Summary
נמטודות אנטומופתוגניות חיות בסימביוזה עם חיידקים ויחד הן מדביקות בהצלחה חרקים על ידי ערעור מערכת החיסון המולדת שלהן. כדי לקדם את המחקר על הבסיס הגנטי של זיהום נמטודות, מתוארות שיטות לשמירה ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות.
Abstract
נמטודות אנטומופתוגניות בסוגים Heterorhabditis ו - Steinernema הם טפילים מחייבים של חרקים שחיים באדמה. המאפיין העיקרי של מחזור החיים שלהם הוא הקשר ההדדי עם החיידקים Photorhabdus ו Xenorhabdus, בהתאמה. טפילי הנמטודה מסוגלים לאתר ולהיכנס לפונדקאים מתאימים של חרקים, לחתור תחת התגובה החיסונית של החרקים ולהתרבות ביעילות כדי לייצר את הדור הבא שיצוד באופן פעיל טרף חרקים חדש להדבקה. בשל התכונות של מחזור החיים שלהם, נמטודות אנטומופתוגניות הן סוכני הדברה ביולוגית פופולריים, המשמשים בשילוב עם קוטלי חרקים להדברת מזיקים חקלאיים הרסניים. במקביל, נמטודות טפיליות אלה מייצגות כלי מחקר לניתוח פתוגניות של נמטודות ותגובות אנטי-נמטודיות מארחות. מחקר זה נעזר בפיתוח לאחרונה של טכניקות גנטיות וגישות תעתיק להבנת תפקידן של מולקולות מופרשות נמטודה במהלך זיהום. כאן, פרוטוקול מפורט על שמירה על נמטודות אנטומופתוגניות ושימוש בהליך פירוק גנים מסופק. מתודולוגיות אלה מקדמות עוד יותר את האפיון הפונקציונלי של גורמי זיהום נמטודות אנטומופתוגניים.
Introduction
המחקר על נמטודות אנטומופתוגניות (EPN) התעצם בשנים האחרונות בעיקר בשל התועלת של טפילים אלה באסטרטגיות משולבות של הדברה ומעורבותם במחקר ביו-רפואי בסיסי 1,2. מחקרים אחרונים ביססו את EPN כאורגניזמי מודל שבהם ניתן לבחון את המרכיבים הגנטיים של הנמטודה המופעלים בשלבים השונים של תהליך ההדבקה. מידע זה מספק רמזים קריטיים על טבען ומספר המולקולות המופרשות על ידי הטפילים כדי לשנות את הפיזיולוגיה של המארח ולערער את התגובה החיסונית המולדת של החרק 3,4. במקביל, ידע זה מתווספים בדרך כלל על ידי פרטים חדשים על סוג מסלולי האיתות החיסוניים של מארח החרקים ועל הפונקציות שהם מווסתים כדי להגביל את הכניסה וההתפשטות של הפתוגנים 5,6. הבנת התהליכים האלה חיונית כדי לדמיין את שני הצדדים של יחסי הגומלין הדינמיים בין EPN לבין מארחי החרקים שלהם. הערכה טובה יותר של הקשר בין EPN לחרקים מארחים תאפשר ללא ספק מחקרים דומים עם נמטודות טפיליות של יונקים, מה שעלול להוביל לזיהוי ואפיון של גורמי זיהום המפריעים למערכת החיסון האנושית.
נמטודות ה-EPN Heterorhabditis sp. ו-Steinernema sp. יכולות להדביק מגוון רחב של חרקים, והביולוגיה שלהם נחקרה באינטנסיביות בעבר. שני טפילי הנמטודה נבדלים זה מזה באופן הרבייה שלהם כאשר ההטרורהבדיטיס מופרה בעצמה ושטיינרנמה עוברת רבייה אמפימיקטית, אם כי לאחרונה הודגם כי S. hermaphroditum מתרבה על ידי הפריה עצמית של הרמפרודיטים או באמצעות פרתנוגנזה 7,8,9. הבדל נוסף בין הנמטודות ההטרורהבדיטיס לשטיינרנמה הוא ההדדיות הסימביוטית שלהם עם שני סוגים נפרדים של חיידקים גראם שליליים, פוטורהבדוס וקסנורהבדוס, בהתאמה, ששניהם פתוגנים חזקים של חרקים. חיידקים אלה נמצאים בשלב הצעירים הנגועים (IJ) של ה-EPN, אשר מזהים פונדקאים רגישים, מקבלים גישה להמוקול החרקים, שם הם משחררים את החיידקים הקשורים אליהם שמשתכפלים במהירות, ומיישבים רקמות חרקים. גם ה-EPN וגם החיידקים שלהם מייצרים גורמי אלימות שמפרקים את הגנות החרקים מנשקם ופוגעים בהומאוסטזיס. לאחר מות החרקים, הנמטודות IJs מתפתחות כדי להפוך ל-EPN בוגר ולהשלים את מחזור החיים שלהן. קבוצה חדשה של IJs שנוצרה בתגובה לחסך מזון וצפיפות יתר בתוך ציד החרקים סוף סוף מגיחה באדמה כדי לצוד פונדקאים מתאימים 9,10,11,12.
כאן מתואר פרוטוקול יעיל לשמירה, הגברה ומניפולציה גנטית של נמטודות EPN. בפרט, הפרוטוקול מתאר את השכפול של ה- H. bacteriophora ו- S. carpocapsae IJs הסימביוטיים, את הדור של נמטודה אקסנית IJs, את הייצור של H. bacteriophora hermaphrodites עבור microinjection, הכנת dsRNA, ואת טכניקת microinjection. שיטות אלה חיוניות להבנת הבסיס המולקולרי של פתוגניות נמטודה וחסינות מארחת נגד נמטודה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור של נמטודה סימביוטית מדביקה צעירים
- מכסים צלחת פטרי (10 ס"מ) בפיסת נייר סינון ומוסיפים כ-10-15 זחלי גלריה מלונלה (איור 1A).
- באמצעות פיפטה, מחלקים 2 מ"ל מים המכילים כ-25-50 IJs לכל תרחיף של 10 מיקרול' על תולעי השעווה. אחסנו את צלחת הפטרי בארון בטמפרטורת החדר.
- בהתאם ללחות של נייר המסנן, להוסיף 1-2 מ"ל של מים כל 2 ימים. תולעי שעווה הנגועות ב- IJs בדרך כלל ימותו תוך 48 שעות.
- הכינו את מלכודות המים של ווייט כ-10 ימים לאחר שתולעי השעווה נדבקות ב-IJs8 (איור 1B,C). העבירו בזהירות את החרקים המתים אל החלק הלא מלוטש של נייר הסינון. השתמשו במי ברז כדי למלא את צלחת הפטרי התחתונה והניחו מכסה של צינור 15 מ"ל כמרווח לאוורור.
