutiske proteinprodukter naturlig glykosylering som en kritisk kvalitetsattributt (CQA) 2,3. Pattedyrceller er ofte de foretrukne uttrykkssystemene da de iboende produserer menneskelignende glykosyleringsmønstre nærmere enn bakterier, gjær, insekt eller planteceller. Videre velges kinesiske hamsterovarieceller (CHO) over andre pattedyrcellelinjer fordi de er motstandsdyktige mot menneskelig virusinfeksjon, utskiller produkter ved høye titere, og kan dyrkes i suspensjonskultur til høye levedyktige celletettheter4. Når det gjelder glykandannelse, genererer ikke-CHO murinproduksjonsceller immunogene glykaner (α(1-3)-koblet galaktose [α(1-3)-Gal] og N-glykolylneuraminsyre [NeuGc]) som hindrer sikker bruk av monoklonale antistoffer (mAbs)5. Disse fordelene gjør CHO-cellene til det fremste uttrykkssystemet, ansvarlig for produksjon av over 80% av nye biotherapeutics mellom 2014 og 20186. Maluavhengig glykosylering er imidlertid en konservert mekanisme som fører til CHO-avledet bioterapeutikk med en rekke glykoformer.

Bioterapeutiske utviklingsstrategier tar sikte på å kontrollere heterogenitet i CHO-celler ved genteknologi. Noen litteratureksempler inkluderer nedslag av sialidaser (Neu1, Neu3)7, BNP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) knockout8, og overekspression av glykosyltransferaser (GnTIII)9. Fremskritt innen glykoengineering er mulig på grunn av en kombinasjon av offentlig tilgjengelige ressurser, som CHO-genomet10, og den pågående utviklingen av genteknologiske verktøy, for eksempel transkripsjonsaktivatorlignende effektorkjerner (TALENer), sinkfingerkjerner (ZFNer) og grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR)-assosiert protein 9 (CRISPR-Cas9)11,12,13,14 . Disse verktøyene leveres vanligvis til CHO-celler som plasmid-DNA eller som rensede ribonukleoproteinkomplekser (RNP). Omvendt er RNA-interferens (RNAi) en genteknologi som i sin enkleste form bare krever levering av rensede korte forstyrrende RNA (siRNA) oligonukleotider. Endogene proteiner behandler dobbeltstrenget siRNA i enkeltstrenger, og kjernen, RNA-indusert silencing kompleks (RISC), danner et kompleks med siRNA for å cleave mål mRNA sekvenser 15,16,17. Genaktivering via denne metoden er forbigående på grunn av RNA ustabilitet, men undersøkelsen heri utnytter denne funksjonen for å hjelpe rask screening.

Modellenzymet som er valgt ut for den nåværende studien, α1,6-fucosyltransferase (FUT8), produserer N-glykaner med α-1,6 kjernebundet L-fucose (Fuc). Denne modifikasjonen er et primært determinant for antistoffavhengig cellecytotoksisitet (ADCC) aktivitet, som det fremgår av studier av kommersielle antistoffer. I fravær av kjernefukosylering øker Rituximab (anti-CD20 IgG1) ADCC 50 ganger og øker ADCC i Trastuzumab (anti-Her2 IgG1) ved å forbedre FcgRIIIa binding18,19. Kjernefukosylering anses derfor som et uønsket trekk ved mAbs som garanterer innsats for å reversere denne fenotypen. Det er eksempler på vellykket Fut8 genmålretting ved hjelp av siRNA med samtidige økninger i ADCC 20,21,22, selv om disse eksemplene leverer Fut8 siRNA kodet på plasmid DNA. Slike eksperimenter genererer stabil genaktivering som plasmid DNA fungerer som en mal for siRNA syntese. Dette gjør det mulig for celler å fylle opp siRNA-molekyler som er degradert av intracellulære RNaser og fosfater. Omvendt tillater levering av eksogen syntetisk siRNA bare forbigående genaktivering, da siRNA ikke kan etterfylles på grunn av mangel på en intracellulær mal. Dermed bør brukerne vurdere om eksperimentelle design er kompatible med plasmid-avledet eller syntetisk siRNA. For eksempel kan studier fokusert på topp mAb-produksjon, vanligvis dag seks av kulturen 23,24, velge syntetisk siRNA som kan leveres til celler noen dager før topputtrykk. Fordelene med en forbigående tilnærming ved hjelp av syntetisk siRNA inkluderer evnen til å outsource produksjon og det faktum at flere siRNA-konstruksjoner kan genereres i en brøkdel av tiden det tar å generere konstruksjoner i plasmider. Videre er syntetisk siRNA effektiv, noe som fremgår av litteratureksempler på Fut8-genaktivering som er tilstrekkelig til å redusere FUT8-proteinuttrykk25 og gi afukosylerte IgG-er med økt FCgRIIIa-binding og ADCC26.

Suksessen til denne glykoengineering protokollen ble bestemt av graden av Fc glykosylering. Massespektrometri er normalt den valgte metoden for glykomiske analyser; Kapillær gelelektroforese og laserindusert fluorescensdeteksjon (CGE-LIF) er imidlertid perfekt egnet til å løse glykoprofil av rensede IgGs og har fordelen av større hurtighet og enkelhet. Massespektrometriprotokoller må kombinere passende kromatografiske og avledningsmetoder, ioniseringskilder og masseanalysatorer 27,28,29. I tillegg til å kreve en utdannet spesialist, er massespektrometriprotokoller lange, og mangfoldet av metoder gjør data vanskelig å sammenligne mellom laboratorier med forskjellige oppsett. I forbindelse med biofarmasøytiske stoffer er CGE-LIF en sensitiv metode som kan gi tilstrekkelige detaljer om en antistoffglykoprofil og er lett skalerbar for høygjennomstrømningsmetoder. For lav overflod, svært komplekse blandinger med dårlig karakteriserte glykoproteiner, kan fordelene med massespektrometri forbli. Imidlertid tjener høyoppløselig og høysensitiv mAb-analyse gitt av CGE-LIF-basert N-glykananalyse som en begrunnelse for å prøve denne metoden. Videre er prøveforberedelse og analyse fullført på bare noen få timer30. Nyere studier har vist at CGE-LIF kan brukes til å overvåke glykaner avledet fra human plasma31, mus32 og CHO IgGs33. Disse studiene fremhever bruken av CGE-LIF for høygjennomstrømningsprøveanalyse og små utvalgsvolumer.

