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Bioengineering

Triphosforilação química de Oligonucleotídeos

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63877
Automatic Translation
1, 1
1The Salk Institute

Summary

Oligonucleotídeos 5'-triphosfatos são componentes onipresentes em vias biológicas essenciais e têm visto o uso crescente em aplicações de biotecnologia. Aqui, descrevemos técnicas para a síntese de rotina e purificação de oligonucleotídeos 5'-triphosphates, a partir de oligonucleotídeos preparados por técnicas de síntese automatizada padrão.

Abstract

O 5′-triphosfato é uma modificação essencial do ácido nucleico encontrada ao longo de toda a vida e cada vez mais utilizada como modificação funcional de oligonucleotídeos em biotecnologia e biologia sintética. Oligonucleotídeos 5'-triphosfatos foram historicamente preparados in vitro por métodos enzimáticos. No entanto, esses métodos são limitados a oligonucleotídeos naturais de RNA, têm fortes preferências de sequência e tendem a produzir produtos heterogêneos. Novos métodos de triphosforilação química complementam tanto o custo reduzido da síntese automatizada de oligonucleotídeos pela química fosforamidita quanto a variedade diversificada de modificações de nucleotídeos agora disponíveis. Assim, a síntese de triphosfatos oligonucleotídeos de sequência e comprimento arbitrários, e opcionalmente contendo várias modificações não naturais, agora é acessível.

Este artigo apresenta os métodos e técnicas apropriados para triphosforilação química de oligonucleotídeos utilizando fosforcloroide salicílico e pirosfato. Este método utiliza reagentes disponíveis comercialmente, é compatível com a maioria dos oligonucleotídeos preparados por métodos de síntese de fase sólida padrão, e pode ser concluído em 2 h após a síntese de oligonucleotídeos, antes da desproteção e purificação. Dois usos de oligonucleotídeos quimicamente triptosfoilados como substratos para enzimas RNA catalíticas são demonstrados, incluindo a síntese de uma versão de imagem espelhada da ribozyme cabeça-de-martelo de triptosfatos L-RNA não biológicos.

Introduction

A forma de RNA de 5′triphosphorylated é onipresente na biologia, pois é gerada pela transcrição do RNA em todos os domínios da vida e pela replicação do RNA durante o ciclo de vida de muitos vírus RNA. Estes triptofatos servem como substrato para a formação de mRNA de 7-metilguanilate em eucariotes e, portanto, desempenham um papel essencial na expressão proteica1. Em contrapartida, o triphosfato é retido em bactérias e vírus; assim, os RNA 5'-triphosphates são reconhecidos pelos reguladores de resposta à imunidade inata em eucariotes 2,3,4,5,6,7. Fora da biologia, uma série de ribozymes de ligase RNA foram evoluídos para usar o 5'-triphosphate in vitro8 e modificados para uso em ensaios diagnósticos 9,10,11,12,13,14,15. Uma dessas ribozyme pode ser usada para síntese dependente de modelos de L-RNA, o enantiomer não biológico de "imagem espelho" do D-RNA natural, do pequeno Oligonucleotídeo L-RNA 5′-triphosphates 16,17,18. A preparação rotineira de oligonucleotídeos triphosforilados de sequência variada e composição de espinha dorsal é essencial para investigar esses sistemas.

O método mais comum e acessível para preparar RNA 5'-triphosfatos em laboratório é por transcrição in vitro. No entanto, o RNA produzido por este método é restrito em sequência e tamanho pelos requisitos de promotor e substrato da enzima polimerase RNA. A polimerase T7 RNA e derivados especializados são os polímeros mais comuns utilizados para este fim 19,20,21,22. O RNA transcrito in vitro preparado com essas enzimas deve ser iniciado com uma purina de 5′terminais e é fortemente tendencioso em direção às purinas nos primeiros 10 nucleotídeos23,24. Além disso, a incorporação enzimática de nucleotídeos modificados por base ou espinha dorsal é na melhor das hipóteses ineficiente e mais frequentemente impossível com polímerases naturais, limitando a oportunidade de produzir oligonucleotídeos 5′-triphosfatos compostos de qualquer coisa menos D-RNA natural. Outro fator limitante é que o RNA gerado pela transcrição in vitro pode conter heterogeneidade substancial de 5′- e 3′- e é produzido como produtos extremamente heterogêneos quando menor que 20 nt 23,24,25,26,27.

Em contraste, a triphosforilação química de oligonucleotídeos preparados pela síntese de fosforamidite em fase sólida 28,29,30,31,32,33,34,35 podem ser usados para preparar oligonucleotídeos 5'-triphosphates 3-50 nt de comprimento, de qualquer sequência. Além disso, uma vasta gama de modificações de ácido nucleico acessíveis à síntese de fosforamidita pode ser adicionada aos oligonucleotídeos antes de 5′-triphosforilação 14,15,16,17,18,29,36. Muitos desses métodos utilizam o reagente de fosfelidade salicyl phosphorochloridite, que foi desenvolvido por Ludwig e Eckstein para a triphosforilação de fase de solução de mononucleosídeos37. A triptosforilação de oligonucleotídeos com este reagente é alcançada na fase sólida pela fosfísica do oligonucleotídeo 5′-hidroxil, conversão ao triphosfato por reação com pirofosfato e oxidação, seguido por procedimentos padrão para o decote do oligonucleotídeo a partir do suporte sólido, desproteção e purificação (Figura 1)28.

Figure 1
Figura 1: Esquema para triphosforilação de oligonucleotídeos sintéticos. No primeiro passo, o oligonucleotídeo 50-hidroxil é fosfílico com SalPCl. No próximo passo, o fosfito de 50 salicílicos é reagido com TBAP para formar o metfosfito cíclico, em seguida, na terceira etapa oxidada para gerar o cíclico 50-trimetafosfato na solução de oxidação do sintetizador DNA/RNA (0,1 M Iodo/piridina/H2O/THF), que é rapidamente hidrolisado para produzir o linear 50-triphosfato na mesma solução28,33, 37 anos. O decote alcalino subsequente do sólido suporte de CPG e a desproteção do oligonucleotídeo no aquoso MeNH2/amônia hidraturará qualquer trimetafosfato cíclico residual à forma linear. Abreviaturas: SalPCl = fosforcloroida salicilal; TBAP = pirofosfato de tributylammonium; THF = tetrahidrofurano; CPG = vidro poroso controlado; MeNH2 = metilamina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Embora os primeiros relatórios publicados usando este método muitas vezes sofriam de rendimentos ruins e produtos laterais indesejados 28,37,38, a manutenção cuidadosa das condições anidros é tudo o que é necessário para obter rotineiramente altos rendimentos. Isso pode ser alcançado com a preparação cuidadosa dos reagentes e o uso de um simples dispositivo de reação montado a partir de componentes plásticos padrão. Aqui, demonstramos os passos apropriados para a triphosforilação química de oligonucleotídeos, incluindo preparação de reagentes, montagem da câmara de reação, reação de triphosforilação, e posterior desproteção e purificação dos oligonucleotídeos triptosforilados. Também está incluído o uso representativo de oligonucleotídeos triphosforilados como substratos para ribozymes ligase para a síntese de produtos maiores de ácido nucleico com backbones L-RNA naturais e abióticos L-RNA.

Protocol

1. Síntese automatizada de fase sólida de oligonucleotídeos de 5′hidroxilo em um suporte sólido

  1. Prepare o sintetizador automatizado de DNA/RNA com reagentes e fosforamiditos de acordo com a composição de oligonucleotídeos de destino e instruções de instrumentos.
  2. Carregue uma coluna de síntese contendo suporte sólido no sintetizador e síntese de oligonucleotídeos de acordo com os protocolos do instrumento sintetizador.
    NOTA: O procedimento de triphosforilação foi otimizado para oligonucleotídeos preparados na escala de 1 μmole.
  3. Remova o grupo de proteção de 5'-dimethoxytrityl para produzir o oligonucleotídeo de suporte sólido 5′-hidroxilo como parte da síntese de oligonucleotídeos na etapa anterior, ou realizando uma etapa de desintoxicação terminal de acordo com os protocolos do instrumento de sintetizador.
  4. Remova a coluna contendo o oligonucleotídeo de 5′hidroxil em suporte sólido do sintetizador, seque sob um vácuo doméstico por 10 minutos para remover solvente residual e prossiga para triphosforilação (seções 3 e 4) uma vez que os materiais para triphosforilação são preparados (seção 2).
    NOTA: Se não for usada imediatamente, a coluna seca pode ser armazenada sob uma atmosfera normal em um recipiente de plástico selado com dessecante a -20 °C. Mais secagem não é necessária nesta fase, pois a coluna é completamente seca antes da triphosforilação na seção 3.

2. Preparar materiais para triphosforilação

  1. Conecte uma fonte de argônio seco com pressão ajustável a um coletor de gás com pelo menos duas linhas e conecte-se a um borbulhador. Certifique-se de que as linhas terminem em seringas de plástico de 1 mL para facilitar a conexão com o aparelho de reação.
  2. Reúna equipamentos para serem usados durante a triphosforilação, incluindo seringas plásticas de 1 mL, uma torneira de polipropileno de três vias, agulhas não pontuadoras, tubos de polipropileno de 1,5 mL e uma pequena espátula metálica. Armazene-os em um recipiente lacrado ou dessecador com dessecante à temperatura ambiente por pelo menos 1 dia antes do uso.
  3. Prepare 30 mL cada um de anidro 1,4-dioxano, 3:1 dioxano:piridina por volume, N-dimetilaformamida (DMF) e acetonitrilo (ACN) em garrafas de vidro secas de 30 mL com armadilhas de secagem (4 peneiras moleculares Å em pacotes de membrana selada) pelo menos 1 dia antes do uso. Lacre com septa de borracha, e armazene em um dessecante com dessecante.
  4. Armazene sólido 2-cloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one (salicyl phosphorochloridite, SalPCl) em seu recipiente original dentro de um frasco selado com dessecante a 4 °C. Sempre lave o recipiente com argônio entre os usos.
  5. Prepare uma solução de pirofosfato de tributylammonium (TBAP) com pelo menos 5 dias de antecedência da reação de triphosforilação:
    1. Pesar 1-5 g de TBAP sólido em uma garrafa de vidro seca de 30 mL e dissolver em 1 mL de DMF e 0,5 mL de tributilamina por g de TBAP.
    2. Adicione três armadilhas de secagem, sele a garrafa com um septo de borracha sob argônio, e bolha com argônio por 30 minutos para degas.
    3. Guarde dentro de um frasco selado com dessecante a 4 °C durante 5 dias para permitir que as peneiras moleculares absorvam toda a água de rastreamento. Armazene o frasco a -20 °C e prepare-se fresco após 6 meses.

3. Montagem e utilização do aparelho de triphosforilação

  1. Deixe que a coluna de síntese aqueça até a temperatura ambiente se recuperar do armazenamento a -20 °C.
  2. Montar a câmara de reação mostrada na Figura 2:
    1. Prepare a antecâmara: retire o êmbolo de uma seringa seca de 1 mL, corte a parte superior da seringa usando uma tesoura ou uma lâmina de barbear e coloque a seringa na coluna de síntese. Conecte a torneira de três vias ao topo da seringa e conecte a entrada lateral da torneira à fonte seca de argônio com o borbulhante, de modo que a entrada superior da torneira seja a porta de injeção de reagente.
    2. Fixar este aparelho em um suporte com grampos e selar todas as articulações a montante com filme de selagem de cera. Ajuste a torneira para que a porta de injeção esteja fechada, e o aparelho esteja aberto à fonte de argônio. Feche o borbulhante e deixe o argônio a baixa pressão (<10 psi) para fluir através da câmara de reação por 5 minutos.
      NOTA: Várias câmaras de reação podem ser definidas em paralelo ao triphosforilto 2-4 oligonucleotídeos. No entanto, uma linha do coletor deve ser reservada para o fornecimento de argônio para as garrafas de reagente.
    3. Reabra o borbulhante e anexe uma seringa ao fundo da coluna de síntese, que será a seringa de resíduos. Puxe argônio através da coluna repetidamente usando a seringa de resíduos; em seguida, recoloque a seringa com o êmbolo empurrado totalmente para dentro.
      NOTA: A menos que carregue os reagentes, a torneira deve ser definida para que a porta de injeção seja fechada e o aparelho aberto à fonte de argônio, como mostrado na Figura 2A. Da mesma forma, a seringa resíduo deve ser anexada e a articulação à coluna de síntese selada com filme de selagem de cera, a menos que remova ativamente os reagentes.
  3. Para adicionar um reagente ou solvente:
    1. Coloque uma agulha na fonte de argônio seco e insira-a no septo de garrafa de reagente ou solvente, tomando cuidado para não imergir a agulha no conteúdo da garrafa.
    2. Monte uma seringa seca com uma agulha e insira-a no septo de garrafa de reagente ou solvente, sem imergi-la no conteúdo da garrafa. Encha a seringa com argônio, retire a agulha do septo e expulse o argônio. Encha a seringa com argônio e expulse novamente; em seguida, encha a seringa com o volume necessário de solvente ou reagente sob pressão de argônio.
    3. Ajuste a torneira do aparelho para que a fonte de argônio esteja fechada, e a porta de injeção esteja aberta (Figura 2B). Remova rapidamente a seringa e a agulha preenchidas da garrafa de origem, limpe qualquer solvente preso ao lado ou ponta da agulha e insira a agulha na porta de injeção. Expulse o reagente para a antecâmara do aparelho, remova a agulha e feche o porta de injeção, reabrindo o aparelho à fonte de argônio.
    4. Retire suavemente o líquido da antecâmara até a coluna de síntese usando a seringa de resíduos para que todo o líquido seja agora mantido na seringa de resíduos. Agora, empurre lentamente a solução de volta para a coluna de síntese, garantindo que não haja bolhas de gás na coluna. Para misturar ou agitar, puxe suavemente a solução para cima e para baixo sobre a coluna com a seringa de resíduos.
      NOTA: Mova sempre o líquido lentamente e suavemente através da câmara de reação para garantir que não sejam quebradas as vedações, o que permite que o ar entre no aparelho.
  4. Para remover um reagente ou solvente da coluna:
    1. Puxe lentamente a solução para a seringa de resíduos. Depois que a maior parte da solução passar para a seringa de resíduos, puxe argônio para lavar o solvente restante da coluna.
    2. Remova o filme de selagem de cera ao redor da junta de seringa de resíduos, depois remova a seringa e descarte a solução de resíduos. Substitua a seringa de resíduos por uma nova seringa seca e resseque a articulação com filme de selagem de cera.

Figure 2
Figura 2: Aparelho de triphosforilação. Durante a mistura ou reações, o dispositivo (A) está aberto à fonte de argônio (i) e fechado ao ar, ajustando a torneira de três vias (ii). Os reagentes são extraídos da antecâmara (iii) para a coluna de síntese (iv) por meio da seringa de resíduos (v). Os reagentes são removidos puxando todo o líquido para a seringa de resíduos (v) e descartando-o. Ao carregar reagentes (B), a torneira de três vias (ii) está aberta à atmosfera, e o reagente é carregado na antecâmara (iii) por meio de uma seringa e agulha (vi). (C) Uma fotografia do aparelho montado como em (A) para mistura e reação de reagentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Triphosforilação na coluna de oligonucleotídeo sintético de 5′hidroxila

  1. Remova a solução SalPCl e TBAP do armazenamento a -20 °C e permita que elas aqueçam à temperatura ambiente antes de usar.
  2. Adicione 200 μL de piridina/dioxano à antecâmara, de acordo com as etapas 3.3.1-3.3.3. No entanto, não carregue solvente na coluna de síntese até o passo 4.4.
  3. Use uma espátula de metal seco para pesar 6-12 mg de SalPCl em um tubo seco de microcentrifuuge de 1,5 mL e dissolva em 100 μL de dioxano, sendo suavemente o solvente para cima e para baixo dentro do tubo de microcentrifuuge.
  4. Adicione o SalPCl dissolvido à antecâmara e carregue-o na coluna de síntese, seguindo o passo 3.3. Deixe-o reagir por 15 minutos, agitando a solução a cada 5 minutos. Remova e descarte a solução SalPCl de acordo com a etapa 3.4.
    NOTA: O SalPCl é adicionado em grande excesso e irá resmá-lo com qualquer água absorvida durante a preparação e carregamento na câmara de reação. No entanto, a introdução de qualquer umidade durante as etapas 4.5 e 4.6 comprometerá o rendimento final do oligonucleotídeo 5′-triphosfato.
  5. Adicione 250 μL de solução TBAP à antecâmara e carregue-a na coluna de síntese, seguindo o passo 3.3. Deixe-o reagir por 20 minutos, agitando a cada 5 minutos. Remova e descarte a solução TBAP de acordo com a etapa 3.4.
  6. Lave a coluna com 0,5 mL de DMF, depois 0,5 mL de ACN, removendo o solvente após cada adição de acordo com as etapas 3.3 e 3.4.
  7. Adicione 250 μL de solução oxidante (0,1 M de iodo em tetrahidrofurano (THF)/piridina/água, 88:10:2) à antecâmara e carregue-a na coluna de síntese, seguindo o passo 3.3. Deixe-o reagir por 30 minutos, agitando a cada 10 minutos. Remova e descarte a solução de oxidante de acordo com a etapa 3.4.
  8. Lave a coluna com 0,5 mL de ACN e remova, de acordo com as etapas 3.3 e 3.4.
  9. Desmonte o aparelho de reação. Lave a coluna de síntese com 5 mL de ACN e seque a coluna.

5. Decote de suporte sólido, desproteção e purificação

  1. Remova a resina de suporte sólido seco da coluna de síntese e transfira-a para um tubo selado de polipropileno de 1,5 mL com um anel o de silicone.
  2. Suspenda a resina em 1 mL de uma mistura de 1:1 de amônia aquosa de 28%-30% e 40% de metilamina aquosa (AMA) e selte firmemente o tubo. Incubar a 65 °C por 10 min com mistura intermitente por inversão suave39. Use um tratamento mais ameno à temperatura ambiente por 2 h para oligonucleotídeos com mais de 40 nt.
    ATENÇÃO: O aquecimento da solução AMA colocará o tubo sob alta pressão. Se o tubo não estiver bem selado ou não usar um anel o compatível com amônia (silicone), o tubo pode ventilar gás ou solvente de vazamento, potencialmente comprometendo a segurança ou o rendimento final do produto. Nunca abra o tubo enquanto estiver acima da temperatura ambiente, pois a solução AMA quente pode evoluir violentamente o gás.
  3. Esfrie o tubo no gelo e centrifuá-lo brevemente (6.000-12.000 × g para 10 s). Remova o supernascido da resina, filtre através de uma seringa equipada com um filtro de 0,2 μm e transfira para um novo tubo de polipropileno estéril. Evaporar a solução para o ressecamento usando uma centrífuga de vácuo equipada com uma armadilha química neutralizante de amônia.
    NOTA: Se o oligonucleotídeo sintético não contiver nucleotídeos de RNA com grupos de proteção de 2′-silyl, pule para a etapa 5.8.
  4. Remova os grupos de proteção do silyl dissolvendo o material seco em 1 mL de 1 M de fluoreto de tetrabutilmonium (TBAF) em THF, aquecendo para 55 °C, tremendo se necessário para dissolver totalmente o oligonucleotídeo e incubando à temperatura ambiente por 16-24 h40,41.
  5. Saciie a solução TBAF com 1 mL de tampão tris de 1 M, pH 7.5 e remova o THF usando uma centrífuga de vácuo.
  6. Remova os sais TBAF usando uma coluna de exclusão de tamanho descartável, seguindo as instruções do fabricante. Para oligonucleotídeos menores que 15 nt, confirme a elução do produto coletando o elunato em frações e identificando as principais frações do produto por absorção a 260 nm em um espectógrafo UV-Vis.
  7. Concentre o oligonucleotídeo de RNA deprotegido por lioofilização ou centrífuga de vácuo se menor que 15 nt, ou por precipitação de etanol se for superior a 15 nt.
  8. Prepare uma escala preparatória de 10%-20% poliacrilamida/8 M ureia/1x Gel TBE usando 19:1 monóis estoque de acrilamida, de acordo com os protocolos apropriados para tamanho de oligonucleotídeo, placa de gel e suporte. Monte a placa de gel no suporte de gel com 1x TBE em reservatórios e pré-executar a 35 W (ou conforme apropriado para o formato de placa de gel) por pelo menos 30 minutos.
  9. Dissolva o oligonucleotídeo sólido no tampão de carregamento de gel de ureia (8 M de ureia, 10% de sacarose, 50 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA com corantes de corrida de bromofenol e xileno) e aqueça a 80 °C. Carregue no gel de poliacrilamida e execute por 1-2 h a 25-35 W (ou conforme apropriado para o formato da placa de gel e tamanho de oligonucleotídeo).
    NOTA: O azul bromofenol ou o cianol de xileno devem ser excluídos do tampão de carregamento de gel para oligonucleotídeos menores que 15 nt se algum dos co-migrar com o produto, pois é difícil remover esses corantes do oligonucleotídeo elucido sem precipitação de etanol.
  10. Quando a eletroforese de gel estiver concluída, remova a placa de gel do suporte de gel, desmonte a placa de gel e enrole o gel no filme de polivinylcloide. Identifique as bandas do produto com sombra traseira com luz UV de 254 nm e exise a banda principal do produto usando uma lâmina de barbear.
  11. Extrair o oligonucleotídeo do gel excisado pelo método de esmagamento e imersão42.
    1. Esmague o gel excisado extrudando-o através de uma seringa plástica ou mecanicamente.
    2. Para oligonucleotídeos com mais de 15 nt:
      1. Elute em volumes 3x de esmagamento e tampão de imersão (300 mM NaCl; 10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) por pelo menos 12 h com agitação ou agitação.
      2. Remova as peças de gel sólido passando a solução através de uma seringa equipada com um filtro de 0,2 μm e concentre o oligonucleotídeo por precipitação de etanol.
    3. Para oligonucleotídeo menor que 15 nt:
      1. Elute em volumes 3x de água sem nuclease por pelo menos 12 h com agitação ou agitação.
      2. Remova as peças de gel sólido passando a solução através de uma seringa equipada com um filtro de 0,2 μm e concentre-se por liofilização.
      3. Remova sais residuais e solutos usando uma coluna de exclusão de tamanho descartável como na etapa 5.6. Concentre-se por liofilização.
  12. Armazene oligonucleotídeos triphosforilados purificados a -20 °C no buffer TE (10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) ou em um buffer de armazenamento de oligonucleotídeos semelhante.
    1. Determine a concentração do oligonucleotídeo medindo a absorvência a 260 nm usando um espectrofotômetro UV-Vis.
      NOTA: O coeficiente de extinção estimado do oligonucleotídeo não deve ser afetado pelo seu estado de fosforilação de 5′, podendo ser calculado a partir de sua sequência usando uma calculadora de coeficiente de extinção oligonucleotídeo.
    2. Verifique a triphosforilação por espectrometria de massa. Procure uma massa esperada de +239,94 Da em relação à do oligonucleotídeo de 5′hidroxilo.
      NOTA: Ou a desorção/ionização do laser assistida por matriz ou a espectrometria de massa de eletrospray (MALDI-MS ou ESI-MS, respectivamente) são adequadas para identificar o estado de triphosforilação do oligonucleotídeo ao utilizar protocolos otimizados para ácidos nucleicos. O ESI-MS fornece resultados mais consistentes, no entanto, devido a menores taxas de fragmentação de íons; um serviço comercial representativo é prestado na Tabela de Materiais.

6. Oligonucleotídeos triptosphoilados como substratos para auto-replicação ribozyme

ATENÇÃO: 32P é um isótopo radioativo e as seguintes etapas devem ser realizadas utilizando protocolos de segurança padrão para trabalhar com materiais radioativos em laboratório e por um pesquisador certificado para uso de materiais radioativos pelos departamentos de Saúde e Segurança Ambiental relevantes. Como alternativa, o substrato de ribozyme auto-replicante A pode ser preparado sinteticamente com um rótulo de 5′-fluoresceína14 e imageado fluorescentemente, como na etapa 7.9.

  1. Prepare a solução A como uma mistura de auto-replicador ribozyme E e 5'-32P-rotulado substrato de RNA A14 para concentrações de 0,30 μM e 30 μM, respectivamente. Prepare as soluções B-transcrito e B-sintético com 15 μM triphosforilado substrato de RNA B, preparado por transcrição in vitro 14 ou triphosforilação química como acima, respectivamente, em tampão EPPS de 75 mM, pH 8.5 e 37,5 MgCl2. Leve ambas as soluções para 42 °C.
    NOTA: Todos os componentes de RNA estão listados na Tabela de Materiais.
  2. Para iniciar a auto-replicação, misture rapidamente 5 μL de solução A com 10 μL de solução B-transcrito ou B-sintético para uma concentração final de 0,1 μM E, 10 μM A, 10 μM B, 25 mM MgCl2 e 50 mM EPPS tampão, pH 8.5. Incubar a mistura de reação a 42 °C.
  3. Em intervalos regulares, pegue 0,5 μL aliquots e sacie em 9,5 μL de tampão de carregamento de gel formamide (95% de formamide; 10 mM EDTA, pH 8).
  4. Prepare um poliacrilamida analítico/8 M de ureia/1x gel TBE, de acordo com protocolos apropriados para a placa de gel e suporte. Monte o gel e a placa fundidos em um suporte de gel, encha os reservatórios com 1x TBE e pré-run em 40 W (ou conforme apropriado para diferentes placas de gel e suportes) por 30 minutos.
  5. Aqueça as amostras de reação saciadas a 80 °C, carregue 5 μL da amostra em cada poço e execute o gel a 40 W por aproximadamente 40 minutos (ou conforme apropriado para diferentes placas e estandes de gel).
  6. Retire a placa de gel do suporte de gel, desmonte e enrole o gel em filme de polivinylchloride. Cubra o gel com uma tela de fósforo e exponha por 1h (ou conforme apropriado para 32P cpm); escaneie a tela usando um scanner de gel fluorescente/fosforescente.
  7. Quantifique o rendimento da reação usando o software de quantificação de imagem em gel.
    1. Abra a imagem em gel usando a caixa de ferramentas de análise, escolha Análise | Definição de forma, selecione Áreas | forma retângulo e desenhe retângulos do mesmo tamanho em torno de bandas correspondentes a A não redigido e ao produto E para cada vez e ambas as reações.
    2. Escolha análise | Subtração de fundo, selecione Áreas | a forma retângulo e desenhe um retângulo do mesmo tamanho em uma porção vazia da imagem em gel. Altere o método de subtração de fundo para todos os retângulos para retângulo de imagem.
    3. Escolha janela | janela de 2 áreas e, em seguida, editar | Exporte para o Excel para exportar os volumes de pixels de banda quantificados para um arquivo de planilha.
  8. Plote a concentração do produto E versus o tempo, e encaixe os dados para o crescimento logístico Eq (1) usando software estatístico de ajuste de dados:
    [E] = Equation 1 (1)
    Quando a reação é de extensão máxima, b é grau de sigmoidicity, e c é taxa de crescimento exponencial.
    1. Na planilha exportada, divida o volume E do produto pela soma dos volumes A e do produto E para determinar o rendimento fracionado do produto para cada vez e ambas as reações. Multiplique pela concentração inicial do substrato A (10 μM) para determinar o rendimento do produto E em função do tempo.
    2. Em software estatístico de ajuste de dados, escolha | de arquivos Nova | Novo Arquivo de projeto, selecione XY em Nova tabela & gráfico e clique em Criar. Digite os tempos de reação e os rendimentos do produto E para ambas as reações em colunas adjacentes, e colunas de rótulo correspondentemente (por exemplo, "tempo", "transcrito B", "B sintético").
    3. Escolha inserir | Nova análise, selecione análises XY | Regressão não linear (ajuste de curva) em seguida, clique EM OK. Escolha curvas de crescimento | Crescimento logístico e clique em OK; não ajuste nenhum outro parâmetro. Observe os parâmetros de ajuste e os intervalos de confiança em Resultados e o gráfico de pontos de dados e curvas encaixadas em Gráficos.

7. Cópia cross-quiral de L-RNA

  1. Prepare 10 μL de solução RNA contendo 20 μM D-RNA 27,3t polimerase cross-quiral, 2 μM 5′-fluoresceína-rotulado l-RNA primer, 4 μM biotinylated L-RNA hammerhead template, e 20 μM cada um de L-RNA pppCUG, pppAUG, pppAGG, e pppCGC, em 10 μL de 50 mM Tris, pH 8.3. Resfrie o RNA aquecendo-o a 90 °C por 1 min e esfriando a 23 °C a 0,2 °C/s em um termociclador PCR. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre a polimerase, primer e modelo.
  2. Incubar a solução RNA a 17 °C e iniciar a reação adicionando 10 μL de tampão de partida de 2x (400 mM MgCl2, 500 mM NaCl e 50 mM Tris, pH 8.3). Certifique-se de que as concentrações finais de todos os componentes da reação são polimerase de 10 μM, 1 primer de μM, modelo de 2 μM, 10 μM cada trinucleotídeo 5′-triphosfato, 200 mM MgCl2, 250 mM NaCl e 50 mM Tris, pH 8.3.
  3. À medida que a reação prossegue, tome 10 μL aliquots e sacie com 5 μL de 0,5 M EDTA, pH 8.
  4. A cada amostra de reação saciada, adicione 0,1 mg de contas magnéticas revestidas de streptavidin (capacidade de ligação biotin-oligonucleotídeo de 20 pmol) suspensas em 10 μL de 1 M NaCl no tampão te com detergente neutro de 0,05% para capturar primers estendidos pelo aparador através do modelo biotinína e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação.
  5. Capture as contas em um ímã de captura de contas, remova e descarte líquido e adicione 50 μL de solução de lavagem (250 mM NaCl em TE com detergente neutro de 0,05%). Misture as contas, capture-as novamente e remova a solução de lavagem. Repita mais uma vez.
  6. Para elute extended primers de contas, adicione 50 μL de solução de elução (25 mM NaOH com detergente neutro de 0,05%) e misture as contas. Recapturar as contas, remover a solução de elução, saciar com 100 mM Tris (pH 7.5) e precipitar com etanol.
  7. Prepare um poliacrilamida analítico/8 M de ureia/1x gel TBE, de acordo com os protocolos apropriados para a placa de gel e suporte. Monte o gel e a placa fundidos em um suporte de gel, encha os reservatórios com 1x TBE e pré-run em 40 W (ou conforme apropriado para diferentes placas de gel e suportes) por 30 minutos.
  8. Dissolva o RNA precipitado em 10 μL de tampão de carregamento de gel formamida e prepare primer com etiqueta final não redigido a 0,5 μM no buffer de carregamento de gel formamide. Aqueça amostras a 80 °C, carregue 5 μL da amostra em cada poço e execute o gel a 40 W por aproximadamente 40 min (ou conforme apropriado para diferentes placas de gel e estandes).
  9. Remova a placa de gel do suporte e escaneie usando um scanner de gel fluorescente/fosforescente para visualizar produtos de extensão L-RNA cross-quiral.

Representative Results

Os oligonucleotídeos devem ser sintetizados utilizando protocolos padrão apropriados aos fosforamiditos e sintetizadores automatizados de DNA/RNA, deixando o produto oligonucleotídeo salvo do suporte sólido na coluna de síntese plástica original, com o grupo dimethoxytrityl terminal de 50 terminais removido para produzir o 50-hidroxil livre (seção 1). Todos os oligonucleotídeos utilizados nesta demonstração foram preparados utilizando resina de vidro poroso controlado Å (CPG) como suporte sólido e conduzida na escala de 0,2 ou 1 μmole. Exemplos representativos de colunas sintetizadoras, resinas, reagentes e fosforamiditos são fornecidos na Tabela de Materiais. Para reações em maior escala, os volumes e tempos utilizados nas etapas subsequentes podem precisar ser ajustados.

A reação de triphosforilação é conduzida na coluna em uma câmara de reação personalizada (Figura 2, seção 3) utilizando componentes padrão e comercialmente disponíveis listados na Tabela de Materiais e segue o esquema ilustrado na Figura 1 (seção 4)28. É essencial que as condições sejam mantidas estritamente anidra durante a triphosforilação, e que todos os solventes e reagentes sejam preparados sobre peneiras moleculares com antecedência e permitidos secar totalmente antes do uso (seção 2). A triphosforilação normalmente leva 2h para ocorrer e, posteriormente, a coluna lavada e seca pode ser tratada de acordo com os procedimentos padrão de desproteção e purificação do oligonucleotídeo (seção 5).

Após a desproteção, os triphosfatos de oligonucleotídeos são purificados pela desnaturação da eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE), mostrando uma única banda de produto principal por retro-shadowing UV que pode ser extirpada e eluida do gel. O produto triphosfato de 5′triphosfato é prontamente separado de produtos laterais de reação para oligonucleotídeos curtos, como mostrado para trinucleotídeos de DNA 50-triphosfatos, pppAAAa e pppCCC, e trinucleotídeo L-RNA 50-triphosphate pppGAA na Figura 3A,B. Ambos os produtos de 5'-hidroxil e 5'triphosfato para aparadores de DNA AAA e CCC foram extirpados e identificados por espectrometria de massa e correspondentemente rotulados na Figura 3A. Bandas adicionais, como visíveis para o aparador de DNA AAA, geralmente não contêm material suficiente para recuperar e identificar. A presença dessas bandas, no entanto, correlaciona-se com massas adicionais de produtos nos produtos de reação não purificados (Figura 3C), tipicamente representando 5'-difosfato, monofosfato e produtos laterais h-fosfosfonato, como discutido abaixo.

Após a purificação da PÁGINA, os oligonucleotídeos maiores podem ser elucidos usando o método de esmagamento e imersão42 e a precipitação subsequente do etanol. No entanto, oligonucleotídeos menores que 15 nt não podem ser precipitados de forma eficiente e, portanto, requerem um procedimento modificado para eluição de gel (etapa 5.11.3). A coluna de exclusão de tamanho descartável listada na Tabela de Materiais é classificada apenas para uso com oligonucleotídeos maiores que 10 nt. No entanto, descobrimos que os oligonucleotídeos tão curtos quanto os aparadores podem ser efetivamente desselados usando o protocolo recomendado pelo fabricante. No entanto, recomenda-se ao dessalucionar oligonucleotídeos curtos (como nas etapas 5.6 e 5.11.3) que a coluna elua seja coletada em frações, e frações de produto sejam identificadas por absortância a 260 nm usando um espectógrafo UV-Vis. Uma coluna de exclusão de tamanho otimizada para oligonucleotídeos mais curtos é fornecida na Tabela de Materiais como uma escolha alternativa. O rendimento final da síntese de oligonucleotídeos da escala 1 μmole após a purificação é de 50-300 nmol.

A triphosforilação pode ser confirmada por espectrometria de massa, onde o produto triphosforilado tem uma massa +239,94 Da maior que o oligonucleotídeo 5'-hidroxil, embora a presença de materiais correspondentes ao 5'-di e monofosfato (+159,96 e +79,98 Da, respectivamente) sejam frequentemente observadas. Um produto lateral de 5'-H-fosfosfonato com massa +63,98 Da da massa 5'-OH também pode ser observado, e altos níveis deste produto indicam que as condições durante a triptosforilação não foram suficientemente anidra. Antes da purificação, os oligonucleotídeos desprotegidos normalmente mostrarão todos esses produtos (Figura 3C), enquanto o material purificado mostrará um pico correspondente ao produto triphosfato de 5′, juntamente com 5'-di- e monofosfatos (Figura 3D,E).

A espectrometria de massa por si só normalmente não dará uma medida rigorosa de pureza de 5′triphosfato devido a taxas diferenciais de ionização e fragmentação do triphosfato durante a ionização. Para medir a pureza final do produto, recomenda-se cromatografia líquida em fase reversa e tandem ESI-MS (RP-LC/ESI-MS), particularmente para oligonucleotídeos mais longos. A análise do D-RNA 50-triphosphates pppACGAGG e pppGAGACCGCAACUUA por RP-LC/ESI-MS (Figura 4A,B, respectivamente) mostram pureza típica do produto final, contendo 20% de 50-difosfato, pois essas duas espécies são difíceis de separar quando presentes em oligonucleotídeos mais longos.

Oligonucleotídeos sintéticos de 5'triphosphate normalmente funcionam tão bem quanto os materiais preparados enzimáticamente em estudos bioquímicos. Na seção 6, como exemplo, 5'-triphosfato 14 nt substratos de RNA preparados sinteticamente ou por transcrição in vitro foram comparados em uma reação de auto-replicação catalisadaRNA 14,15,43,44,45. Ribozyme E catalisa a junção dos substratos A e B para produzir uma nova cópia de E em uma reação autocatalítica capaz de crescimento exponencial (Figura 5A). E e 32componentes A rotulados em P foram preparados por transcrição in vitro, e o substrato B triphosforilado foi preparado sinteticamente, como descrito acima, ou por transcrição in vitro 14. O progresso da reação de auto-replicação foi monitorado pela coleta de amostras periódicas que foram analisadas por PAGE desnaturando e quantificadas através de um scanner de gel fluorescente/fosforescente. Os dados resultantes, adequados a uma função de crescimento logístico, revelaram que o substrato B transcrito ou sintético suporta crescimento exponencial, mas o B sintético dá uma quantidade ligeiramente maior de produto (Figura 5B). Este resultado pode refletir heterogeneidade composicional no final de 5′end do RNA preparado por transcrição in vitro 23,24.

A triptosforilação química também permite a síntese de triptosfatos de oligonucleotídeos que não podem ser preparados biologicamente, seja in vitro ou em células. Na seção 7, triptosfatos de oligonucleotídeos não biológicos compostos de L-RNA, o enantiomer do D-RNA natural, preparados como nas seções 1-5, foram usados como substratos para o D-RNA "cross-quiral" polymerase ribozyme 27.3t (Figura 6A), que catalisa a polimerização dirigida por modelo de um produto L-RNA mais longo de curto L-RNA oligootróo-5'triphosphates de forma sequencial.. Como exemplo, a ribozyme pode sintetizar uma versão L-RNA do motivo de auto-decote hammerhead (Figura 6B)18. Triptosfatos de trinucleotídeos L-RNA purificados foram combinados com um primer L-RNA e modelo L-RNA (Figura 6C) e reagiram com a ligase transversal. As amostras ao longo da reação foram analisadas pela PAGE e imagens usando um scanner de gel fluorescente/fosforescente para demonstrar a síntese de uma versão L-RNA da ribozyme hammerhead codificada pelo modelo (Figura 6D).

Figure 3
Figura 3: Purificação de trinucleotídeos 50-triphosfatos. (A) Análise de PÁGINA (visualizada por UV-back-shadowing) de triphosforilação de trinucleotídeos de DNA tri-desoxyadenosine (AAA, azul) e tri-desoxicytidina (CCC, vermelho), intencionalmente sobrecarregado para visualizar pequenos produtos laterais. Tanto o produto de 50 triphosphates (ppp) quanto o material inicial de 50-hidroxyl (OH) foram extirpados e identificados pelo MALDI-MS. (B) Página preparatória de triphosforilação do L-RNA trinucleotídeo GAA, com a maior banda de produto extirpada e identificada como o 50-triphosphate (ppp) pelo ESI-MS. (C) MALDI-MS de produtos de reação bruta após a desproteção e (D) produtos purificados de (A). 50-triphosphate (ppp; pppAAA esperava 1.119 Da, observou 1.118 Da; pppCCC esperava 1.047 Da, observado 1.046); 50-difosfato (pp), 50-monofosfato (p), 50-hidroxila (OH) e 50-H-fosfosfoato (Hp) são rotulados. (E) Espectro de massa desconvolucido da injeção direta ESI-MS de produto isolado de 50 triphosfato de (B), com picos identificados rotulados (esperado 1.181,6 Da, observado 1.181,0 Da). 50-diphosphate (pp) também são observados produtos, assim como picos de íons de sódio para os produtos tri-e di-fosfato (+22 Da). Picos de contaminantes comuns são rotulados com um asterisco. Para facilitar a comparação, os espectros de massa foram normalizados à maior intensidade medida em cada espectro e são relatados como uma porcentagem em relação a esse valor. Abreviaturas: PAGE = eletroforese de gel de poliacrilamida; MALDI-MS = desorção/ionização a laser assistida por matriz; ESI-MS = espectrometria de massa de ionização eletrospray. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: RP-LC analítico de 6 nt e 14 nt D-RNA oligonucleotídeos triphosfatos. (A) 50-pppACGAGG-30 e (B) 50-pppGAGACCGCAACUUA-30. O Tandem ESI-MS identificou o pico principal de ambos (~70%) como o 50-triphosphate (ppp), com menores quantidades de 50-diphosphate (pp). Abreviaturas: RP-LC = cromatografia líquida em fase inversa; nt = nucleotídeos; ESI-MS = espectrometria de massa de ionização eletrospray. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Comparação de substratos de oligonucleotídeos 50 triphosfatos preparados por síntese química ou transcrição in vitro. (A) A ribozyme auto-replicante E liga o RNA A e o RNA B. (B) auto-replicante usando 10 μM A e 10 μM B, sintético (círculos abertos) ou em transcrição (círculos preenchidos). (B) Os dados foram adequados à equação de crescimento logístico: [E] = a / (1 + b e-ct), onde a é o rendimento final, b é o grau de sigmoidicity, e c é a taxa de crescimento exponencial. As taxas de crescimento para as duas reações foram idênticas, em 1,14 h-1, enquanto a extensão final foi 10% maior para reações com B sintético. Por favor clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 6
Figura 6: Polimerização L-RNA cross-quiral com uma ribozyme. (A) O D-RNA 27.3t polymerase ribozyme, que catalisa a ligadura dependente de modelo de L-RNA. (B) O produto L-RNA sintetizado por 27,3t faz parte de um motivo endonuclease de martelo. (C) Polimerização L-RNA catalisada por 27,3t usando um modelo L-RNA biotinilado (marrom), um primer L-RNA (magenta) e quatro trinucleotídeos L-RNA (ciano), preparados sinteticamente. (D) Análise de PÁGINA dos produtos de extensão de (B) a 4h e 24 h, mostrando cada incorporação de trinucleotídeos até o produto de comprimento completo (ponto preto). O primer L-RNA não redigido está incluído como marcador de referência. Abreviaturas: PAGE = eletroforese de gel de poliacrilamida; M = marcador de referência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O procedimento de triphosforilação descrito aqui é amplamente compatível com a síntese de oligonucleotídeos usando química fosforamidita padrão. Os fosforamiditos nucleoídeos devem ter grupos de proteção de laboratório base compatíveis com desproteção rápida na AMA39, incluindo o padrão β-cianoetil no fosfito, e isobutíryl, dimetilformamidil, acetil, fenoxiacetil, ou 4-isopropilphenoxyacetyl nos grupos exocíclicos das nucleobases. Os grupos ribose 2'-hidroxil devem ser protegidos por grupos protetores de silyl, seja t-butyldimethylsilyl (TBDMS) ou tri-iso-propylsilyloxymetil (TOM)40,41. O grupo de pivaloyloxymetil de laboratório base (PivOM) também foi relatado como compatível com triphosforilação química30.

Foram descritos múltiplos métodos para a triphosforilação química de oligonucleotídeos sintéticos 28,29,30,31,32,33,34,35. Encontramos triphosforilação usando o reagente Ludwig-Eckstein37 para ser um dos mais acessíveis, não exigindo nenhuma síntese especializada de reagentes e nenhum equipamento especializado. Oligonucleotídeos 5'-triphosfatos preparados por este método têm sido usados rotineiramente como substratos para ribozymes ligase RNA, incluindo o uso de triptosfatos L-RNA enzimáticas inacessíveis para alcançar síntese dependente de modelos e replicação deste ácido nucleico "imagem espelho" 14,16,17,18 . O método também é adequado para a preparação de pequenos RNAs de alça-tronco de 5′triphosforilados que são potentes ativadores da resposta imune inata em vertebrados 6,7.

O reagente Ludwig-Eckstein, salicyl phosphorochloridite37, é altamente reativo à água, e efetivamente limpa qualquer água introduzida ao dissolver o reagente antes de carregar na coluna oligonucleotídeo. Após este ponto, no entanto, o oligonucleotídeo 5′-fosfitylado reagirá preferencialmente com qualquer água introduzida no sistema sobre pirofosfato, formando um produto lateral de 5′H-fosfosfonato após o trabalho 28,37,38. Preparação cuidadosa dos reagentes de triphosforilação e da câmara de reação de triphosforilação garantem que este produto lateral não esteja formado. Para secagem de solventes, as peneiras moleculares tipo 4 Å são vendidas pré-embaladas em sacos de Teflon compatíveis com a maioria dos solventes orgânicos sob várias marcas pela maioria das empresas de reagente de síntese de oligonucleotídeos. Precauções adicionais, como realizar triphosforilação em um porta-luvas sob uma atmosfera anidro, geralmente não são necessárias.

A reação do oligonucleotídeo 5′-fosfito com TBAP forma uma solução cíclica de 5′-trimetafosfito, que é então oxidada ao cíclico 5′-trimetafosfato usando solução oxidante de síntese de oligonucleotídeo (iodo em água/piridina/THF). Deve-se notar que as soluções comerciais de oxidante utilizam quantidades variadas de iodo, e é essencial usar a alta concentração de iodo de 0,1 M para garantir a oxidação completa ao triphosfato. O produto cíclico é hidrolisado para o último 5′-triphosphate na mesma solução37, e soluções alternativas de oxidante anidro devem ser utilizadas se a linearização com nucleófilos que não sejam desejadas água (veja abaixo para aplicações)33. Qualquer trimetafosfato cíclico residual, no entanto, será linearizado durante a subsequente desproteção alcalina do oligonucleotídeo. A hidrólise do 5′-trimetaphosphate cíclico produz apenas o triphosfato 37,46 linear, em vez de triptofatoramificado 37,46.

A desproteção do oligonucleotídeo normalmente não precisa ser modificada para acomodar 5′-triphosforilação, mas algumas precauções devem ser tomadas. O triphosfato é relativamente estável à breve exposição a condições alcalinas, mas deve-se tomar cuidado para não expor o triphosfato à AMA por mais tempo do que o necessário. Devem ser evitados grupos de proteção que requerem tratamento mais prolongado em amônia ou AMA por mais de 10 minutos a 65 °C. Tratamentos mais suaves, como 2 h em amônia à temperatura ambiente são aceitáveis quando compatíveis com outros grupos de proteção de fosforamidita. Um método comum de desproteção rápida para oligonucleotídeos sintéticos de RNA protegidos por silyl usa trietilamina trihidrofluoreride e alta temperatura47; no entanto, isso deve ser evitado ao preparar rna 5'-triphosfatos à medida que as condições ácidas prolongadas são encontradas para acelerar a hidrólise triptosfato31,32.

O Preparae PAGE provou ser o método mais simples e confiável para purificação pós-proteção de oligonucleotídeos triphosforilados (Figura 3 e Figura 4). No entanto, o INTUS de fase inversa preparatória também pode ser usado para purificar produtos triphosforilados. A presença de 5'-difosfato e, em menor grau, 5'-monofosfatos é observada rotineiramente ao verificar a triphosforilação por espectrometria de massa. Observamos a fragmentação de 5′triphosfato durante a espectrometria de massa a partir de material altamente puro preparado por síntese química ou transcrição, particularmente se o instrumento não for otimizado para análise de oligonucleotídeos. No entanto, a análise rp-LC frequentemente mostra que 10%-20% do produto lateral 5'-diphosphate está presente em oligonucleotídeos mais longos de 5′-triphosforilados (Figura 4). Preparações comerciais de pirofosfato de tributylammonium podem ser contaminados com até 20% de monofosfato, que produzirá 5'-difosfato como um produto lateral durante a triptosforilação30,31. A preparação cuidadosa deste reagente internamente pode render estoques TBAP muito mais puros31. No entanto, encontramos oligonucleotídeos triphosforilados usando fontes comerciais de TBAP ainda mostram reatividade comparável ou maior quando usado como substratos em reações enzimáticas (Figura 5B), em comparação com o material preparado pela transcrição in vitro.

Um uso mais notável de triphosforilação de oligonucleotídeos com o reagente Ludwig-Eckstein aproveita o trimetafosphito cíclico intermediário33. Se a etapa de oxidação subsequente for conduzida com peróxido de 1 M t-butilo em hexanos, que é frequentemente usado para oxidação de oligonucleotídeos em condições anidrasas, a oxidação do fosfito ocorre sem hidrolise de abertura do anel, produzindo o trimetafosfato cíclico. Este intermediário pode então ser reagido com nucleófilos primários de amina ou álcool para produzir 5'-triphosphates com modificações no γ-fosfato. Essas modificações incluem a adição de uma tag lipofílica ligada por uma ligação fosforamidata, que facilita a rápida purificação específica do triptosfato por RP-LC, seguida de hidrólise ácida da tag do triphosfato33. Modificações fluorescentes na posição γ-fosfato também podem ser introduzidas para uso como repórteres fluorescentes em tempo real para reações de ligadura catalisada por ribozyme15,33.

Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Os autores são gratos a Greg Springsteen, Natasha Paul, Charles Olea Jr., Jonathan Sczepanski e Katrina Tjhung por discussões úteis sobre as melhores práticas para reações de triptoria química e a Gerald Joyce por comentários úteis. Este trabalho foi apoiado pela concessão da MCB 2114588 da Fundação Nacional de Ciência.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm polyethersulfone syringe filter MilliporeSigma SLMP025SS Syringe filter for removing crushed polyacrylamide gel particles (Section 5)
0.22 µm PTFE syringe filter MilliporeSigma SLLG013SL Syringe filter for removing CPG resin (Section 5)
1 mL plastic syringes ThermoFisher Scientific 14-823-434 (BD 309659) Components of triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
1,4-Dioxane, anhydrous MilliporeSigma 296309 Triphosphorylation solvent (sections 2–4)
2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, Salicyl Phosphorochloridite (SalPCl) MilliporeSigma 324124 Triphosphorylation reagent (sections 2–4)
30 mL glass bottles MilliporeSigma 23232 Bottles for preparing triphosphorylation solvents and TBAP solution (section 2)
3-way Stopcock, polycarbonate/polypropylene Bio-Rad Laboratories 7328103 Component of triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
40% acrylamide/bis-acrylamide solution, 19:1 Bio-Rad Laboratories 1610144 For PAGE (sections 5–7)
Acetonitrile, anhydrous, 100 mL Glen Research 40-4050-50 Triphosphorylation solvent (sections 2–4)
Ammonia-neutralizing Trap ThermoFisher Scientific ANT100 and ANS121 For use with Speedvac DNA130 (section 5)
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad Laboratories 1610700 For PAGE, catalyst for acrylamide polymerization (sections 5–7)
Aqueous ammonia, 28% MilliporeSigma 338818 For preparing AMA deprotection reagent (section 5)
Aqueous methylamine, 40% TCI America TCI-M0137 For preparing AMA deprotection reagent (section 5)
Automated DNA/RNA oligonucleotide synthesizer PerSeptive Biosystems Expedite 8909 DNA/RNA Synthesizer any column-based synthesizer is acceptable (section 1)
Bead-capture magnet ThermoFisher Scientific 12320D For streptavidin bead capture (section 7)
Bromophenol blue Bio-Rad Laboratories 1610404 For PAGE urea loading buffer (section 5)
Deep vacuum oil pump ThermoFisher Scientific VLP200-115 For use with lyophilizer (section 5)
Drierite dessicant, 10-20 mesh MilliporeSigma 737828 Desiccant for storing triphosphorylation chemicals and equipment (sections 1–2)
D-RNA 27.3t cross-chiral polymerase prepared in house18 5′-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
D-RNA CPG solid supports, 1,000Å, prepackaged 1 µmole synthesis columns Glen Research 20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
D-RNA TOM-protected phosphoramidites ChemGenes ANP-3201, 3202, 3203, 3205 representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
Empty Expedite Synthesis Columns, 1µm Glen Research 20-0021-01 Synthesis columns for use with Expedite DNA/RNA synthesizer (section 1)
EPPS, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(3-propanesulfonic acid), solid MilliporeSigma E1894 Ribozyme reaction buffer component (section 6)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), solid MilliporeSigma EDS Divalent metal ion chelator for use in various buffers (sections 5–7)
Filters for Expedite synthesis columns Glen Research 20-0021-0F Expedite-style synthesis column filters, for use with empty synthesis columns (section 1)
Fluorescent/phosphorescent gel scanner Cytiva Amersham Typhoon RGB, 29187193 For visualizing analytical PAGE (sections 6–7)
Formamide, deionized VWR Life Science 97062 For PAGE formamide gel loading buffer (sections 6–7)
Gel image quantitation software Cytiva ImageQuant TL For quantifying scanned gel images (section 6)
Glass desiccator MilliporeSigma CLS3121150 Triphosphorylation solvent storage (section 2)
L-RNA CPG solid supports, 1,000Å, bulk ChemGenes N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10 L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
L-RNA hammerhead template prepared in house18 5′-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
L-RNA primer prepared in house18 5′-fluorescein-GGCUCGA-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
L-RNA TOM-protected phosphoramidites ChemGenes OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205 L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
Lyophilizer/Freeze Dryer VirTis Benchtop K For concentrating oligonucleotides (section 5)
Magnesium Chloride Hexahydrate, solid MilliporeSigma M2670 For ribozyme reactions (sections 6–7)
N,N-Dimethylformamide, anhydrous MilliporeSigma 227056 Triphosphorylation solvent (section 2)
NAP-25 Desalting column (Sephadex G-25 resin) ThermoFisher Scientific 45000150 Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-25 resin (section 5)
Non-coring stainless steel needle, 20 G ThermoFisher Scientific 14-815-410 Needles for piercing rubber septa (sections 2–4)
Oligonucleotide extinction coefficient calculator Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer Tool Nearest-Neighbor Model Short Oligonucleotide 260nm extinction coefficient calculator (section 5)
Oxidizer solution, 0.1 M Iodine in THF/pyridine/water ChemGenes RN-1456 Triphosphorylation reagent (section 4)
PAGE plates Timberrock/CBS NGP-250-BO and NO For PAGE (sections 5–7)
PAGE power supply Bio-Rad Laboratories PowerPac HV 1645056 For PAGE (sections 5–7)
PAGE spacers and combs (analytical) Timberrock/CBS VGS-0725 and VGC-0714 For PAGE (sections 6–7)
PAGE spacers and combs (preparative) Timberrock/CBS VGS-3025R and VGC-3001 For PAGE (section 5)
PAGE stand Timberrock/CBS ASG-250 For PAGE (sections 5–7)
Parafilm M ThermoFisher Scientific 13-374-12 (Bemis PM999) Wax sealing film for triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
PCR thermocycler Bio-Rad Laboratories C1000 Touch Thermalcycler For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
PD 10 Desalting column (Sephadex G-10 resin) MilliporeSigma GE17-0010-01 Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-10 resin, for oligonucleotides < 15 nt (section 5)
Phosphor screens Cytiva 28956480 For visualizing 32P-labeled RNA (section 6)
Phosphoramidite synthesis reagents Glen Research 30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62 representative, for standard RNA/DNA synthesis (section 1)
Polypropylene screw-cap sealable tube MilliporeSigma BR780752 1.5 mL microcentrifuge tubes with screw-cap and silicone O-ring, for safe AMA deprotection (section 5)
Pyridine, anhydrous MilliporeSigma 270970 Triphosphorylation solvent (section 2)
Reverse-phase liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (RP-LC/ESI-MS) Novatia n/a Commercial service for LC/MS specializing in oligonucleotides (section 5)
Rubber Septa (ID x OD 7.9 mm x 14 mm), white MilliporeSigma Z564702 Septa for preparing triphosphorylation solvents and TBAP (section 2)
Self-replicator ribozyme E prepared in house14 5′-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3′ For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Self-replicator substrate A prepared in house14 5′-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3′-OH For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Self-replicator substrate B, transcribed prepared in house14 5′-pppGAGACCGCAA CUUA-3′ For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Small Drying Traps, 4 Å molecular sieves ChemGenes DMT-1975 Drying traps for DNA/RNA synthesizer phosphoramidites and triphosphorylation reagents (sections 1–2)
Sodium Chloride (NaCl), solid MilliporeSigma S7653 Salt for use in various buffers (sections 5–7)
Sodium Hydroxide (NaOH), solid MilliporeSigma S8045 Salt for use in various buffers (sections 5–7)
Statistical data-fitting software GraphPad Prism For fitting data from analytical PAGE to kinetic models (section 6)
Streptavidin-coated magnetic beads ThermoFisher Scientific 65002 For capturing biotin-labeled RNA in cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
Sucrose MilliporeSigma 84097 For PAGE urea loading buffer (section 5)
TBE running buffer, 10x ThermoFisher Scientific AAJ62788K3 For PAGE (sections 5–7)
Tetrabutylammonium Fluoride, 1.0 M solution in Tetrahydrofuran Aldrich 216143 For removing 2′-silyl protecting groups (section 5)
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad Laboratories 1610801 For polymerizing acrylamide for PAGE (sections 5–7)
Tributylamine MilliporeSigma 90781 Triphosphorylation reagent (section 2)
Tributylammonium pyrophosphate (TBAP) MilliporeSigma P8533 Triphosphorylation reagent (section 2)
Tris base MilliporeSigma T6666 Buffering agent for use in various buffers (sections 5–7)
TWEEN20 polysorbate detergent MilliporeSigma P7949 Neutral detergent for use with magnetic beads (Section 7)
Urea MilliporeSigma U5378 For PAGE and gel loading buffer (sections 5–7)
UV-Vis spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000, ND2000 For measuring oligonucleotide concentrations (section 5)
Vacuum centrifuge ThermoFisher Scientific Savant Speedvac DNA130-115 Vacuum Concentrator For removing AMA and THF (section 5)
Xylene cyanol Bio-Rad Laboratories 1610423 For PAGE urea loading buffer (section 5)

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References

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Bioengenharia Edição 184
Triphosforilação química de Oligonucleotídeos
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Bare, G. A. L., Horning, D. P. Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (184), e63877, doi:10.3791/63877 (2022).

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