- העבירו את תולעי השעווה הרכות והשבריריות בזהירות על ידי הרמתן באיטיות מנייר הסינון באמצעות זוג מלקחיים מפלסטיק. השתמשו במי ברז במקום במים שעברו דה-מינרליזציה או שעברו דה-יוניזציה. האחרון גורם לצבירת נמטודה.
- יש לוודא שמפלס המים במלכודת המים מגיע לכמחצית מגובהה של צלחת הפטרי. צפו כי מפלס המים ישתנה עם הזמן בהתאם לתנאי הטמפרטורה והלחות בחדר.
- כאשר המים בצלחת הפטרי הקטנה הופכים לעכורים עקב נוכחות של נמטודות, השתמשו בפיפטה כדי להעביר את הדור החדש של ה-IJs לבקבוקון תרבית תאים T25 או T75.
- הוסיפו מי ברז עד כ-40% מהנפח עד שיגיעו לצפיפות המתאימה (איור 1C). הימנעו מגודש נמטודות ואחסנו את צלוחיות תרביות התאים בצורה אופקית.
- מוסיפים עוד מים לצלחת הפטרי התחתונה וחוזרים על שלבים 1.6 ו-1.7 עד שה-IJs מפסיקים להגיח מפגרי החרקים תוך כ-3-5 ימים.
2. ייצור נמטודה אקסנית מדביקה צעירים
הערה: נמטודות אקסניות משמשות מכיוון שלאחר דיסוציאטים מורכבים של חיידקי נמטודה בתוך החרק, כל אחד מבני הזוג ההדדיים מעורר תגובה חיסונית מארחת מובהקת5. הזן המוטנטי Ret16 של Photorhabdus temperata משמש מכיוון שחיידקים אלה תומכים בצמיחה של H. בקטריופורה אך אינם מצליחים ליישב את המעיים הנמטודתיים13,14.
- Heterorhabditis bacteriophora צעירים מדביקים
- בעזרת קצה פיפטה סטרילי או מרית, מגרדים כמה פתיתים של תרבית קפואה של P. temperata Ret16 על צלחת מקונקי ופסים למושבות בודדות. דגירה של הצלחת במשך 2-3 ימים בטמפרטורה של 28 °C (76 °F).
- לחסן 10 מ"ל של ציר LB עם מושבה בצינור 50 מ"ל ולדגום את התרבות לילה ב 28 °C (84 °F) באינקובטור רועד. השתמש רק במושבות הפאזה העיקריות שהן אדומות על אגר מקונקי. המושבות בשלב המשני יהיו אוף-ווייט על אגר מקונקי.
- יש לשטוף 100 μL של תרבית לילה עם 900 μL של 1x PBS על ידי צנטריפוגה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ב-17,900 x גרם. דקאנט הסופרנאטנט. לדלל את התרבות 10x ב 1x PBS. השאירו את הצינור על קרח.
- לטבול את תולעי השעווה לתוך תמיסת אתנול 70%, לייבש את החרקים עם מגבת נייר, ולהניח אותם בצינור 50 מ"ל.
- הניחו את הצינור על הקרח במשך 20 דקות כדי לשתק את תולעי השעווה.
- השתמשו בנייר סינון כדי לכסות את החצאים העליונים והתחתונים של צלחת פטרי (10 ס"מ). השתמשו במכסה צלחת פטרי המכוסה בנייר סינון כתמיכה בסיסית להזרקה. הרטיבו את נייר הסינון של צלחת הפטרי התחתונה והעבירו על הקרח כדי לעזור לתולעי השעווה המוזרקות להתאושש.
- פיפט 50 μL של חיידקים קרים כקרח על חתיכת פרפילם ולהכין את מזרק המחט 22 G. לחץ על הבוכנה בעדינות כדי להסיר את האוויר בקצה המחט.
- שמרו על תולעת שעווה קרוב לקצה האחורי מתחת לסטריאוסקופ (איור 2).
- הזריקו 50 μL של תרבית החיידקים לצד הגבי של בית החזה, רצוי בצומת שבין שני מקטעים. כדי למזער את הנזק הפנימי, יש להזריק ממש מתחת לציפורן, במקביל ככל האפשר לתולעת השעווה. זה טבעי עבור טיפה של hemolymph לדמם החוצה כאשר תולעת שעווה מנוקבת
- מעבירים את החרקים המוזרקים לצלחת פטרי ההתאוששות.
- חזור על שלבים 2.1.7-2.1.1.9 עד שכל החרקים מוזרקים עם החיידקים. כדי להרדים את החרקים, הניחו אותם על קרח למשך 5 דקות.
- מניחים את צלחת הפטרי בחושך (למשל, מגירה או ארון) ומוסיפים מי ברז לנייר הסינון אם הוא נראה יבש. תולעי שעווה ייכנעו יומיים לאחר ההזרקה, וייראו אדומות לבנים לאחר כ-3-4 ימים. אם החרקים נראים חומים, הזיהום החיידקי לא הצליח.
- לאחר 7 ימים לאחר ההדבקה, העבירו את החרקים עם הצבע האדום לבנים האופייני לאבן על צלחת פטרי מרופדת בנייר מסנן טרי, והמשיכו עם "ייצור של נמטודה סימביוטית מדביקה צעירים" משלב 1. אם אתה משתמש בנמטודות סימביוטיות, חזור על ההליך משלב 2.1. תוך שימוש ב-IJs החדשים שיוצרו מהסיבוב הראשון.
- עיקור פני השטח של H. בקטריופורה IJs
- אספו מספיק בקטריופורה סימביוטית ו-IJs אקסניים מועמדים על ידי צנטריפוגה כדי ליצור כדור 100 μL בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
- הוסף 500 μL של אקונומיקה 5% לכדור בכל צינור microcentrifuge והפוך. דגירה למשך 10 דקות צנטריפוגה ב 17,900 x g במשך דקה אחת. הסר את ה-supernatant.
- לשטוף את הכדור עם 1 מ"ל של מים סטריליים לחזור צנטריפוגה. הסר את ה-supernatant. חזור על שלב זה ארבע פעמים נוספות.
- אימות אקסניות
- פיפטה 400 μL של מים סטריליים לנמטודות הסימביוטיות והמועמדות-אקסניות של H. bacteriophora .
- מניחים את הנמטודות מעל החרקים בצלחת הפטרי ומתייגים את הטיפולים בהתאם.
- מניחים את צלחות הפטרי עם החרקים הנגועים בחושך ובודקים מדי פעם אם תולעי השעווה הופכות לאדומות.
הערה: תולעי שעווה הנגועות בנמטודות הסימביוטיות של H. bacteriophora יהפכו לאדומות תוך יומיים מרגע ההדבקה. שינוי צבע תולעי השעווה נובע מהפרשת תרכובות שונות המיוצרות על ידי חיידקי פוטורהבדוס הדדיים במהלך תהליך ההדבקה. חוסר צבע אדום בתולעי השעווה הנגועות 4 ימים לאחר ההדבקה מאשר כי H. bacteriophora הם אקסניים. הסיבה לכך היא שחיידקי P. temperata Ret16 אינם נמצאים במעי הנמטודה.
- שיטה חלופית לאימות אקסניות
- עיקור פני השטח הסימביוטי H. bacteriophora IJs ו-H. bacteriophora IJs סימביוטיים-אקסניים-מועמדים-אקסניים כמתואר בשלב 2.1.14.
- הומוגניזציה של כ-500 IJs ב-500 μL של PBS סטרילי 1x בצינורות מיקרופוג' באמצעות מזיקים סטריליים. סובבו את ההומוגנט, הוציאו את הסופרנטנט ומרחו אותו על אגר LB. דגירה של הצלחות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- ספרו את יחידות יצירת המושבה (CFU) עבור כל צלחת. דגימות מחיידקי H. בקטריופורה אקסניים לא ייצרו מושבות כלשהן של חיידקי P. luminescens הסימביוטיים.
- Steinernema carpocapsae צעירים מדביקים
- הכנת צלחות אגר שומנים (תמיסת 300 מ"ל מייצרת כ-20 צלחות מפוצלות)
- שוקלים 2.4 גרם של מרק תזונתי, 4.5 גרם תמצית שמרים ו-1.5 גרם אגר ומוסיפים אותם ל-267 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה. Autoclave את הפתרון.
- מוסיפים 3 מ"ל של 1 M MgCl2, 1.2 מ"ל של שמן תירס ו-28.8 מ"ל של סירופ תירס 7%.
- מכינים ומוסיפים לתמיסה 300 μL של קנאמיצין 30 מ"ג/מ"ל ו-300 μL של 50 מ"ג/מ"ל אמפיצילין (מעוקר עם מסנן 0.2 מיקרומטר).
- הורידו את התערובת לחצי צלחת פטרי מחולקת/צלחת מפוצלת.
- הכנת מדשאת חיידקים X. nematophila (זן ΔrpoS)
- תרבית X. nematophila (Xn) ΔrpoS ישירות מסטוקסין חיידקי קפוא 2 מ"ל של תמיסת LB/kan/amp על שייקר בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- חסן 5 מ"ל של מדיום LB המכיל 30 מיקרוגרם/מ"ל קנאמיצין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין עם 250 μL מתרבית הלילה ולגדל את החיידקים במהלך הלילה על שייקר.
הערה: חיידקי Xn אינם גדלים היטב כאשר הם מפוספסים ישירות על גבי מדיית אגר שומנית מתוך ציר קפוא. במידת הצורך, ניתן לאשר תחילה את השלב הראשוני והמשני Xn במדיה של NBTA (אגר מזין בתוספת 25 מ"ג של ברומותימול כחול l−1 ו-40 מ"ג טריפנילטרזוליום כלוריד l−1) לפני תחילת תרבית נוזלית טרייה. - פיפטה 100 μL של התרבית על צלחות אגר שומנים ו spread על כל הצלחת עם לולאת חיסון סטרילית. דגירה של הצלחות למשך 24 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
- S. carpocapsae IJs מעקר פני השטח
- השאירו בקבוקון המכיל IJs בזווית כך שה- IJs ישקעו לפינה של הבקבוקון. לשאוף 1 מ"ל של IJs מיושב לתוך צינור microcentrifuge. צנטריפוגה ב 17,900 x g עבור 10 s. הסר את ה-supernatant.
- הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת אקונומיקה טרייה של 1%. היפוך צינורות כדי לערבב ביסודיות. דגירה למשך דקה אחת (דגירה ממושכת של אקונומיקה תוביל למוות של IJ). סובב שוב במשך 10 שניות.
- כדי להסיר שאריות אקונומיקה, שטפו את הנמטודות עם 1 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים וצנטריפוגות במשך 10 שניות. חזרו על הכביסה ארבע פעמים נוספות.
- הערך את ספירת ה- IJ לכל מ"ל על ידי ספירת 10-20 μL של ה- IJs השטופים מתחת לסטריאוסקופ והתאם את ריכוז ה- IJs בהתאם.
- גידול S. carpocapsae IJs
- מעבירים עם פיפטה כ-1,000 IJs על גבי הלוחות המפוצלים של אגר השומנים (איור 3, תמונה שמאלית). מניחים את הצלחות בארון או במגירה לחים. השתמשו במגבות נייר לחות כדי להגביר את הלחות. שמרו על הצלחות בטמפרטורת החדר (22-25 מעלות צלזיוס).
- בדוק את מגבות הנייר כל יומיים כדי לוודא שהן נשארות לחות. במידת הצורך, הוסיפו מים אחת ליומיים למגבות הנייר כדי לשמור על הלחות בארון או במגירה. לחלופין, מניחים אמבט מים לתחתית הארון כדי להגביר את הלחות.
- כאשר IJs מופיעים רק, הוסיפו מים לצד השני של הצלחת, והניחו שכבה של נייר סינון על פני מרכז הצלחת (מלכודת מים, איור 3, תמונה ימנית). אסוף את המים האלה המכילים את ה- IJs הסיבוב הראשון לתוך בקבוק תרבית תאים T75. אלה הם נמטודות עגולות I. S. carpocapsae .
- מעקרים את פני השטח עם אקונומיקה (שלב 2.2.3) שוב וחוזרים על התהליך משלב 2.2 באמצעות הנמטודות Round 1 S. carpocapsae . התוצאה תהיה נמטודות סיבוב 2 S. carpocapsae .
- בדוק תחת סטריאוסקופ כל כמה ימים כדי לעקוב אחר התפתחות הנמטודות.
- אימות המצב האקסני של S. carpocapsae IJs
- לעקר את ה-IJs של סיבוב 1, סיבוב 2 ו-S. carpocapsae הסימביוטי עם אקונומיקה כמתואר בשלב 2.2.3.
- הומוגניזציה של כ-400-700 IJs בצינורות מיקרו-פוג'ים באמצעות מזיקים מפלסטיק סטרילי. צנטריפוגה ההומוגנטית, דקטנציה של הסופרנטנט, ופיזור התמיסה על לוחות אגר LB. שמור את צלחות האגר באינקובטור שנקבע על 28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- ספור את היווצרות ה- CFU עבור כל צלחת. דגימות מנמטודות אקסניות לא ייצרו צמיחה חיידקית כלשהי.
- אימות המצב האקסני של S. carpocapsae IJs על ידי PCR
- לעקר את ה-IJs של סיבוב 1, סיבוב 2 ו-S. carpocapsae הסימביוטי עם אקונומיקה כמתואר בשלב 2.2.3.
- הוציאו דנ"א מההומוגנט. הליך חילוץ מפורט מתואר בסעיף 4.1.2 להלן.
- ביצוע PCR באמצעות פריימרים XptA2 עם טמפרטורת חישול 61 °C :61 °C (61 °F):
XptA F: 5′-GCCTGGAAAGAGTGGACGAA-3′.
XptA R: 5′-GTAAGACCAAGGGGCACTCC-3′.
הערה: פריימרים אלה מגבירים את הגן קוטלי החרקים XptA2 של X. nematophila, ומייצרים אמפליקון בגודל 231 bp. תוכנית האופניים הייתה כדלקמן: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 34 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, טמפרטורת חישול של 61 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ו-73 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ואחריה 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. - דמיינו את השברים המוגברים על ידי הפרדה בג'ל אגרוז של 1.5%. דגימות מעוקרות על פני השטח האקסניות לא ייצרו להקות כלשהן.
- הכנת צלחות אגר שומנים (תמיסת 300 מ"ל מייצרת כ-20 צלחות מפוצלות)
3. גידול H. בקטריופורה הרמפרודיטים למיקרו-איניג'קציה
- הכינו צלחות צלחת פטרי באורך 6 ס"מ עם NA+chol (מרק תזונתי של 1.5x, 1.5% אגר ו-10 מיקרוגרם/מ"ל כולסטרול).
- הכן 3 מ"ל של תמיסת PP3 (2% פרוטאז פפטון #3, PP3) בצינור תרבית של 10 מ"ל.
- השתמשו בקצה סטרילי של 20 μL כדי לגרד את החלק העליון של מלאי הגליצרול של P. luminescens (25% גליצרול סטרילי בנפח/וול) המתוחזק בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ולהפיל אותו בצינור התרבית.
- דגירה של הצינור למשך הלילה בשייקר מבוקר טמפרטורה שנקבע על 28 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד.
- למחרת, התרבות תהיה בצבע אדום בהיר. צלחת 50 μL של התרבית על צלחת NA+chol Petri בגודל 6 ס"מ והפיצה אותה באמצעות מפזר חיידקים באופן מעגלי.
- הניחו את הצלחות באינקובטור של 28 מעלות צלזיוס. מדשאת P. luminescens תהיה מוכנה תוך 24-36 שעות ותיראה בצבע אדום בהיר.
- לחסן את הצלחת עם 50-100 IJs מעוקרים משטח ולשמור על הצלחת ב 28 °C (76 °F).
- הרמפרודיט L4 בריא יתחיל להופיע בערך 48-54 שעות לאחר החיסון. לצורך הזרקה נדרשים להזרקה בקטריופורה הרמפרודיטים בריאים, שאינם מורעבים מאוחרים מסוג L4 H. בקטריופורה .
4. הכנת dsRNA
- עיצוב פריימר
- תכנן פריימרים ל-dsRNA כך שיתמקדו בכ-500 אזורי אקסון של זוגות בסיסים בדנ"א של H. בקטריופורה .
- ניתן לקבוע פריימרים לאזורי עניין באמצעות Primer3 (https://primer3.ut.ee) או תוכנית דומה, תוך בחירה עבור אורך מכפלה אופטימלי של 500 זוגות בסיסים, Tm של 60 °C ואורך פריימר של 22 נוקלאוטידים.
- הוסף אתר T7 (TAATACGACTCACTATAGGG) ל-5′ הקצוות של כל פריימר קדמי כדי לאפשר תמלול במבחנה.
- תכנן פריימרים ל-dsRNA כך שיתמקדו בכ-500 אזורי אקסון של זוגות בסיסים בדנ"א של H. בקטריופורה .
- בידוד דנ"א גנומי
- השתמש בדנ"א גנומי שבודד מכדורים קפואים של כ-50,000 H. bacteriophora IJs לסינתזת dsRNA.
- השתמש בכדור IJ שעבר החייאה ב-50 μL של מאגר ליזיס (50 mM KCl, 0.05% (w/v) ג'לטין, 10 mM Tris-HCl pH 8.2, 0.45% Tween 20, 60 מיקרוגרם/מ"ל פרוטאינאז K, 2.5 mM MgCl2) הממוקם ב-−80 °C למשך 30 דקות לפחות.
- הומוגניזציה של הכדור עם מזיק צינור קטן.
- מחממים את התמיסה לטמפרטורת החדר ודוגרים בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, תוך מערבולת כל 15 דקות.
- דנטורציה של פרוטאינאז K על ידי דגירה של הרקמה ההומוגנית למשך 15 דקות ב-95 מעלות צלזיוס.
- מצננים את הדגימה ל-4 מעלות צלזיוס וצנטריפוגה ב-3,400 x גרם למשך דקה אחת.
- השתמש בסופרנטנט שנוצר כתבנית עבור PCR עוקב.
- הגדר תגובת PCR של 50 μL באמצעות מאסטרמיקס מסחרי עם 200 ננוגרם של DNA בתבנית, 0.2 μM של פריימר קדימה ואחורה, ותנאי המחזור המוצעים על ידי היצרן.
- נתחו את תגובת ה-PCR על ג'ל אגרוז של 1.2% כדי לוודא שהתגובות יצרו רצועות בודדות בגודל החזוי.
- סינתזת dsRNA
- השתמש בערכת תמלול מסחרית.
- השתמש בתגובת PCR של 5 μL עבור שעתוק במבחנה. בצע את הוראות היצרן.
- הדגירה של התגובה במשך 16 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- נקו את תגובות השעתוק במבחנה באמצעות ערכה מסחרית באמצעות משקעי אמוניום אצטט/אתנול כדי לרכז את ה-dsRNA.
- השהו את ה-dsRNA המכושף ב-10 מיקרול של מים נטולי RNase.
- לכמת את הרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר.
- להעריך את האיכות על ידי הפרדת dsRNA על ג'ל אגרוז 1.2%
5. מיקרו-איניג'קציה
הערה: משטח הזרקה הוא כיסוי זכוכית עם שכבה של 2% (w/v) אגרוז על המרכז. כאשר התולעים שיש להזריק מועברות לפדים אלה, שכבת האגרוז תשתק אותם לצורך ההליך. בדרך כלל, רפידות נוספות נשמרות ליד המיקרוסקופ לשימוש כללי.
- הכנת משטח ההזרקה
- מרתיחים 2% אגרוז במים על ידי הוספת 0.2 גרם אגרוז ל-10 מ"ל מים.
- הניחו 1-4 טיפות (כ-50 μL) על מרכזו של כיסוי זכוכית ברוחב 50 מ"מ x 70 מ"מ.
- השתמש בכיסוי אחר כדי לשטח את הטיפה.
- תנו לכיסוי להתייבש במשך 2-3 דקות לפני שהחליקו את הכיסויים הצידה.
- סמן עם 'R' את הצד הימני של כיסוי הפונה כלפי מעלה.
- תנו לשקופיות להתייבש בטמפרטורת החדר במשך יום אחד לפני השימוש בהן.
- הכנת מחטי הזרקה
- השתמש בנימי זכוכית 1.0 מ"מ המכילים נימה עדינה פנימית. זה מאפשר מילוי יעיל של המחט.
הערה: ניתן להשתמש בכל מושך מחט מסחרי (למשל, Narishige PB-7). - הפעילו את מושך המחטים.
- ודאו שהמחמם מוגדר למקסימום והסולנואיד מוגדר ל-8.40 כדי להבטיח את חדות המחט הנדרשת ואת האורך הנכון.
- מכניסים את צינור הנימים לרכס הידית העליון דרך החוט ומהדקים את הידית העליונה. החלק העליון של צינור הנימים יהיה מפלס עם החלק העליון של מושך המחט ואת נימה חימום יהיה באמצע הנימים.
- הזז את היחידה התחתונה למעלה ולאחר מכן הידק את הידית התחתונה. ודא שהנימי ממוקם בצורה מאובטחת.
- סגור את הכיסוי של מושך המחט ולחץ על התחל. האור הירוק יידלק. לאחר מספר דקות יתחמם הנימים ויתפרקו כך שיפרידו לשני חצאים.
הערה: שתי המחטים המופרדות אינן באותו אורך, אך ניתן להשתמש בשניהם עבור הזריקות. עדיפות לנקודות מחט ארוכות יותר. - מסדרים את המחטים במצב אנכי עם הנקודות שלהן כלפי מטה באמצעות פיסת חימר מידול. לחלופין, אחסנו את המחטים בצלחת פטרי המוחזקת במקומה על ידי שתי רצועות של חימר דוגמנות.
- השתמש בנימי זכוכית 1.0 מ"מ המכילים נימה עדינה פנימית. זה מאפשר מילוי יעיל של המחט.
- טעינת המחט
הערה: תמיסת חומצת הגרעין חייבת להיות צנטריפוגה למשך 10 דקות לפחות ב- 20,784 x g כדי זיהומים כדוריים שעשויים להיות נוכחים בהשעיה. הצנטריפוגה של הזיהומים מונעת מהם לחסום את זרימת מחט ההזרקה.- השתמש באחת משתי השיטות כדי לטעון חומצות גרעין במחטים.
- שיטה 1
- השתמש בפיפטה כדי להעביר כ-0.5 μL של דגימת הדנ"א הצנטריפוגית לקצה הלא מחוספס של מחט ההזרקה. זה יופיע כטיפה זעירה של נוזל היושבת על גבי צינור הנימים.
- עמדו מנגד במשך 5 עד 7 דקות כדי לאפשר לדגימת הנוזל לתפוס את קצה המחט. המוצר הסופי יהיה מחט מלאה ללא בועות אוויר.
- השתמש במיקרוסקופ דיסקציה כדי לאשר את נוכחותה של תמיסה בקצה המחט לפני ההזרקה.
- שיטה 2
- השתמש בעצות טעינה עבור המיקרו-איניג'קטור.
- באמצעות קצה טעינה זה, פיפטה 5 μL של תמיסת חומצת הגרעין.
- בזמן שהמחט הנמשכת נמצאת על מחט מושכת, שחררו את הידית העליונה, הזיזו מעט את המחט הנמשכת העליונה כלפי מעלה, ויישרו מחדש את הידית.
- בזהירות להכניס את קצה המטעין לתוך צינור נימי ולהרחיב אותו לתחתית מחט ההזרקה.
- פיפטה את תמיסת חומצת הגרעין לתוך מחט ההזרקה.
- הסר את המטעין מהמחט הנמשכת ושמור אותה בנפרד לטעינה נוספת, במידת הצורך. הקפד להחליף מעמיסים בעת טעינת תערובת אחרת של חומצות גרעין.
- הכנת מיקרוסקופ ההזרקה
הערה: מיקרוסקופ הפוך עם תאורה מפוזרת מבסיס המיקרוסקופ משמש להכנת תולעים, מיקרו-הטמעה והתאוששות. מתואר השימוש במיקרוסקופ הפוך ברזולוציה גבוהה עם מטרות פי 10 ו -40x. המיקרוסקופ מצויד במניפולטור מחט המחזיק את המחט ומביא אותה למקומה לצורך ההזרקה. שמן microinjection משמש כדי למנוע את התולעת מהתייבשות מהירה בזמן שהיא על שכבת האגרוז של כרית ההזרקה. השמן המוצע לשימוש הוא שמן הלוקרבון 700.- הפעילו את המנורה וכיילו את הבהירות באמצעות לוח הבקרה.
- בדוק את המספר על מנסרת המעבה וולאסטון; זה יתאים למטרה בשימוש (40x).
- אשר כי צריח DIC, המסומן על ידי "DIC", נמצא במיקום הנכון.
- ודא שהידית ביעד מוגדרת על אפס (0).
- סובבו את טבעת ה-Ph ימינה עד הסוף.
- התאם את המקטב באופן שהחץ נמצא במצב אופקי.
- שים פיסת נייר על הבמה כדי לצפות בנקודת המוקד (אור).
- סגרו את הסרעפת בשדה עד כדי כך שיש נקודה על הנייר.
- השתמש בחוגה בצד שמאל כדי להזיז את המעבה למעלה ולמטה עד כדי כך שנראה כתם אור חד מאוד על נייר היצירה.
- פתחו את דיאפרגמה השדה באיטיות עד כדי כך שנראה מעגל קטן של אור.
- קח את פיסת הנייר משם.
- ודא כי נקודת האור נמצאת במרכז המטרה. אחרת, יישרו את נקודת האור עם מרכז המטרה על ידי התאמת הברגים הכסופים בחלק העליון של המעבה.
- לפתוח באופן מלא את הסרעפת בשדה.
- בדוק שה-ICT/P של המנתח נלחץ פנימה.
- הרכבת מחט ההזרקה על המיקרוסקופ
- הפעילו את זרימת גז החנקן אל מחט המיקרו-איניג'קציה. לחץ הגז למחט יהיה כ-20 psi.
- בדוק את ידיות המיקרומניפולטור (החלק במיקרוסקופ שמזיז את המחט) ממוקמות במרכז, מה שמאפשר את טווח התנועה הרחב ביותר כאשר המחט מורכבת.
- פתח את ההרכבה המחזיקה את מוט המתכת כדי להסיר אותו ממחזיק המחט.
- הכנס את המחט החדשה לחלק העליון של המיקרוסקופ; ולאחר מכן התקן את אטם הגומי כדי לשמור על המחט במקומה.
- אבטח את החלק התחתון של מחזיק המחט על ידי התאמתו למרכיבה.
- מכניסים את המחט לחריץ שעל המיקרומניפולטור ומבריגים אותה כראוי כדי לשמור עליה יציבה. ודא שהבורג הוא בערך 1 אינץ ' מקצה המיקרומניפולטור.
- מקם את קצה המחט במרכז שדה הראייה בזווית של כ-45° ביחס ללוחית הבמה, תוך שימוש בידיות ובפקדים הגסים של המיקרומניפולטור. זה קריטי להשאיר את קצה המחט גבוה מספיק כדי שהיא לא תישבר בטעות.
- שבירת המחטים
- מניחים את המחט במיקרומניפולטור שבו קצה המחט בדרך כלל נשבר כדי לאפשר לתמיסת חומצת הגרעין לזרום דרכה.
- שברו נימים והניחו אותו על גבי מגלשת זכוכית הנושאת טיפה של שמן מיקרו-אינסולין.
- הניחו את השקופית על המיקרוסקופ והתמקדו.
- הביאו את קצה המחט לאותה רמה כמו הצד של הנימים באמצעות הבקרה העדינה של המיקרוסקופ (איור 4).
- הפעל את זרימת החנקן לזמן קצר באמצעות מפעיל כף הרגל כדי לאשר שקצה המחט אינו שבור. הפעלה מהירה תספיק.
- הזיזו את המחט בעדינות כך שהיא בקושי תיגע בצד של הנימים.
- הקש קלות על צד המיקרוסקופ כדי לשבור את קצה המחט.
- מוציאים את המחט מהנימים ומפעילים את זרימת החנקן כדי לבדוק שהמחט שבורה כראוי.
- המחט תיצור טיפת הזרקה קטנה שגדולה בערך פי חמישה מקצה המחט (איור 4). אם טיפת ההזרקה היא בגודל קטן יותר, שברו את הקצה עוד יותר. אם טיפת ההזרקה גדולה יותר, נסו להשתמש במחט טרייה.
6. מיקרו-איניג'קציה
- פיפטה טיפה של שמן microinjection על כרית הזרקה.
- טובלים פיק מעוקר להבה לתוך טיפת השמן הזעירה ואסוף H צעירה. נמטודה בוגרת בקטריופורה מהצלחת.
- בחרו את הנמטודות מחלקים של הצלחת שאינם קרובים למדשאת החיידקים כדי למנוע העברה של מספר גבוה של תאי חיידקים למשטח ההזרקה. כמו כן, לקצור נמטודה עם גונדות מעוצבות היטב.
- הזיזו את הנמטודות למשטח ההזרקה ומקמו אותן אנכית כך שהגונאדים יפנו אל המחט. וודאו כי הפות מצביע על אותו כיוון כמו מחט ההזרקה, ושתי זרועות הגונד הדיסטליות נמצאות בכיוון ההפוך ומעלה כנגד דופן גוף הנמטודה.
הערה: בדומה ל-Pristionchus pacificus, הגונד של H. bacteriophora נודד באופן דורסלי ממצב הפות הגחוני ואז נודד בחזרה למיקום הגחוני. - בדקו שכמות השמן מספיקה כדי למנוע ייבוש נמטודה מבלי לאפשר לנמטודה להסתובב.
- הביאו את הנמטודה לפוקוס עם המטרה פי 10 על ידי החזקת המחט הרבה מעל השקופית. בנפט, הגונדות הנמטודיות נתפסות כשני אזורים ברורים הקרובים לחלק הקדמי והאחורי של התולעת. ודא שהגונאדים נמצאים בפוקוס ולא בחלקים האחרים של התולעת.
- סדרו את הנמטודה בזווית של 15° עד 45° לכיוון מחט ההזרקה, מה שייתן יותר מקום למחט בתוך הגונד. כמו כן, גישה זו מונעת מהמחט לעבור דרך כל גוף הנמטודה כאשר המחט מוצגת בתוך הגונד.
- מקם את מחט ההזרקה ואת הנמטודה לאותה רמה על ידי הנמכה הדרגתית של המחט עד שהיא מובאת למיקוד (איור 5). וודאו שכאשר מורידים את המחט, היא נשארת ליד הנמטודה ולא מעל התולעת.
- השתמש במטרה של 40x כדי להתמקד בזרוע הגונאד הסינקטיאלית של הנמטודה.
- הזיזו את המחט למעלה ולמטה באמצעות המתכוונן העדין עד שהקצה יהיה בפוקוס יחד עם זרוע הגונד הסינתודית של הנמטודה.
- הזיזו את הנמטודה באיטיות לכיוון המחט באמצעות שלב ההחלקה. לאחר מכן דחפו בעדינות את הגונד למיקום עם המחט כנגד דופן הגוף של הנמטודה, מה שיגרום לחדירת מחט יעילה לתוך גוף הנמטודה.
- צעדו בקצרה על מפעיל כף הרגל כדי להתחיל את הזרימה של תמיסת חומצת הגרעין. מספיקה הפעלה מהירה. אם המחט נמצאת בתוך הגונד, הגונד יתמלא בתמיסה ויתנפח.
- לאחר שהמחט מובטחת במצב הנכון, מלאו את הגונד בתמיסת חומצת הגרעין עד למילוי זרועות הגונד. חשוב להימנע מגירוש הנוזל מהתולעת דרך החור שבו המחט ניקבה אותו.
- באמצעות שלב ההחלקה, יש להרחיק בזהירות את התולעת מהמחט.
- הרימו את המחט וסובבו אותה נגד כיוון השעון.
- הניחו טיפה של חיץ PBS 1x על גבי התולעת כדי לגרום לה לצוף.
- השתמשו בפיק מעוקר הלהבה כדי להרים את התולעת ולהניח אותה לתוך טיפה נוספת של M9 על צלחת זרעים טרייה של P. luminescens כדי להיפטר מהתולעת מעודף שמן.
- הסר את הנמטודה מה-M9 והנח אותה בצד הרחוק של מדשאת החיידקים.
- השתמש באותה צלחת כדי להעביר כמה נמטודות מוזרקות.
- תוך 2-3 ימים, העריכו את נמטודות הדור הראשון (F1) עבור הפנוטיפ המהונדס. הפרד את הנמטודות המהונדסות של F1 על לוחות בודדים כדי לקבוע אילו תולעים ייצרו קווים מהונדסים יציבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להעריך את מצבם של נמטודות H. bacteriophora שעברו את האקסניזציה, נקבעה נוכחותן או היעדרן של מושבות חיידקים מסוג P. luminescens ב- IJs. לשם כך נאסף כדור של כ-500 התקנים תוך-גזעיים שעברו קודם לכן עיקור והומוגני ב-PBS. טיפול הבקרה החיובית כלל כדור של כ-500 IJs מתרבית הנמטודה שהכיל חיידקים סימביוטיים מסוג P. luminescens . הכדורים של נמטודות בקרה אקסניזציה וחיוביות היו הומוגניים ב-1x PBS. ההומוגנאטים הודבקו על אגר והתפשטו כדי להקל על צמיחתן של מושבות בודדות. לוחות האגר דוגרו בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת נצפתה התרחשותן של מושבות P. luminescens (CFU). כצפוי, H. בקטריופורה מתרבית המניות נשאה תאי P. luminsecens סימביוטיים ; עם זאת, נמטודות נטולות חיידקי P. luminecens הקשורים אליהן היו אקסניות ואוחסנו בנפרד לניסויים עתידיים (איור 6).
ההדחה של ביטוי הגן nol-5 שימשה כדוגמה כדי להראות את היעילות של RNAi באמצעות תהליך המיקרו-איניג'קציה. מיקרו-הטמעה בוצעה בדור ההורים וההשפעה נצפתה בצאצא F1. ההפלה של nol-5 באמצעות מיקרו-איניג'קציה של RNAi גרמה להיעדר חיידקים בגונאד של 60% מהצאצאים (איור 7).
איור 1: יצירת צעירים מדביקים (שלב חיים חופשי של נמטודות אנטומופתוגניות). (א) זיהום של זחלי חרקים מסוג Galleria mellonella (שנשמרו בצלחת פטרי) עם צעירים מזהמים בנמטודה (המוחזקים בבקבוק תרבית רקמה). (ב) קיפול פיסת נייר סינון להכנת מלכודת מים. (ג) סידור מלכודת מים של נמטודות אנטומופתוגניות עם זחלי חרקים מתים מסוג Galleria mellonella המכילים צעירים מזהמים (12 יום לאחר זיהום נמטודות). הדור החדש של צעירים מדביקים יעזוב את החרקים המתים ויעבור למים, אשר לאחר מכן מאוחסנים בבקבוק תרבית רקמה. התמונות נעשות באמצעות תוכנה גרפית BioRender (https://biorender.com). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הזרקת זחלי חרקים מסוג Galleria mellonella עם זן החיידקים Photorhabdus temperata Ret16. תולעי שעווה נשמרות בצלחת פטרי, והן משותקות באמצעות טיפול קר (כלומר, הן מונחות על קרח למשך מספר דקות). החלק האחורי של גוף החרק נלחץ עם זוג מלקחיים כדי ליצור משטח נפוח המתאים להזרקה. זווית ההזרקה רדודה כדי למנוע פגיעה ברקמות החרקים הפנימיות, מה שיוביל למוות של חרקים עקב טיפול רשלני. התמונות נעשות באמצעות תוכנה גרפית BioRender (https://biorender.com). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: יצירת נמטודות אקסניות מסוג Steinernema carpocapsae entomopathogenic. מחצית אחת של צלחת פטרי מחולקת מכילה מדשאה של חיידקי Xenorhabdus nematophila ΔrpoS על אגר שומנים וצעירים מזהמים של נמטודות S. carpocapsae . שיטה זו במבחנה גורמת לצעירים המדביקים להפוך לנמטודות בוגרות, אשר ייצרו מאוחר יותר ביצים שיבקעו כדי להוליד את הדור החדש של הטפילים. כאשר מספר גדול של צעירים נגועים מסוג S. carpocapsae שנוצרו לאחרונה מופיעים בחלק זה של צלחת הפטרי המחולקת, מוסיפים מים לחצי השני של המנה יחד עם פיסת נייר סינון כדי להקל על נדידת הנמטודות. התמונות נעשות באמצעות תוכנה גרפית BioRender (https://biorender.com) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: שבירת קצה המחט. קצה המחט סגור בדרך כלל. הזרימה הנכונה של תמיסת חומצת הגרעין נבדקת לפני ביצוע ההזרקה בפועל. על מגלשת זכוכית, מניחים טיפה של שמן הלוקרבון. הניחו צינור נימי, המשמש לייצור המחט, אנכית כפי שמוצג באיור. הביאו את הנימים להתמקד ב-40x והורידו בעדינות את המחט במישור עם הנימים. געו בעדינות בקצה המחט אל הנימים. זה יוצר פתח לזרימה חלקה של ה-dsRNA. אם לא יוצא נוזל, בצע זרימת חנקן מהירה באמצעות מפעיל כף הרגל. הלחץ מהחנקן והמגע של קצה המחט עם הנימים ישברו את המחט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: אתר ההזרקה. הגונד של H. bacteriophora נודד באופן דורסלי ממיקום הפות הגחוני ואז נודד בחזרה למצב הגחון. הזרועות הנודדות מצליבות זו את זו ליד הפות ומשתרעות מעבר לפות משני צדיה. בסביבות השעה 48 שעות, הזרועות המורחבות של הגונד של מבוגר צעיר, שגדל מ- IJ, נראות ליד הפות. מיקרו-הטמעה מתבצעת בעמדה זו. סרגל קנה מידה: 0.1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: אימות של הטרורהבדיטיס בקטריופורה אקסניזציה. ההצלחה של הליך האקסניזציה הוערכה על ידי אישור היעדרם של תאי חיידקים של Photorhabdus luminescens בצעירים נגועים H. בקטריופורה שטופלו . לשם כך, כדור של כ-500 תולעים מעוקרות פני השטח מתרבות המלאי (סימביוטית) או תולעים שעברו את תהליך האקסניזציה (אקסניזציה) היו הומוגניות. לאחר מכן, הומוגנט התפשט על צלחות אגר ולאחר דגירה של 24 שעות, המראה של מושבות חיידקים (יחידות יוצרות מושבה, CFU) היה מנוטר. היעדר מושבות חיידקים על הצלחות מצביע על כך שנמטודות H. bacteriophora חופשיות מהחיידקים הסימביוטיים P. luminescens שלהן . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: RNAi תיווך את ההפלה של הגן nol-5 . חיקוי מתווך של RNAi של הגן H. bacteriophora nol-5 גורם לפנוטיפ ללא נבט. צאצאיו של נמטודת H. bacteriophora מסוג בר, שאינם מוזרקים (a) מכילים ביצים בגונדות שלה. הצאצאים של סוג בר, nol-5 RNAi מוזרק H. bacteriophora נמטודה (b) אינו מכיל ביצים בגונדות הריקות שלו עקב נפילה של ה-nol-5 RNA. סרגל קנה מידה: 0.1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הבנת הבסיס המולקולרי של זיהום נמטודות אנטומופתוגניות וחסינות חרקים נגד נמטודה דורשת הפרדת הטפילים מהחיידקים הקשורים הדדית 13,15,16. הנמטודות האנטומופתוגניות H. bacteriophora ו- S. carpocapsae חיות יחד עם החיידקים הגראם-שליליים P. luminescens ו- X. nematophila, בהתאמה17. שני מיני החיידקים הוכחו בעבר כמקודדים גורמים המעניקים פתוגניות על ידי התמקדות ברקמות חרקים ונטרול מערכת החיסון המולדת במהלך זיהום 18,19. זה מעכב את המאמצים לזהות את האסטרטגיות שנמטודות פיתחו כדי לקיים אינטראקציה עם פונדקאי החרקים. לכן, זיהוי ואפיון תפקודי באמצעות הפלת גנים של מרכיבי הנמטודה שגם הם משתתפים בתהליך ההדבקה יכולים להיות מקלים על ידי יצירת תולעים אקסניות. כאן מוצגים פרוטוקולים יעילים לייצור נמטודות אנטומופתוגניות אקסניות וביצוע השתקת גנים RNAi ב- H. bacteriophora.
שלב קריטי בשני הפרוטוקולים ליצירת נמטודות אקסניות בהצלחה הוא עיקור פני השטח של H. bacteriophora ו- S. carpocapsae IJs14,20. חלק זה של השיטה כולל טיפול בתולעים בתמיסת אקונומיקה ונחשב חיוני להצלחת תהליך האקסניזציה מכיוון שהוא מסיר את חיידקי P. luminescens ו- X. nematophila מציפורן הנמטודה. זהו הליך חשוב כדי להבטיח כי רק החיידקים ההדדיים על פני השטח של התולעים מנוקים ולא אלה בתוך הטפילים. השלמת שלב זה דורשת תשומת לב מכיוון שטיפול ממושך באקונומיקה ישפיע על הישרדות הנמטודה.
דמיון של פרוטוקול האקסניזציה הנוכחי עבור נמטודות S. carpocapsae עם שיטה שנקבעה בעבר הוא השימוש בחיידקים המוטנטיים X. nematophila ΔrpoS שאינם מסוגלים ליישב את התולעים21. הבדל בין המתודולוגיה הנוכחית לבין פרוטוקול שדווח בעבר, שהכניס ביצי נמטודה מעוקרות על פני השטח על אגר22 המזין, הוא הוספת אנטיביוטיקה למדיית התרבית כדי לעכב זיהום מיקרוביאלי שככל הנראה ישפיע על צמיחת הנמטודה ועל כושרה.
RNAi על ידי microinjection היא שיטה קלה ואמינה להעברת הרנ"א לביציות. פרץ הנוזל בתוך הגונד מספק אישור חזותי לשחרור תמיסת חומצת הגרעין במהלך תהליך ההזרקה. הודגם כי RNAi על ידי מיקרו-אינדקציה טוב משמעותית מ-RNAi על ידי השרייה. זה כנראה בגלל היכולת של תמיסת RNAi להגיע לביציות שנמצאות בשלבים שונים של התמיינות בתוך הגונד.
תוך כדי אופטימיזציה של התהליך, מומלץ לבדוק ריכוזים שונים של תמיסת RNA לקבלת תוצאות טובות יותר. נבדקו ריכוזים שונים של RNA הנעים בין 50 ננוגרם/מיקרול ל-10 מיקרוגרם/מיקרול. נמצא כי ריכוז של 6 מיקרוגרם/מיקרול עבד טוב יותר מריכוזים אחרים. כדי להגדיל את תפוקת הרנ"א בשלב השעתוק במבחנה , הפרוטוקול שונה מתקופת דגירה של 4 שעות ל-16 שעות. זה הביא לעלייה משמעותית בתפוקה הסופית של RNA. אחד הגורמים המרכזיים למיקרו-אינטגיה מוצלחת הוא משך הזמן שנמטודה מבלה על משטח ההזרקה. פחות זמן גורם לנמטודה בריאה ששורדת ולצאצא בריא עם סיכוי מוגבר לצפות בפנוטיפ המיועד.
הפרוטוקול הנוכחי לחקלאות ולמניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות הוא תרומה משמעותית למחקרים עתידיים בתחומי הנמטולוגיה, האימונולוגיה והאינטראקציות בין פונדקאי לטפיל. שילוב גישות המאפשרות מניפולציה של נמטודות אנטומופתוגניות יוביל לגילוי הגורמים הגנטיים המגדירים את יחסי הגומלין בין מולקולות אפקטור נמטודות לבין רכיבי איתות חיסוניים מארחים המקודדים גורמים בעלי תכונות אנטי-נמטודיות. הוא גם יקבע אילו מרכיבים מולקולריים מרכזיים של נמטודה יקבעו את הקשר הסימביוטי עם החיידקים הקשורים. מענה על שאלות אלה חשוב לשיפור שיטות חקלאיות ולפיתוח אמצעים חדשניים לשליטה בנמטודות טפיליות אנושיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לחברי המחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון על הקריאה הביקורתית בכתב היד. כל הדמויות הגרפיות נעשו באמצעות BioRender. מחקר ב- I. E., J. H., ו- D. O'H. מעבדות נתמכו על ידי אוניברסיטת ג'ורג ' וושינגטון והמכללה הקולומביאנית לאמנויות ומדעים המסייעים לקרנות וקרנות מחקר בין-תחומיות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | VWR | 97062-244 | |
| Ambion Megascript T7 Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1333 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | 611770250 | |
| Cell culture flask T25 | Fisher Scientific | 156367 | |
| Cell culture flask T75 | Fisher Scientific | 156499 | |
| ChoiceTaq Mastermix | Denville Scientific | C775Y42 | |
| Corn oil | VWR | 470200-112 | |
| Corn syrup | MP Biomedicals/VWR | IC10141301 | |
| Culture tube 10 mL | Fisher Scientific | 14-959-14 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Falcon tube 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5252000021 | |
| Filter paper | VWR | 28320-100 | |
| Galleria mellonella waxorms | Petco | - | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-553-464 | 50 x 24 mm |
| Halocarbon Oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inoculating loop | VWR | 12000-806 | |
| Kanamycin | VWR | 97062-956 | |
| Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-3 | 1.0 mm |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Leica DM IRB Inverted Research Microscope | Microscope Central | - | |
| MacConkey medium | Millipore-Sigma | M7408-250G | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| Microcentrifuge tube | VWR | 76332-064 | 1.5 ml |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Needle syringe | VWR | BD305155 | 22G |
| Nutrient broth | Millipore-Sigma | 70122-100G | |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | |
| Partitioned Petri dish | VWR | 490005-212 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab |
| PCR primers | Azenta | - | |
| Pestle | Millipore-Sigma | BAF199230001 | Bel-Art Disposable Pestle |
| Petri dish 6 cm | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Petri dish 10 mm | VWR | 10799-192 | 35 x 10 mm |
| Proteose Peptone #3 | Thermo Fisher Scientific | 211693 | |
| Yeast extract | Millipore-Sigma | Y1625 |
References
- Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants. Frontiers in Microbiology. 11, 2983 (2020).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Eleftherianos, I., Heryanto, C. Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection. Genes. 12 (2), 202 (2021).
- Ciche, T. The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora. WormBook. , 1-9 (2007).
- Stock, S. P. Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes. Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).
- Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), (2021).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).
- Abd-Elgawad, M. M. M. Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes. Plants. 10 (8), 1660 (2021).
- Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds. Frontiers in Microbiology. 9, 3177 (2018).
- Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism. Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes. Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).
- Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).
- Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. Photorhabdus and a host of hosts. Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus. Microbiological Research. 240, 126568 (2020).
- Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes. BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).
- Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila. Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).
- McMullen, J. G., Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). Journal of Visualized Experiments. (91), e52096 (2014).
