Summary
Os nematoides entomopatômicos vivem em simbiose com bactérias e, juntos, infectam com sucesso insetos, minando seu sistema imunológico inato. Para promover pesquisas com base genética na infecção por nematoides, são descritos métodos de manutenção e manipulação genética de nematoides entomopatômicos.
Abstract
Nematoides entomopatômicos nos gêneros Heterorhabditis e Steinernema são parasitas obrigatórios de insetos que vivem no solo. A principal característica de seu ciclo de vida é a associação mutualista com as bactérias Photorhabdus e Xenorhabdus, respectivamente. Os parasitas nematoides são capazes de localizar e entrar em hospedeiros de insetos adequados, subverter a resposta imune do inseto e multiplicar-se eficientemente para produzir a próxima geração que irá ativamente caçar novas presas de insetos para infectar. Devido às propriedades de seu ciclo de vida, nematoides entomopatômicos são agentes de controle biológico popular, que são usados em combinação com inseticidas para controlar pragas destrutivas de insetos agrícolas. Simultaneamente, esses nematoides parasitas representam uma ferramenta de pesquisa para analisar a patogenicidade nematoide e hospedar respostas anti-nematóides. Esta pesquisa é auxiliada pelo desenvolvimento recente de técnicas genéticas e abordagens transcriômicas para entender o papel de moléculas secretas de nematoide durante a infecção. Aqui, um protocolo detalhado sobre a manutenção de nematoides entomopatômicos e o uso de um procedimento de knockdown genético é fornecido. Essas metodologias promovem ainda mais a caracterização funcional dos fatores de infecção por nematoides entomopatômicos.
Introduction
As pesquisas sobre nematoides entomopatômicos (EPN) têm se intensificado nos últimos anos devido principalmente à utilidade desses parasitas em estratégias integradas de manejo de pragas e seu envolvimento em pesquisas biomédicas básicas 1,2. Estudos recentes estabeleceram a EPN como organismos modelo para examinar os componentes genéticos do nematoide que são ativados durante os diferentes estágios do processo de infecção. Essas informações fornecem pistas críticas sobre a natureza e o número de moléculas secretadas pelos parasitas para alterar a fisiologia hospedeira e desestabilizar a resposta imune inata do inseto 3,4. Simultaneamente, esse conhecimento é comumente complementado por novos detalhes sobre o tipo de vias de sinalização imunológica do hospedeiro de insetos e as funções que regulam para restringir a entrada e a disseminação dos patógenos 5,6. Entender esses processos é crucial para vislumbrar ambos os lados da interação dinâmica entre a EPN e seus hospedeiros de insetos. Uma melhor apreciação da relação hospedeiro epn-inseto facilitará, sem dúvida, estudos semelhantes com nematoides parasiticos mamíferos, o que pode levar à identificação e caracterização de fatores infeccionais que interferem no sistema imunológico humano.
Os nematoides da EPN Heterorhabditis sp. e Steinernema sp. podem infectar uma ampla gama de insetos, e sua biologia tem sido intensamente estudada anteriormente. Os dois parasitas nematoides diferem em seu modo de reprodução, com heterorhabdite sendo auto-fertilizado e Steinernema submetido à reprodução anfímica, embora recentemente S. hermaphroditum tenha sido mostrado para se reproduzir pela auto-fertilização de hermafroditas ou através da partenogênese 7,8,9. Outra diferença entre heterorhabditis e nematoides Steinernema é seu mutualismo simbiótico com dois gêneros distintos de bactérias Gram-negativas, Photorhabdus e Xenorhabdus, respectivamente, que são patógenos potentes de insetos. Essas bactérias são encontradas na fase juvenil infecciosa (IJ) da EPN, que detecta hospedeiros suscetíveis, têm acesso ao hemocoel de insetos onde liberam suas bactérias associadas que se replicam rapidamente, e colonizam tecidos de insetos. Tanto a EPN quanto suas bactérias produzem fatores de virulência que desarmam as defesas de insetos e prejudicam a homeostase. Após a morte dos insetos, os IJs nematode desenvolvem-se para se tornarem EPN adultos e completarem seu ciclo de vida. Uma nova coorte de IJs formados em resposta à privação de alimentos e superlotação dentro do cadáver de insetos finalmente emerge no solo para caçar hospedeiros adequados 9,10,11,12.
Aqui, é descrito um protocolo eficiente para manter, amplificar e manipular geneticamente nematoides EPN. Em particular, o protocolo descreve a replicação de IJs simbióticos H. bacteriophora e S. carpocapsae , a geração de IJs de nematoides axenic, a produção de hermafroditas H. bacteriophora para microinjeção, a preparação do dsRNA e a técnica de microinjeção. Esses métodos são essenciais para a compreensão da base molecular da patogenicidade nematode e da imunidade anti-nematode hospedeira.
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Protocol
1. Produção de infanto-juvenis simbióticos
- Cubra uma placa de Petri (10 cm) com um pedaço de papel filtro e adicione aproximadamente 10-15 larvas de Galleria mellonella (Figura 1A).
- Usando uma pipeta, dispense 2 mL de água contendo cerca de 25-50 IJs por suspensão de 10 μL nos vermes de cera. Guarde a placa de Petri em um armário em temperatura ambiente.
- Dependendo da umidade do papel filtro, adicione 1-2 mL de água a cada 2 dias. Vermes de cera infectados com IJs normalmente morrerão dentro de 48 h.
- Prepare as armadilhas de água de White aproximadamente 10 dias após os vermes de cera serem infectados com os IJs8 (Figura 1B,C). Transfira cuidadosamente os insetos mortos para a parte não coçada do papel do filtro. Use água da torneira para encher a placa de Petri inferior e coloque uma tampa de um tubo de 15 mL como espaçador para ventilação.
- Transfira cuidadosamente as lombrigas macias e frágeis, levantando-as lentamente do papel do filtro usando um par de fórceps plásticos. Use água da torneira em vez de água desmineralizada ou deionizada. Este último causa agregação de nematoides.
- Certifique-se de que o nível de água na armadilha de água atinja aproximadamente metade da altura da placa de Petri. Espere que o nível da água mude ao longo do tempo, dependendo das condições de temperatura e umidade no quarto.
- Quando a água na pequena placa de Petri ficar turva devido à presença de nematoides, use uma pipeta para mover a nova geração de IJs em um frasco de cultura celular T25 ou T75.
- Adicione água da torneira até cerca de 40% do volume até que a densidade apropriada seja atingida (Figura 1C). Evite o congestionamento do nematoide e armazene os frascos de cultura celular horizontalmente.
- Adicione mais água ao fundo da placa de Petri e repita as etapas 1.6 e 1.7 até que os IJs parem de emergir das carcaças de insetos em aproximadamente 3-5 dias.
2. Produção de infantojuvenes infecciosos de nematoides
NOTA: Os nematoides axeônicos são usados porque após o complexo nematoides-bactérias dissociar dentro do inseto, cada parceiro mutualista provoca uma resposta imune hospedeira distinta5. A cepa mutante Ret16 de Photorhabdus temperata é usada porque essas bactérias suportam o crescimento de H. bacteriophora, mas não conseguem colonizar o intestino nematode13,14.
- Heterorhabditis bacteriophora jovens infecciosos
- Usando uma ponta de pipeta estéril ou espátula, raspe vários flocos de uma cultura congelada de P. temperata Ret16 em uma placa MacConkey e listras para colônias únicas. Incubar a placa por 2-3 dias a 28 °C.
- Inocular 10 mL de caldo LB com uma colônia em um tubo de 50 mL e incubar a cultura durante a noite a 28 °C em uma incubadora de agitação. Use apenas as colônias de fase primária que são vermelhas no ágar MacConkey. As colônias de fase secundária estarão off-white no ágar MacConkey.
- Lave 100 μL de cultura durante a noite com 900 μL de 1x PBS por centrifugação em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL a 17.900 x g. Decantar o supernatante. Diluir a cultura 10x em 1x PBS. Deixe o tubo no gelo.
- Mergulhe as larvas em uma solução de 70% de etanol, seque os insetos com uma toalha de papel e coloque-os em um tubo de 50 mL.
- Coloque o tubo no gelo por 20 minutos para imobilizar as larvas de cera.
- Use um papel filtro para cobrir as metades superior e inferior de uma placa de Petri (10 cm). Use a tampa da placa de Petri coberta com papel filtro como suporte básico para injeção. Umedeça o papel filtro da placa de Petri inferior e transfira no gelo para ajudar as lombrigas injetadas a se recuperarem.
- Pipeta 50 μL de bactérias geladas em um pedaço de parafilm e prepare a seringa de agulha de 22 G. Pressione o êmbolo suavemente para remover o ar na ponta da agulha.
- Mantenha uma lombriga de cera perto da extremidade posterior sob o estereoscópio (Figura 2).
- Injete 50 μL da cultura bacteriana no lado dorsal do tórax, preferencialmente na junção entre dois segmentos. Para minimizar os danos internos, injete logo abaixo da cutícula, o mais paralelo possível à lombriga de cera. É natural para uma gota de hemoglifo sangrar quando o verme de cera é perfurado
- Transfira os insetos injetados para a placa de Petri de recuperação.
- Repetir as etapas 2.1.7-2.1.9 até que todos os insetos sejam injetados com as bactérias. Para anestesiar os insetos, coloque-os no gelo por 5 minutos.
- Coloque a placa de Petri no escuro (por exemplo, gaveta ou armário) e adicione água da torneira ao papel do filtro se ele aparecer seco. Os vermes de cera sucumbirão 2 dias após a injeção, e aparecerão vermelho de tijolo após aproximadamente 3-4 dias. Se os insetos parecem marrons, a infecção bacteriana não teve sucesso.
- Aos 7 dias após a infecção, transfira os insetos com a cor vermelha de tijolo característico para uma placa de Petri revestida de papel fresco, e continue com "Produção de juveniles infecciosos nematodicos simbióticos" a partir do passo 1. Se usar nematoides simbióticos, repita o procedimento a partir da etapa 2.1. usando os IJs recém-produzidos a partir da primeira rodada.
- IJs de H. bacteriophora esterilizadores de superfície
- Colete IJs simbióticos suficientes de H. bacteriophora e IJs axenic candidatos por centrifugação para fazer uma pelota de 100 μL em um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
- Adicione 500 μL de alvejante de 5% à pelota em cada tubo de microcentrifuga e inverta. Incubar por 10 minutos. Centrifugar a 17.900 x g por 1 min. Remova o supernatante.
- Lave a pelota com 1 mL de água estéril e repita a centrifugação. Remova o supernatante. Repita este passo mais quatro vezes.
- Verificando axenicidade
- Pipeta 400 μL de água estéril para os nematoides simbióticos e bacteriophora bacteriophora .
- Coloque os nematoides sobre os insetos na placa de Petri e rotule os tratamentos em conformidade.
- Coloque as placas de Petri com os insetos infectados no escuro e verifique periodicamente se as larvas ficam vermelhas.
NOTA: Os vermes infectados com nematoides simbióticos H. bacteriophora ficarão vermelhos dentro de 2 dias após a infecção. A descoloração da enceguilina deve-selado à secreção de vários compostos produzidos por bactérias fotorhabdus mutualistas durante o processo de infecção. Falta de cor vermelha nas lombrigas infectadas 4 dias após a infecção confirma que o H. bacteriophora é axenic. Isso porque as bactérias P. temperata Ret16 não estão presentes no intestino nematode.
- Método alternativo para verificar axenicidade
- IJs simbióticos de símbios de tamanho superficial H. bacteriophora e IJs de bacteriophora de bacteriophora de tamanho superficial, conforme descrito na etapa 2.1.14.
- Homogeneize aproximadamente 500 IJs em 500 μL de PBS 1x estéril em tubos de microfuça usando pilões estéreis. Gire o homogeneado, decante o sobrenante, e espalhe-o em ágar LB. Incubar as placas a 28 °C por 24 h.
- Conte as unidades de formação da colônia (UFC) para cada placa. Amostras de axenic H. bacteriophora não formarão nenhuma colônia da bactéria P. luminescens simbiótica.
- Steinernema carpocapsae Jovens Infecciosos
- Preparação de placas de ágar lipídicos (solução de 300 mL faz aproximadamente 20 placas divididas)
- Pesar 2,4 g de Caldo de Nutrientes, 4,5 g de extrato de levedura e 1,5 g de ágar e adicioná-los a 267 mL de água desionizada. Autoclave a solução.
- Adicione 3 mL de 1 M MgCl2, 1,2 mL de óleo de milho e 28,8 mL de xarope de milho de 7%.
- Prepare e adicione à solução 300 μL de kanamycina de 30 mg/mL e 300 μL de ampicillina de 50 mg/mL (esterilizada com filtro de 0,2 μm).
- Decante a mistura em metade de uma placa de Petri dividida/placa dividida.
- Preparação de X. nematophila (cepa ΔrpoS) gramado bacteriano
- Cultura X. nematophila (Xn) ΔrpoS diretamente de um estoque bacteriano congelado 2 mL de solução LB/kan/amp em um shaker a 30 °C durante a noite.
- Inocular 5 mL de meio LB contendo 30 μg/mL kanamycin e 50 μg/mL ampicillin com 250 μL da cultura da noite para o dia e cultivar as bactérias durante a noite em um shaker.
NOTA: As bactérias Xn não crescem bem quando listradas diretamente na seleção da mídia de ágar lipídida de um estoque congelado. Se necessário, a fase primária e secundária Xn pode ser confirmada em primeiro lugar na mídia NBTA (ágar nutriente suplementado com 25 mg de azul bromotimol l−1 e 40 mg de cloreto de triphenyltetrazolium l−1) antes de iniciar uma cultura líquida fresca. - Pipeta 100 μL da cultura nas placas de ágar lipídida e espalhe em toda a placa com um laço inoculante estéril. Incubar as placas por 24 h a 30 °C.
- IJs S. carpocapsae esterilizadores de superfície
- Deixe um frasco contendo IJs em um ângulo de tal forma que os IJs afundem em um canto do frasco. Aspire 1 mL dos IJs assentados em um tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 17.900 x g para 10 s. Remova o supernatante.
- Adicione 1 mL de solução alvejante recém-preparada. Inverter tubos para misturar bem. Incubar por 1 min (incubação prolongada de alvejante levará à morte do IJ). Gire novamente por 10 s. Remova o supernatante.
- Para remover resíduos de alvejante, lave os nematoides com 1 mL de água destilada e centrífuga e centrífuga por 10 s. Remova o supernatante. Repita a lavagem mais quatro vezes.
- Estime a contagem de IJ por mL contando 10-20 μL dos IJs lavados sob o estereoscópio e ajuste a concentração dos IJs em conformidade.
- Rearing S. carpocapsae IJs
- Transfira com uma pipeta em torno de 1000 IJs nas placas divididas de ágar lipídida (Figura 3, imagem esquerda). Coloque as placas em um armário ou gaveta umidificadas. Use toalhas de papel úmidas para aumentar a umidade. Mantenha as placas em temperatura ambiente (22-25 °C).
- Verifique as toalhas de papel dia sim, dia não para garantir que fiquem úmidas. Se necessário, adicione água a cada dois dias às toalhas de papel para manter a umidade no armário ou gaveta. Alternativamente, coloque um banho de água no fundo do armário para aumentar a umidade.
- Quando os IJs aparecerem apenas, adicione água ao outro lado da placa e coloque uma camada de papel filtro no meio da placa (armadilha de água, Figura 3, imagem direita). Colete esta água contendo os IJs da primeira rodada em um frasco de cultura celular T75. Estes são os nematoides round I S. carpocapsae .
- Esterilizar a superfície com alvejante (etapa 2.2.3) novamente e repetir o processo a partir da etapa 2.2 usando os nematodes de carpocapsae Round 1 S. carpocapsae . O resultado será a 2ª Rodada S. carpocapsae nematodes.
- Verifique sob um estereóscópio a cada poucos dias para acompanhar o desenvolvimento dos nematoides.
- Verificando o estado axenic de IJs de S. carpocapsae
- Esterilizar a superfície do Round 1, Round 2 e IJs simbióticos de Carpocapsae com alvejante conforme descrito na etapa 2.2.3.
- Homogeneize aproximadamente 400-700 IJs em tubos de microfuge usando pilões plásticos estéreis. Centrifugar o homogeneizar, decantar o supernante, e espalhar a solução em placas de ágar LB. Mantenha as placas de ágar em uma incubadora a 28 °C por 24 h.
- Conte a formação da UFC para cada placa. Amostras de nematoides axenic não produzirão nenhum crescimento bacteriano.
- Verificando o estado axenic de IJs de S. carpocapsae por PCR
- Esterilizar a superfície do Round 1, Round 2 e IJs simbióticos de Carpocapsae com alvejante conforme descrito na etapa 2.2.3.
- Extrair DNA do homogeneizar. Um procedimento de extração detalhado está descrito na Seção 4.1.2 abaixo.
- Realize o PCR usando os primers XptA2 com temperatura de ressarção de 61 °C:
XptA F: 5'-GCCTGGAAAAAGGTGGACGAA-3′.
XptA R: 5'-GTAAGACCAAGGGGCACTCC-3′.
NOTA: Estes primers amplificam o gene inseticida XptA2 de X. nematophila, produzindo um amplicon de tamanho de 231 bp. O programa de ciclismo foi o seguinte: 95 °C para 2 min, 34 ciclos de 95 °C para 30 s, temperatura de 61 °C para 1 min e 73 °C por 1 min seguido de 72 °C para 10 min. - Visualize os fragmentos amplificados por separação em um gel de 1,5% de agarose. Amostras esterilizadas pela superfície axenica não formarão nenhuma faixa.
- Preparação de placas de ágar lipídicos (solução de 300 mL faz aproximadamente 20 placas divididas)
3. Criação de hermafroditas H. bacteriophora para microinjeção
- Prepare placas de placa de Petri de 6 cm com NA+chol (caldo de nutrientes de 1,5x, 1,5% de ágar e 10 μg/mL de colesterol).
- Prepare 3 mL de solução PP3 (2% Protease Peptone #3, PP3) em um tubo de cultura de 10 mL.
- Use uma ponta estéril de 20 μL para raspar a parte superior do estoque de Glicerol P. luminescens (25% vol/vol de glicerol estéril) mantido a -80 °C e soltá-lo no tubo de cultura.
- Incubar o tubo durante a noite em um agitador controlado pela temperatura a 28 °C, 200 rpm.
- No dia seguinte, a cultura será clara em vermelho. Placa 50 μL da cultura em uma placa de Petri na+chol de 6 cm e espalhe-a usando um espalhador bacteriano de forma circular.
- Coloque as placas em uma incubadora de 28 °C. O gramado P. luminescens estará pronto em 24-36 h e aparecerá em vermelho claro na cor.
- Inocular a placa com IJs esterilizados de superfície 50-100 e manter a placa a 28 °C.
- Hermafrodita L4 saudável começará a aparecer aproximadamente 48-54 h após a inoculação. Hermafroditas L4 H. bacteriophora saudáveis e não famintas são necessárias para injeção.
4. Preparação do dsRNA
- Design primer
- Projete primers para dsRNA para atingir ~500 regiões de garoa base do DNA H. bacteriophora .
- Os primers para regiões de interesse podem ser determinados usando Primer3 (https://primer3.ut.ee) ou um programa semelhante, selecionando para um comprimento de produto ideal de 500 pares base, Tm de 60 °C e comprimento de primer de 22 nucleotídeos.
- Adicione um site T7 (TAATACGACTCACTATAGGG) às extremidades de 5′ de cada primer para frente para permitir transcrição in vitro.
- Projete primers para dsRNA para atingir ~500 regiões de garoa base do DNA H. bacteriophora .
- Isolamento genômico do DNA
- Use DNA genômico isolado de pelotas congeladas de ~50.000 H. bacteriophora IJs para síntese de dsRNA.
- Use uma pelota IJ resuspended em 50 μL de tampão de lise (50 mM KCl, 0,05% (w/v) gelatina, 10 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,45% Tween 20, 60 μg/mL Proteinase K, 2,5 mM MgCl2) colocada a −80 °C por pelo menos 30 min.
- Homogeneize a pelota com um pequeno pilão de tubo.
- Aqueça a solução para a temperatura ambiente e incubar a 60 °C por 2 h, vórtice a cada 15 minutos.
- Desnaturar o Proteinase K incubando o tecido homogeneizado por 15 min a 95 °C.
- Esfrie a amostra a 4 °C e centrífuga a 3.400 x g por 1 min.
- Use o supernatante resultante como modelo para PCR subsequente.
- Configure uma reação pcr de 50 μL usando um mastermix comercial com 200 ng de DNA de modelo, 0,2 μM de primer dianteiro e reverso, e as condições sugeridas de ciclismo do fabricante.
- Analise a reação do PCR em um gel de 1,2% de agarose para verificar se as reações produziram bandas únicas do tamanho previsto.
- síntese dsRNA
- Use um kit de transcrição comercial.
- Use uma reação PCR de 5 μL para transcrição in vitro. Siga as instruções do fabricante.
- Incubar a reação por 16 h a 37 °C.
- Limpe as reações de transcrição in vitro com um kit comercial usando a precipitação de acetato/etanol de amônio para concentrar o dsRNA.
- Suspenda o dsRNA pelleted em 10 μL de água sem RNase.
- Quantifique o RNA usando um espectrômetro.
- Avalie a qualidade separando o dsRNA em um gel de 1,2% de agarose
5. Microinjeção
NOTA: Uma almofada de injeção é uma mancha de vidro com uma camada de 2% (w/v) agarose no centro. Quando os vermes a serem injetados são transferidos para estas almofadas, a camada de agarose irá imobilizá-los para o procedimento. Normalmente, almofadas extras são mantidas perto do microscópio para uso geral.
- Preparando o bloco de injeção
- Ferva 2% de água adicionando 0,2 g de agarose a 10 mL de água.
- Coloque 1-4 gotas (~50 μL) no centro de uma tampa de vidro fina de 50 mm x 70 mm.
- Use outra mancha de cobertura para achatar a gota.
- Deixe o deslizamento secar por 2-3 minutos antes de deslizar a tampa para fora lateralmente.
- Marque com um 'R' o lado direito da tampa virada para cima.
- Deixe os slides secarem à temperatura ambiente por 1 dia antes de usá-los.
- Preparação de agulhas de injeção
- Use capilares de vidro de 1,0 mm contendo um filamento fino interno. Isso permite um preenchimento eficiente da agulha.
NOTA: Qualquer puxador de agulha comercial (por exemplo, Narishige PB-7) pode ser usado. - Ligue o puxador de agulhas.
- Certifique-se de que o aquecedor está pronto ao máximo e o solenoide está definido para 8,40 para garantir a nitidez necessária da agulha e o comprimento adequado.
- Insira o tubo capilar no cume superior do botão através do filamento e aperte o botão superior. A parte superior do tubo capilar será nivelada com a parte superior do puxador de agulha e o filamento de aquecimento estará no meio do capilar.
- Mova a unidade inferior para a parte superior e, em seguida, aperte o botão inferior. Certifique-se de que o capilar está bem colocado.
- Feche a tampa do puxador de agulha e pressione o início. A luz verde acenderá. Após alguns minutos, o capilar será aquecido e separado para separar em duas metades.
NOTA: As duas agulhas separadas não têm o mesmo comprimento, mas ambas podem ser usadas para as injeções. Os pontos de agulha mais longos são preferidos. - Disponha as agulhas em uma posição vertical com seus pontos para baixo usando um pedaço de argila de modelagem. Alternativamente, armazene as agulhas em uma placa de Petri mantida no lugar por duas tiras de argila de modelagem.
- Use capilares de vidro de 1,0 mm contendo um filamento fino interno. Isso permite um preenchimento eficiente da agulha.
- Carregando a agulha
NOTA: A solução de ácido nucleico deve ser centrifuada por pelo menos 10 min a 20.784 x g para impurezas de pelotas que possam estar presentes na suspensão. A centrifugação das impurezas os impede de bloquear o fluxo da agulha de injeção.- Use qualquer um dos dois métodos para carregar ácidos nucleicos nas agulhas.
- Método 1
- Use uma pipeta para transferir aproximadamente 0,5 μL da amostra de DNA centrífuga para a extremidade unpulled da agulha de injeção. Isso aparecerá como uma pequena gota de líquido sentado em cima do tubo capilar.
- Aguarde por 5 a 7 minutos para permitir que a amostra líquida ocupe a extremidade da agulha. O produto final será uma agulha cheia sem bolhas de ar presentes.
- Use um microscópio de dissecção para confirmar a presença de solução na ponta da agulha antes da injeção.
- Método 2
- Use dicas de carregamento para o microinjetor.
- Utilizando esta ponta de carregamento, pipeta 5 μL da solução de ácido nucleico.
- Enquanto a agulha puxada está no puxador da agulha, solte o botão superior, mova a agulha puxada superior ligeiramente para cima, e aperte o botão.
- Insira cuidadosamente a ponta do carregador no tubo capilar e estenda-a até o fundo da agulha de injeção.
- Pipeta a solução de ácido nucleico na agulha de injeção.
- Retire o carregador da agulha puxada e mantenha-o separado para maior carga, se necessário. Certifique-se de trocar carregadores ao carregar uma mistura de ácido nucleico diferente.
- Preparando o microscópio de injeção
NOTA: Um microscópio invertido com iluminação difusa da base do microscópio é usado para preparação de vermes, microinjeção e recuperação. Descreve-se o uso de um microscópio invertido de alta resolução com objetivos de 10x e 40x. O microscópio é equipado com um manipulador de agulhas que segura a agulha e a coloca em posição para a injeção. O óleo de microinjeção é usado para evitar que o verme se destrua rapidamente enquanto na camada agarose da almofada de injeção. O óleo sugerido para usar é o Óleo de Halocarbon 700.- Ligue a lâmpada e calibra o brilho com o painel de controle.
- Verifique o número do prisma de Wollaston do condensador; corresponderá ao objetivo utilizado (40x).
- Confirme que a torre DIC, marcada por "DIC", está na posição certa.
- Certifique-se de que o botão no objetivo está definido em zero (0).
- Vire o anel ph para a direita até o fim.
- Ajuste o polarizador de uma forma que a seta esteja na posição horizontal.
- Coloque um pedaço de papel no palco para observar o ponto focal (luz).
- Feche o diafragma de campo a ponto de haver uma mancha no papel.
- Use o mostrador à esquerda para mover o condensador para cima e para baixo ao ponto de ser visto um ponto de luz muito afiado no papel da peça.
- Abra o diafragma de campo lentamente até o ponto em que um pequeno círculo de luz é visível.
- Tire o pedaço de papel.
- Certifique-se de que o ponto de luz está no centro do objetivo. Caso contrário, forque o ponto de luz com o centro do objetivo, ajustando os parafusos prateados na parte superior do condensador.
- Abra totalmente o diafragma de campo.
- Verifique se o analisador ICT/P está pressionado.
- Montagem da agulha de injeção no microscópio
- Ligue o fluxo de gás nitrogênio para a agulha de microinjeção. A pressão do gás na agulha será de aproximadamente 20 psi.
- Verifique os botões do micromanipulador (a parte do microscópio que move a agulha) estão posicionados para o centro, o que permite a maior amplitude de movimento quando a agulha é montada.
- Desaparafusar o conjunto que segura a haste metálica para removê-la do suporte da agulha.
- Inserir a nova agulha na parte superior do microscópio; em seguida, instale a junta de borracha para manter a agulha em posição.
- Fixar a parte inferior do suporte da agulha encaixando-a no conjunto.
- Coloque a agulha no sulco do micromanipulador e enrosque-a corretamente para mantê-la estável. Certifique-se de que o parafuso está aproximadamente 1 dentro da extremidade do micromanipulador.
- Coloque a ponta da agulha no meio do campo visual em cerca de um ângulo de 45° em relação à placa de palco, utilizando os botões e controles grossrosos do micromanipulador. É fundamental deixar a ponta da agulha alta o suficiente para que ela não quebre por acidente.
- Quebrando as agulhas
- Coloque a agulha no micromanipulador onde a ponta da agulha normalmente quebrará para permitir que a solução de ácido nucleico flua através dela.
- Quebre um capilar e coloque-o em cima de um escorregador de vidro carregando uma gota de óleo de microinjeção.
- Coloque o slide no microscópio e foque.
- Leve a ponta da agulha ao mesmo nível do lado do capilar usando os controles finos do microscópio (Figura 4).
- Ligue o fluxo de nitrogênio brevemente usando o atuador do pé para confirmar que a ponta da agulha não está quebrada. Uma rápida saída será suficiente.
- Mova a agulha suavemente para que ela mal toque o lado do capilar.
- Toque levemente na lateral do microscópio para quebrar a ponta da agulha.
- Retire a agulha do capilar e ligue o fluxo de nitrogênio para verificar se a agulha está quebrada corretamente.
- A agulha criará uma pequena gota de injeção aproximadamente cinco vezes maior que a ponta da agulha (Figura 4). Se a queda de injeção for de tamanho menor, quebre ainda mais a ponta. Se a gota de injeção for de tamanho maior, tente usar uma agulha fresca.
6. Microinjeção
- Pipeta uma gota de óleo de microinjeção em uma almofada de injeção.
- Mergulhe uma picareta esterilizada pela chama na queda de óleo de microinjeção e colete um jovem H. bacteriophora nematode adulto da placa.
- Escolha os nematoides de partes da placa que não estão perto do gramado bacteriano para evitar a transferência de um alto número de células bacterianas para a almofada de injeção. Além disso, colher um nematoide com gônadas bem formadas.
- Mova os nematoides para a almofada de injeção e posicione-os verticalmente para que as gôndas enfrentem a agulha. Certifique-se de que a vulva aponta para a mesma direção que a agulha de injeção, e os dois braços de gônada distal estão na direção oposta e contra a parede do corpo do nematoide.
NOTA: Como Pristionchus pacificus, a gônamo de H. bacteriophora migra dorsalmente da posição ventral vulval e depois migra de volta para a posição ventral. - Verifique se a quantidade de óleo é suficiente para evitar a dessecação nematode sem permitir que o nematoide ande por aí.
- Leve o nematoide ao foco com o objetivo de 10x segurando a agulha bem acima do slide. No petróleo, as gônadas nematoides são vistas como duas regiões claras próximas à anterior e posterior do verme. Certifique-se de que as gôndas estão em foco e não as outras partes do verme.
- Disponha o nematoide em um ângulo de 15° a 45° em direção à agulha de injeção, o que dará mais espaço à agulha dentro da gônada. Além disso, essa abordagem impede que a agulha passe por todo o corpo do nematoide quando a agulha é introduzida dentro da gônada.
- Posicione a agulha de injeção e o nematoide ao mesmo nível baixando gradualmente a agulha até que ela seja levada ao foco (Figura 5). Certifique-se de que, à medida que a agulha é abaixada, ela permanece ao lado do nematoide e não acima do verme.
- Use o objetivo de 40x para focar no braço de gônada sincicial do nematode.
- Mova a agulha para cima e para baixo usando o ajustador fino até que a ponta esteja em foco junto com o braço de gônada sincicial nematode.
- Mova o nematoide lentamente em direção à agulha usando o estágio deslizante. Em seguida, empurre suavemente a gônada para posicionar com a agulha contra a parede do corpo do nematoide, o que resultará em penetração eficiente da agulha dentro do corpo nematoides.
- Pise brevemente no atuador do pé para iniciar o fluxo da solução de ácido nucleico. Uma rápida saída é suficiente. Se a agulha estiver dentro da gônada, a gônada vai encher com a solução e inchar.
- Uma vez que a agulha esteja garantida na posição correta, encha a gônada com a solução de ácido nucleico até que os braços da gônada estejam cheios. É importante evitar a expulsão de líquido do verme através do buraco onde a agulha o perfurou.
- Usando o estágio deslizante, mova cuidadosamente o verme para longe da agulha.
- Levante a agulha e gire-a no sentido anti-horário.
- Coloque uma gota de 1x tampão PBS em cima do worm para fazê-lo flutuar.
- Use a picareta esterilizada pela chama para levantar o verme e colocá-lo em outra gota de M9 em uma placa fresca de P. luminescens semeada para livrar o verme do excesso de óleo.
- Retire o nematoide do M9 e coloque-o no outro lado do gramado bacteriano.
- Use a mesma placa para transferir vários nematoides injetados.
- Em 2-3 dias, avalie os nematoides de primeira geração (F1) para o fenótipo transgênico. Separe os nematoides transgênicos F1 em placas individuais para determinar quais vermes gerarão linhas transgênicas estáveis.
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Representative Results
Para avaliar o estado dos nematoides de H. bacteriophora que passaram pela axenização, foi determinada a presença ou ausência de colônias bacterianas de P. luminescens em IJs. Para isso, foi coletada uma pelota de aproximadamente 500 IJs que haviam sido esterilizados e homogeneizados anteriormente na PBS. O tratamento de controle positivo consistia em uma pelota de aproximadamente 500 IJs da cultura nematoide contendo bactérias simbióticas P. luminescens . As pelotas de nematoides de controle axenizado e positivo foram homogeneizadas em 1x PBS. Os homogeneizadores foram espiados em ágar e espalhados para facilitar o crescimento de colônias individuais. As placas de ágar foram incubadas a 28 °C por 24 h. No dia seguinte, observou-se a ocorrência de colônias de P. luminescens (UFC). Como esperado, h. bacteriophora da cultura de estoque carregava células simbióticas P. luminsecens ; no entanto, os nematoides desprovidos de suas bactérias P. luminecens associadas foram axenic e armazenados separadamente para futura experimentação (Figura 6).
O knockdown da expressão genética nol-5 foi usado como exemplo para mostrar a eficácia do RNAi utilizando o processo de microinjeção. A microinjeção foi realizada na geração parental e o efeito foi observado na prole da F-1. O knockdown do nol-5 utilizando microinjeção RNAi resultou na ausência de germinal na gônada de 60% da prole (Figura 7).
Figura 1: Geração de juvenis infecciosos (estágio de vida livre de nematoides entomopatômicos). (a) Infecção de larvas de insetos Galleria mellonella (mantidas em placa de Petri) com juvenis infecciosos nematode (mantidos em frascos de cultura tecidual). b Dobrar um pedaço de papel filtro para a preparação de uma armadilha de água. c O arranjo de uma armadilha de água de nematoides entomopatômicos com larvas mortas de insetos Galleria mellonella contendo juvenis infecciosos (12 dias após infecção por nematoides). A nova geração de jovens infecciosos deixará os insetos mortos e se moverá para a água, que é então armazenada em um frasco de cultura tecidual. As imagens são feitas usando software gráfico BioRender (https://biorender.com). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Injeção de larvas de insetos Galleria mellonella com a cepa de bactéria Photorhabdus temperata Ret16. Os vermes de cera são mantidos em uma placa de Petri, e são imobilizados através de tratamento frio (ou seja, são colocados no gelo por alguns minutos). A parte posterior do corpo do inseto é pressionada com um par de fórceps para criar uma superfície inchada que é adequada para injeção. O ângulo de injeção é raso para evitar a lesão de tecidos internos de insetos, o que levaria à morte de insetos devido ao manuseio descuidado. As imagens são feitas usando software gráfico BioRender (https://biorender.com). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Geração de oxiscósides carpocapsae entomopatogênicos. Metade de uma placa de Petri dividida contém um gramado de xenorhabdus nematophila ΔrpoS bactérias em ágar lipídico e juvenis infecciosos de S. carpocapsae nematodes. Este método in vitro induz os jovens infecciosos a se tornarem nematoides adultos, que mais tarde produzirão ovos que chocarão para dar origem à nova geração dos parasitas. Quando um grande número de jovens infecciosos S. carpocapsae recém-gerados aparecem nesta parte da placa de Petri dividida, a água é adicionada à outra metade da placa juntamente com um pedaço de papel filtro para facilitar a migração dos nematoides. As imagens são feitas usando software gráfico BioRender (https://biorender.com) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Quebrando a ponta da agulha. A ponta da agulha geralmente é fechada. O fluxo adequado da solução de ácido nucleico é verificado antes de realizar a injeção real. Em uma lâmina de vidro, coloque uma gota de óleo de halocarbono. Coloque um tubo capilar, usado para fazer a agulha, verticalmente como mostrado na figura. Leve o capilar para se concentrar em 40x e leve suavemente a agulha para baixo no plano com o capilar. Toque suavemente a ponta da agulha no capilar. Isso cria uma abertura para o fluxo suave do dsRNA. Se nenhum fluido estiver saindo, realize um fluxo rápido de nitrogênio usando o atuador do pé. A pressão do nitrogênio e o contato da ponta da agulha com o capilar quebrará a agulha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Local de injeção. A gôndio de H. bacteriophora migra dorsalmente da posição ventral vulval e, em seguida, migra de volta para a posição ventral. Os braços migratórios cruzam uns aos outros perto da vulva e se estendem além da vulva de ambos os lados. Por volta das 48 horas, os braços estendidos da gôndana de um jovem adulto, cultivado a partir de IJ, são visíveis perto da vulva. A microinjeção é realizada nesta posição. Barra de escala: 0,1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Validação da bacteriophora de heterorhabditis . O sucesso do procedimento de axenização foi estimado confirmando a ausência de células bacterianas Photorhabdus luminescens em jovens infecciosos H. bacteriophora tratados. Para isso, uma pelota de aproximadamente 500 vermes esterilizados pela superfície da cultura do estoque (simbiótico) ou vermes que haviam sido submetidos ao processo de axenização (axenic) foram homogeneizados. Em seguida, a homogeneidade foi espalhada em placas de ágar e após uma incubação de 24 horas, o aparecimento de colônias bacterianas (unidades formadoras de colônias, UFC) foi monitorado. A falta de colônias bacterianas nas placas sugere que os nematoides h. bacteriophora estão livres de suas bactérias simbióticas P. luminescens . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: RNAi mediado knockdown de gene nol-5 . O knockdown mediado da RNAi do gene H. bacteriophora nol-5 resulta em um fenótipo sem germe. A descendência de um tipo selvagem, não injetado H. bacteriophora nematode (a) contém ovos em suas gônadas. A descendência de um tipo selvagem, nol-5 RNAi injetado H. bacteriophora nematode (b) não contém ovos em suas gônadas vazias devido ao knockdown do RNA nol-5 . Barra de escala: 0,1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Compreender a base molecular da infecção entomopatômica e imunidade anti-nematode de insetos requer a separação dos parasitas das bactérias mutuamente associadas 13,15,16. Os nematoides entomopatômicos H. bacteriophora e S. carpocapsae vivem junto com as bactérias Gram-negativas P. luminescens e X. nematophila, respectivamente17. Ambas as espécies bacterianas têm sido mostradas anteriormente para codificar fatores que conferem patogenicidade mirando tecidos de insetos e neutralizando o sistema imunológico inato durante a infecção18,19. Isso dificulta os esforços para identificar as estratégias que os nematoides evoluíram para interagir com o hospedeiro do inseto. Portanto, a identificação e caracterização funcional através da derrubada genética dos componentes do nematoides que também participam do processo de infecção podem ser facilitadas pela geração de vermes axeônicos. Aqui, são apresentados protocolos eficientes para a produção de nematoides entomopatômicos axenic e a realização de silenciamento genético RNAi em H. bacteriophora.
Um passo crítico em ambos os protocolos para a geração com sucesso de nematoides axenic é a esterilização superficial de H. bacteriophora e IJs S. carpocapsae 14,20. Esta parte do método envolve o tratamento dos vermes com solução alvejante e é considerada crucial para o sucesso do processo de axenização, pois remove as bactérias P. luminescens e X. nematophila da cutícula nematode. Este é um procedimento importante para garantir que apenas as bactérias mutualistas na superfície dos vermes sejam limpas e não aquelas dentro dos parasitas. A conclusão desta etapa requer atenção, pois o tratamento prolongado de alvejante afetará a sobrevivência do nematoide.
Uma semelhança do presente protocolo de axenização para nematoides S. carpocapsae com um método previamente estabelecido é o uso das bactérias mutantes X. nematophila ΔrpoS que não são capazes de colonizar os vermes21. Uma diferença entre a metodologia atual e um protocolo relatado anteriormente, que introduziu ovos de nematoides esterilizados na superfície no ágarnutriente 22, é a adição de antibióticos na mídia cultural para inibir a contaminação microbiana que provavelmente afetaria o crescimento e a aptidão do nematoide.
RNAi por microinjeção é um método fácil e confiável de entregar o RNA aos oócitos. A explosão de líquido dentro da gônia fornece confirmação visual da liberação da solução de ácido nucleico durante o processo de injeção. Mostrou-se que o RNAi por microinjeção é significativamente melhor que o RNAi por imersão. Isso provavelmente se deve à capacidade da solução RNAi de alcançar oócitos que estão em diferentes estágios de diferenciação dentro da gônus.
Ao mesmo tempo em que otimiza o processo, recomenda-se testar diferentes concentrações de solução de RNA para melhores resultados. Foram testadas várias concentrações de RNA variando de 50 ng/μL a 10 μg/μL. Verificou-se que uma concentração de 6 μg/μL funcionou melhor do que outras concentrações. Para aumentar o rendimento do RNA durante a etapa de transcrição in vitro , o protocolo foi modificado de um período de incubação de 4 horas para 16 horas. Isso resultou em um aumento substancial no rendimento final do RNA. Um dos fatores-chave para o sucesso da microinjeção é a quantidade de tempo que um nematoide gasta na almofada de injeção. Menos tempo resulta em um nematoide sobrevivente saudável e prole saudável com maior chance de observar o fenótipo pretendido.
O protocolo atual para a cultura e manipulação genética de nematoides entomopatômicos é uma contribuição significativa para estudos futuros nos campos de interações nematologia, imunologia e hospúrio-parasita. A combinação de abordagens que permitem a manipulação de nematoides entomopatômicos levará à descoberta dos fatores genéticos que definem a interação entre moléculas de efeito nematode e componentes de sinalização imunológica hospedeira que codificam fatores com propriedades anti-nematóides. Determinará ainda quais componentes moleculares de nematóides-chave determinam a relação simbiótica com as bactérias relacionadas. Responder a essas perguntas é importante para melhorar as práticas agrícolas e desenvolver novos meios para o controle de nematoides parasitas humanos.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos aos membros do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade George Washington pela leitura crítica do manuscrito. Todas as figuras gráficas foram feitas usando BioRender. Pesquisa no I.E., J.H., e D. O'H. laboratórios têm sido apoiados pela Universidade George Washington e pela Columbian College of Arts and Sciences facilitando fundos e Fundos de Pesquisa Interdisciplinar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | VWR | 97062-244 | |
| Ambion Megascript T7 Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1333 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | 611770250 | |
| Cell culture flask T25 | Fisher Scientific | 156367 | |
| Cell culture flask T75 | Fisher Scientific | 156499 | |
| ChoiceTaq Mastermix | Denville Scientific | C775Y42 | |
| Corn oil | VWR | 470200-112 | |
| Corn syrup | MP Biomedicals/VWR | IC10141301 | |
| Culture tube 10 mL | Fisher Scientific | 14-959-14 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Falcon tube 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5252000021 | |
| Filter paper | VWR | 28320-100 | |
| Galleria mellonella waxorms | Petco | - | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-553-464 | 50 x 24 mm |
| Halocarbon Oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inoculating loop | VWR | 12000-806 | |
| Kanamycin | VWR | 97062-956 | |
| Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-3 | 1.0 mm |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Leica DM IRB Inverted Research Microscope | Microscope Central | - | |
| MacConkey medium | Millipore-Sigma | M7408-250G | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| Microcentrifuge tube | VWR | 76332-064 | 1.5 ml |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Needle syringe | VWR | BD305155 | 22G |
| Nutrient broth | Millipore-Sigma | 70122-100G | |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | |
| Partitioned Petri dish | VWR | 490005-212 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab |
| PCR primers | Azenta | - | |
| Pestle | Millipore-Sigma | BAF199230001 | Bel-Art Disposable Pestle |
| Petri dish 6 cm | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Petri dish 10 mm | VWR | 10799-192 | 35 x 10 mm |
| Proteose Peptone #3 | Thermo Fisher Scientific | 211693 | |
| Yeast extract | Millipore-Sigma | Y1625 |
References
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