CGE-LIF-metoden har begrensninger som bør tas i betraktning. Kostnad er en betydelig barriere for bruk av dette og andre enheter for glykananalyse. Disse kostnadene er imidlertid typiske innen feltet, og CGE-LIF antas å være et kostnadseffektivt alternativ34. Laboratorier med mindre budsjetter kan finne det mer praktisk å leie maskiner eller outsource prøveanalyse. En annen vurdering av enhver analytisk metode er repeterbarhet. Evaluering av CGE-LIF ble utført ved hjelp av 48 replikeringer av samme utvalg som ble analysert på forskjellige dager. Det relative standardavviket per kapillær ble bestemt for intrabatch og interbatch repeterbarhet. Intrabatch-sammenligningen av replikeringer ble funnet å ha et relativt standardavvik på 6,2%, noe som indikerer at kapillær ytelse ikke er jevn. Videre viste en sammenligning av interbatch-data et relativt standardavvik på 15,8% 31, noe som indikerer at kapillærytelsen endres over tid. De operasjonelle manglene som er identifisert, gjelder kanskje ikke i den aktuelle studien, som bruker forskjellige maskiner og proprietære reagenser. Hvis brukere har tenkt å utvikle en intern protokoll, ville det være verdt å vurdere studien av Ruhaak et al. 31, som nøye evaluerte reagensene for CGE-LIF. Som sådan, reagenser for prøve injeksjon (Hi-Di Formamide og DMSO), glykan merking (NaBH3CN eller 2-picoline borane)31, og andre har blitt optimalisert.

Denne studien presenterer en tidseffektiv glykoengineeringsprotokoll som kombinerer hurtigheten til direkte RNAi med nedstrøms glykomisk analyse. Metodikken er illustrert ved hjelp av Fut8-genet som mål av årsakene som er skissert ovenfor.

Protocol

1. DsiRNA design og rekonstituering

  1. Bruk Safari, Firefox eller Microsoft Edge for å få tilgang til IDT-nettstedet (https://eu.idtdna.com). Velg fanen Produkter og tjenester på hjemmesiden etterfulgt av RNA-interferens. Hvis du vil generere egendefinerte terningkast (DsiRNA) som er rettet mot Fut8-genet , velger du Utformingsverktøy etterfulgt av fanen Generer egendefinert DsiRNA .
    1. Skriv inn Fut8-tiltredelsesnummeret, eller skriv inn gensekvensen manuelt for å begynne. I denne studien ble de foreslåtte Fut8-sekvensene fra både "CHO-K1" og "Chinese Hamster" -oppføringer hentet fra https://chogenome.org og brukt til å generere DsiRNA. De fleste gener har flere transkripsjonsvarianter, og det er viktig å verifisere at DsiRNA vil være aktiv på alle rapporterte varianter i den nåværende samlingen.
    2. Velg alternativet for å utføre et "Manuell BLAST" -søk, da CHO-cellegenomet for øyeblikket ikke er tilgjengelig som et "referansegenom" på IDT-nettstedet. Dette trinnet søker etter treff mellom egendefinerte DsiRNA-sekvenser og genomet av interesse.
    3. Klikk Søk for å generere DsiRNA-sekvenser.
    4. Vurder i sin tur spesifisiteten til hver DsiRNA ved hjelp av "Manual BLAST" -funksjonen med skatte-ID:10029 (CHO-cellelinjer og kinesisk hamster). Resultatene fra spørringsdekningen indikerer at DsiRNA konstruerer match fut8 (inkludert Fut8-transkripsjonsvarianter ) til 100 %, mens komplementaritet mot utilsiktede mål er ≤76 %35.
    5. Kontroller at DsiRNA spesifikt er rettet mot Fut8 for å sikre at GC-innholdet er mellom 30% -50%. Et lavt GC-innhold er forbundet med svak og uspesifisert binding, mens et høyt GC-innhold hemmer siRNA-avslapping og lasting i RISC-komplekset36.
    6. Velg tre DsiRNA for bruk i transfeksjonsstudier (tabell 1), som hver er rettet mot et annet sted for Fut8-genet . Kjøp en forhåndsutformet ikke-målrettet eller kryptert DsiRNA fra IDT for kontrolleksperimenter.
  2. Ved ankomst sentrifugerer du DsiRNA på 13 300 x g i 1 min til pellets før du åpner røret. Rekonstituer hver lyofiliserte DsiRNA i nukleasefri dupleksbuffer (levert av IDT) til en 100 μM lagerløsning. Legg for eksempel til 20 μL buffer til 2 nmol DsiRNA for å få en 100 μM lager.
    1. For å sikre tilstrekkelig blanding, inkuber lagerløsningene ved romtemperatur i 30 minutter mens du rister forsiktig på en orbital shaker (50 rpm, 16 mm bane).
    2. Lag en mesterblanding ved å kombinere 20 μL av hver DsiRNA-konstruksjon som er rettet mot Fut8 (100 μM av hver DsiRNA). Forbered aliquots og oppbevar ved −20 °C.
DsiRNA-mål Sekvens GC (%)
Struktur A 5' GAGAAGAUAGAAACAGUCAAAUACC 3' 36%
5' GGUAUUUGACUGUUUCUAUCUUCUC 3'
Struktur B 5' AGAAUGAGAAUGGAUGUUUUUCCTT 3' 32%
5' AAGGAAAAACAUCCAUUCAUUCUGA 3'
Struktur C 5' AGAGAAGAUAGAAACAGUCAAAUAC 3' 32%
5' GUAUUUGACUGUUUCUAUCUUCUCG 3'

Tabell 1. DsiRNA-sekvenser som brukes til Fut8-knockdown. Sekvenser generert av IDT som er rettet mot Fut8 i kinesiske hamster- og CHO K1-cellegenomer. Sans- og antisensesekvensene for hver konstruksjon vises (henholdsvis), og GC-innholdet i hver struktur vises. Gjengitt fra Kotidis et al. 52.

2. DsiRNA-transfeksjon

  1. Gjenoppliv CHO-celler som uttrykker et IgG monoklonalt antistoff37 ved hjelp av kulturforhold som passer for cellelinjen av interesse.
    MERK: Cellene som brukes i denne studien ble generert ved hjelp av glutaminsyntetasesystemet (GS), der endogen GS hemmes av L-metioninsulffoksimin (MSX) for å forbedre utvalget av sjeldne høyproduserende kloner. Bruk derfor bare MSX hvis det kreves av den valgte cellelinjen.
    1. Avriming av et hetteglass med celler i 2-3 min i et vannbad satt til 37 °C. Rengjør hetteglasset utvendig med 70% (v / v) etanol og fortsett alt arbeid i et klasse II biosikkerhetsskap.
    2. Overfør cellefjæringen til et 15 ml sentrifugerør som inneholder 9 ml forhåndsvarslet medium som passer for den valgte cellelinjen. Pellet cellene ved sentrifugering ved 100 x g i 5 min.
    3. Fjern og kast forsiktig mediet uten å forstyrre cellepelleten. Deretter resuspenderer du cellepelleten i 10 ml forhåndsvarslet medium og tar en aliquot for telling.
    4. Flekk cellene med Trypan blå hvis du teller med et hemocytometer, eller en passende flekk for å skille levende / døde celler når du bruker en automatisert celleteller.
    5. Etter en av opplistingsmetodene overfører du et passende volum celleoppheng til en 125 ml Erlenmeyer shake-kolbe med en levedyktig celletetthet på 3 x 105 celler·ml-1 i 30 ml middels (med valgfri tilskudd på 50 μM MSX).
    6. Overfør celler til en inkubator satt til 36,5 °C, 5 % CO2 og plasser dem på en risteplattform ved 150 o/min (16 mm bane).
    7. Passasjeceller hver 3-4 dager med en såddtetthet på 2 x 105 celler·mL-1 og et arbeidsvolum på 50 ml i en 250 ml Erlenmeyer shake kolbe. Hvis du bruker MSX, må du avslutte tilskuddet etter første gang.
    8. Passasjeceller 2x i tillegg til opptining.
  2. Transfeksjon
    1. Vurder celletettheten og sørg for at celle levedyktigheten er større enn 90%.
    2. Rengjør biosikkerhetsskapet og alt utstyr forsiktig med 70% (v / v) etanol og en RNase-hemmerløsning for å unngå forurensning.
    3. Pelletsceller på 100 x g i 5 minutter og resuspend i forvarsel medium til en levedyktig celletetthet på 5 x 106 celler·mL-1.
    4. Overfør 8 μL (tilsvarende 1 μM) av DsiRNA master mix eller kontroll til en steril (0,4 cm) elektroporering cuvette. Overfør deretter 800 μL av celleopphenget (tilsvarende 4 x 106 celler) til samme cuvette og sørg for at begge komponentene blandes.
    5. Lever følgende pulsforhold: 1200 V, 0,1 ms, firkantet bølgeform.
    6. Overfør cellefjæringen fra cuvette til en brønn av en 6-brønns plate, pass på å unngå skumlignende materiale. Gjenopprett cellene i inkubatoren (36,5 °C, 5 % CO2) uten å riste i 10 minutter.
    7. Tilsett 800 μL forhåndsvarslet medium for å lage et sluttvolum på 1,6 ml per brønn og returner de transfekterte cellene til inkubatoren for vekst (36,5 °C, 5 % CO2) mens du rister ved 150 o/min (16 mm bane).
    8. Høst supernatantene og cellene ved 48 timer etter transfeksjon.
      Stoppested: Cellekulturens supernatant kan holdes ved -20 °C; Det anbefales imidlertid at cellelyset utføres umiddelbart etter cellepelletsoppsamling for å unngå proteinforringelse. Supernatanter brukes i trinn 3, trinn 4 og trinn 5, mens cellepellets brukes i trinn 6.

3. IgG kvantifisering og rensing

  1. Mål IgG-konsentrasjon ved hjelp av biolagsinterferometri eller en annen valgfri metode.
    1. Hydratprotein En biosensorspiss i prøve fortynningsmiddel i 10-30 min. I mellomtiden overfører du cellesuspensjoner til 15 ml sentrifugerør og pelletsceller ved 100 x g i 5 minutter eller fjerner celler ved filtrering gjennom et 0,45 μm nitrocellulosefilter.
    2. Uten å forstyrre pelletsen, overfør forsiktig det isolerte supernatantet som inneholder IgG til et rent sentrifugerør.
    3. Bruk følgende innstillinger for biolayer interferometri: shaker hastighet, 2200 rpm; kjøretid, 60 s. Disse parameterne brukes til å måle alle prøver og kontroller.
    4. Når biosensorspissene er hydrert, lager du en standardkurve ved hjelp av en IgG-standard (4 μL av hver konsentrasjon).
    5. Kvantiser prøvekonsentrasjoner ved å laste 4 μL av cellen supernatant. Rengjør apparatet med lofrie våtservietter mellom hver prøve.
    6. Koble standardkurven til de ukjente prøvene for å interpolere bindingshastigheten for de ukjente prøvene. Lagre dataene og eksporter som en CSV- eller PDF-fil.
  2. IgG-rensing
    1. Klargjør elutionbufferen som inneholder 0,2 M glycin (pH 2,5) og steriliser ved å passere gjennom et 0,22 μm filter.
    2. Filtrer 1 ml av det isolerte supernatantet ved romtemperatur ved hjelp av 0,22 μm mikrocentrifuge filterrør til hele supernatanten strømmer gjennom.
    3. Pellet 150-200 μL protein A agarose perler i 1,5 ml sentrifugerør ved 100 x g i 3 minutter og kast supernatanten. Vask deretter proteinet A perler med 150-200 μL cellekulturmedium og gjenta sentrifugering. Kast supernatanten.
    4. Resuspend det likevektede proteinet A perler med 1 ml av de tilberedte supernatantene fra trinn 3.2.3. og last inn i et 1 ml polypropylenrør. Fest polypropylenrøret til en roterende mikser (15 mm bane) og spinn ved 30 o/min i 60-90 minutter ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C.
    5. Etter at inkubasjonen er fullført, samle gjennomstrømningen og vask perlene med 1 ml 1x PBS for å fjerne ubundne proteiner. Samle vaskefraksjonen også.
    6. Elute IgG fra protein A perler ved å legge 3 ml elution buffer til polypropylen kolonnen. Samle sekvensielle fraksjoner som drenerer fra kolonnen (500 μL hver) i merkede rør.
    7. Valgfritt: Hvis det rensede antistoffet skal lagres, nøytraliserer du elutionbufferen ved å tilsette 25 μL 1 M Tris pH 9,5. Hopp over dette trinnet hvis antistoffet vil bli behandlet umiddelbart via bufferutveksling, etc.
      MERK: Alle deler av rensingen (gjennomstrømning, vask og alle elutionfraksjoner) bør holdes for å sikre at målproteinet ikke går tapt. Disse eksemplene kan også hjelpe under feilsøking hvis rensingen ikke lykkes.
    8. Bruk den første elution (elution A) for nedstrøms behandling, men behold alle andre brøker hvis de kreves i fremtiden.

4. Bufferutveksling og prøvekonsentrasjon

  1. Exchange IgG-elutionbuffer med 1x PBS.
    1. Last elution A på en 3 kDa molekylvekt cutoff sentrifugalkonsentrator. Se produsentens veiledning når du velger en passende MWCO-kolonne. I dette eksperimentet sikrer en mindre porestørrelse maksimal oppbevaring av utskilt protein, men øker også sentrifugeringstiden.
    2. Sentrifuge ved 13.300 x g i 40-50 min ved 4 °C. Sentrifugering er fullført når restvolumet er lik eller mindre enn 50 μL.
    3. Kast gjennomstrømningen og tilsett 500 μL prechilled (4 °C) 1x PBS for å fortynne resterende supernatant. Sentrifuger prøven igjen ved hjelp av de samme forholdene (13 300 x g i 40-50 min ved 4 °C) til 50 μL gjenværende supernatant gjenstår.
    4. Tilsett 500 μL prechilled (4 °C) 1x PBS for å fortynne gjenværende supernatant og gjenta sentrifugeringsprosessen igjen for å oppnå en 100x fortynning av supernatanten.
    5. Konsentrer supernatanten til en endelig konsentrasjon på ~ 2,5 g· L-1 i 40 μL eller mindre for å sikre kompatibilitet med glykananalysemetoden.
      MERK: 100 μg må lastes for glykananalyse.
      Stoppested: Den konsentrerte IgG (i 1x PBS) kan lagres ved −20 °C og tines før glykananalyse.

5. Glykansk analyse

  1. Utfør glykananalyse ved hjelp av kapillær gelelektroforese i henhold til produsentens instruksjoner.
    1. Overfør 200 μL av den magnetiske perleløsningen til et 0,2 ml PCR-rør og plasser det magnetiske stativet for å skille perlene fra supernatanten.
    2. Fjern forsiktig supernatanten og fjern rørene fra det magnetiske stativet. Tilsett renset proteinprøve og virvel for å sikre fullstendig blanding.
    3. Tilsett denatureringsbuffer (følger med) i prøverøret og inkuber i 8 minutter ved 60 °C. Hold prøverørene åpne for optimal reaksjonsytelse.
    4. Tilsett PNGase F (500 enheter per prøve) og inkuber i 20 minutter ved 60 °C for å holde glykaner fra de rensede antistoffene.
    5. Lukk prøverøret og virvelen etter frigjøring av N-glykaner. Tilsett acetonitril, virvel og inkuber ved romtemperatur i 1 min.
    6. Plasser prøverørene i det magnetiske stativet for å skille perlene fra løsningen. Bruk en pipette for å fjerne supernatanten forsiktig uten å berøre perlene.
    7. I en avtrekkshette tilsetter du glykanetikettløsningen som inneholder fluorofor i prøven. Vortex for å sikre tilstrekkelig blanding og inkubering ved 60 °C i 20 minutter (åpne lokk).
    8. Vask prøven 3x i acetonitril for å fjerne overflødig fargestoff. Deretter unngår du de merkede glykanene i DDI-vann (følger med).
    9. Plasser prøverøret i det magnetiske stativet for å skille perlene fra supernatanten som inneholder rensede og merkede glykaner.
    10. Forbered og last glukose stigestandarden, alternative standarder og prøver i de angitte brettposisjonene. Kjør glykananalyseprotokollen.
    11. Bruk passende programvare for å analysere og identifisere glykanene som finnes i eksemplet.
      MERK: Sørg for at temperaturen i varmeblokken er nøyaktig for effektiv inkubasjon.

6. Vestlig blott

  1. Kvantifisere knockdown effektivitet ved hjelp av vestlig blot analyse med en anti-α-1,6-fucosyltransferase antistoff. Polyakrylamidgeler og bufferoppskrifter er tilgjengelige fra kommersielle leverandører38,39.
    1. Ved 48 h etter transfeksjon teller cellene ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisert celleteller og bestemmer volumet av celleoppheng tilsvarende 5 x 106 celler.
    2. Overfør riktig volum cellefjæring fra hver eksperimentell tilstand til et sterilt 1,5 ml sentrifugerør og pellets ved 13 200 x g i 10 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten.
    3. Lyse cellene med 200 μL lysisbuffer (egnet for utvinning av proteiner fra pattedyrceller) som inneholder 1% v / v proteasehemmercocktail ved romtemperatur i 10 minutter. Rist blandingen forsiktig under inkubasjon (50 rpm, 16 mm bane).
    4. For å fjerne cellulært rusk, sentrifugerer du lysatet ved 13 200 x g i 10 minutter og overfører deretter det ryddede lysatet til et sterilt 1,5 ml rør.
    5. Mål proteinkonsentrasjonen av hvert lysat ved hjelp av et spektrofotometer ved 280 nm. Deretter forbereder du aliquots av hver prøve justert for å ha samme proteinkonsentrasjon.
    6. Denaturer proteinprøvene ved inkubasjon ved 100 °C i 10-15 min i DTT-SDS prøvelastefargestoff; den endelige fargekonsentrasjonen er 1x.
    7. Last 15 μL av de denaturerte prøvene og 5 μL prestained protein stige i en SDS-PAGE gel med 12,5% løse gel for effektiv separasjon. Kjør prøvene på 25 mA per gel i 90 min eller til fargefronten når enden av gelen.
    8. Fjern gelen forsiktig fra kassetten og inkuber i 1x overføringsbuffer som inneholder metanol.
    9. Forbered det våte overføringssystemet og aktiver en PVDF-membran med metanol. Monter gel- og PVDF-membranen for våt overføring, legg en isblokk i overføringstanken, og senk hele tanken i is for å sikre at overføringsforholdene forblir kalde. Kjør på 350 mA/100 V i 60 min.
    10. Blokker membranen ved å inkubere i en blokkeringsløsning i 30 minutter ved romtemperatur mens du rister forsiktig på en orbital shaker ved 50 rpm (16 mm bane).
    11. Skyll membranen med sterilt vann i 5 min og gjenta. Bruk deretter en ren skalpell for å forsiktig kutte membranen horisontalt ved ~ 50 kDa, ved hjelp av den synlige proteinstigen som guide.
    12. Inkuber membranen som inneholder proteiner større enn 50 kDa med anti-α-1,6-fucosyltransferase antistoff ved 1:1000 i en antistoff fortynningsbuffer. Inkuber membranen med immobiliserte proteiner mindre enn 50 kDa med anti-GAPDH ved 1:10.000 i fortynningsbuffer. Membraner kan inkuberes i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C.
    13. Vask membranene i 5 min (x3) og inkuber deretter med et passende sekundært antistoff i minst 30 minutter ved romtemperatur.
    14. Utfør 3x vasker med en vaskebuffer i 5 min, etterfulgt av 3x vasker med vann. Deretter utvikler du membranen med et kromogent substrat (eller passende deteksjonsreagens) til båndene vises (1-60 min).
    15. Skyll membranen 2x med vann, og la den tørke. Ta et bilde av membranen og utfør densitometrisk analyse40.
    16. Hvis du vil beregne det relative proteinuttrykket i hver prøve, må du først beregne forholdet mellom GAPDH-signalet i prøver. Dette er normaliseringsfaktoren for hvert utvalg som korrigerer for avvik i prøvelasting.
      Equation 1
    17. Del FUT8-signalintensiteten (for hver bane) på normaliseringsfaktoren for den tilsvarende banen for å oppnå det relative FUT8-proteinuttrykket.
      Equation 2

Representative Results

Vestlig blotanalyse viste redusert FUT8-proteinuttrykk i celler transfektert med en blanding av tre Fut8 DsiRNA-konstruksjoner. I kontrollprøver transfektert med ikke-målrettede DsiRNA, dukket FUT8 opp som et dobbeltbånd på ~ 65 og 70 kDa. Siden den anslåtte molekylvekten til FUT8 er 66 kDa, indikerer en reduksjon i signalintensiteten til det lavere molekylvektbåndet genaktivering. For å bekrefte og kvantifisere genaktivering ble nivået av FUT8-protein normalisert til det relative GAPDH-proteinnivået. Western blot analyse oppdaget to bånd for GAPDH på ~ 37 og 35 kDa. Det høyere molekylvektbåndet tilsvarer den anslåtte proteinstørrelsen og brukes derfor i normaliseringsberegninger. Når det ble normalisert mot GAPDH-proteinnivåer, ble FUT8-proteinuttrykket redusert med opptil 60 % (figur 1).

I tråd med observasjonen av gennedslag ved 48 timers posttransfeksjon ble tilsvarende mAb-prøver behandlet for analyse av CGE-LIF. Glykanstrukturer fra knockdown-celler viste en reduksjon i fukosylering. Denne trenden var mest markert i agalakosylerte strukturer (G0F) og observert i mindre grad i galaktosylerte strukturer (G1F, G1F' og G2F). Fra dette datasettet ble den totale IgG-kjernefukosylering redusert til ~75 %, ned fra ~95 % kjernefukosylering som ble observert for den negative kontrolltilstanden (figur 2). En større reduksjon i kjernefukosylering ble forventet gitt ~60% reduksjon i FUT8 proteinnivåer. Ved refleksjon er det bemerkelsesverdig at glykoprofil representerer glykosylerte mAbs som akkumulerte over en periode på 48 timer siden transfeksjon, mens genaktivering representerer proteinnivåer som bare er tilstede på tidspunktet for høsting.

Videre gransking av denne knockdown-metoden innebar å variere DsiRNA-konsentrasjonen, høsttiden og elektroporasjonsforholdene. Hver faktor ble individuelt undersøkt for å bestemme relevansen. Effekten av elektroporasjonspulsforhold på kjernefukosylering og celle levedyktighet fanges opp i eksperimenter B, C, D og E. Disse resultatene viser en todelt reduksjon i kjernefukosylering fra elektroporasjon ved hjelp av to firkantede bølgepulser (eksperiment C) sammenlignet med en enkelt kvadratisk bølgepuls (eksperiment B), uten signifikante forskjeller i celle levedyktighet (tabell 2). Elektroporasjonstilstand e3 (eksperiment D) førte til den laveste celle levedyktigheten (~ 90%) og IgG-utbyttet på dette tidspunktet. Celler som overlevde elektroporasjonshendelsen ble imidlertid moderat transfektert, noe som fremgår av ~10% reduksjon i kjernefukosylering (tabell 2). Interessant nok brukte eksperiment D elektroporasjonsforhold som ga størst reduksjon i kjernefukosylering (14,7%), men var tydeligvis skadelig for celle levedyktighet (91% -93% levedyktighet). Dette begrensede settet med eksperimenter illustrerer behovet for å bestemme elektroporasjonsinnstillinger som muliggjør tilstrekkelig permeabilisering av cellemembranen uten å forårsake ugjenkallelig skade. Det er også interessant å merke seg rollen som siRNA-konsentrasjon og høsttid på kjernefukosylering. Totalt sett har økende siRNA-konsentrasjon større innflytelse på kjernefukosylering enn å øke høsttiden (Eksperimenter B, F, G versus Eksperimenter A, B, H). I fremtidige eksperimenter ville det være interessant å titrate siRNA-konsentrasjonene levert av elektroporasjonsmetoden e2.

Figure 1
Figur 1. Eksperimentelt flytskjema. Trinnene for glykoengineering og eksempelanalyse vises med den tilknyttede tiden som kreves for hvert trinn. SiRNA-design tar noen timer, avhengig av antall genmål eller konstruksjoner per genmål. CHO celletransfeksjon med siRNA er fullført om noen timer, og transformerte celler blir igjen for å vokse i 48 timer. Cellepellets og supernatanter høstes innen få timer. Cellepellets lyser, og de intracellulære proteinene separeres på en SDS PAGE og deretter blottet og undersøkt med antistoffer mot målgenet. Glykaner er spaltet fra rensede antistoffer og analysert av CGE-LIF. Disse analysene kan kreve 1 dag hver. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Bekreftelse av RNA-interferens. Vestlig flekkdeteksjon av α-1,6-fucosyltransferase (FUT8) proteinnivåer i prøver behandlet med Fut8 eller ikke-målrettende kontroll DsiRNA. Bånd som tilsvarer FUT8 er mer intense i kontroll enn Fut8-knockdown-prøver. GAPDH-proteinnivået ble også vurdert for å normalisere målgenuttrykket. Alle prøver ble tatt fra eksperiment G (se tabell 2). Gjengitt fra Kotidis et al. 52. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Effekten av Fut8-knockdown på kumulativ IgG-glykosylering ved 48 timer. Et skifte i glykandistribusjon oppdages i knockdown-prøver. Spesielt reduseres den relative overfloden av de viktigste kjernefukosylerte strukturene (G0F) mens de afukosylerte artene økes i knockdown-eksperimentet. Målinger ble utført fra eksperiment G-prøver (se tabell 2). Biologiske triplikater utført for hvert eksperiment ble blandet etter høsting for å redusere byrden av nedstrømsanalyse. Gjengitt fra Kotidis et al. 52. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Navn på eksperiment Elektroporasjonsmetode DsiRNA-konsentrasjon (nΜ) Innhøstingstid (h) Levedyktighet (%) Xv (106 celler·ml-1) IgG-titer (mg· L-1) Forskjell i kjernefukosylering (%)
ExpA_Negative e1 500 24 98.3 4.71 122.5 -
ExpA_Knockdown e1 500 24 98.3 4.9 110.3 4.08
ExpB_Negative e1 500 48 95.6 9.55 453.3 -
ExpB_Knockdown e1 500 48 96.7 9.61 469 5.38
ExpC_Negative e2 500 48 96.3 9.91 449.3 -
ExpC_Knockdown e2 500 48 96.7 11 454.6 11.42
ExpD_Negative e3 500 48 90.6 6.25 318.5 -
ExpD_Knockdown e3 500 48 89.1 6.09 311.85 9.71
ExpE_Negative e4 500 48 91.1 7.2 380.3 -
ExpE_Knockdown e4 500 48 93.3 7.79 422.8 14.7
ExpF_Negative e1 750 48 96.2 9.7 501 -
ExpF_Knockdown e1 750 48 95.7 9.76 504.6 9.9
ExpG_Negative e1 1000 48 96.1 11.1 422.6 -
ExpG_Knockdown e1 1000 48 95.9 9.73 499.3 17.26
ExpH_Negative e1 500 72 94.4 14.3 925.8 -
ExpH_Knockdown e1 500 72 95 13.5 1018.4 7.37

Tabell 2. Optimalisering av transfeksjon. Iterative modifikasjoner av elektroporasjonsmetoden, DsiRNA-konsentrasjonen og høsttiden førte til endringer i celle levedyktighet, levedyktig celletetthet, IgG-titer på høsttidspunktet og forskjeller i kjernefukosylering. Hvert eksperiment sammenlignet knockdown og den respektive negative kontrollen for å avgjøre om modifikasjonen gir ønsket effekt (dvs. en reduksjon i fukosylering). Elektroporasjonsinnstillinger var som følger: e1: 1200 V, 0,1 ms, firkantet bølgeform; e2: 1200 V, 2x 0,1 ms, 5 s mellom pulser, firkantet bølgeform; e3: 150 V, 20 ms, firkantet bølgeform; e4: 250 V, 500 μF, eksponentiell forfall. Gjengitt fra Kotidis et al. 52.

Discussion

Glykosyleringsveier innebærer et komplekst metabolsk nettverk av enzymer og tilbehørsproteiner. Dissekering av funksjonen til veibestanddeler er skremmende hvis du er avhengig av konvensjonell knockout eller knockin genteknologiske strategier alene. En alternativ tilnærming er å foreløpig screene medlemmer av en vei ved hjelp av en forbigående tap av funksjon analyse. For dette formål ble to raske protokoller kombinert, RNAi og CGE-LIF deteksjon, for å skape en mer effektiv måte å karakterisere glykosyleringsgener på. Metoden som er beskrevet krever 5-7 dager for ferdigstillelse sammenlignet med konvensjonelle metoder som potensielt kan ta flere uker for ferdigstillelse. Videre kan forskningsmiljøer med automatiseringsfunksjoner utnytte denne metoden til å screene flere genkandidater enn mulig med manuell håndtering.

Suksessen til en forbigående glykoengineeringskampanje er i stor grad avhengig av siRNA-designen. Tilpassede DsiRNA-design må følge reglene som tidligere er skissert, eller for enkelhets skyld, brukere kan velge kommersielt tilgjengelige forhåndsdesignede sekvenser. I likhet med andre genmodifiseringsstrategier har RNAi potensial for off-target effekter. Derfor oppfordres brukere til å vurdere utilsiktet genmålretting ved beregningsmetoder41. Eksperimentelle designvalg kan også bidra til å begrense off-target effekter. Kittler et al. viste at multiplekset levering av siRNA førte til en reduksjon i off-target effekter42. Selv om dette virker kontraintuitivt, foreslås det at en mesterblanding reduserer konsentrasjonen av hver siRNA-konstruksjon, og dermed begrenser muligheten for off-target genaktivering. En annen fordel er at samtidig transfeksjon av siRNA-strukturer som retter seg mot det samme genet øker sannsynligheten for vellykket RNAi. Bruken av en mastermiks sikrer også konsistens mellom prøver og replikerer og fremskynder transfeksjonsprosessen. Etter en innledende skjerm med blandede siRNA-konstruksjoner, kan et annet eksperiment utføres ved hjelp av individuelle konstruksjoner for å fastslå RNAi-effektiviteten til hver sekvens. I denne og andre knockdown-studier har opptil tre siRNA blitt samlet og levert til cellene 43,44,45. Det kan imidlertid være ønskelig å screene mer enn tre siRNA samtidig for effektivt å målrette mot et enkelt gen eller å målrette mot flere gener. Faktisk viste en studie multiplekset siRNA-mediert silencing av opptil seks gener på nivåer som kan sammenlignes med silencing av individuelle gener46. Imidlertid er det nødvendig med ytterligere studier for å bestemme maksimalt antall siRNA-konstruksjoner som kan brukes i et basseng uten at det går på bekostning av silencingeffektiviteten. Multiplex-strategien ble foreslått av Martin et al. for å forbedre tempoet i RNAi-bibliotekets screeningeksperimenter46, og et lignende konsept kan være nyttig for å screene glykosyleringsgener.

Protokollen som beskrives her, fungerer som et konseptbevis med forventning om at påfølgende eksperimenter vil bli utført for å validere andre glykosyleringsgener. Nye gener av interesse kan være ukarakteriserte eller mindre populære enn Fut8, og primære antistoffer for å oppdage genaktivering kan være dårlige eller utilgjengelige. I dette scenariet kan alternative metoder som RT-PCR brukes til å kvantifisere genaktivering47, men det bør bemerkes at RT-PCR oppdager mRNA i stedet for protein. Når antistoffer for vestlig blotting er tilgjengelige, er et vanlig problem dårlig deteksjon eller tilstedeværelse av ikke-spesifikke bånd. Feilsøkingsveiledninger for å hjelpe brukere med å løse vanlige problemer er tilgjengelige, og disse har en tendens til å inkludere en rekke løsninger som primær antistofftitrering, alternativ blokkering og deteksjonsforhold48,49. I denne studien dukket FUT8 uventet opp som et dobbeltband på ~ 65 og ~ 70 kDa. Det er mulig at ~70 kDa-båndet representerer glykosylert FUT8. Litteraturbevis fra menneskelige cellelinjer beskriver O-koblet glykosylering ved Thr 564 50,51, et nettsted som er bevart i kinesisk hamster, og CHO K1 FUT8-sekvenser.

Som tidligere nevnt involverer glykosyleringsveier ofte et komplekst utvalg av enzymer. Den nåværende protokollen er utviklet, optimalisert og demonstrert ved hjelp av en monogen glykosyleringsreaksjon kontrollert av Fut8. Derfor er det nødvendig med ytterligere studier for å bekrefte robustheten til denne metoden når målgenet koder et enzym med alternative kinetikk- og uttrykksnivåer eller en vei regulert av isoenzymer med overflødige funksjoner.

Samlet sett er evnen til raskt å kneble gener og oppdage modifiserte IgG-glykoprofiler et nyttig verktøy i arbeidet mot tilpassede glykoengineered antistoffer. Innsikt fra lignende kortsiktige studier kan anvendes for å generere stabile glykoengineered celler for bruk i langsiktige analyser som fed-batch kultur. Utenfor den farmasøytiske konteksten bidrar denne metoden til studiet av glykanbiologi og fremhever glykanenes viktige funksjon i utvikling, helse og sykdom.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

PK takker Institutt for kjemisk prosessteknologi, Imperial College London, for hans stipend. RD takker U.K. Biotechnology and Biological Sciences Research Council for hans studentskap. MM er finansiert av U.K. Biotechnology and Biological Sciences Research Council (Grant reference: BB/S006206/1). IAG takker Det irske forskningsrådet (stipendnr. GOIPG/2017/1049) og CONACyT (Stipend nr. 438330).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32 Karat software SCIEX contact manufacturer Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method.
Acetonitrile, HPLC grade Sigma Aldrich 34851 Solvent.
Anti-FUT8 antibody AbCam ab198741 Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene.
Anti-GAPDH antibody AbCam ab181602 Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user.
BioDrop Spectrophotometer Biochrom 80 3006 55 Instrument used to quantify protein concentration.
BLItz ForteBio 45 5000 Instrument. Label-Free Protein Analysis System.
BRAND Haemocytometer Sigma Alrich BR717810 Counting chamber device
Capillary cartridge SCIEX A55625 Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 µm outer diameter (o.d), x 50 µm inner diameter (i.d).
C100HT Glycan analysis—capillary electrophoresis SCIEX contact manufacturer Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used.
CD CHO Medium Thermo Fisher Scientific 10743029 Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice.
Centrifuge tubes, 15 mL Greiner Bio 188261 Sterile polypropylene tube.
Centrifuge tubes, 50 mL Greiner Bio 227270 Sterile polypropylene tube.
CHO IgG MedImmune Gift Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190144 1x PBS, without calcium or magnesium.
Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL Corning 431143 Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.
Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL Corning 431144 Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.
Fast Glycan Labelling and Analysis kit SCIEX B94499PTO Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS.
Fut8 DsiRNA IDT Custom Custom designed DsiRNA targetting Fut8.
Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm Bio-Rad 1652088 Electroporation cuvette.
Gene Pulser Xcell Eukaryotic System Bio-Rad 165 2661 Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod.
Immobilon-FL PVDF  membrane Merck-Millipore IPFL00010 Immunoblot transfer membrane, low background.
L-Methionine sulfoximine (MSX) Sigma Aldrich M5379 Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system.
Kimwipes Thermo Fisher Scientific 10623111 Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent Thermo Fisher Scientific 78505 Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate.
Methanol, HPLC grade Fisher Scientific 10365710 Solvent.
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 616201 Autoclavable tubes.
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system Bio-Rad 1658035FC Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply.
NC-Slide A8 ChemoMetec 942 0003 8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250.
Negative Control DsiRNA, 5 nmol IDT 51 01 14 04 Non-targeting DsiRNA.
Nuclease-free duplex buffer IDT 11-01-03-01 Reconstitution buffer for DsiRNA.
NucleoCounter NC-250 Chemometec contact manufacturer Instrument. Automated Cell Analyzer
Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa Thermo Fisher Scientific 26616 Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting.
PCR tubes Greiner Bio 608281 Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation.
Pipette filter tips sterilised  (10, 200, 1000 µL) Gibson F171203, F171503, F171703 Sterile filter tips to avoid RNA contamination.
PNGase F enzyme New England Biolabs P0704S Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins.
Polypropylene columns, 1 mL Qiagen 34924 Columns for gravity-flow chromatography.
Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich P8340 Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases
Protein-A Agarose Beads Merck-Millipore 16 125 For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins.
Protein-A biosensor ForteBio 18 5010 Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification.
RNaseZap Invitrogen AM9780 Removes RNAse contamination.
Sample dilutent ForteBio 18 1104 Activate Protein A tips.
Serological pipets (5, 10, 25 mL) Corning 4487, 4488, 4489 Used for sterile cell culture tecniques.
Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF Sigma Aldrich 296813 Reducing agent.
Solution 18 ChemoMetec 910-3018 Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)
Spin-X Centrifuge Tube Filters Corning 8161  0.22 µm pore, Cellulose Acetate membrane.
Suspension plate with lid, 6-well Greiner Bio 657 185 Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures.
Syringe filters,  0.22 μm Sartorius 514 7011 Surfactant-free cellulose acetate (SFCA)
Syringes with Luer lock tip, 20 mL Fisher Scientific 10569215 For secure connection with syringe filter.
Trypan Blue solution Gibco 15250061 Stains dead and dying cells.
Vivaspin 500, 3,000 MWCO Sartorius VS0191 Polyethersulfone
WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit Thermo Fisher Scientific WB7105 Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jefferis, R. Glycosylation as a strategy to improve antibody-based therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 226-234 (2009).
  2. Rathore, A. S., Winkle, H. Quality by design for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 27 (1), 26-34 (2009).
  3. Eon-Duval, A., Broly, H., Gleixner, R. Quality attributes of recombinant therapeutic proteins: An assessment of impact on safety and efficacy as part of a quality by design development approach. Biotechnology Progress. 28 (3), 608-622 (2012).
  4. Lalonde, M. -E., Durocher, Y. Therapeutic glycoprotein production in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 251, 128-140 (2017).
  5. Mimura, Y., et al. Glycosylation engineering of therapeutic IgG antibodies: challenges for the safety, functionality and efficacy. Protein & Cell. 9 (1), 47-62 (2018).
  6. Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36 (12), 1136-1145 (2018).
  7. Zhang, M., Koskie, K., Ross, J. S., Kayser, K. J., Caple, M. V. Enhancing glycoprotein sialylation by targeted gene silencing in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. , (2010).
  8. Kanda, Y., et al. et al. of a GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) knockout host cell line: a new strategy for generating completely non-fucosylated recombinant therapeutics. Journal of Biotechnology. 130 (3), 300-310 (2007).
  9. Umaña, P., Jean-Mairet, J., Moudry, R., Amstutz, H., Bailey, J. E. Engineered glycoforms of an antineuroblastoma IgG1 with optimized antibody-dependent cellular cytotoxic activity. Nature Biotechnology. 17 (2), 176-180 (1999).
  10. Xu, X., et al. et al. genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).
  11. Chan, K. F., et al. et al. of GDP-fucose transporter gene (Slc35c1) in CHO cells by ZFNs, TALENs and CRISPR-Cas9 for production of fucose-free antibodies. Biotechnology Journal. 11 (3), 399-414 (2016).
  12. Zhang, P., et al. Identification of functional elements of the GDP-fucose transporter SLC35C1 using a novel Chinese hamster ovary mutant. Glycobiology. 22 (7), 897-911 (2012).
  13. Amann, T., et al. Genetic engineering approaches to improve posttranslational modification of biopharmaceuticals in different production platforms. Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2778-2796 (2019).
  14. Karottki, K. J., et al. Awakening dormant glycosyltransferases in CHO cells with CRISPRa. Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 593-598 (2020).
  15. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  16. Hammond, S. M., Bernstein, E., Beach, D., Hannon, G. J. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature. 404 (6775), 293-296 (2000).
  17. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., Hannon, G. J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409 (6818), 363-366 (2001).
  18. Shields, R. L., et al. et al. of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human FcγRIII and antibody-dependent cellular toxicity. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 26733-26740 (2002).
  19. Shinkawa, T., et al. et al. Absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 3466-3473 (2003).
  20. Mori, K., et al. Engineering Chinese hamster ovary cells to maximize effector function of produced antibodies using FUT8 siRNA. Biotechnology and Bioengineering. 88 (7), 901-908 (2004).
  21. Imai-Nishiya, H., et al. Double knockdown of alpha1,6-fucosyltransferase (FUT8) and GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) in antibody-producing cells: a new strategy for generating fully non-fucosylated therapeutic antibodies with enhanced ADCC. BMC Biotechnology. 7, 84 (2007).
  22. Beuger, V., et al. et al. silencing of fucosyltransferase 8 in Chinese-hamster ovary cells for the production of antibodies with enhanced antibody immune effector function. Biotechnology and Applied Biochemistry. 53 (1), 31 (2009).
  23. Templeton, N., Dean, J., Reddy, P., Young, J. D. Peak antibody production is associated with increased oxidative metabolism in an industrially relevant fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 2013-2024 (2013).
  24. Hussain, H., et al. A comparative analysis of recombinant Fab and full-length antibody production in Chinese hamster ovary cells. Biotechnology and Bioengineering. 118 (12), 4815-4828 (2021).
  25. Shimoyama, H., et al. Partial silencing of fucosyltransferase 8 gene expression inhibits proliferation of Ishikawa cells, a cell line of endometrial cancer. Biochemistry and Biophysics Reports. 22, 100740 (2020).
  26. Tummala, S., et al. Evaluation of exogenous siRNA addition as a metabolic engineering tool for modifying biopharmaceuticals. Biotechnology Progress. 29 (2), 415-424 (2013).
  27. Carillo, S., et al. Comparing different domains of analysis for the characterisation of N-glycans on monoclonal antibodies. Journal of Pharmaceutical Analysis. 10 (1), 23-34 (2020).
  28. Reusch, D., et al. Comparison of methods for the analysis of therapeutic immunoglobulin G Fc-glycosylation profiles-Part 2: Mass spectrometric methods. mAbs. 7 (4), 732-742 (2015).
  29. Donini, R., Haslam, S. M., Kontoravdi, C. Glycoengineering Chinese hamster ovary cells: a short history. Biochemical Society Transactions. 49 (2), 915-931 (2021).
  30. Szigeti, M., Chapman, J., Borza, B., Guttman, A. Quantitative assessment of mAb Fc glycosylation of CQA importance by capillary electrophoresis. ELECTROPHORESIS. 39 (18), 2340-2343 (2018).
  31. Ruhaak, L. R., et al. Optimized workflow for preparation of APTS-labeled N-glycans allowing high-throughput analysis of human plasma glycomes using 48-channel multiplexed CGE-LIF. Journal of Proteome Research. 9 (12), 6655-6664 (2010).
  32. Patenaude, A. -M., et al. N-glycosylation analysis of mouse immunoglobulin G isolated from dried blood spots. Electrophoresis. 42 (24), 2615-2618 (2021).
  33. Karst, D. J., et al. Modulation and modeling of monoclonal antibody N-linked glycosylation in mammalian cell perfusion reactors. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 1978-1990 (2017).
  34. Dadouch, M., Ladner, Y., Perrin, C. Analysis of monoclonal antibodies by capillary electrophoresis: sample preparation, separation, and detection. Separations. 8 (1), 4 (2021).
  35. Fakhr, E., Zare, F., Teimoori-Toolabi, L. Precise and efficient siRNA design: a key point in competent gene silencing. Cancer Gene Therapy. 23 (4), 73-82 (2016).
  36. Birmingham, A., et al. A protocol for designing siRNAs with high functionality and specificity. Nature Protocols. 2 (9), 2068-2078 (2007).
  37. Makrydaki, E., et al. Immobilised enzyme cascade for targeted glycosylation. , (2022).
  38. Bulletin_6201.pdf. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6201.pdf (2022).
  39. Bulletin_6376.pdf. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2022).
  40. Dot Blot Analysis. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/dot-blot/index.html (2022).
  41. Yilmazel, B., et al. Online GESS: prediction of miRNA-like off-target effects in large-scale RNAi screen data by seed region analysis. BMC Bioinformatics. 15 (1), 192 (2014).
  42. Kittler, R., et al. Genome-wide resources of endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nature Methods. 4 (4), 337-344 (2007).
  43. Stec, E., et al. A multiplexed siRNA screening strategy to identify genes in the PARP pathway. Journal of Biomolecular Screening. 17 (10), 1316-1328 (2012).
  44. Brown, J. M., et al. Ligand conjugated multimeric siRNAs enable enhanced uptake and multiplexed gene silencing. Nucleic Acid Therapeutics. 29 (5), 231-244 (2019).
  45. Parsons, B. D., Schindler, A., Evans, D. H., Foley, E. A direct phenotypic comparison of siRNA pools and multiple individual duplexes in a functional assay. PLoS One. 4 (12), 8471 (2009).
  46. Martin, S. E., et al. Multiplexing siRNAs to compress RNAi-based screen size in human cells. Nucleic Acids Research. 35 (8), 57 (2007).
  47. Popp, O., Moser, S., Zielonka, J., Rüger, P., Hansen, S., Plöttner, O. Development of a pre-glycoengineered CHO-K1 host cell line for the expression of antibodies with enhanced Fc mediated effector function. mAbs. 10 (2), 290-303 (2018).
  48. Yang, P. -C., Mahmood, T. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
  49. Troubleshooting Western Blots with the Western Blot Doctor. Bio-Rad Laboratories. , Available from: https://www.bio-rad.com/en-uk/applications-technologies/troubleshooting-western-blots-with-western-blot-doctor?ID=MIW4HR15 (2022).
  50. Steentoft, C., et al. Precision mapping of the human O-GalNAc glycoproteome through SimpleCell technology. EMBO. 32 (10), 1478-1488 (2013).
  51. FUT8 - Alpha-(1,6)-fucosyltransferase - Proteomics. , Available from: https://www.nextprot.org/entry/NX_Q9BYC5/proteomics (2022).
  52. Kotidis, P., et al. Rapid antibody glycoengineering in CHO cells via RNA interference and CGE-LIF N-glycomics. Methods in Molecular Biology. 2370, 147-167 (2022).

Tags

Bioingeniør utgave 184
Rask antistoffglykoengineering i kinesiske hamsterovarieceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marbiah, M., Kotidis, P., Donini,… More

Marbiah, M., Kotidis, P., Donini, R., Gómez, I. A., Jimenez del Val, I., Haslam, S. M., Polizzi, K. M., Kontoravdi, C. Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells. J. Vis. Exp. (184), e63872, doi:10.3791/63872 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter