Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Entomopatojenik Nematodların Kültürlenmesi ve Genetik Olarak Manipüle Edilmesi

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63885
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, The George Washington University, 2Department of Microbiology, Immunology, and Tropical Medicine, School of Medicine and Health Sciences, The George Washington University

Summary

Entomopatojenik nematodlar bakterilerle simbiyoz içinde yaşarlar ve birlikte doğuştan gelen bağışıklık sistemlerini zayıflatarak böcekleri başarılı bir şekilde enfekte ederler. Nematod enfeksiyonunun genetik temeli üzerine araştırmaları teşvik etmek için, entomopatojenik nematodları korumak ve genetik olarak manipüle etmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Abstract

Heterorhabditis ve Steinernema cinslerindeki entomopatojenik nematodlar, toprakta yaşayan böceklerin zorunlu parazitleridir. Yaşam döngülerinin temel özelliği, sırasıyla Photorhabdus ve Xenorhabdus bakterileri ile karşılıklı ilişkidir. Nematod parazitleri, uygun böcek konakçılarını bulabilir ve girebilir, böcek bağışıklık tepkisini bozabilir ve enfekte etmek için yeni böcek avını aktif olarak avlayacak yeni nesli üretmek için verimli bir şekilde çoğalabilir. Yaşam döngülerinin özellikleri nedeniyle, entomopatojenik nematodlar, yıkıcı tarımsal böcek zararlılarını kontrol etmek için böcek öldürücülerle birlikte kullanılan popüler biyolojik kontrol ajanlarıdır. Aynı zamanda, bu paraziter nematodlar, nematod patojenitesini ve konakçı anti-nematod yanıtlarını analiz etmek için bir araştırma aracını temsil eder. Bu araştırma, enfeksiyon sırasında nematod salgılanan moleküllerin rolünü anlamak için genetik tekniklerin ve transkriptomik yaklaşımların son zamanlarda geliştirilmesi ile desteklenmektedir. Burada, entomopatojenik nematodların korunması ve bir gen nakavt prosedürünün kullanılması konusunda ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır. Bu metodolojiler ayrıca entomopatojenik nematod enfeksiyon faktörlerinin fonksiyonel karakterizasyonunu teşvik etmektedir.

Introduction

Entomopatojenik nematodlar (EPN) üzerine yapılan araştırmalar, öncelikle bu parazitlerin entegre haşere yönetimi stratejilerindeki yararları ve temel biyomedikal araştırmalara katılımları nedeniyle son birkaç yılda yoğunlaşmıştır 1,2. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, EPN'yi, enfeksiyon sürecinin farklı aşamalarında aktive olan nematod genetik bileşenlerini incelemek için model organizmalar olarak belirlemiştir. Bu bilgi, konakçı fizyolojisini değiştirmek ve böceğin doğuştan gelen bağışıklık tepkisini istikrarsızlaştırmak için parazitler tarafından salgılanan moleküllerin doğası ve sayısı hakkında kritik ipuçları sağlar 3,4. Aynı zamanda, bu bilgi yaygın olarak böcek konakçısı immün sinyal yollarının tipi ve patojenlerin girişini ve yayılmasını kısıtlamak için düzenledikleri işlevler hakkında yeni detaylarla desteklenmektedir 5,6. Bu süreçleri anlamak, EPN ve böcek konakçıları arasındaki dinamik etkileşimin her iki tarafını da öngörmek için çok önemlidir. EPN-böcek konakçı ilişkisinin daha iyi değerlendirilmesi, kuşkusuz, insan bağışıklık sistemine müdahale eden enfeksiyon faktörlerinin tanımlanmasına ve karakterize edilmesine yol açabilecek memeli parazitik nematodlarla benzer çalışmaları kolaylaştıracaktır.

EPN nematodları Heterorhabditis sp. ve Steinernema sp. çok çeşitli böcekleri enfekte edebilir ve biyolojileri daha önce yoğun bir şekilde incelenmiştir. İki nematod paraziti, Heterorhabditis kendi kendine döllenirken ve Steinernema'nın amfimiktik üreme geçiren üreme biçimlerinde farklılık gösterir, ancak son zamanlarda S. hermaphroditum'un hermafroditlerin kendi kendine döllenmesi veya partenogenez 7,8,9 yoluyla çoğaldığı gösterilmiştir. Heterorhabditis ve Steinernema nematodları arasındaki bir diğer fark, her ikisi de böceklerin güçlü patojenleri olan sırasıyla iki farklı Gram-negatif bakteri cinsi, Photorhabdus ve Xenorhabdus ile simbiyotik karşılıklılıklarıdır. Bu bakteriler, EPN'nin serbest yaşayan ve beslenmeyen enfektif juvenil (IJ) aşamasında, duyarlı konakçıları tespit eden, hızla çoğalan ilişkili bakterilerini serbest bıraktıkları böcek hemokoluna erişen ve böcek dokularını kolonize eden bulunur. Hem EPN hem de bakterileri, böcek savunmasını silahsızlandıran ve homeostazı bozan virülans faktörleri üretir. Böcek ölümünü takiben, nematod IJ'ler yetişkin EPN olmak ve yaşam döngülerini tamamlamak için gelişir. Yiyecek yoksunluğuna ve böcek kadavrasındaki aşırı kalabalığa yanıt olarak oluşan yeni bir IJ kohortu, uygun konakçıları avlamak için toprakta nihayet ortaya çıkar 9,10,11,12.

Burada, EPN nematodlarının bakımı, çoğaltılması ve genetik olarak manipüle edilmesi için etkili bir protokol açıklanmaktadır. Protokol özellikle, simbiyotik H. bakteriyophora ve S. carpocapsae IJ'lerin replikasyonunu, aksenik nematod IJ'lerin oluşumunu, mikroenjeksiyon için H. bacteriophora hermafroditlerinin üretimini, dsRNA'nın hazırlanmasını ve mikroenjeksiyon tekniğini özetlemektedir. Bu yöntemler, nematod patojenitesinin moleküler temelini ve konakçı anti-nematod bağışıklığını anlamak için gereklidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Simbiyotik nematod enfektif gençlerin üretimi

  1. Bir Petri kabını (10 cm) bir parça filtre kağıdı ile örtün ve yaklaşık 10-15 Galleria mellonella larvası ekleyin (Şekil 1A).
  2. Bir pipet kullanarak, balmumu solucanlarına 10 μL süspansiyon başına yaklaşık 25-50 IJ içeren 2 mL su dağıtın. Petri kabını oda sıcaklığında bir dolapta saklayın.
  3. Filtre kağıdının nemine bağlı olarak, her 2 günde bir 1-2 mL su ekleyin. IJ'lerle enfekte olmuş balmumu kurtları normalde 48 saat içinde ölecektir.
  4. White'ın su tuzaklarını, balmumu kurtları IJs8 ile enfekte olduktan yaklaşık 10 gün sonra hazırlayın (Şekil 1B, C). Ölü böcekleri filtre kağıdının ıslatılmamış kısmına dikkatlice aktarın. Alt Petri kabını doldurmak için musluk suyu kullanın ve havalandırma için bir ara parça olarak 15 mL'lik bir tüp kapağı yerleştirin.
  5. Yumuşak ve kırılgan balmumu kurtlarını, bir çift plastik forseps kullanarak filtre kağıdından yavaşça kaldırarak dikkatlice aktarın. Demineralize veya deiyonize su yerine musluk suyu kullanın. İkincisi nematod agregasyonuna neden olur.
    1. Su tutucudaki su seviyesinin Petri kabının yüksekliğinin yaklaşık yarısına ulaştığından emin olun. Su seviyesinin, odadaki sıcaklık ve nem koşullarına bağlı olarak zamanla değişeceğini bekleyin.
  6. Küçük Petri kabındaki su, nematodların varlığı nedeniyle bulanıklaştığında, yeni nesil IJ'leri bir T25 veya T75 hücre kültürü şişesine taşımak için bir pipet kullanın.
  7. Uygun yoğunluğa ulaşılana kadar hacmin yaklaşık% 40'ına kadar musluk suyu ekleyin (Şekil 1C). Nematod tıkanıklığından kaçının ve hücre kültürü şişelerini yatay olarak saklayın.
  8. Alt Petri kabına daha fazla su ekleyin ve IJ'ler yaklaşık 3-5 gün içinde böcek karkaslarından çıkmayı bırakana kadar 1.6 ve 1.7 adımlarını tekrarlayın.

2. Aksenik nematod enfektif yavruların üretimi

NOT: Aksenik nematodlar kullanılır, çünkü nematod-bakteri kompleksi böcek içinde ayrıştıktan sonra, her karşılıklı ortak ayrı bir konakçı bağışıklık tepkisi ortaya çıkarır5. Photorhabdus temperata'nın mutant suşu Ret16 kullanılır, çünkü bu bakteriler H. bacteriophora'nın büyümesini destekler, ancak nematod bağırsağını kolonize edemez13,14.

  1. Heterorhabditis bacteriophora enfektif gençler
    1. Steril bir pipet ucu veya spatula kullanarak, donmuş bir P. temperata Ret16 kültürünün birkaç pulunu bir MacConkey plakasına kazıyın ve tek koloniler için çizgi çizin. Plakayı 28 ° C'de 2-3 gün boyunca inkübe edin.
    2. 10 mL'lik LB suyunu 50 mL'lik bir tüpte bir koloni ile aşılayın ve kültürü sallayan bir inkübatörde gece boyunca 28 ° C'de inkübe edin. Yalnızca MacConkey agar'da kırmızı olan birincil faz kolonilerini kullanın. İkincil faz kolonileri MacConkey agar'da kirli beyaz olacaktır.
    3. 100 μL gece kültürünü, 17.900 x g'da 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde santrifüj yaparak 900 μL 1x PBS ile yıkayın. Süper natantı dekant. Kültürü 1x PBS'de 10x seyreltin. Tüpü buz üzerinde bırakın.
    4. Balmumu kurtlarını% 70'lik bir etanol çözeltisine batırın, böcekleri bir kağıt havluyla kurutun ve 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
    5. Balmumu kurtlarını hareketsiz hale getirmek için tüpü 20 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
    6. Petri kabının üst ve alt yarısını (10 cm) örtmek için bir filtre kağıdı kullanın. Filtre kağıdı ile kaplı Petri kabı kapağını enjeksiyon için temel destek olarak kullanın. Alt Petri kabının filtre kağıdını nemlendirin ve enjekte edilen balmumu kurtlarının iyileşmesine yardımcı olmak için buz üzerine aktarın.
    7. Bir parça parafilm üzerine 50 μL buz gibi soğuk bakteri pipeti koyun ve 22 G iğne şırıngasını hazırlayın. İğnenin ucundaki havayı çıkarmak için pistona hafifçe bastırın.
    8. Bir balmumu solucanını stereoskop altında arka uca yakın tutun (Şekil 2).
    9. Bakteri kültürünün 50 μL'sini toraksın dorsal tarafına, tercihen iki segment arasındaki kavşakta enjekte edin. İç hasarı en aza indirmek için, balmumu kurduna mümkün olduğunca paralel olarak kütikülün hemen altına enjekte edin. Balmumu kurdu delindiğinde bir damla hemolenf damlacığının kanaması doğaldır.
    10. Enjekte edilen böcekleri iyileşme Petri kabına aktarın.
    11. Tüm böceklere bakteri enjekte edilene kadar 2.1.7-2.1.9 adımlarını tekrarlayın. Böcekleri anestezik etmek için, onları 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
    12. Petri kabını karanlıkta (örneğin, çekmece veya dolap) yerleştirin ve kuru görünüyorsa filtre kağıdına musluk suyu ekleyin. Balmumu kurtları enjeksiyondan 2 gün sonra yenik düşer ve yaklaşık 3-4 gün sonra tuğla kırmızısı görünür. Böcekler kahverengi görünüyorsa, bakteriyel enfeksiyon başarısız olmuştur.
    13. Enfeksiyondan sonraki 7 günde, karakteristik tuğla kırmızısı rengindeki böcekleri taze bir filtre kağıdı kaplı Petri kabına aktarın ve 1. adımdan itibaren "Simbiyotik nematod enfektif yavruların üretimi" ile devam edin. Simbiyotik nematodlar kullanıyorsanız, prosedürü adım 2.1'den tekrarlayın. ilk turdan itibaren yeni üretilen IJ'leri kullanarak.
    14. Yüzey sterilize edici H. bacteriophora IJ'ler
      1. 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde 100 μL'lik bir pelet yapmak için santrifüjleme yoluyla yeterli simbiyotik H. bakteriyoforu ve aday aksenik IJ'leri toplayın.
      2. Her mikrosantrifüj tüpündeki pelete 500 μL% 5 ağartıcı ekleyin ve ters çevirin. 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. 1 dakika boyunca 17.900 x g'de santrifüj. Süper natantı çıkarın.
      3. Peleti 1 mL steril suyla yıkayın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Süper natantı çıkarın. Bu adımı dört kez daha tekrarlayın.
    15. Aksenisiteyi doğrulama
      1. Pipet, yıkanmış simbiyotik ve aday aksenik H. bakteriyoforasına 400 μL steril su verir.
      2. Nematodları Petri kabındaki böceklerin üzerine yerleştirin ve tedavileri buna göre etiketleyin.
      3. Petri bulaşıklarını enfekte olmuş böceklerle karanlıkta yerleştirin ve balmumu kurtlarının kırmızıya dönüp dönmediğini periyodik olarak kontrol edin.
        NOT: H. bacteriophora simbiyotik nematodlarla enfekte olmuş balmumu kurtları, enfeksiyondan sonraki 2 gün içinde kırmızı hale gelecektir. Balmumu kurdu renk değişikliği, enfeksiyon işlemi sırasında karşılıklı Photorhabdus bakterileri tarafından üretilen çeşitli bileşiklerin salgılanmasından kaynaklanmaktadır. Enfeksiyondan 4 gün sonra enfekte balmumu kurtlarında kırmızı renk eksikliği, H. bakteriyoforasının aksenik olduğunu doğrulamaktadır. Bunun nedeni, P. temperata Ret16 bakterilerinin nematod bağırsağında bulunmamasıdır.
    16. Aksenisiteyi doğrulamak için alternatif yöntem
      1. Adım 2.1.14'te açıklandığı gibi simbiyotik H. bakteriyophora IJ'leri ve aday aksenik H. bakteriyophora IJ'leri yüzey sterilize edin.
      2. Steril havaneler kullanarak mikrofüj tüplerinde 500 μL steril 1x PBS'de yaklaşık 500 IJ'yi homojenize edin. Homojenatı döndürün, süpernatanı boşaltın ve LB agar'a yayın. Plakaları 24 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin.
      3. Her plaka için koloni oluşturan birimleri (CFU) sayın. Aksenik H. bakteriyoforasından alınan örnekler, simbiyotik P. luminescens bakterilerinin herhangi bir kolonisini oluşturmaz.
  2. Steinernema carpocapsae Enfektif Gençler
    1. Lipid agar plakalarının hazırlanması (300 mL çözelti yaklaşık 20 bölünmüş plaka yapar)
      1. 2.4 g Besin Suyu, 4.5 g maya özü ve 1.5 g agar tartın ve bunları 267 mL deiyonize suya ekleyin. Çözümü otoklav edin.
      2. 3 mL 1 M MgCl 2,1.2 mL mısır yağı ve 28.8 mL% 7 mL mısır şurubu ekleyin.
      3. 300 μL 30 mg / mL kanamisin ve 300 μL 50 mg / mL ampisilin (0.2 μm filtre ile sterilize edilmiş) hazırlayın ve çözeltiye ekleyin.
      4. Karışımı bölünmüş bir Petri kabının / bölünmüş tabağın yarısına boşaltın.
    2. X. nematophila (suş ΔrpoS) bakteriyel çiminin hazırlanması
      1. Kültür X. nematophila (Xn) ΔrpoS doğrudan dondurulmuş bir bakteri stokundan, gece boyunca 30 ° C'de bir çalkalayıcı üzerinde 2 mL LB / kan / amp çözeltisi.
      2. 30 μg / mL kanamisin ve 50 μg / mL ampisilin içeren 5 mL LB ortamını, gece kültürünün 250 μL'si ile aşılayın ve bakterileri bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca büyütün.
        NOT: Xn bakterileri, dondurulmuş bir stoktan doğrudan seleksiyon lipit agar ortamına çizildiğinde iyi büyümez. Gerekirse, taze bir sıvı kültüre başlamadan önce birincil ve ikincil faz Xn, NBTA ortamında (25 mg bromothimol mavi l-1 ve 40 mg tripheniltetrazolium klorür l-1 ile desteklenmiş besin agar) doğrulanabilir.
      3. Pipet, lipit agar plakaları üzerindeki kültürün 100 μL'sini oluşturur ve steril bir aşılama halkası ile tüm plakaya yayılır. Plakaları 30 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin.
    3. Yüzey sterilize edici S. carpocapsae IJ'ler
      1. IJ'ler içeren bir şişeyi, IJ'lerin şişenin bir köşesine batacağı bir açıyla bırakın. Yerleşmiş IJ'lerin 1 mL'sini bir mikrosantrifüj tüpüne aspire edin. 10 s için 17.900 x g'de santrifüj. Süper natantı çıkarın.
      2. 1 mL% 1 taze hazırlanmış ağartıcı çözeltisi ekleyin. İyice karıştırmak için tüpleri ters çevirin. 1 dakika boyunca inkübe edin (uzun süreli ağartıcı inkübasyonu IJ ölümüne yol açacaktır). 10 saniye boyunca tekrar döndürün.
      3. Ağartıcı kalıntılarını gidermek için, nematodları 1 mL steril damıtılmış su ile yıkayın ve 10 sn boyunca santrifüj yapın. Yıkamayı dört kez daha tekrarlayın.
      4. Stereoskop altında yıkanan IJ'lerin 10-20 μL'sini sayarak mL başına IJ sayısını tahmin edin ve IJ'lerin konsantrasyonunu buna göre ayarlayın.
    4. Yetiştirme S. carpocapsae IJs
      1. Pipetle yaklaşık 1000 IJ ile lipit agar bölünmüş plakalarına aktarın (Şekil 3, soldaki resim). Plakaları nemlendirilmiş bir kabine veya çekmeceye yerleştirin. Nemi artırmak için nemli kağıt havlular kullanın. Plakaları oda sıcaklığında (22-25 °C) tutun.
      2. Kağıt havluları nemli kaldıklarından emin olmak için her gün kontrol edin. Gerekirse, kabin veya çekmecedeki nemi korumak için kağıt havlulara her gün su ekleyin. Alternatif olarak, nemi artırmak için kabinin altına bir su banyosu yerleştirin.
      3. IJ'ler yalnızca göründüğünde, plakanın diğer tarafına su ekleyin ve plakanın ortasına bir filtre kağıdı tabakası yerleştirin (su tutucu, Şekil 3, sağ resim). İlk tur IJ'leri içeren bu suyu bir T75 hücre kültürü şişesinde toplayın. Bunlar Round I S. carpocapsae nematodlarıdır.
      4. Çamaşır suyu ile yüzey sterilizasyonu yapın (adım 2.2.3) ve Round 1 S. carpocapsae nematodlarını kullanarak adım 2.2'den itibaren işlemi tekrarlayın. Sonuç Round 2 S. carpocapsae nematodları olacaktır.
      5. Nematodların gelişimini izlemek için birkaç günde bir stereoskop altında kontrol edin.
    5. S. carpocapsae IJ'lerin aksenik durumunu doğrulama
      1. Round 1, Round 2 ve symbiotic S. carpocapsae IJ'leri adım 2.2.3'te açıklandığı gibi ağartıcı ile yüzey sterilize edin.
      2. Steril plastik havaneler kullanarak mikrofüj tüplerinde yaklaşık 400-700 IJ'yi homojenize edin. Homojenatı santrifüj edin, süpernatanı boşaltın ve çözeltiyi LB agar plakalarına yayın. Agar plakalarını 24 saat boyunca 28 ° C'ye ayarlanmış bir inkübatörde tutun.
      3. Her plaka için CFU oluşumunu sayın. Aksenik nematodlardan alınan örnekler herhangi bir bakteri büyümesi üretmez.
    6. S. carpocapsae IJ'lerin aksenik durumunun PCR ile doğrulanması
      1. Round 1, Round 2 ve symbiotic S. carpocapsae IJ'leri adım 2.2.3'te açıklandığı gibi ağartıcı ile yüzey sterilize edin.
      2. Homojenattan DNA ayıklayın. Ayrıntılı bir ekstraksiyon prosedürü aşağıdaki Bölüm 4.1.2'de açıklanmıştır.
      3. Tavlama sıcaklığı 61 °C olan XptA2 primerlerini kullanarak PCR uygulayın:
        XptA F: 5′-GCCTGGAAAGAGTGGACGAA-3′.
        XptA R: 5′-GTAAGACCAAGGGGCACTCC-3′.
        NOT: Bu primerler, X. nematophila'nın böcek öldürücü geni XptA2'yi yükselterek 231 bp boyutunda bir amplikon üretir. Bisiklet programı şu şekildeydi: 2 dakika için 95 ° C, 30 s için 95 ° C'lik 34 döngü, 1 dakika için 61 ° C ve 1 dakika için 73 ° C tavlama sıcaklığı ve ardından 10 dakika için 72 ° C.
      4. Güçlendirilmiş parçaları% 1.5'lik bir agaroz jeli içinde ayırarak görselleştirin. Aksenik yüzey sterilize edilmiş numuneler herhangi bir bant oluşturmaz.

3. Mikroenjeksiyon için H. bacteriophora hermafroditlerinin yetiştirilmesi

  1. NA+chol (1.5x Besin Suyu,% 1.5 agar ve 10 μg / mL kolesterol) ile 6 cm Petri kabı tabakları hazırlayın.
  2. 10 mL'lik bir kültür tüpünde 3 mL PP3 çözeltisi (% 2 Protease Peptone #3, PP3) hazırlayın.
  3. -80 ° C'de tutulan P. luminescens gliserol stoğunun (% 25 hacim / hacim steril gliserol) üstünü kazımak ve kültür tüpüne bırakmak için steril bir 20 μL uç kullanın.
  4. Tüpü gece boyunca 28 ° C, 200 rpm'ye ayarlanmış sıcaklık kontrollü bir çalkalayıcıda inkübe edin.
  5. Ertesi gün, kültür açık kırmızı renkte olacaktır. 6 cm'lik NA+chol Petri kabı üzerine 50 μL kültür plakası koyun ve dairesel bir şekilde bir bakteri yayıcı kullanarak yayın.
  6. Plakaları 28 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. P. luminescens çimleri 24-36 saat içinde hazır olacak ve açık kırmızı renkte görünecektir.
  7. Plakayı 50-100 yüzey sterilize edilmiş IJ ile aşılayın ve plakayı 28 ° C'de tutun.
  8. Sağlıklı L4 hermafroditi aşılamadan yaklaşık 48-54 saat sonra ortaya çıkmaya başlayacaktır. Enjeksiyon için sağlıklı, aç kalmamış geç L4 H. bacteriophora hermafroditleri gereklidir.

4. dsRNA'nın hazırlanması

  1. Astar tasarımı
    1. H. bacteriophora DNA'sının ~ 500 baz çifti ekzon bölgesini hedeflemek için dsRNA için primerler tasarlayın.
      1. İlgilenilen bölgeler için astarlar, Primer3 (https://primer3.ut.ee) veya benzer bir program kullanılarak, 500 baz çifti optimum ürün uzunluğu, 60 ° C'lik Tm ve 22 nükleotidin astar uzunluğu seçilerek belirlenebilir.
      2. İn vitro transkripsiyona izin vermek için her ileri astarın 5′ ucuna bir T7 bölgesi (TAATACGACTCACTATAGGG) ekleyin.
  2. Genomik DNA İzolasyonu
    1. dsRNA sentezi için ~ 50.000 H. bakteriyoforası IJ'nin dondurulmuş peletlerinden izole edilmiş genomik DNA kullanın.
    2. En az 30 dakika boyunca -80 °C'de yerleştirilmiş 50 μL lizis tamponunda (50 mM KCl, %0,05 (w/v) jelatin, 10 mM Tris-HCl pH 8.2, %0.45 Ara 20, 60 μg/mL Proteinaz K,2.5 mM MgCl 2) içinde yeniden askıya alınmış bir IJ pelet kullanın.
    3. Peleti küçük bir tüp havaneli ile homojenize edin.
    4. Çözeltiyi oda sıcaklığına ısıtın ve her 15 dakikada bir girdap yaparak 2 saat boyunca 60 ° C'de inkübe edin.
    5. Homojenize edilmiş dokuyu 95 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe ederek Proteinaz K'yı denatüre edin.
    6. Numuneyi 4 °C'ye soğutun ve 1 dakika boyunca 3.400 x g'de santrifüj yapın.
    7. Elde edilen süpernatantı sonraki PCR için şablon olarak kullanın.
    8. 200 ng şablon DNA, 0,2 μM ileri ve geri astar ve üreticinin önerdiği döngü koşullarına sahip ticari bir mastermix kullanarak 50 μL PCR reaksiyonu ayarlayın.
    9. Reaksiyonların tahmin edilen boyutta tek bantlar ürettiğini doğrulamak için% 1.2'lik bir agaroz jeli üzerindeki PCR reaksiyonunu analiz edin.
  3. dsRNA sentezi
    1. Ticari bir transkripsiyon kiti kullanın.
    2. İn vitro transkripsiyon için 5 μL PCR reaksiyonu kullanın. Üreticinin talimatlarını izleyin.
    3. Reaksiyonu 37 ° C'de 16 saat boyunca inkübe edin.
    4. İn vitro transkripsiyon reaksiyonlarını, dsRNA'yı konsantre etmek için amonyum asetat / etanol çökeltmesi kullanarak ticari bir kit ile temizleyin.
    5. Peletlenmiş dsRNA'yı 10 μL RNaz içermeyen suda askıya alın.
    6. RNA'yı bir spektrofotometre kullanarak sayısallaştırın.
    7. DsRNA'yı% 1.2'lik bir agaroz jeli üzerinde ayırarak kaliteyi değerlendirin

5. Mikroenjeksiyon

NOT: Bir enjeksiyon pedi, ortasında% 2 (w / v) agaroz tabakası bulunan bir cam kapak kaymasıdır. Enjekte edilecek solucanlar bu pedlere aktarıldığında, agaroz tabakası onları prosedür için hareketsiz hale getirecektir. Normalde, ekstra pedler genel kullanım için mikroskopun yakınında tutulur.

  1. Enjeksiyon pedinin hazırlanması
    1. 10 mL suya 0.2 g agaroz ekleyerek suda% 2 agaroz kaynatın.
    2. 50 mm x 70 mm inceliğinde bir cam kapak kapağının ortasına 1-4 damla (~ 50 μL) yerleştirin.
    3. Damlayı düzleştirmek için başka bir kapak kayması kullanın.
    4. Kapak kaymasını yana doğru kaydırmadan önce kapak kaymasını 2-3 dakika kurumaya bırakın.
    5. Yukarı bakan kapak kapağının sağ tarafını bir 'R' ile işaretleyin.
    6. Slaytları kullanmadan önce 1 gün oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
  2. Enjeksiyon iğnelerinin hazırlanması
    1. İç ince filament içeren 1,0 mm cam kılcal damarlar kullanın. Bu, iğnenin verimli bir şekilde doldurulmasını sağlar.
      NOT: Herhangi bir ticari iğne çektirici (örneğin, Narishige PB-7) kullanılabilir.
    2. İğne çektirme makinesini açın.
    3. Gerekli iğne keskinliğini ve uygun uzunluğu sağlamak için ısıtıcının maksimuma ve solenoidin 8,40'a ayarlandığından emin olun.
    4. Kılcal boruyu filamentten üst düğme sırtına yerleştirin ve üst düğmeyi sıkın. Kılcal borunun üst kısmı, iğne çektirmenin üst kısmı ile aynı seviyede olacak ve ısıtma filamenti kılcal damarın ortasında olacaktır.
    5. Alt üniteyi üste doğru hareket ettirin ve ardından alt düğmeyi sıkın. Kılcal damarın güvenli bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
    6. İğne çektiricisinin kapağını kapatın ve başlat düğmesine basın. Yeşil ışık yanar. Birkaç dakika sonra kılcal damar ısıtılacak ve iki yarıya ayrılmak üzere ayrılacaktır.
      NOT: İki ayrı iğne aynı uzunlukta değildir, ancak her ikisi de enjeksiyonlar için kullanılabilir. Daha uzun iğne noktaları tercih edilir.
    7. İğneleri, bir parça modelleme kili kullanarak noktaları aşağı doğru olacak şekilde dikey konumda düzenleyin. Alternatif olarak, iğneleri iki şerit modelleme kili tarafından yerinde tutulan bir Petri kabında saklayın.
  3. İğnenin yüklenmesi
    NOT: Nükleik asit çözeltisi, süspansiyonda bulunabilecek pelet safsızlıklarına karşı 20.784 x g'de en az 10 dakika boyunca santrifüj edilmelidir. Kirliliklerin santrifüjlenmesi, enjeksiyon iğnesinin akışını engellemelerini önler.
    1. İğnelere nükleik asitleri yüklemek için iki yöntemden birini kullanın.
    2. Yöntem 1
      1. Santrifüj DNA örneğinin yaklaşık 0,5 μL'sini enjeksiyon iğnesinin çekilmemiş ucuna aktarmak için bir pipet kullanın. Bu, kılcal tüpün üstünde oturan küçük bir sıvı damlası olarak görünecektir.
      2. Sıvı numunenin iğnenin ucunu işgal etmesine izin vermek için 5 ila 7 dakika bekleyin. Nihai ürün, hava kabarcıkları bulunmayan dolu bir iğne olacaktır.
      3. Enjeksiyondan önce iğne ucunda çözeltinin varlığını doğrulamak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın.
    3. Yöntem 2
      1. Mikroenjektör için yükleme uçlarını kullanın.
      2. Bu yükleme ucunu kullanarak, nükleik asit çözeltisinin 5 μL'sini pipetleyin.
      3. Çekilen iğne iğne çektirme makinesinin üzerindeyken, üst düğmeyi gevşetin, üst çekilen iğneyi hafifçe yukarı doğru hareket ettirin ve düğmeyi yeniden sıkın.
      4. Yükleyicinin ucunu dikkatlice kılcal boruya yerleştirin ve enjeksiyon iğnesinin dibine kadar uzatın.
      5. Nükleik asit çözeltisini enjeksiyon iğnesine pipetleyin.
      6. Yükleyiciyi çekilen iğneden çıkarın ve gerekirse daha fazla yükleme için ayrı tutun. Farklı bir nükleik asit karışımı yüklerken yükleyicileri kapattığınızdan emin olun.
  4. Enjeksiyon mikroskobunun hazırlanması
    NOT: Mikroskop tabanından dağınık aydınlatmaya sahip ters çevrilmiş bir mikroskop, solucan hazırlama, mikroenjeksiyon ve kurtarma için kullanılır. 10x ve 40x hedefleri olan yüksek çözünürlüklü ters çevrilmiş bir mikroskop kullanımı açıklanmaktadır. Mikroskop, iğneyi tutan ve enjeksiyon için yerine getiren bir iğne manipülatörü ile donatılmıştır. Mikroenjeksiyon yağı, solucanın enjeksiyon pedinin agaroz tabakası üzerindeyken hızlı dehidrasyonunu önlemek için kullanılır. Kullanılması önerilen yağ Halokarbon Yağı 700'dür.
    1. Lambayı açın ve kontrol paneliyle parlaklığı kalibre edin.
    2. Kondenser Wollaston prizması üzerindeki sayıyı kontrol edin; kullanılan hedefe (40x) karşılık gelecektir.
    3. "DIC" ile işaretlenmiş DIC taretinin doğru konumda olduğunu onaylayın.
    4. Hedefteki düğmenin sıfır (0) olarak ayarlandığından emin olun.
    5. Ph halkasını sonuna kadar sağa çevirin.
    6. Polarizörü, ok yatay konumda olacak şekilde ayarlayın.
    7. Odak noktasını (ışığı) gözlemlemek için sahneye bir parça kağıt koyun.
    8. Alan diyaframını, kağıt üzerinde bir nokta olacak şekilde kapatın.
    9. Kondenseri parça kağıdı üzerinde çok keskin bir ışık noktasının görüldüğü noktaya kadar yukarı ve aşağı hareket ettirmek için soldaki kadranı kullanın.
    10. Alan diyaframını, küçük bir ışık çemberinin görülebildiği noktaya kadar yavaşça açın.
    11. Kağıt parçasını alın.
    12. Işık noktasının hedefin merkezinde olduğundan emin olun. Aksi takdirde, kondenserin üstündeki gümüş vidaları ayarlayarak ışık noktasını hedefin merkezi ile hizalayın.
    13. Alan diyaframını tamamen açın.
    14. Analizör ICT/P'ye basılıp basılmadığını kontrol edin.
  5. Enjeksiyon iğnesinin mikroskop üzerine monte edilmesi
    1. Mikroenjeksiyon iğnesine azot gazı akışını açın. İğneye gaz basıncı yaklaşık 20 psi olacaktır.
    2. Mikromanipülatör düğmelerinin (mikroskopun iğneyi hareket ettiren kısmı) merkeze yerleştirildiğini kontrol edin, bu da iğne monte edildiğinde en geniş hareket aralığına izin verir.
    3. İğne tutucusundan çıkarmak için metal çubuğu tutan tertibatı sökün.
    4. Yeni iğneyi mikroskobun üst kısmına yerleştirin; ardından iğneyi yerinde tutmak için lastik contayı takın.
    5. İğne tutucunun alt kısmını montaja takarak sabitleyin.
    6. İğneyi mikromanipülatördeki oluğa yerleştirin ve sabit tutmak için düzgün bir şekilde vidalayın. Vidanın mikromanipülatörün ucundan yaklaşık 1 inç olduğundan emin olun.
    7. İğnenin ucunu, mikromanipülatörün düğmelerini ve kaba kontrollerini kullanarak, sahne plakasına göre yaklaşık 45° 'lik bir açıyla görme alanının ortasına yerleştirin. İğne ucunu kazara kırılmaması için yeterince yüksek bırakmak çok önemlidir.
  6. İğnelerin kırılması
    1. İğneyi, nükleik asit çözeltisinin içinden akmasına izin vermek için iğnenin ucunun normalde kırılacağı mikromanipülatöre yerleştirin.
    2. Bir kılcal damarı kırın ve bir damla mikroenjeksiyon yağı taşıyan bir cam slaytın üzerine yerleştirin.
    3. Slaytı mikroskopa yerleştirin ve odaklanın.
    4. Mikroskopun ince kontrollerini kullanarak iğnenin ucunu kılcal damar tarafıyla aynı seviyeye getirin (Şekil 4).
    5. İğnenin ucunun kırılmadığını doğrulamak için ayak aktüatörünü kullanarak azot akışını kısaca açın. Hızlı bir açma-kapama yeterli olacaktır.
    6. İğneyi hafifçe hareket ettirin, böylece kılcal damarın yanına zar zor dokunur.
    7. İğne ucunu kırmak için mikroskopun yan tarafına hafifçe dokunun.
    8. İğneyi kılcal damardan çıkarın ve iğnenin düzgün kırılıp kırılmadığını kontrol etmek için azot akışını açın.
    9. İğne, iğnenin ucundan yaklaşık beş kat daha büyük küçük bir enjeksiyon damlası oluşturacaktır (Şekil 4). Enjeksiyon damlası daha küçük boyuttaysa, ucu daha da kırın. Enjeksiyon damlacığı daha büyük boyuttaysa, taze bir iğne kullanmaya çalışın.

6. Mikroenjeksiyon

  1. Bir enjeksiyon pedi üzerine bir damla mikroenjeksiyon yağı pipetin.
  2. Alevle sterilize edilmiş bir kepçeyi mikroenjeksiyon yağ damlasına batırın ve genç bir H toplayın. bakteriyophora yetişkin nematodu plakadan.
  3. Çok sayıda bakteri hücresinin enjeksiyon pedine aktarılmasını önlemek için plakanın bakteriyel çimlere yakın olmayan kısımlarından nematodları seçin. Ayrıca, iyi biçimlendirilmiş gonadlarla bir nematod hasat edin.
  4. Nematodları enjeksiyon pedine taşıyın ve gonadlar iğneye bakacak şekilde dikey olarak konumlandırın. Vulvanın enjeksiyon iğnesiyle aynı yöne işaret ettiğinden ve iki distal gonad kolunun ters yönde ve nematod vücut duvarına karşı olduğundan emin olun.
    NOT: Pristionchus pacificus gibi, H. bacteriophora'nın gonadı da ventral vulval pozisyondan dorsal olarak göç eder ve daha sonra ventral pozisyona geri göç eder.
  5. Nematodun etrafta dolaşmasına izin vermeden nematod kurumasını önlemek için yağ miktarının yeterli olup olmadığını kontrol edin.
  6. İğneyi slaytın çok üzerinde tutarak 10x hedefiyle nematodu odaklayın. Yağda, nematod gonadlar solucanın ön ve arka tarafına yakın iki net bölge olarak görülür. Gonadların odaklandığından ve solucanın diğer kısımlarının olmadığından emin olun.
  7. Nematodu enjeksiyon iğnesine doğru 15 ° ila 45 ° 'lik bir açıyla düzenleyin, bu da gonadın içindeki iğneye daha fazla yer açacaktır. Ayrıca, bu yaklaşım, iğne gonadın içine sokulduğunda iğnenin tüm nematod gövdesinden geçmesini önler.
  8. Enjeksiyon iğnesini ve nematod, odaklanana kadar iğneyi kademeli olarak indirerek aynı seviyeye getirin (Şekil 5). İğne indirilirken, solucanın üstünde değil, nematodun yanında kaldığından emin olun.
  9. Nematodun sinsityal gonad koluna odaklanmak için 40x hedefini kullanın.
  10. İnce ayarlayıcıyı kullanarak iğneyi, uç nematod sinsityal gonad kolu ile birlikte odaklanana kadar yukarı ve aşağı hareket ettirin.
  11. Kayma aşamasını kullanarak nematodu yavaşça iğneye doğru hareket ettirin. Daha sonra gonadı iğneyle nematod gövdesi duvarına doğru hafifçe itin, bu da nematod gövdesinin içine etkili iğne penetrasyonuna neden olur.
  12. Nükleik asit çözeltisinin akışını başlatmak için ayak aktüatörüne kısaca basın. Hızlı bir açma-kapama yeterlidir. İğne gonadın içindeyse, gonad çözelti ile dolacak ve şişecektir.
  13. İğne doğru pozisyonda sağlandıktan sonra, gonadın kolları dolana kadar gonadı nükleik asit çözeltisi ile doldurun. İğnenin deldiği delikten sıvının solucandan atılmasını önlemek önemlidir.
  14. Kaydırma aşamasını kullanarak, solucanı dikkatlice iğneden uzaklaştırın.
  15. İğneyi kaldırın ve saat yönünün tersine çevirin.
  16. Solucanın üzerine bir damla 1x PBS arabelleği koyarak solucanın üzerine yerleştirin.
  17. Solucanı kaldırmak için alevle sterilize edilmiş kepçeyi kullanın ve solucanı fazla yağdan arındırmak için taze bir P. luminescens tohumlu plaka üzerinde başka bir M9 damlasına yerleştirin.
  18. Nematodu M9'dan çıkarın ve bakteri çimlerinin uzak tarafına yerleştirin.
  19. Birkaç enjekte edilen nematodları aktarmak için aynı plakayı kullanın.
  20. 2-3 gün içinde, transgenik fenotip için birinci nesil (F1) nematodları değerlendirin. Hangi solucanların kararlı transgenik çizgiler üreteceğini belirlemek için transgenik F1 nematodlarını ayrı ayrı plakalara ayırın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aksenizasyondan geçen H. bacteriophora nematodlarının durumunu değerlendirmek için, IJ'lerde P. luminescens bakteri kolonilerinin varlığı veya yokluğu belirlenmiştir. Bunu yapmak için, daha önce yüzey sterilize edilmiş ve PBS'de homojenize edilmiş yaklaşık 500 IJ'lik bir pelet toplandı. Pozitif kontrol tedavisi, simbiyotik P. luminescens bakterileri içeren nematod kültüründen yaklaşık 500 IJ'lik bir peletten oluşuyordu. Baltanize ve pozitif kontrol nematodlarının peletleri 1x PBS'de homojenize edildi. Homojenatlar agar üzerine pipetlendi ve bireysel kolonilerin büyümesini kolaylaştırmak için yayıldı. Agar plakaları 24 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edildi. Ertesi gün, P. luminescens kolonilerinin (CFU) oluşumu gözlendi. Beklendiği gibi, stok kültüründen H. bakteriyophora simbiyotik P. luminsecens hücrelerini taşıdı; Bununla birlikte, ilişkili P. luminecens bakterilerinden yoksun nematodlar aksenikti ve gelecekteki deneyler için ayrı ayrı depolandı (Şekil 6).

Nol-5 gen ekspresyonunun yıkılması, mikroenjeksiyon işlemini kullanarak RNAi'nin etkinliğini göstermek için örnek olarak kullanılmıştır. Mikroenjeksiyon ebeveyn neslinde yapıldı ve etki F1 soyunda gözlendi. RNAi mikroenjeksiyonu kullanılarak nol-5'in yıkılması, döllerin% 60'ının gonadında germline yokluğuna neden oldu (Şekil 7).

Figure 1
Şekil 1: Enfektif yavruların oluşumu (entomopatojenik nematodların serbest yaşam aşaması). (a) Galleria mellonella böcek larvalarının (Petri kabında tutulur) nematod enfektif yavrularla (doku kültürü şişesinde tutulur) enfeksiyonu. (b) Bir su tutucusunun hazırlanması için bir parça filtre kağıdının katlanması. (c) Entomopatojenik nematodların enfektif yavrular içeren ölü Galleria mellonella böcek larvaları ile su tuzağının düzenlenmesi (nematod enfeksiyonundan 12 gün sonra). Yeni nesil enfektif yavrular ölü böcekleri terk edecek ve daha sonra bir doku kültürü şişesine saklanan suya taşınacaktır. Görüntüler BioRender grafik yazılımı (https://biorender.com) kullanılarak oluşturulur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Resim 2: Galleria mellonella böcek larvalarının Photorhabdus temperata Ret16 bakteri suşu ile enjeksiyonu. Balmumu kurtları bir Petri kabında tutulur ve soğuk muamele ile hareketsiz hale getirilir (yani, birkaç dakika boyunca buz üzerine yerleştirilirler). Böcek gövdesinin arka kısmı, enjeksiyon için uygun şişmiş bir yüzey oluşturmak için bir çift forseps ile bastırılır. Enjeksiyon açısı, dikkatsiz kullanım nedeniyle böcek ölümüne yol açacak iç böcek dokularının zarar görmesini önlemek için sığdır. Görüntüler BioRender grafik yazılımı (https://biorender.com) kullanılarak oluşturulur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Aksenik Steinernema carpocapsae entomopatojenik nematodların oluşumu. Bölünmüş bir Petri kabının yarısı, lipid agar ve S. carpocapsae nematodlarının enfektif yavruları üzerinde bir Xenorhabdus nematophila ΔrpoS bakterisi çimi içerir. Bu in vitro yöntem, enfektif yavruları yetişkin nematodlar haline getirmeye teşvik eder, bu da daha sonra parazitlerin yeni nesline yol açmak için yumurtadan çıkacak yumurtalar üretecektir. Bölünmüş Petri kabının bu bölümünde çok sayıda yeni üretilen S. carpocapsae enfektif yavrusu göründüğünde, nematodların göçünü kolaylaştırmak için bir parça filtre kağıdı ile birlikte kabın diğer yarısına su eklenir. Görüntüler BioRender grafik yazılımı kullanılarak yapılmıştır (https://biorender.com) Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Resim 4: İğne ucunun kırılması. İğnenin ucu genellikle kapalıdır. Gerçek enjeksiyon yapılmadan önce nükleik asit çözeltisinin doğru akışı kontrol edilir. Bir cam slaytın üzerine bir damla halokarbon yağı koyun. İğneyi yapmak için kullanılan kılcal bir tüpü, şekilde gösterildiği gibi dikey olarak yerleştirin. Kılcal damarı 40x'e odaklanacak şekilde getirin ve iğneyi kılcal damarla birlikte yavaşça aşağı indirin. İğne ucunu kılcal damara hafifçe dokunun. Bu, dsRNA'nın düzgün akışı için bir açıklık yaratır. Sıvı çıkmıyorsa, ayak aktüatörünü kullanarak hızlı bir açma-kapama azot akışı gerçekleştirin. Azottan gelen basınç ve iğne ucunun kılcal damarla teması iğneyi kıracaktır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Enjeksiyon yeri. H. bacteriophora'nın gonadı ventral vulval pozisyondan dorsal olarak göç eder ve daha sonra ventral pozisyona geri göç eder. Göç eden kollar vulvanın yakınında birbirlerini çaprazlar ve her iki taraftaki vulvanın ötesine uzanır. Yaklaşık 48 saatte, IJ'den yetiştirilen genç bir yetişkinin gonadının uzanan kolları vulvanın yakınında görülebilir. Mikroenjeksiyon bu pozisyonda yapılır. Ölçek çubuğu: 0,1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Heterorhabditis bakteriyofora eksenizasyonunun doğrulanması. Aksenizasyon prosedürünün başarısı, tedavi edilen H. bacteriophora enfektif gençlerinde Photorhabdus luminescens bakteri hücrelerinin yokluğunun doğrulanmasıyla tahmin edildi. Bunun için, stok kültüründen (simbiyotik) yaklaşık 500 yüzey sterilize solucandan oluşan bir pelet veya eksenizasyon işleminden (aksenik) geçen solucanlar homojenize edildi. Daha sonra, homojenat agar plakalarına yayıldı ve 24 saatlik bir inkübasyonun ardından, bakteriyel kolonilerin (koloni oluşturan birimler, CFU) görünümü izlendi. Plakalardaki bakteri kolonilerinin eksikliği, H. bacteriophora nematodlarının P. luminescens simbiyotik bakterilerinden arındırılmış olduğunu göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: RNAi, nol-5 geninin nakavt edilmesine aracılık etti. RNAi aracılı H. bacteriophora nol-5 geninin nakavtı, germ çizgisi olmayan bir fenotiple sonuçlanır. Yabani tipte, enjekte edilmemiş H. bacteriophora nematod (a) soyu, gonadlarında yumurta içerir. Vahşi tipte bir soy olan nol-5 RNAi enjekte edilen H. bacteriophora nematod (b), nol-5 RNA'nın yıkılması nedeniyle boş gonadlarında yumurta içermez. Ölçek çubuğu: 0,1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Entomopatojenik nematod enfeksiyonunun ve böcek anti-nematod bağışıklığının moleküler temelini anlamak, parazitlerin karşılıklı olarak ilişkili bakterilerden ayrılmasını gerektirir13,15,16. Entomopatojenik nematodlar H. bacteriophora ve S. carpocapsae sırasıyla Gram-negatif bakteriler P. luminescens ve X. nematophila ile birlikte yaşar17. Her iki bakteri türünün de daha önce böcek dokularını hedef alarak ve enfeksiyon sırasında doğuştan gelen bağışıklık sistemine karşı koyarak patojenite sağlayan faktörleri kodladığı gösterilmiştir18,19. Bu, nematodların böcek konağı ile etkileşime girmek için geliştirdiği stratejileri belirleme çabalarını engeller. Bu nedenle, enfeksiyon sürecine de katılan nematod bileşenlerinin gen nakavtı yoluyla tanımlanması ve fonksiyonel karakterizasyonu, aksenik solucanların üretilmesiyle kolaylaştırılabilir. Burada, H. bacteriophora'da aksenik entomopatojenik nematodların üretilmesi ve RNAi gen susturulmasının gerçekleştirilmesi için etkili protokoller sunulmaktadır.

Aksenik nematodların başarılı bir şekilde üretilmesi için her iki protokolde de kritik bir adım, H. bacteriophora ve S. carpocapsae IJs 14,20'nin yüzey sterilizasyonudur. Yöntemin bu kısmı, solucanların ağartıcı çözeltisi ile muamele edilmesini içerir ve eksenizasyon işleminin başarısı için çok önemli olarak kabul edilir, çünkü P. luminescens ve X. nematophila bakterilerini nematod kütikülünden uzaklaştırır. Bu, parazitlerin içindekilerin değil, yalnızca solucanların yüzeyindeki karşılıklı bakterilerin temizlenmesini sağlamak için önemli bir prosedürdür. Bu adımın tamamlanması dikkat gerektirir, çünkü uzun süreli ağartıcı tedavisi nematod sağkalımını etkileyecektir.

S. carpocapsae nematodları için mevcut eksenizasyon protokolünün daha önce kurulmuş bir yöntemle benzerliği, solucanları kolonize edemeyen X. nematophila ΔrpoS mutant bakterilerinin kullanılmasıdır21. Mevcut metodoloji ile yüzey sterilize edilmiş nematod yumurtalarını besin agar22'ye sokan daha önce bildirilen bir protokol arasındaki fark, nematod büyümesini ve zindeliğini muhtemelen etkileyecek mikrobiyal kontaminasyonu inhibe etmek için kültür ortamına antibiyotik eklenmesidir.

Mikroenjeksiyon ile RNAi, RNA'nın oositlere iletilmesi için kolay ve güvenilir bir yöntemdir. Gomadın içindeki sıvının patlaması, enjeksiyon işlemi sırasında nükleik asit çözeltisinin salınımının görsel olarak doğrulanmasını sağlar. Mikroenjeksiyonla RNAi'nin ıslatma yoluyla RNAi'den önemli ölçüde daha iyi olduğu gösterilmiştir. Bu muhtemelen RNAi çözeltisinin gonad içinde farklılaşmanın farklı aşamalarında olan oositlere ulaşma yeteneğinden kaynaklanmaktadır.

Süreci optimize ederken, daha iyi sonuçlar için farklı konsantrasyonlarda RNA çözeltisinin test edilmesi önerilir. 50 ng / μL ila 10 μg / μL arasında değişen çeşitli RNA konsantrasyonları test edildi. 6 μg / μL'lik bir konsantrasyonun diğer konsantrasyonlardan daha iyi çalıştığı bulunmuştur. İn vitro transkripsiyon adımı sırasında RNA verimini arttırmak için, protokol 4 saatlik bir kuluçka periyodundan 16 saate değiştirildi. Bu, RNA'nın nihai veriminde önemli bir artışa neden oldu. Başarılı mikroenjeksiyon için anahtar faktörlerden biri, bir nematodun enjeksiyon pedi üzerinde harcadığı süredir. Daha az zaman, sağlıklı bir şekilde hayatta kalan bir nematod ve amaçlanan fenotipi gözlemleme şansının arttığı sağlıklı bir döl ile sonuçlanır.

Entomopatojenik nematodların kültürlenmesi ve genetik olarak manipüle edilmesi için mevcut protokol, nematoloji, immünoloji ve konakçı-parazit etkileşimleri alanlarında gelecekteki çalışmalar için önemli bir katkıdır. Entomopatojenik nematodların manipülasyonuna izin veren yaklaşımların birleştirilmesi, nematod efektör molekülleri ile anti-nematod özelliklerine sahip faktörleri kodlayan konakçı immün sinyal bileşenleri arasındaki etkileşimi tanımlayan genetik faktörlerin keşfine yol açacaktır. Ayrıca, hangi anahtar nematod moleküler bileşenlerinin ilgili bakterilerle simbiyotik ilişkiyi belirlediğini belirleyecektir. Bu soruları cevaplamak, tarımsal uygulamaların iyileştirilmesi ve insan parazitik nematodlarının kontrolü için yeni araçlar geliştirilmesi açısından önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

George Washington Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü üyelerine yazının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Tüm grafik figürler BioRender kullanılarak yapılmıştır. I. E., J. H. ve D. O'H. araştırmaları. Laboratuvarlar, George Washington Üniversitesi ve Columbian College of Arts and Sciences tarafından desteklenerek fonları ve Disiplinler Arası Araştırma Fonlarını kolaylaştırmıştır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose VWR 97062-244
Ambion Megascript T7 Kit Thermo Fisher Scientific AM1333
Ampicillin Fisher Scientific 611770250
Cell culture flask T25 Fisher Scientific 156367
Cell culture flask T75 Fisher Scientific 156499
ChoiceTaq Mastermix Denville Scientific C775Y42
Corn oil VWR 470200-112
Corn syrup MP Biomedicals/VWR IC10141301
Culture tube 10 mL Fisher Scientific 14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips Eppendorf E5242956003
Ethanol Millipore-Sigma E7023
Falcon tube 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Femtojet Microinjector Eppendorf 5252000021
Filter paper VWR 28320-100
Galleria mellonella waxorms Petco -
Glass coverslip Fisher Scientific 12-553-464 50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700 Sigma H8898
Inoculating loop VWR 12000-806
Kanamycin VWR 97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-3 1.0 mm
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500 LB agar miller powder 500 g
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500 LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope Microscope Central -
MacConkey medium Millipore-Sigma M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Thermo Fisher Scientific AM1908
Microcentrifuge tube VWR 76332-064 1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
Needle syringe VWR BD305155 22G
Nutrient broth Millipore-Sigma 70122-100G
Parafilm VWR 52858-076
Partitioned Petri dish VWR 490005-212
PBS VWR 97062-732 Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers Azenta -
Pestle Millipore-Sigma BAF199230001 Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm VWR 25384-092 60 x 15 mm
Petri dish 10 mm VWR 10799-192 35 x 10 mm
Proteose Peptone #3 Thermo Fisher Scientific 211693
Yeast extract Millipore-Sigma Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
  2. Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).
  3. Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
  4. Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants. Frontiers in Microbiology. 11, 2983 (2020).
  5. Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
  6. Eleftherianos, I., Heryanto, C. Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection. Genes. 12 (2), 202 (2021).
  7. Ciche, T. The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora. WormBook. , 1-9 (2007).
  8. Stock, S. P. Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes. Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).
  9. Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), (2021).
  10. Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).
  11. Abd-Elgawad, M. M. M. Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes. Plants. 10 (8), 1660 (2021).
  12. Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds. Frontiers in Microbiology. 9, 3177 (2018).
  13. Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism. Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).
  14. Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes. Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).
  15. Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).
  16. Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).
  17. Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).
  18. Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. Photorhabdus and a host of hosts. Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).
  19. Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus. Microbiological Research. 240, 126568 (2020).
  20. Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes. BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).
  21. Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila. Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).
  22. McMullen, J. G., Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). Journal of Visualized Experiments. (91), e52096 (2014).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 181 Entomopatojenik nematodlar Heterorhabdit Steinernema parazitizm konakçı-parazit etkileşimleri
Entomopatojenik Nematodların Kültürlenmesi ve Genetik Olarak Manipüle Edilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heryanto, C., Ratnappan, R.,… More

Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes. J. Vis. Exp. (181), e63885, doi:10.3791/63885 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter