Summary
Bir antikorun glikozilasyon paterni klinik performansını belirler, bu nedenle glikozilasyonu kontrol etmek için endüstriyel ve akademik çabalar devam eder. Tipik glikomühendislik kampanyaları zaman ve emek yoğun olduğundan, geçici susturma kullanarak glikozilasyon genlerinin etkisini karakterize etmek için hızlı bir protokolün oluşturulması yararlı olacaktır.
Abstract
Rekombinant monoklonal antikorlar spesifik moleküler hedefleri bağlar ve daha sonra bir immün yanıtı indükler veya diğer ligandların bağlanmasını inhibe ederler. Bununla birlikte, monoklonal antikor işlevselliği ve yarı ömrü, konakçıya özgü glikozilasyonun tipi ve dağılımı ile azaltılabilir. Üstün antikorlar üretme girişimleri, gliko ile optimize edilmiş antikorları sentezleyen genetiği değiştirilmiş üretici hücrelerin gelişimine ilham vermiştir. Glikomühendislik tipik olarak, kümelenmiş düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) ile ilişkili protein 9 gibi yöntemler kullanılarak kararlı bir nakavt veya knockin hücre hattının üretilmesini gerektirir. Mühendislik hücreleri tarafından üretilen monoklonal antikorlar daha sonra istenen glikoprofilin elde edilip edilmediğini belirlemek için kütle spektrometrik yöntemler kullanılarak karakterize edilir. Bu strateji zaman alıcıdır, teknik olarak zordur ve uzmanlar gerektirir. Bu nedenle, genetik glikomühendislik ve glikan tespiti için kolaylaştırılmış protokolleri kullanan alternatif bir strateji, optimal antikorlara yönelik çabalara yardımcı olabilir. Bu kavram kanıtı çalışmasında, IgG üreten bir Çin hamster yumurtalık hücresi, glikomühendisliği optimize etmek için ideal bir konakçı olarak görev yaptı. Fut8 genini hedef alan kısa müdahale eden RNA, Çin hamster yumurtalık hücrelerine verildi ve FUT8 protein ekspresyonunda ortaya çıkan değişiklikler ölçüldü. Sonuçlar, bu yöntemle yapılan nakavtın etkili olduğunu ve FUT8'de ~% 60'lık bir azalmaya yol açtığını göstermektedir. Antikor glikoprofilinin tamamlayıcı analizi, hızlı ama oldukça hassas bir teknik kullanılarak gerçekleştirildi: kılcal jel elektroforezi ve lazerle indüklenen floresan tespiti. Tüm nakavt deneyleri, afukozile glikanlarda bir artış gösterdi; Bununla birlikte, bu çalışmada elde edilen en büyük değişim ~% 20 idi. Bu protokol, in silico tasarım araçlarını, ticari olarak sentezlenmiş gen hedefleme reaktiflerini ve kapsamlı bir önceki deneyim gerektirmeyen hızlı niceleme testlerini kullanarak glikomühendislik çabalarını basitleştirir. Bu nedenle, bu protokol tarafından sunulan zaman verimlilikleri, yeni gen hedeflerine yönelik araştırmalara yardımcı olabilir.
Introduction
N-bağlı glikozilasyon, oligosakkarit moieties kovalent olarak Asn kalıntılarına bağlandığı enzimatik bir süreçtir. De novo protein sentezinden farklı olarak, glikan sentezi, proteinlerin heterojen glikozilasyonu ile sonuçlanan şablonsuz bir reaksiyondur. Glikanların yapısı, bileşimi ve dağılımı protein konformasyonunu ve fonksiyonunu etkileyebilir. Gerçekten de, immünoglobulin G'nin (IgG) kristalize edilebilir fragman (Fc) bölgesindeki N-glikozilasyon, antikor1'in terapötik etkinliğini, immünojenitesini ve yarı ömrünü düzenler. Bu nedenle, rekombinant biyoterapötik protein ürünlerinin geliştirilmesi için tasarıma göre kalite (QbD) paradigması, glikozilasyonu doğal olarak kritik bir kalite özelliği (CQA) 2,3 olarak tanımlar. Memeli hücreleri genellikle tercih edilen ekspresyon sistemleridir, çünkü doğal olarak insan benzeri glikozilasyon modellerini bakteri, maya, böcek veya bitki hücrelerinden daha yakından üretirler. Dahası, Çin hamster yumurtalık (CHO) hücreleri, diğer memeli hücre hatları üzerinde seçilir, çünkü insan virüsü enfeksiyonuna dirençlidirler, yüksek titrelerde ürünler salgılarlar ve süspansiyon kültüründe yüksek canlı hücre yoğunluklarına kadar yetiştirilebilirler4. Glikan oluşumu ile ilgili olarak, CHO olmayan murin üretim hücreleri, monoklonal antikorların (mAbs) güvenli kullanımını etkileyen immünojenik glikanlar (α(1-3)-Gal] ve N-glikolilnöraminik asit [NeuGc]) α(1-3)-Gal] üretir. Bu faydalar, CHO hücrelerini 2014 ve 2018 yılları arasında yeni biyoterapötiklerin% 80'inden fazlasının üretilmesinden sorumlu olan en önde gelen ekspresyon sistemi haline getirmektedir6. Bununla birlikte, şablondan bağımsız glikozilasyon, bir dizi glikoform ile CHO kaynaklı biyoterapötiklere yol açan korunmuş bir mekanizmadır.
Biyoterapötik geliştirme stratejileri, genetik mühendisliği ile CHO hücrelerinde heterojenliği kontrol etmeyi amaçlamaktadır. Bazı literatür örnekleri arasında sialidazların (Neu1, Neu3)7, GDP-mannoz 4,6-dehidrataz (GMD) nakavt8'in ve glikoziltransferazların (GnTIII) aşırı ekspresyonunun (GnTIII) 9 nakavtı sayılabilir. Glikomühendislikteki ilerlemeler, CHO genom10 gibi halka açık kaynakların bir kombinasyonu ve transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazlar (TALEN'ler), çinko parmak nükleazları (ZFN'ler) ve kümelenmiş düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) ile ilişkili protein 9 (CRISPR-Cas9) 11,12,13,14 gibi genetik mühendisliği araçlarının devam eden gelişimi nedeniyle mümkündür. . Bu araçlar tipik olarak CHO hücrelerine plazmid DNA'sı veya saflaştırılmış ribonükleoprotein (RNP) kompleksleri olarak verilir. Tersine, RNA girişimi (RNAi), en basit haliyle, sadece saflaştırılmış kısa müdahale eden RNA (siRNA) oligonükleotidlerinin verilmesini gerektiren bir genetik mühendisliği teknolojisidir. Endojen proteinler çift sarmallı siRNA'yı tek iplikçiklere dönüştürür ve nükleaz, RNA kaynaklı susturma kompleksi (RISC), hedef mRNA dizilerini15,16,17 ayırmak için siRNA ile bir kompleks oluşturur. Bu yöntemle gen susturma, RNA instabilitesi nedeniyle geçicidir, ancak buradaki araştırma, hızlı taramaya yardımcı olmak için bu özellikten yararlanmaktadır.
Mevcut çalışma için seçilen model enzim, α1,6-fukoziltransferaz (FUT8), α-1,6 çekirdeğe bağlı L-fukoz (Fuc) ile N-glikanlar üretir. Bu modifikasyon, ticari antikorların çalışmalarıyla kanıtlandığı gibi, antikora bağımlı hücre sitotoksisitesi (ADCC) aktivitesinin birincil belirleyicisidir. Çekirdek fukozilasyonunun yokluğunda, Rituximab (anti-CD20 IgG1) ADCC'yi 50 kat arttırır ve FcgRIIIa bağlanmasını18,19 iyileştirerek Trastuzumab'da (anti-Her2 IgG1) ADCC'yi arttırır. Bu nedenle, çekirdek fukozilasyon, bu fenotipi tersine çevirme çabalarını garanti eden mAbs'nin istenmeyen bir özelliği olarak kabul edilir. ADCC20,21,22'de eşzamanlı artışlarla siRNA kullanarak başarılı Fut8 gen hedefleme örnekleri vardır, ancak bu örnekler plazmid DNA'sı üzerinde kodlanmış Fut8 siRNA'yı verir. Bu tür deneyler, plazmid DNA'sı siRNA sentezi için bir şablon görevi gördüğü için kararlı gen susturma üretir. Bu, hücrelerin hücre içi RNazlar ve fosfatazlar tarafından parçalanan siRNA moleküllerini yenilemesine izin verir. Tersine, eksojen sentetik siRNA'nın verilmesi, hücre içi bir şablonun eksikliği nedeniyle siRNA'nın yenilenemediği için sadece geçici gen susturulmasına izin verir. Bu nedenle, kullanıcılar deneysel tasarımların plazmid türevi veya sentetik siRNA ile uyumlu olup olmadığını düşünmelidir. Örneğin, pik mAb üretimine odaklanan çalışmalar, tipik olarak23,24 kültürünün altıncı günü, pik ekspresyondan birkaç gün önce hücrelere verilebilen sentetik siRNA'yı tercih edebilir. Sentetik siRNA kullanan geçici bir yaklaşımın faydaları, üretimi dış kaynak olarak kullanma yeteneğini ve plazmidlerde yapılar üretmek için geçen sürenin bir kısmında çoklu siRNA yapılarının üretilebileceği gerçeğini içerir. Ayrıca, sentetik siRNA, FUT8 protein ekspresyonu25'i azaltmak ve artmış FCgRIIIa bağlanması ve ADCC26 ile afukozile IgG'ler vermek için yeterli olan Fut8 gen susturma literatür örneklerinde kanıtlandığı gibi etkilidir.
Bu glikomühendislik protokolünün başarısı, Fc glikozilasyon derecesi ile belirlendi. Kütle spektrometrisi normalde glikomik analizler için tercih edilen yöntemdir; Bununla birlikte, kılcal jel elektroforezi ve lazerle indüklenen floresan tespiti (CGE-LIF), saflaştırılmış IgG'lerin glikoprofilini çözmek için mükemmel bir şekilde uygundur ve daha hızlı ve basitlik avantajına sahiptir. Kütle spektrometresi protokolleri, uygun kromatografik ve türevlendirme yöntemlerini, iyonizasyon kaynaklarını ve kütle analizörlerini27,28,29 birleştirmelidir. Eğitimli bir uzmana ihtiyaç duymanın yanı sıra, kütle spektrometresi protokolleri uzundur ve yöntemlerin çeşitliliği, verilerin farklı kurulumlara sahip laboratuvarlar arasında karşılaştırılmasını zorlaştırır. Biyofarmasötikler bağlamında, CGE-LIF bir antikor glikoprofili hakkında yeterli ayrıntı sağlayabilen ve yüksek verimli yöntemler için kolayca ölçeklendirilebilen hassas bir yöntemdir. Düşük bollukta, zayıf karakterize glikoproteinlere sahip oldukça karmaşık karışımlar için, kütle spektrometrisinin avantajları devam edebilir. Bununla birlikte, CGE-LIF tabanlı N-glikan analizi tarafından sağlanan yüksek çözünürlüklü ve yüksek hassasiyetli mAb analitiği, bu yöntemi denemek için bir gerekçe görevi görür. Ayrıca, numune hazırlama ve analiz sadece birkaç saat içinde tamamlanır30. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, CGE-FIF'in insan plazması31, fare 32 ve CHO IgGs33'ten türetilen glikanları izlemek için kullanılabileceğini göstermiştir. Bu çalışmalar, yüksek verimli numune analizi ve küçük numune hacimleri için CGE-LIF kullanımını vurgulamaktadır.
CGE-LIF yönteminin dikkate alınması gereken sınırlamaları vardır. Maliyet, glikan analizi için bu ve diğer cihazların kullanılmasında önemli bir engeldir. Bununla birlikte, bu maliyetler sahada tipiktir ve CGE-FIF'in uygun maliyetli bir seçenek olduğu düşünülmektedir34. Daha küçük bütçeli laboratuvarlar, makine kiralamayı veya numune analizini dış kaynak olarak kullanmayı daha pratik bulabilir. Herhangi bir analitik yöntemin bir başka hususu da tekrarlanabilirliktir. CGE-LIF'in değerlendirilmesi, farklı günlerde test edilen aynı numunenin 48 kopyası kullanılarak gerçekleştirildi. Kılcal damar başına nispi standart sapma, intrabatch ve interbatch tekrarlanabilirlik için belirlendi. Replikaların parti içi karşılaştırmasında, kılcal performansın tekdüze olmadığını gösteren% 6.2'lik bir nispi standart sapmaya sahip olduğu bulunmuştur. Ayrıca, partiler arası verilerin karşılaştırılması,% 15.8 31'lik göreceli bir standart sapma gösterdi ve kılcal performansın zamanla değiştiğini gösterdi. Tespit edilen operasyonel eksiklikler, farklı makineler ve tescilli reaktifler kullanan mevcut çalışmada geçerli olmayabilir. Kullanıcılar şirket içi bir protokol geliştirmek istiyorlarsa, Ruhaak ve ark. tarafından yapılan çalışmayı dikkate almaya değer olacaktır. CGE-LIF için reaktifleri dikkatlice değerlendiren 31. Bu nedenle, numune enjeksiyonu (Hi-Di Formamid ve DMSO), glikan etiketleme (NaBH3CN veya 2-pikolin boran)31 ve diğerleri için reaktifler optimize edilmiştir.
Bu çalışma, doğrudan RNAi'nin hızını aşağı akış glikomik analizi ile birleştiren zaman verimli bir glikomühendislik protokolü sunmaktadır. Metodoloji, yukarıda özetlenen nedenlerden dolayı Fut8 genini hedef olarak kullanarak gösterilmiştir.
Protocol
1. DsiRNA tasarımı ve sulandırma
- IDT web sitesine erişmek için Safari, Firefox veya Microsoft Edge kullanın (https://eu.idtdna.com). Giriş sayfasından, Ürünler ve Hizmetler sekmesini ve ardından RNA girişimini seçin. Fut8 genini hedefleyen özel diser-substratlar (DsiRNA) yapıları oluşturmak için, Tasarım aracını ve ardından Özel DsiRNA Oluştur sekmesini seçin.
- Fut8 Katılım Numarasını girin veya başlamak için gen dizisini manuel olarak girin. Bu çalışmada, hem "CHO-K1" hem de "Çin Hamster" girişlerinden önerilen Fut8 dizileri https://chogenome.org elde edilmiş ve DsiRNA üretmek için kullanılmıştır. Çoğu genin birkaç transkript varyantı vardır ve DsiRNA'nın mevcut derlemede bildirilen tüm varyantlarda aktif olacağını doğrulamak önemlidir.
- CHO hücre genomu şu anda IDT web sitesinde "referans genom" olarak mevcut olmadığından "Manuel BLAST" araması yapma seçeneğini belirleyin. Bu adım, özel DsiRNA dizileri ile ilgilenilen genom arasındaki eşleşmeleri arar.
- DsiRNA dizileri oluşturmak için Ara'ya tıklayın.
- Buna karşılık, vergi kimliği: 10029 (CHO hücre hatları ve Çin hamsteri) ile "Manuel BLAST" işlevini kullanarak her DsiRNA'nın özgüllüğünü değerlendirin. Sorgu kapsamı sonuçları, DsiRNA yapılarının Fut8 (Fut8 transkript varyantları dahil) ile %100 eşleştiğini, istenmeyen hedeflere karşı tamamlayıcılığın ise %≤76%35 olduğunu göstermektedir.
- GC içeriğinin% 30 ila% 50 arasında olmasını sağlamak için DsiRNA'nın özellikle Fut8'i hedeflediğini kontrol edin. Düşük GC içeriği zayıf ve spesifik olmayan bağlanma ile ilişkilendirilirken, yüksek GC içeriği siRNA'nın çözülmesini ve RISC kompleksi36'ya yüklenmesini engeller.
- Transfeksiyon çalışmalarında kullanılmak üzere üç DsiRNA seçin (Tablo 1), her biri Fut8 geninin farklı bir yerini hedefler. Kontrol deneyleri için IDT'den önceden tasarlanmış hedeflemesiz veya karıştırılmış bir DsiRNA satın alın.
- Varışta, tüpü açmadan önce DsiRNA'yı 13.300 x g'de 1 dakika boyunca peletlemek için santrifüj yapın. Her liyofilize DsiRNA'yı nükleaz içermeyen dupleks tamponda (IDT tarafından sağlanan) 100 μM'lik bir stok çözeltisine yeniden oluşturun. Örneğin, 100 μM'lik bir stok elde etmek için 2 nmol DsiRNA'ya 20 μL tampon ekleyin.
- Yeterli karıştırmayı sağlamak için, stok çözeltilerini oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin ve yörüngesel bir çalkalayıcıda (50 rpm, 16 mm yörünge) hafifçe sallayın.
- Fut8'i (her DsiRNA'nın 100 μM'si) hedefleyen her DsiRNA yapısının 20 μL'sini birleştirerek bir ana karışım oluşturun. Alikotları hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın.
| DsiRNA hedefi | Sıra | GC (%) | ||
| Yapı A | 5' GAGAAGAUAGAAACAGUCAAAUACC 3' | 36% | ||
| 5' GGUAUUUGACUGUUUCUAUCUUCUCUC 3' | ||||
| Yapı B | 5' AGAAUGAGAAUGGAUGUUUUUCCTT 3' | 32% | ||
| 5' AAGGAAAAACAUCCAUUCUCAUUCUGA 3' | ||||
| Yapı C | 5' AGAGAAGAUAGAAACAGUCAAAUAC 3' | 32% | ||
| 5' GUAUUUGACUGUUUCUAUCUUCUCUCG 3' | ||||
Tablo 1. Fut8 knockdown için kullanılan DsiRNA dizileri. Çin hamsterinde Fut8'i hedef alan IDT tarafından üretilen diziler ve CHO K1 hücre genomları. Her yapı için sense ve antisense dizileri (sırasıyla) gösterilir ve her yapının GC içeriği görüntülenir. Kotidis et al. 52.
2. DsiRNA transfeksiyonu
- İlgilenilen hücre hattına uygun kültür koşullarını kullanarak bir IgG monoklonal antikoru37 eksprese eden CHO hücrelerini canlandırın.
NOT: Bu çalışmada kullanılan hücreler, endojen GS'nin nadir yüksek verimli klonların seçimini arttırmak için L-metiyonin sülfoksimin (MSX) tarafından inhibe edildiği glutamin sentetaz (GS) sistemi kullanılarak üretilmiştir. Bu nedenle, MSX'i yalnızca tercih edilen hücre satırının gerektirdiği durumlarda kullanın.- 37 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosunda 2-3 dakika boyunca bir şişe hücrenin buzunu çözün. Şişenin dış yüzeyini %70 (v/v) etanol ile temizleyin ve tüm çalışmalara sınıf II biyogüvenlik kabininde devam edin.
- Hücre süspansiyonunu, seçilen hücre hattına uygun 9 mL önceden ısıtılmış ortam içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüjleme ile hücreleri pelet edin.
- Hücre peletini rahatsız etmeden ortamı dikkatlice çıkarın ve atın. Daha sonra, hücre peletini 10 mL önceden ısıtılmış ortamda yeniden askıya alın ve saymak için bir aliquot alın.
- Bir hemositometre ile sayıyorsanız hücreleri Trypan mavisi ile lekeleyin veya otomatik bir hücre sayacı kullanırken canlı / ölü hücreleri ayırt etmek için uygun bir leke.
- Her iki numaralandırma yöntemini de takiben, uygun bir hücre süspansiyonu hacmini, 30 mL ortamda 3 x 10 5 hücre·mL-1 (isteğe bağlı50 μM MSX takviyesi ile) canlı bir hücre yoğunluğunda 125 mL Erlenmeyer sallama şişesine aktarın.
- Hücreleri 36,5 ° C, % 5 CO2'ye ayarlanmış bir inkübatöre aktarın ve 150 rpm'de (16 mm yörünge) sallanan bir platforma yerleştirin.
- Her 3-4 günde bir 2 x 10tohumlama yoğunluğunda geçiş hücreleri 5 hücre · mL-1 ve 250 mL'lik bir Erlenmeyer sallama şişesinde 50 mL'lik bir çalışma hacmi. MSX kullanıyorsanız, ilk pasajdan sonra takviyeyi bırakın.
- Geçiş hücreleri çözülmeye ek olarak 2 kat.
- Transfeksiyon
- Hücre yoğunluğunu değerlendirin ve hücre canlılığının% 90'dan fazla olduğundan emin olun.
- Kontaminasyonu önlemek için biyogüvenlik kabinini ve tüm ekipmanı %70 (v/v) etanol ve bir RNaz inhibitörü çözeltisi ile dikkatlice temizleyin.
- Pelet hücreleri 5 dakika boyunca 100 x g'da ve önceden ısıtılmış ortamda 5 x 10 6 hücreli canlı bir hücre yoğunluğuna kadar yeniden askıya alınır· mL-1.
- DsiRNA ana karışımının 8 μL'sini (1 μM'ye eşdeğer) aktarın veya steril (0,4 cm) bir elektroporasyon küvetine kontrol edin. Daha sonra, hücre süspansiyonunun 800 μL'sini (4 x 106 hücreye eşdeğer) aynı küvete aktarın ve her iki bileşenin de karıştırıldığından emin olun.
- Aşağıdaki darbe koşullarını sağlayın: 1200 V, 0,1 ms, kare dalga formu.
- Hücre süspansiyonunu küvetten 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın ve köpük benzeri malzemeden kaçınmaya özen gösterin. İnkübatördeki hücreleri (36.5 ° C, % 5 CO2) 10 dakika boyunca sallamadan geri kazanın.
- Kuyu başına 1,6 mL'lik bir son hacim yapmak için 800 μL önceden ısıtılmış ortam ekleyin ve 150 rpm'de (16 mm yörünge) sallanırken transfekte edilmiş hücreleri büyüme için inkübatöre (36,5 ° C,% 5 CO2) geri döndürün.
- Süpernatantları ve hücreleri transfeksiyon sonrası 48 saatte hasat edin.
Durma noktası: Hücre kültürü süpernatantı -20 ° C'de tutulabilir; Bununla birlikte, protein yıkımını önlemek için hücre peleti toplanmasından hemen sonra hücre lizisinin yapılması tavsiye edilir. Süpernatanlar Adım 3, Adım 4 ve Adım 5'te kullanılırken, hücre peletleri Adım 6'da kullanılır.
3. IgG nicelleştirme ve saflaştırma
- Biyolayer interferometri veya başka bir seçim yöntemi kullanarak IgG konsantrasyonunu ölçün.
- Hidrat proteini Bir biyosensör, numune seyrelticisinde 10-30 dakika boyunca uçlar. Bu arada, hücre süspansiyonlarını 5 dakika boyunca 100 x g'de 15 mL santrifüj tüplerine ve pelet hücrelerine aktarın veya 0.45 μm nitroselüloz filtreden filtrasyon yoluyla hücreleri çıkarın.
- Peleti rahatsız etmeden, IgG içeren izole edilmiş süpernatantı dikkatlice temiz bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Biyokatman interferometrisi için aşağıdaki ayarları kullanın: çalkalayıcı hızı, 2200 rpm; çalışma süresi, 60 sn. Bu parametreler tüm numuneleri ve kontrolleri ölçmek için kullanılacaktır.
- Biyosensör uçları hidratlandıktan sonra, bir IgG standardı (her konsantrasyonun 4 μL'si) kullanarak standart bir eğri oluşturun.
- Hücre süpernatantının 4 μL'sini yükleyerek numune konsantrasyonlarını sayısallaştırın. Aparatı her numune arasında tüy bırakmayan mendillerle temizleyin.
- Bilinmeyen örneklerin bağlanma hızını interpolasyon yapmak için standart eğriyi bilinmeyen örneklere bağlayın. Verileri kaydedin ve csv veya PDF dosyası olarak dışa aktarın.
- IgG saflaştırma
- 0,2 M glisin (pH 2,5) içeren elüsyon tamponu hazırlayın ve 0,22 μm'lik bir filtreden geçerek sterilize edin.
- İzole edilmiş süpernatantın 1 mL'sini, tüm süpernatant akana kadar 0,22 μm mikrosantrifüj filtre tüpleri kullanarak oda sıcaklığında filtreleyin.
- Pelet 150-200 μL protein A agaroz boncukları 1.5 mL santrifüj tüplerinde 100 x g'de 3 dakika boyunca ve süpernatanı atın. Daha sonra, protein A boncuklarını 150-200 μL hücre kültürü ortamı ile yıkayın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Süper natantı atın.
- Dengelenmiş protein A boncuklarını, hazırlanan süpernatantların 1 mL'si ile Adım 3.2.3'ten itibaren yeniden askıya alın. ve 1 mL'lik bir polipropilen tüpe yükleyin. Polipropilen tüpü döner bir karıştırıcıya (15 mm yörüngede) yapıştırın ve oda sıcaklığında 60-90 dakika boyunca veya 4 ° C'de gece boyunca 30 rpm'de döndürün.
- Kuluçka tamamlandıktan sonra, akışı toplayın ve bağlanmamış proteinleri çıkarmak için boncukları 1 mL 1x PBS ile yıkayın. Yıkama fraksiyonunu da toplayın.
- Polipropilen kolona 3 mL elüsyon tamponu ekleyerek A proteini boncuklarından IgG'yi süzün. Sütundan (her biri 500 μL) etiketli tüplere boşalan sıralı fraksiyonları toplayın.
- İsteğe bağlı: Saflaştırılmış antikor depolanacaksa, 1 M Tris pH 9.5'in 25 μL'sini ekleyerek elüsyon tamponunu nötralize edin. Antikor tampon değişimi vb. yoluyla hemen işlenecekse bu adımı atlayın.
NOT: Saflaştırmanın tüm kısımları (akış, yıkamalar ve tüm elüsyon fraksiyonları), hedef proteinin kaybolmaması için tutulmalıdır. Bu numuneler, saflaştırma başarılı olmazsa sorun giderme sırasında da yardımcı olabilir. - Çıkış yönündeki işleme için ilk elüsyonu (elüsyon A) kullanın, ancak gelecekte gerekli olmaları durumunda diğer tüm fraksiyonları saklayın.
4. Tampon değişimi ve numune konsantrasyonu
- IgG elüsyon arabelleğini 1x PBS ile değiştirin.
- Elüsyon A'yı 3 kDa moleküler ağırlıklı kesme santrifüjlü konsantrikatör üzerine yükleyin. Uygun bir MWCO sütunu seçerken üreticinin kılavuzuna bakın. Bu deneyde, daha küçük bir gözenek boyutu, salgılanan proteinin maksimum tutulmasını sağlar, ancak aynı zamanda santrifüjleme süresini de arttırır.
- 4 °C'de 40-50 dakika boyunca 13.300 x g'de santrifüj. Santrifüjleme, artık hacim 50 μL'ye eşit veya daha az olduğunda tamamlanır.
- Akışı atın ve kalan süpernatanı seyreltmek için 500 μL önceden soğutulmuş (4 °C) 1x PBS ekleyin. 50 μL artık süpernatant kalana kadar aynı koşulları (4 ° C'de 40-50 dakika boyunca 13.300 x g) kullanarak numuneyi tekrar santrifüj edin.
- Artık süpernatantı seyreltmek için 500 μL önceden soğutulmuş (4 °C) 1x PBS ekleyin ve süpernatanın 100x seyreltilmesini elde etmek için santrifüjleme işlemini tekrarlayın.
- Süpernatantı ~ 2.5 g· nihai konsantrasyona konsantre edin L-1'in glikan analiz yöntemiyle uyumluluğunu sağlamak için 40 μL veya daha az.
NOT: Glikan analizi için 100 μg yüklenmesi gerekir.
Durma noktası: Konsantre IgG (1x PBS'de) -20 ° C'de saklanabilir ve glikan analizinden önce çözülebilir.
5. Glikan analizi
- Üreticinin talimatlarına göre kılcal jel elektroforezi kullanarak glikan analizi yapın.
- Manyetik boncuk çözeltisinin 200 μL'sini 0,2 mL'lik bir PCR tüpüne aktarın ve boncukları süpernatandan ayırmak için manyetik standın üzerine yerleştirin.
- Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve tüpleri manyetik standdan çıkarın. Tam karıştırmayı sağlamak için saflaştırılmış protein numunesini ve vorteksi ekleyin.
- Numune tüpüne denatürasyon tamponu (ürünle verilir) ekleyin ve 60 °C'de 8 dakika kuluçkaya yatırın. Optimum reaksiyon performansı için numune tüplerini açık tutun.
- PNGaz F (numune başına 500 ünite) ekleyin ve saflaştırılmış antikorlardan glikanları ayırmak için 60 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
- N-glikanların salınımını takiben, numune tüpünü ve girdabını kapatın. Asetonitril, vorteks ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin.
- Boncukları çözeltiden ayırmak için numune tüplerini manyetik standa yerleştirin. Boncuklara dokunmadan süpernatantı dikkatlice çıkarmak için bir pipet kullanın.
- Bir duman davlumbazında, florofor içeren glikan etiketleme çözeltisini numuneye ekleyin. Yeterli karıştırmayı sağlamak için vorteks ve 20 dakika boyunca 60 ° C'de inkübe edin (açık kapaklar).
- Fazla boyayı gidermek için numuneyi 3x asetonitril içinde yıkayın. Ardından, etiketli glikanları DDI suyunda (birlikte verilir) süzün.
- Boncukları saflaştırılmış ve etiketlenmiş glikanlar içeren süpernatanttan ayırmak için numune tüpünü manyetik standa yerleştirin.
- Glikoz merdiveni standardını, braket standartlarını ve numuneleri hazırlanan tepsi konumlarına hazırlayın ve yükleyin. Glikan analizi protokolünü çalıştırın.
- Numunede bulunan glikanları analiz etmek ve tanımlamak için uygun yazılımı kullanın.
NOT: Verimli inkübasyon için ısı bloğundaki sıcaklığın doğru olduğundan emin olun.
6. Batı lekesi
- Bir anti-α-1,6-fukoziltransferaz antikoru ile batı leke analizini kullanarak nakavt verimliliğini ölçün. Poliakrilamid jeller ve tampon tarifleri ticari tedarikçilerden temin edilebilir38,39.
- Transfeksiyon sonrası 48 saatte, bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve 5 x 106 hücreye eşdeğer hücre süspansiyonunun hacmini belirleyin.
- Her deneysel koşuldan uygun hücre süspansiyonu hacmini, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 13.200 x g'de steril bir 1.5 mL santrifüj tüpüne ve peletine aktarın. Süper natantı atın.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 1 v / v proteaz inhibitörü kokteyli içeren 200 μL lizis tamponu (memeli hücrelerinden proteinlerin ekstraksiyonu için uygun) olan hücreleri lize edin. Kuluçka sırasında karışımı hafifçe çalkalayın (50 rpm, 16 mm yörünge).
- Hücresel kalıntıları çıkarmak için, lizatı 10 dakika boyunca 13.200 x g'de santrifüj edin ve ardından temizlenmiş lizatı steril bir 1.5 mL tüpe aktarın.
- Her lizatın protein konsantrasyonunu 280 nm'de bir spektrofotometre kullanarak ölçün. Daha sonra, aynı protein konsantrasyonuna sahip olacak şekilde ayarlanmış her numunenin alikotlarını hazırlayın.
- DTT-SDS numune yükleme boyasında 10-15 dakika boyunca 100 °C'de inkübasyon ile protein numunelerini denatüre edin; son boya konsantrasyonu 1x'tir.
- Denatüre numunelerin 15 μL'sini ve 5 μL boyalı protein merdivenini, verimli ayırma için% 12,5 çözünür jeli ile bir SDS-PAGE jeline yükleyin. Numuneleri jel başına 25 mA'da 90 dakika boyunca veya boya ön kısmı jelin sonuna ulaşana kadar çalıştırın.
- Jeli kasetten dikkatlice çıkarın ve metanol içeren 1x transfer tamponunda inkübe edin.
- Islak transfer sistemini hazırlayın ve metanol ile bir PVDF membranını etkinleştirin. Islak transfer için jeli ve PVDF membranını monte edin, transfer tankına bir buz bloğu yerleştirin ve transfer koşullarının soğuk kalmasını sağlamak için tüm tankı buza batırın. 60 dakika boyunca 350 mA/100 V'ta çalıştırın.
- 50 rpm'de (16 mm yörünge) bir orbital çalkalayıcı üzerinde hafifçe sallarken, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir blokaj çözeltisi içinde inkübe ederek membranı bloke edin.
- Membranı steril suyla 5 dakika durulayın ve tekrarlayın. Ardından, görünür protein merdivenini kılavuz olarak kullanarak zarı ~ 50 kDa'da yatay olarak dikkatlice kesmek için temiz bir neşter kullanın.
- 50 kDa'dan daha büyük proteinleri barındıran membranı, bir antikor seyreltici tamponunda 1:1000'de anti-α-1,6-fukoziltransferaz antikoru ile inkübe edin. Membranı, seyreltici tamponda 1:10.000'de anti-GAPDH ile 50 kDa'dan daha az hareketsiz proteinlerle inkübe edin. Membranlar oda sıcaklığında 1 saat veya 4 °C'de gece boyunca inkübe edilebilir.
- Membranları 5 dakika (x3) boyunca yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca uygun bir ikincil antikor ile inkübe edin.
- 5 dakika boyunca bir yıkama tamponu ile 3x yıkama yapın, ardından 3x su ile yıkayın. Daha sonra, membranı bantlar görünene kadar (1-60 dakika) kromojenik bir substrat (veya uygun algılama reaktifi) ile geliştirin.
- Membranı 2x suyla durulayın ve kurumasını bekleyin. Membranın görüntüsünü yakalayın ve densitometrik analiz gerçekleştirin40.
- Her numunedeki nispi protein ekspresyonunu hesaplamak için, önce numunelerdeki GAPDH sinyalinin oranını hesaplayın. Bu, numune yüklemedeki tutarsızlıkları düzelten her numune için normalleştirme faktörüdür.
- Göreceli FUT8 protein ekspresyonunu elde etmek için FUT8 sinyal yoğunluğunu (her şerit için) ilgili şeridin normalleştirme faktörüne bölün.
Representative Results
Batı leke analizi, üç Fut8 DsiRNA yapısının bir karışımı ile transfekte edilen hücrelerde FUT8 protein ekspresyonunun azaldığını gösterdi. Hedeflemeyen DsiRNA ile transfekte edilen kontrol örneklerinde FUT8, ~ 65 ve 70 kDa'da çift bant olarak ortaya çıktı. FUT8'in öngörülen moleküler ağırlığı 66 kDa olduğundan, düşük moleküler ağırlık bandının sinyal yoğunluğundaki bir azalma, gen susturulmasının göstergesidir. Gen susturulmasını doğrulamak ve ölçmek için, FUT8 proteininin seviyesi göreceli GAPDH protein seviyesine normalleştirildi. Western blot analizi, ~ 37 ve 35 kDa'da GAPDH için iki bant tespit etti. Daha yüksek moleküler ağırlık bandı, tahmin edilen protein boyutuna karşılık gelir ve bu nedenle normalizasyon hesaplamalarında kullanılır. GAPDH protein seviyelerine karşı normalleştirildiğinde, FUT8 protein ekspresyonu% 60'a kadar azaldı (Şekil 1).
Transfeksiyon sonrası 48 saatlik gen nakavtının gözlemlenmesi doğrultusunda, karşılık gelen mAb örnekleri CGE-LIF tarafından analiz edilmek üzere işlenmiştir. Nakavt hücrelerinden gelen glikan yapıları fukozilasyonda bir azalma gösterdi. Bu eğilim en çok agalaktosillenmiş yapılarda (G0F) belirgindi ve galaktosillenmiş yapılarda (G1F, G1F' ve G2F) daha az ölçüde gözlendi. Bu veri kümesinden, toplam IgG çekirdek fukozilasyonu, negatif kontrol koşulu için gözlenen ~% 95 çekirdek fukozilasyonundan ~% 75'e düşmüştür (Şekil 2). FUT8 protein seviyelerindeki ~% 60'lık düşüş göz önüne alındığında, çekirdek fukozilasyonunda daha büyük bir azalma bekleniyordu. Yansıma üzerine, glikoprofilin transfeksiyondan bu yana 48 saatlik bir süre boyunca biriken glikozile mAbs'leri temsil ettiği, gen susturmanın ise sadece hasat sırasında mevcut olan protein seviyelerini temsil ettiği dikkat çekicidir.
Bu nakavt yönteminin daha fazla incelenmesi, DsiRNA konsantrasyonunun, hasat zamanının ve elektroporasyon koşullarının değiştirilmesini içeriyordu. Her faktör, alaka düzeyini belirlemek için ayrı ayrı incelendi. Elektroporasyon darbe koşullarının çekirdek fukozilasyonu ve hücre canlılığı üzerindeki etkisi, B, C, D ve E Deneylerinde yakalanmıştır. Bu sonuçlar, hücre canlılığında önemli farklılıklar olmaksızın, tek bir kare dalga darbesine (Deney B) kıyasla, iki kare dalga darbesi (Deney C) kullanılarak elektroporasyondan kaynaklanan çekirdek fukozilasyonunda iki kat azalma olduğunu göstermektedir (Tablo 2). Elektroporasyon koşulu e3 (Deney D), bu zaman noktasında en düşük hücre canlılığına (~% 90) ve IgG verimine yol açtı. Bununla birlikte, elektroporasyon olayından kurtulan hücreler, çekirdek fukozilasyonundaki ~% 10'luk azalma ile kanıtlandığı gibi, orta derecede transfekte edildi (Tablo 2). İlginç bir şekilde, Deney D, çekirdek fukozilasyonunda (% 14.7) en büyük azalmayı sağlayan, ancak hücre canlılığına (% 91-% 93 canlılık) açıkça zarar veren elektroporasyon koşullarını kullandı. Bu sınırlı deney seti, geri dönüşü olmayan bir hasara neden olmadan hücre zarının yeterli geçirgenliğini sağlayan elektroporasyon ayarlarının belirlenmesi ihtiyacını göstermektedir. SiRNA konsantrasyonunun ve hasat zamanının çekirdek fukozilasyonu üzerindeki rolünü not etmek de ilginçtir. Genel olarak, artan siRNA konsantrasyonu, çekirdek fukozilasyonu üzerinde hasat zamanını artırmaktan daha büyük bir etkiye sahiptir (Deneyler B, F, G ve Deneyler A, B, H). Gelecekteki deneylerde, elektroporasyon yöntemi e2 tarafından verilen siRNA konsantrasyonlarını titre etmek ilginç olacaktır.
Şekil 1. Deneysel akış şeması. Glikomühendislik ve numune analizi adımları, her adım için gereken ilişkili süre ile gösterilmiştir. SiRNA tasarımı, gen hedefi başına gen hedeflerinin veya yapılarının sayısına bağlı olarak birkaç saat sürer. SiRNA ile CHO hücre transfeksiyonu birkaç saat içinde tamamlanır ve dönüştürülmüş hücreler 48 saat boyunca büyümeye bırakılır. Hücre peletleri ve süpernatantlar birkaç saat içinde hasat edilir. Hücre peletleri lize edilir ve hücre içi proteinler bir SDS PAGE üzerinde ayrılır ve daha sonra hedef gene karşı antikorlarla lekelenir ve incelenir. Glikanlar saflaştırılmış antikorlardan ayrılır ve CGE-LIF tarafından analiz edilir. Bu tahlillerin her biri 1 gün sürebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. RNA girişiminin doğrulanması. Fut8 veya hedeflemeyen kontrol DsiRNA ile tedavi edilen örneklerde α-1,6-fukoziltransferaz (FUT8) protein seviyelerinin batı lekesi tespiti. FUT8'e karşılık gelen bantlar, Fut8 knockdown örneklerinden daha yoğun kontrol altındadır. Hedef gen ekspresyonunu normalleştirmek için GAPDH protein seviyesi de değerlendirildi. Tüm örnekler Deney G'den alınmıştır (bkz. Tablo 2). Kotidis et al. 52. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Fut8 knockdown'un 48 saatte kümülatif IgG glikozilasyonu üzerine etkisi. Nakavt numunelerinde glikan dağılımında bir kayma tespit edilir. Özellikle, ana çekirdek-fukozile yapıların (G0F) göreceli bolluğu azalırken, afukozile edilmiş türler knockdown deneyinde arttırılır. Ölçümler Deney G örneklerinden yapılmıştır (bakınız Tablo 2). Her deney için gerçekleştirilen biyolojik üçlüler, aşağı akış analizinin yükünü azaltmak için hasattan sonra karıştırıldı. Kotidis et al. 52. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Deneme adı | Elektroporasyon yöntemi | DsiRNA konsantrasyonu (nΜ) | Hasat zamanı (h) | Canlılık (%) | Xv (106 hücreli·mL-1) | IgG titresi (mg· L-1) | Çekirdek-fukozilasyon farkı (%) | ||||||
| ExpA_Negative | e1 | 500 | 24 | 98.3 | 4.71 | 122.5 | - | ||||||
| ExpA_Knockdown | e1 | 500 | 24 | 98.3 | 4.9 | 110.3 | 4.08 | ||||||
| ExpB_Negative | e1 | 500 | 48 | 95.6 | 9.55 | 453.3 | - | ||||||
| ExpB_Knockdown | e1 | 500 | 48 | 96.7 | 9.61 | 469 | 5.38 | ||||||
| ExpC_Negative | e2 | 500 | 48 | 96.3 | 9.91 | 449.3 | - | ||||||
| ExpC_Knockdown | e2 | 500 | 48 | 96.7 | 11 | 454.6 | 11.42 | ||||||
| ExpD_Negative | e3 | 500 | 48 | 90.6 | 6.25 | 318.5 | - | ||||||
| ExpD_Knockdown | e3 | 500 | 48 | 89.1 | 6.09 | 311.85 | 9.71 | ||||||
| ExpE_Negative | e4 | 500 | 48 | 91.1 | 7.2 | 380.3 | - | ||||||
| ExpE_Knockdown | e4 | 500 | 48 | 93.3 | 7.79 | 422.8 | 14.7 | ||||||
| ExpF_Negative | e1 | 750 | 48 | 96.2 | 9.7 | 501 | - | ||||||
| ExpF_Knockdown | e1 | 750 | 48 | 95.7 | 9.76 | 504.6 | 9.9 | ||||||
| ExpG_Negative | e1 | 1000 | 48 | 96.1 | 11.1 | 422.6 | - | ||||||
| ExpG_Knockdown | e1 | 1000 | 48 | 95.9 | 9.73 | 499.3 | 17.26 | ||||||
| ExpH_Negative | e1 | 500 | 72 | 94.4 | 14.3 | 925.8 | - | ||||||
| ExpH_Knockdown | e1 | 500 | 72 | 95 | 13.5 | 1018.4 | 7.37 | ||||||
Tablo 2. Transfeksiyon optimizasyonu. Elektroporasyon yönteminin, DsiRNA konsantrasyonunun ve hasat zamanının yinelemeli modifikasyonları, hücre canlılığında, canlı hücre yoğunluğunda, hasat zamanında IgG titresinde ve çekirdek fukozilasyonunda farklılıklara neden oldu. Her deney, modifikasyonun istenen etkiyi (yani fukozilasyonda bir azalma) üretip üretmediğini belirlemek için nakavtı ve ilgili negatif kontrolü karşılaştırdı. Elektroporasyon ayarları aşağıdaki gibidir: e1: 1200 V, 0.1 ms, kare dalga formu; e2: 1200 V, 2x 0,1 ms, darbeler arasında 5 s, kare dalga formu; e3: 150 V, 20 ms, kare dalga formu; e4: 250 V, 500 μF, üstel bozunma. Kotidis et al. 52.
Discussion
Glikozilasyon yolakları, enzimlerin ve aksesuar proteinlerin karmaşık bir metabolik ağını içerir. Yol bileşenlerinin işlevini incelemek, yalnızca geleneksel nakavt veya nakavt genetik mühendisliği stratejilerine dayanıyorsa göz korkutucudur. Alternatif bir yaklaşım, geçici bir işlev kaybı testi kullanarak bir yolun üyelerini önceden taramaktır. Bu amaçla, glikozilasyon genlerini karakterize etmenin daha etkili bir yolunu oluşturmak için RNAi ve CGE-LIF tespiti olmak üzere iki hızlı protokol birleştirildi. Açıklanan yöntem, tamamlanması potansiyel olarak birkaç hafta süren geleneksel yöntemlere kıyasla tamamlanması için 5-7 gün gerektirir. Ayrıca, otomasyon yeteneklerine sahip araştırma ortamları, manuel kullanımla mümkün olandan daha fazla gen adayını taramak için bu yöntemden yararlanabilir.
Geçici bir glikomühendislik kampanyasının başarısı büyük ölçüde siRNA tasarımına bağlıdır. Özel DsiRNA tasarımları daha önce belirtilen kurallara uymalıdır veya kolaylık sağlamak için kullanıcılar ticari olarak temin edilebilen önceden tasarlanmış dizileri tercih edebilir. Diğer gen modifikasyon stratejileri gibi, RNAi de hedef dışı etkiler için potansiyele sahiptir. Bu nedenle, kullanıcıların kasıtsız gen hedeflemesini hesaplama yöntemleriyle değerlendirmeleri teşvik edilir41. Deneysel tasarım seçimleri, hedef dışı etkilerin sınırlandırılmasına da yardımcı olabilir. Kittler ve ark., siRNA'nın çoklanmış iletiminin hedef dışı etkilerde bir azalmaya yol açtığını göstermiştir42. Bu mantıksız görünse de, bir ana karışımın her bir siRNA yapısının konsantrasyonunu azalttığı ve böylece hedef dışı gen susturma fırsatını sınırladığı öne sürülmektedir. Diğer bir yararı, aynı geni hedef alan siRNA yapılarının eşzamanlı transfeksiyonunun başarılı RNAi olasılığını arttırmasıdır. Bir ana karışımın kullanımı ayrıca numuneler ve replikasyonlar arasında tutarlılık sağlar ve transfeksiyon işlemini hızlandırır. Karışık siRNA yapılarının ilk taramasını takiben, her bir dizinin RNAi verimliliğini belirlemek için bireysel yapılar kullanılarak başka bir deney yapılabilir. Bu ve diğer nakavt çalışmalarında, üç adede kadar siRNA bir araya getirilmiş ve43,44,45 hücrelerine verilmiştir. Bununla birlikte, tek bir geni verimli bir şekilde hedeflemek veya birkaç geni hedeflemek için aynı anda üçten fazla siRNA'nın taranması istenebilir. Gerçekten de, bir çalışma, bireysel genlerin susturulmasıyla karşılaştırılabilir seviyelerde altı genin multipleks siRNA aracılı susturulmasını göstermiştir46. Bununla birlikte, susturma verimliliğinden ödün vermeden bir havuzda kullanılabilecek maksimum siRNA yapı sayısını belirlemek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Multipleks stratejisi, Martin ve ark. tarafından RNAi kütüphanesi tarama deneylerinin hızını arttırmak için önerilmiştir46 ve benzer bir kavram glikozilasyon genlerini taramak için yararlı olabilir.
Burada açıklanan protokol, diğer glikozilasyon genlerini doğrulamak için sonraki deneylerin yapılacağı beklentisiyle bir kavram kanıtı olarak hizmet eder. İlgilenilen yeni genler karakterize edilmeyebilir veya Fut8'den daha az popüler olabilir ve gen susturulmasını tespit etmek için birincil antikorlar zayıf veya kullanılamaz olabilir. Bu senaryoda,47 genini susturmak için RT-PCR gibi alternatif yöntemler kullanılabilir, ancak RT-PCR'nin protein yerine mRNA'yı tespit ettiği unutulmamalıdır. Batı lekelenmesi için antikorlar mevcut olduğunda, yaygın bir sorun zayıf tespit veya spesifik olmayan bantların varlığıdır. Kullanıcıların sık karşılaşılan sorunları çözmelerine yardımcı olacak sorun giderme kılavuzları mevcuttur ve bunlar birincil antikor titrasyon, alternatif blokaj ve algılama koşulları gibi bir dizi çözüm içerme eğilimindedir48,49. Bu çalışmada, FUT8 beklenmedik bir şekilde ~ 65 ve ~ 70 kDa'da çift bant olarak ortaya çıktı. ~ 70 kDa bandının glikozile FUT8'i temsil etmesi mümkündür. İnsan hücre hatlarından elde edilen literatür kanıtları, Çin hamsterinde korunan bir bölge olan Thr 564 50,51'de O'ya bağlı glikozilasyonu ve CHO K1 FUT8 dizilerini tanımlamaktadır.
Daha önce de belirtildiği gibi, glikozilasyon yolları genellikle karmaşık bir enzim dizisi içerir. Mevcut protokol, Fut8 tarafından kontrol edilen monogenik bir glikozilasyon reaksiyonu kullanılarak geliştirilmiş, optimize edilmiş ve gösterilmiştir. Bu nedenle, hedef gen, alternatif kinetik ve ekspresyon seviyelerine sahip bir enzimi veya gereksiz fonksiyonlara sahip izoenzimler tarafından düzenlenen bir yolu kodladığında bu yöntemin sağlamlığını doğrulamak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.
Birlikte ele alındığında, genleri hızla susturma ve modifiye IgG glikoprofillerini tespit etme yeteneği, özel glikomühendislik antikorlarına yönelik çabalarda yararlı bir araçtır. Benzer kısa vadeli çalışmalardan elde edilen bilgiler, beslenen parti kültürü gibi uzun vadeli tahlillerde kullanılmak üzere kararlı glikomühendislik hücreleri üretmek için uygulanabilir. Farmasötik bağlamın dışında, bu yöntem glikan biyolojisinin incelenmesine katkıda bulunur ve glikanların gelişim, sağlık ve hastalıktaki önemli işlevini vurgular.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
PK, Imperial College London'daki Kimya Mühendisliği Bölümü'ne bursu için teşekkür eder. RD, öğrenciliği için İngiltere Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi'ne teşekkür eder. MM, İngiltere Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmektedir (Hibe referansı: BB / S006206 / 1). IAG, İrlanda Araştırma Konseyi'ne teşekkür eder (Burs No. GOIPG/2017/1049) ve CONACyT (Burs No. 438330).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32 Karat software | SCIEX | contact manufacturer | Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method. |
| Acetonitrile, HPLC grade | Sigma Aldrich | 34851 | Solvent. |
| Anti-FUT8 antibody | AbCam | ab198741 | Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene. |
| Anti-GAPDH antibody | AbCam | ab181602 | Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user. |
| BioDrop Spectrophotometer | Biochrom | 80 3006 55 | Instrument used to quantify protein concentration. |
| BLItz | ForteBio | 45 5000 | Instrument. Label-Free Protein Analysis System. |
| BRAND Haemocytometer | Sigma Alrich | BR717810 | Counting chamber device |
| Capillary cartridge | SCIEX | A55625 | Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 µm outer diameter (o.d), x 50 µm inner diameter (i.d). |
| C100HT Glycan analysis—capillary electrophoresis | SCIEX | contact manufacturer | Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used. |
| CD CHO Medium | Thermo Fisher Scientific | 10743029 | Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice. |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Greiner Bio | 188261 | Sterile polypropylene tube. |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Greiner Bio | 227270 | Sterile polypropylene tube. |
| CHO IgG | MedImmune | Gift | Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system. |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x PBS, without calcium or magnesium. |
| Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL | Corning | 431143 | Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice. |
| Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL | Corning | 431144 | Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice. |
| Fast Glycan Labelling and Analysis kit | SCIEX | B94499PTO | Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS. |
| Fut8 DsiRNA | IDT | Custom | Custom designed DsiRNA targetting Fut8. |
| Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm | Bio-Rad | 1652088 | Electroporation cuvette. |
| Gene Pulser Xcell Eukaryotic System | Bio-Rad | 165 2661 | Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod. |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck-Millipore | IPFL00010 | Immunoblot transfer membrane, low background. |
| L-Methionine sulfoximine (MSX) | Sigma Aldrich | M5379 | Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system. |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 10623111 | Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes. |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 78505 | Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | 10365710 | Solvent. |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 616201 | Autoclavable tubes. |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system | Bio-Rad | 1658035FC | Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply. |
| NC-Slide A8 | ChemoMetec | 942 0003 | 8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250. |
| Negative Control DsiRNA, 5 nmol | IDT | 51 01 14 04 | Non-targeting DsiRNA. |
| Nuclease-free duplex buffer | IDT | 11-01-03-01 | Reconstitution buffer for DsiRNA. |
| NucleoCounter NC-250 | Chemometec | contact manufacturer | Instrument. Automated Cell Analyzer |
| Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa | Thermo Fisher Scientific | 26616 | Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting. |
| PCR tubes | Greiner Bio | 608281 | Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation. |
| Pipette filter tips sterilised (10, 200, 1000 µL) | Gibson | F171203, F171503, F171703 | Sterile filter tips to avoid RNA contamination. |
| PNGase F enzyme | New England Biolabs | P0704S | Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins. |
| Polypropylene columns, 1 mL | Qiagen | 34924 | Columns for gravity-flow chromatography. |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases |
| Protein-A Agarose Beads | Merck-Millipore | 16 125 | For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins. |
| Protein-A biosensor | ForteBio | 18 5010 | Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification. |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | Removes RNAse contamination. |
| Sample dilutent | ForteBio | 18 1104 | Activate Protein A tips. |
| Serological pipets (5, 10, 25 mL) | Corning | 4487, 4488, 4489 | Used for sterile cell culture tecniques. |
| Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF | Sigma Aldrich | 296813 | Reducing agent. |
| Solution 18 | ChemoMetec | 910-3018 | Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) |
| Spin-X Centrifuge Tube Filters | Corning | 8161 | 0.22 µm pore, Cellulose Acetate membrane. |
| Suspension plate with lid, 6-well | Greiner Bio | 657 185 | Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures. |
| Syringe filters, 0.22 μm | Sartorius | 514 7011 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) |
| Syringes with Luer lock tip, 20 mL | Fisher Scientific | 10569215 | For secure connection with syringe filter. |
| Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | Stains dead and dying cells. |
| Vivaspin 500, 3,000 MWCO | Sartorius | VS0191 | Polyethersulfone |
| WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | WB7105 | Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online. |
References
- Jefferis, R. Glycosylation as a strategy to improve antibody-based therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 226-234 (2009).
- Rathore, A. S., Winkle, H. Quality by design for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 27 (1), 26-34 (2009).
- Eon-Duval, A., Broly, H., Gleixner, R. Quality attributes of recombinant therapeutic proteins: An assessment of impact on safety and efficacy as part of a quality by design development approach. Biotechnology Progress. 28 (3), 608-622 (2012).
- Lalonde, M. -E., Durocher, Y. Therapeutic glycoprotein production in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 251, 128-140 (2017).
- Mimura, Y., et al. Glycosylation engineering of therapeutic IgG antibodies: challenges for the safety, functionality and efficacy. Protein & Cell. 9 (1), 47-62 (2018).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36 (12), 1136-1145 (2018).
- Zhang, M., Koskie, K., Ross, J. S., Kayser, K. J., Caple, M. V. Enhancing glycoprotein sialylation by targeted gene silencing in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. , (2010).
- Kanda, Y., et al. et al. of a GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) knockout host cell line: a new strategy for generating completely non-fucosylated recombinant therapeutics. Journal of Biotechnology. 130 (3), 300-310 (2007).
- Umaña, P., Jean-Mairet, J., Moudry, R., Amstutz, H., Bailey, J. E. Engineered glycoforms of an antineuroblastoma IgG1 with optimized antibody-dependent cellular cytotoxic activity. Nature Biotechnology. 17 (2), 176-180 (1999).
- Xu, X., et al. et al. genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).
- Chan, K. F., et al. et al. of GDP-fucose transporter gene (Slc35c1) in CHO cells by ZFNs, TALENs and CRISPR-Cas9 for production of fucose-free antibodies. Biotechnology Journal. 11 (3), 399-414 (2016).
- Zhang, P., et al. Identification of functional elements of the GDP-fucose transporter SLC35C1 using a novel Chinese hamster ovary mutant. Glycobiology. 22 (7), 897-911 (2012).
- Amann, T., et al. Genetic engineering approaches to improve posttranslational modification of biopharmaceuticals in different production platforms. Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2778-2796 (2019).
- Karottki, K. J., et al. Awakening dormant glycosyltransferases in CHO cells with CRISPRa. Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 593-598 (2020).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Hammond, S. M., Bernstein, E., Beach, D., Hannon, G. J. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature. 404 (6775), 293-296 (2000).
- Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., Hannon, G. J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409 (6818), 363-366 (2001).
- Shields, R. L., et al. et al. of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human FcγRIII and antibody-dependent cellular toxicity. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 26733-26740 (2002).
- Shinkawa, T., et al. et al. Absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 3466-3473 (2003).
- Mori, K., et al. Engineering Chinese hamster ovary cells to maximize effector function of produced antibodies using FUT8 siRNA. Biotechnology and Bioengineering. 88 (7), 901-908 (2004).
- Imai-Nishiya, H., et al. Double knockdown of alpha1,6-fucosyltransferase (FUT8) and GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) in antibody-producing cells: a new strategy for generating fully non-fucosylated therapeutic antibodies with enhanced ADCC. BMC Biotechnology. 7, 84 (2007).
- Beuger, V., et al. et al. silencing of fucosyltransferase 8 in Chinese-hamster ovary cells for the production of antibodies with enhanced antibody immune effector function. Biotechnology and Applied Biochemistry. 53 (1), 31 (2009).
- Templeton, N., Dean, J., Reddy, P., Young, J. D. Peak antibody production is associated with increased oxidative metabolism in an industrially relevant fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 2013-2024 (2013).
- Hussain, H., et al. A comparative analysis of recombinant Fab and full-length antibody production in Chinese hamster ovary cells. Biotechnology and Bioengineering. 118 (12), 4815-4828 (2021).
- Shimoyama, H., et al. Partial silencing of fucosyltransferase 8 gene expression inhibits proliferation of Ishikawa cells, a cell line of endometrial cancer. Biochemistry and Biophysics Reports. 22, 100740 (2020).
- Tummala, S., et al. Evaluation of exogenous siRNA addition as a metabolic engineering tool for modifying biopharmaceuticals. Biotechnology Progress. 29 (2), 415-424 (2013).
- Carillo, S., et al. Comparing different domains of analysis for the characterisation of N-glycans on monoclonal antibodies. Journal of Pharmaceutical Analysis. 10 (1), 23-34 (2020).
- Reusch, D., et al. Comparison of methods for the analysis of therapeutic immunoglobulin G Fc-glycosylation profiles-Part 2: Mass spectrometric methods. mAbs. 7 (4), 732-742 (2015).
- Donini, R., Haslam, S. M., Kontoravdi, C. Glycoengineering Chinese hamster ovary cells: a short history. Biochemical Society Transactions. 49 (2), 915-931 (2021).
- Szigeti, M., Chapman, J., Borza, B., Guttman, A. Quantitative assessment of mAb Fc glycosylation of CQA importance by capillary electrophoresis. ELECTROPHORESIS. 39 (18), 2340-2343 (2018).
- Ruhaak, L. R., et al. Optimized workflow for preparation of APTS-labeled N-glycans allowing high-throughput analysis of human plasma glycomes using 48-channel multiplexed CGE-LIF. Journal of Proteome Research. 9 (12), 6655-6664 (2010).
- Patenaude, A. -M., et al. N-glycosylation analysis of mouse immunoglobulin G isolated from dried blood spots. Electrophoresis. 42 (24), 2615-2618 (2021).
- Karst, D. J., et al. Modulation and modeling of monoclonal antibody N-linked glycosylation in mammalian cell perfusion reactors. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 1978-1990 (2017).
- Dadouch, M., Ladner, Y., Perrin, C. Analysis of monoclonal antibodies by capillary electrophoresis: sample preparation, separation, and detection. Separations. 8 (1), 4 (2021).
- Fakhr, E., Zare, F., Teimoori-Toolabi, L. Precise and efficient siRNA design: a key point in competent gene silencing. Cancer Gene Therapy. 23 (4), 73-82 (2016).
- Birmingham, A., et al. A protocol for designing siRNAs with high functionality and specificity. Nature Protocols. 2 (9), 2068-2078 (2007).
- Makrydaki, E., et al. Immobilised enzyme cascade for targeted glycosylation. , (2022).
- Bulletin_6201.pdf. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6201.pdf (2022).
- Bulletin_6376.pdf. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2022).
- Dot Blot Analysis. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/dot-blot/index.html (2022).
- Yilmazel, B., et al. Online GESS: prediction of miRNA-like off-target effects in large-scale RNAi screen data by seed region analysis. BMC Bioinformatics. 15 (1), 192 (2014).
- Kittler, R., et al. Genome-wide resources of endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nature Methods. 4 (4), 337-344 (2007).
- Stec, E., et al. A multiplexed siRNA screening strategy to identify genes in the PARP pathway. Journal of Biomolecular Screening. 17 (10), 1316-1328 (2012).
- Brown, J. M., et al. Ligand conjugated multimeric siRNAs enable enhanced uptake and multiplexed gene silencing. Nucleic Acid Therapeutics. 29 (5), 231-244 (2019).
- Parsons, B. D., Schindler, A., Evans, D. H., Foley, E. A direct phenotypic comparison of siRNA pools and multiple individual duplexes in a functional assay. PLoS One. 4 (12), 8471 (2009).
- Martin, S. E., et al. Multiplexing siRNAs to compress RNAi-based screen size in human cells. Nucleic Acids Research. 35 (8), 57 (2007).
- Popp, O., Moser, S., Zielonka, J., Rüger, P., Hansen, S., Plöttner, O. Development of a pre-glycoengineered CHO-K1 host cell line for the expression of antibodies with enhanced Fc mediated effector function. mAbs. 10 (2), 290-303 (2018).
- Yang, P. -C., Mahmood, T. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
- Troubleshooting Western Blots with the Western Blot Doctor. Bio-Rad Laboratories. , Available from: https://www.bio-rad.com/en-uk/applications-technologies/troubleshooting-western-blots-with-western-blot-doctor?ID=MIW4HR15 (2022).
- Steentoft, C., et al. Precision mapping of the human O-GalNAc glycoproteome through SimpleCell technology. EMBO. 32 (10), 1478-1488 (2013).
- FUT8 - Alpha-(1,6)-fucosyltransferase - Proteomics. , Available from: https://www.nextprot.org/entry/NX_Q9BYC5/proteomics (2022).
- Kotidis, P., et al. Rapid antibody glycoengineering in CHO cells via RNA interference and CGE-LIF N-glycomics. Methods in Molecular Biology. 2370, 147-167 (2022).
