Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kryo-elektrontomografi ekstern datainnsamling og subtomografi gjennomsnitt

Published: July 12, 2022 doi: 10.3791/63923
Automatic Translation
1, 1, *1, *1,2,3
1Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source Ltd, Harwell Science & Innovation Campus, 2Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics, University of Oxford, 3Chinese Academy of Medical Sciences Oxford Institute, University of Oxford
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver høyoppløselig kryo-elektrontomografi ekstern datainnsamling ved hjelp av Tomo5 og påfølgende databehandling og subtomografi gjennomsnitt ved hjelp av emClarity. Apoferritin brukes som et eksempel for å illustrere detaljerte trinnvise prosesser for å oppnå en kryo-ET-struktur ved 2,86 Å oppløsning.

Abstract

Kryo-elektrontomografi (cryo-ET) har fått fart de siste årene, spesielt siden introduksjonen av direkte elektrondetektorer, forbedrede automatiserte oppkjøpsstrategier, forberedende teknikker som utvider mulighetene for hva elektronmikroskopet kan avbilde ved høy oppløsning ved hjelp av kryo-ET og ny subtomografi gjennomsnittlig programvare. I tillegg har datainnsamling blitt stadig mer strømlinjeformet, noe som gjør det mer tilgjengelig for mange brukere. SARS-CoV-2-pandemien har ytterligere akselerert ekstern kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) datainnsamling, spesielt for enkeltpartikkel cryo-EM, i mange anlegg globalt, og gir uavbrutt brukertilgang til toppmoderne instrumenter under pandemien. Med de siste fremskrittene innen Tomo5 (programvare for 3D-elektrontomografi), har ekstern cryo-ET-datainnsamling blitt robust og enkel å håndtere fra hvor som helst i verden. Denne artikkelen tar sikte på å gi en detaljert gjennomgang, fra datainnsamlingsoppsettet i tomografiprogramvaren for prosessen med en (ekstern) kryo-ET-datainnsamlingsøkt med detaljert feilsøking. Den (eksterne) datainnsamlingsprotokollen suppleres videre med arbeidsflyten for strukturbestemmelse ved næratomisk oppløsning ved subtomografigjennomsnitt med emClarity, ved bruk av apoferritin som et eksempel.

Introduction

Kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM) er viden kjent for å ha opplevd en renessanseperiode, og akselerert den til å bli en kjerne og sentralt nyttig verktøy i strukturbiologi. Utvikling og utnyttelse av direkte elektrondetektorer 1,2,3, forbedrede mikroskoper og elektronkilder 3,4,5, forbedringer i automatisering/gjennomstrømning 6,7,8,9, og beregningsmessige fremskritt innen enkeltpartikkelanalyse10,11,12,13 ,14 og tomografi15,16,17 er alle delvis ansvarlige for teknikkens nylige suksess. Disse teknologiske driverne har utviklet cryo-EMs evne til å løse biologiske makromolekylære strukturer under kryogene og innfødte forhold. Resolusjonene som er lett oppnåelige er tilstrekkelige for atomisk nøyaktig modellering og har brakt teknikken til forkant av strukturbiologiarenaen. En reduksjonistisk tilnærming til å uttrykke og rense et biologisk mål av interesse har lenge vist seg vellykket i makromolekylær krystallografi (MX) for grunnleggende biologisk forskning, narkotikaforskning og translasjonsvitenskap. I samme tilnærming kan cryo-EM nå levere resultater som er parallelle med høyoppløselige MX-studier. Den nåværende store suksessen i kryo-EM-grenen av strukturbiologi kalles enkeltpartikkelanalyse (SPA), som kjøper 2D-projeksjonsbilder typisk av en renset proteinprøve18 for å oppnå tusenvis av visninger av en biologisk makromolekyl19. Disse bildene (1) inneholder informasjon fra en rekke visninger som fullt ut representerer orienteringene til målet i 3D-rom og (2) fanger objektets konformasjonelle heterogenitet, som senere kan skilles og undersøkes.

En alternativ tilnærming til å anskaffe disse 2D-projeksjonsbildene av biologiske prøver, selv in situ og uten rensing, er kryo-elektrontomografi (cryo-ET). Cryo-ET tar en serie bilder av det samme objektet i skrå vinkler ved å rotere prøven mekanisk. Dermed blir 2D-projeksjonene samlet inn i SPA, som representerer vinkelposisjonene til molekylet av interesse, iboende samlet som en del av cryo-ET-bildeeksperimentet20. Tomografiske tiltserier blir deretter rekonstruert til et tomogram som inneholder 3D-representasjoner av de avbildede makromolekylære kompleksene. Arten av tomografisk datainnsamling reduserer til en viss grad avhengigheten av gjennomsnitt for å oppnå en full 3D-representasjon av et molekyl fra en samling av 2D-bilder. På grunn av dagens scenedesign er prøven imidlertid vanligvis vippet fra -60 ° til + 60 °, og etterlater en manglende kile21 med informasjon i den tomografiske 3D-rekonstruksjonen.

3D-rekonstruksjonene i et enkelt tomogram har da en manglende kile av informasjon og lavt signal til støy. Individuelle makromolekyler kan ekstraheres som subtomogrammer og gjennomsnittsberegnes sammen for å takle dette. Der hvert makromolekyl i et subtomogram finnes i en annen retning, er den manglende kilen orientert forskjellig i hvert subtomogram av målobjektet, så gjennomsnitt over mange kopier fyller ut informasjon på grunn av den manglende kilen. Nylige utviklinger innen bildebehandling har også forsøkt å trene kunstig intelligens nevrale nettverk for å fylle ut den manglende kilen med meningsfulle data22. Denne gjennomsnittsprosessen øker også signalet til støy, i likhet med målet om gjennomsnitt i enkeltpartikkelanalyse, slik at rekonstruksjonens kvalitet og oppløsning forbedres. Hvis interessemolekylet har symmetri, kan det også defineres og brukes under gjennomsnitt, noe som forbedrer rekonstruksjonsoppløsningen ytterligere. Ekstraksjonen av 3D-volumer av et makromolekyl fra et tomogram til et sett med subtomogrammer og deres etterfølgende behandling er kjent som subtomogram gjennomsnitt (STA) 23. Hvor hvert subtomogram representerer en unik kopi av molekylet som studeres, kan enhver strukturell heterogenitet bli forhørt ved hjelp av STA-arbeidsflyten. Som ofte brukt i SPA-arbeidsflyten, kan klassifiseringsteknikker brukes under STA for å dissekere konformasjonstilstandene til komplekset av interesse. I tillegg til at STA muliggjør høyoppløselig rekonstruksjon i kryo-ET, gjør denne tilnærmingen teknikken til et kraftig verktøy for å forhøre de strukturelle mekanismene til makromolekyler i deres opprinnelige cellulære miljø eller av mål som ofte ikke er mottagelige for SPA24,25,26.

Elektrontomografi har en lang historie med å bestemme 3D-ultrastrukturen til cellulære prøver ved romtemperatur27. Oppkjøpet av visninger ved fysisk vipping av prøven gir nok informasjon for 3D-rekonstruksjon av et objekt på cellulære lengdeskalaer og er spesielt viktig når cellulære strukturer mangler regelmessigheten for gjennomsnitt. Celler kan også fryses på substrater for kryo-ET-avbildning ved cellekantene der prøven er tynn nok til å være elektrongjennomsiktig. Under disse forholdene kan STA brukes til å bestemme makromolekylære strukturer i et cellulært miljø, om enn når prøven er tynn nok til å være elektrontransparent28. Men når det kombineres med ytterligere forberedende teknikker, inkludert kryo-korrelativt lys og elektronmikroskopi (kryo-CLEM) og fokusert ionstrålefresing (kryo-FIB), kan kryo-ET brukes til å avbilde inne i hele celler under kryogene forhold29. Dette samler kraften til cryo-ET for å studere den cellulære ultrastrukturen med kraften til STA for å bestemme strukturene til makromolekylære komplekser in situ mens de identifiserer deres cellulære plassering30 og gir øyeblikksbilder av komplekser engasjert i dynamiske prosesser31. Teknikkens evne til å avbilde cellulære prøver og bruke STA i flere studier har fremhevet teknikkens kraft til å løse makromolekylære strukturer in situ, selv ved oppløsninger som kan sammenlignes med SPA32. En ytterligere fordel er funnet i kunnskapen om den opprinnelige plasseringen av makromolekylet, representert ved den endelige klassifiserte 3D-rekonstruksjonen i tomogrammet30. Derfor kan den makromolekylære strukturen korreleres med den cellulære ultrastrukturen. Disse observasjonene på tvers av lengdeskalaer vil antagelig føre til viktige funn der strukturelle mekanismer kan korreleres med cellulære endringer i sammenheng med funksjonelle studier.

Cryo-ET og STA tillater datainnsamling i tre hovedarbeidsflyter: molekylær, cellulær og lamelltomografi. Strukturene av rensede makromolekylære komplekser kan bestemmes av cryo-ET ved molekylær tomografi. Bestemme proteinstrukturer i deres cellulære miljø hvor cellen er tynn nok, kan beskrives som cellulær tomografi. Mer nylig, med utviklingen av kryogen målretting og fresing, kan de samme teknikkene brukes i arbeidsflyter for lamelltomografi for å bestemme proteinstrukturene dypt inne i cellen i sitt opprinnelige miljø, samtidig som de avslører den cellulære konteksten der disse proteinene observeres. Ulike datainnsamlingsstrategier kan brukes avhengig av tilgjengelige programvarepakker og, viktigst, avhengig av kravet til prøven. Molekylære eller ikke-adherente prøver på et kobber TEM-rutenett av et renset protein krever vanligvis mindre håndtering og forblir dermed flate og uskadede i ideelle tilfeller. Elektrontomogrammer kan enkelt settes opp i serie over et hullete karbonnett for raskt å skaffe titalls til hundrevis av tomogrammer på en systematisk måte. Den enkleste måten for brukere å sette opp molekylære tomografiprøver der proteiner er rikelig tilstede på rutenettet, ville være å bruke Tomo5 (programvare for 3D-elektrontomografi brukt i denne studien, se Materialtabell). Andre tomografi programvare som Leginon9 og serialEM6 er også tilgjengelig; De tilbyr flere oppsettalternativer for mer personlige tilnærminger for datainnsamling, men er mer komplekse og kan derfor være vanskeligere å navigere, spesielt for brukere som er nye for tomografi og brukere som får tilgang til økten eksternt. For et anlegg med en stor og mangfoldig brukerbase er Tomo5 enkel å betjene i et avsidesliggende miljø og å lære opp brukere i. For adherente celler krever rutenett vanligvis flere håndteringstrinn, og nødvendigheten av å bruke skjøre gullnett øker behovet for forbedret omsorg i håndterings- og datainnsamlingsstrategier. For å gjøre det lettere å finne et cellulært område av interesse og unngå okklusjon fra selve rutenettet ved høye vippevinkler, er det også fordelaktig å bruke større maskestørrelser, men til den prisen at de iboende er mer skjøre. For lamellprøver bestemmes prøvens skjøthet av lamellens kvalitet, som kan variere. Disse faktorene øker oppsettstiden og hensynene, men den økte tilpasningsevnen og robustheten gjør Tomo5 igjen egnet for denne typen datainnsamling. Det finnes imidlertid spesialiserte datainnsamlingsscenarioer for hver arbeidsflyt. BISECT og PACE-tomo (begge kjører i SerialEM) introduserer muligheten for skriptet strålebildeskifting under tomografioppkjøp for å øke tomograminnsamlingshastigheten28, spesielt innen molekylær tomografi. Middels forstørrelsesmontasjer (MMM) i SerialEM 6,7,33 kan bedre identifisere og nøyaktig målrette molekylære funksjoner i alle arbeidsflyter, selv om disse funksjonene i skrivende stund begynner å bli implementert i Tomo5.

I likhet med SPA blir cryo-ET og STA stadig mer tilgjengelige gjennom forbedringene som er gjort for anskaffelsesprogramvare og et vell av tilgjengelige pakker for subtomografi i gjennomsnitt 16,17,32,34,35,36,37,38. I tillegg, under pandemien, ble det viktig å muliggjøre ekstern tilgang til kryo-EM-instrumentering for fortsatt drift av nasjonale anlegg som electron Bio-Imaging Centre (eBIC) ved Diamond Light Source (DLS), Storbritannia. Denne utviklingen har gjort cryo-ET mer tilgjengelig og robust for forskere som ønsker å bruke teknikken. Når data er anskaffet, er STA et viktig verktøy for å analysere tilbakevendende objekter for å oppnå maksimal oppløsningsrekonstruksjon og tillate klassifisering av makromolekylær heterogenitet. Den nåværende protokollen tar sikte på å gi en detaljert gjennomgang av å forberede et kryo-TEM-mikroskop for kryo-ET-datainnsamling og hvordan man utfører subtomogramgjennomsnitt ved hjelp av emClarity på et molekylært tomografidatasett av apoferritin som et eksempel. Bruken av emClarity (programvare for høyoppløselig kryo-elektrontomografi og subtomogram gjennomsnitt, se Materialtabell) krever kjøring av skript fra kommandolinjen, så et nivå av kjennskap til Linux / UNIX-systemer antas.

Den eksterne tilkoblingen avhenger av nettverksmiljøet i hvert institutt/anlegg. På eBIC bruker det eksterne systemet programmer som tillater ekstern datainnsamling på den spesifikke nettverkskonfigurasjonen som brukes på Diamond. Ekstern tilkobling til mikroskopet forenkles av to plattformer: NoMachine og TeamViewer (se materialtabell). Ved hjelp av programmet NoMachine kan brukeren logge på et eksternt Windows-skrivebord. Det eksterne Windows-skrivebordet levert av NoMachine ligger på samme nettverk som mikroskopet og fungerer dermed som en virtuell støtte-PC til mikroskopet. Fra den virtuelle støtte-PC-en kobler brukeren seg til mikroskopet via TeamViewer og gir direkte tilgang og kontroll til mikroskop-PC-en som kjører TUI og Tomo.

Denne protokollen består av to deler (trinn 1 og trinn 2). Trinn 1 fokuserer på ekstern kryo-ET datainnsamling ved hjelp av Tomo5 (programvare for 3D-elektrontomografi). Gjennomgangen for en (ekstern) økt tar bilder med stadig høyere forstørrelser for til slutt å tillate brukeren å lede tomografiprogramvaren til å målrette prøveområder for tomografisk datainnsamling. Figur 1 oppsummerer denne prosessen. Trinn 2 beskriver cryo-ET STA-databehandling ved hjelp av emClarity (programvare for høyoppløselig kryo-elektrontomografi og gjennomsnitt av subtomogram). Figur 9 oppsummerer denne prosessen.

Protokollen er ment for et eksternt publikum. Det forutsetter at personen fysisk ved mikroskopet og lasting av prøvene har gjort de direkte justeringene og tatt vare på kamerainnstillingen og fått referanseinnsamling. For denne protokollen antas et trekondensatorlinsesystem med en autoloader. For ytterligere detaljerte retningslinjer for tomografiprogramvaren, er en detaljert håndbok fra produsenten tilgjengelig i Windows Start-knappen der programvaren ble lastet fra.

Protocol

Programvarepakkene som ble brukt i denne studien er til dels fritt tilgjengelige (se materialfortegnelse).

1. Ekstern cryo-ET-datainnsamling ved hjelp av Tomo5

  1. Hvis programvaren ikke er lastet inn, begynner du med å starte denne programvaren fra TEM-serverens PC (se Materialfortegnelse).
  2. Utfør innledende kontroller og konfigurer bildebetingelsen ved å velge Forhåndsinnstillinger.
    1. Start øktoppsettet ved å justere parametrene for bildeinnhenting i «Forberedelse»-fanen under Forhåndsinnstillinger (figur 2A,B).
      1. Juster "Oversiktsforstørrelse" slik at den passer til rutenettets størrelse og dose for å få tilstrekkelige tellinger.
        MERK: Hvis den passende forstørrelsen er ukjent for rutenetttypen, går du tilbake til dette trinnet etter at du har lastet inn et rutenett.
      2. "Eucentrisk høyde" og "søkeforstørrelse" kan være det samme. Klikk på Søk i "Tomografi" -fanen for å sette opp posisjoner og sikre at forstørrelsen er tilstrekkelig til å vise kjennetegnet av interesse og for å passe til "Eksponering" og "Sporing / Fokus" -området i synsfeltet (figur 2C).
      3. Sett "Exposure Magnification" til ønsket målpikselstørrelse. Hvis dette er ukjent, kan du etablere det ved å justere forstørrelsen til ønsket synsfelt for å passe til interesseområdet.
    2. Kopier parametrene for bildeinnhenting (eksponering) til alle de andre forhåndsinnstillingene for høy forstørrelse (Sporing, Drift, Fokus, Thon Ring, Null tap,). For å gjøre det, trykk Sett for å sette "Eksponering" til mikroskopet og Få for å få "Eksponeringsinnstillinger" til alle andre høye forstørrelser etter å ha valgt dem individuelt.
      1. Juster eksponeringstidene, spesielt for "Fokus" og "Sporing" for å gi et passende antall tellinger, også med tanke på tykkelsen ved 60 °, noe som betyr både ved 0 ° og 60 °, for nok elektroner til å passere gjennom prøven for å gi et sterkt signal for krysskorrelasjon.
        MERK: Som et estimat er eksponeringstider for "Sporing" og "Fokus" lik forhåndsinnstillingen "Eksponering" et godt første mål. For et eksempel på doseberegning for forhåndsinnstillingen "Eksponering", se figur 3. Still inn beregnet eksponeringstid for forhåndsinnstillingen "Eksponering" i kategorien "Forberedelse".
    3. Juster "Zero Loss Preset" for å bruke en lysere og større spotstørrelse (en større spotstørrelse tilsvarer et mindre antall), da dette trenger en høyere dose.
      MERK: Denne forhåndsinnstillingen brukes best til å justere spalten til energifilteret hvis det finnes på mikroskopet.
  3. Utfør atlassamlingen ved å følge trinnene nedenfor.
    1. For å samle et atlas, klikk på Ny økt i "Atlas" -fanen, angi øktinnstillingene, skriv inn lagringsbanen og utdataformatet, og trykk på Bruk. Velg Screening (figur 4), og merk deretter av for alle atlasene som skal anskaffes. Velg Lukk kollventiler for å la mikroskopet være uten tilsyn; Dette vil lukke kolonneventilene etter at alle de valgte atlasene er samlet inn. For å starte screeningen, trykk på Start-knappen .
    2. Inspiser enkelt eller flere atlas for mål ved å klikke på rutenettet i venstre panel under "Screening" (figur 4), deretter venstreklikke og dra musen for å bevege seg rundt og midtre bla for å zoome inn og ut. Velg rutenett for måloppsett, velg det og klikk på Last inn prøve fra innsiden av programvaren.
    3. For bildeskiftkalibreringene fortsetter du å bruke atlas-screeningfanen for å navigere i det lastede rutenettet. Finn en identifiserbar funksjon som vil være gjenkjennelig ved alle forstørrelsesforhåndsinnstillinger, dvs. en iskrystall som overlapper med en kant av et hull eller en annen gjenkjennelig funksjon (figur 5). Flytt til den firkanten med et høyre museklikk, og deretter "Flytt scenen til Grid Square".
      MERK: Scenen må være i eusentrisk høyde for å implementere bildeskiftkalibreringer riktig.
  4. Utfør bildeskiftkalibrering.
    1. I kategorien "Autofunksjoner" (figur 6), sett forhåndsinnstillingen til "Eucentrisk Height", naviger til "Auto-Eucentric by Stage Tilt", og trykk Start. Overvåk statusvinduet for å sikre at det er vellykket å finne den eucentriske høyden, og hold øye med de positive og negative vippebildene; de må korrelere.
      MERK: Fra versjon 5.8 av Tomo-programvaren kan kriteriet for eusentrisk høydeaksept endres; Standard er 0,25 μm, og å sette den til 0,5-0,8 μm gir mer spillerom. Verdiene avhenger av mikroskopets ytelse, men det anbefales at de er så små som mulig.
      1. Når du er i eusentrisk høyde og i fokus, sentrer scenen på en funksjon. Samle en forhåndsvisning ved hjelp av forhåndsinnstillingen "Atlas". Angi alle "Forhåndsinnstillinger" fra "Forberedelse" -fanen. Deretter øker du forstørrelsen til Oversikt > senterfunksjon > Forhåndsvisning, gjentar deretter "Søkeforstørrelse" og til slutt "Eksponeringsforstørrelse".
    2. Hvis funksjonen forble sentrert under målrettingen, hopper du over bildeskiftkalibreringene. Ellers, for å kalibrere bildeskiftet, gå til "Forberedelse" -fanen, velg Kalibrer bildeskift og trykk Start (figur 5). Dette vil iterativt justere lavere forstørrelser til funksjonen sentrert ved eksponeringsforstørrelse.
      MERK: Hvis den opprinnelige forhåndsinnstilte "Eksponering" ikke er sentrert på dette stadiet, for omsentrering, vil programvaren bare bruke trinnskift for dette trinnet.
      1. Trykk Fortsett for forhåndsinnstillingen "Eksponering". Det neste bildet som vises vil være "Forhåndsinnstilling for søk". For å kalibrere bildeskiftet mellom forhåndsinnstillingene, dobbeltklikk i forhåndsvisningen "Søk" til der midten av forhåndsvisningen av "Eksponering" er, og trykk deretter på Hent på nytt (figur 5). Klikk på Fortsett for å gå til neste par forhåndsinnstillinger.
        MERK: Hvis et bildeskift ved atlasforstørrelse ble brukt under denne kalibreringen, må du sørge for å anskaffe atlaset på nytt etter at bildeskiftkalibreringen er fullført. Velg ønsket atlas og trykk Tilbakestill valgt i topppanelet i "Atlas" -fanen. Bekreft og begynn å anskaffe atlaset igjen.
  5. Utfør tomografioppsettet.
    1. Opprett oppsettet for datainnsamling for tomografi i kategorien "Tomografi".
      MERK: Med mindre det er spesifikt angitt, gjøres oppsettet helt i kategorien "Tomografi".
    2. Start en ny økt. I "Session Setup" for biologiske prøver, velg Slab-like som prøvetype og velg Batch og Low Dose, velg utdataformat og lagringsmappe, eventuelt legg til en e-postmottaker, og trykk deretter Apply.
      MERK: Menypunktet "Batch Positions" blir nå tilgjengelig (figur 7A). Det for øyeblikket lastede atlaset blir automatisk importert. "Oversikt" og "Søk bilder" kan hentes og revideres til et nytt bilde er anskaffet. I tillegg, fra versjon 5.8, kan søkekart på 3 x 3, 4 x 4 og 5 x 5 fliser kjøpes med "Skaff søkekart" for å lette målsøking og oppsett. De tilsvarer en versjon av mellomstore forstørrelsesmontasjer.
    3. For å sette opp mål, gå til "Atlas-pilen", finn et interesseområde og flytt dit ved å velge alternativene som dukker opp med et høyreklikk. Ta et oversiktsbilde for å bekrefte en god posisjon for eusentrisk høydejustering, og trykk deretter på Auto Eucentric; Dette vil kjøre Eucentric by Stage Tilt-rutinen. Deretter anskaffer du et nytt oversiktsbilde på nytt for å oppdatere den eusentriske høyden.
      MERK: "Autofokus" -knappen skal ikke være nødvendig hvis posisjonen er i eusentrisk høyde. Hvis det eusentriske høydebildet vises langt ute av fokus, er den eusentriske høyden sannsynligvis ikke riktig og må gjøres om (for feilsøking av eusentrisk høyde, se diskusjonsdelen).
    4. Kontroller målet ved hjelp av forhåndsinnstillingen "Oversikt" før du setter opp den første posisjonen; velg forhåndsinnstillingen "Oversikt" og vipp trinnet til ±60° for å sjekke hvilken avstand fra rutenettet posisjonene kan settes opp (figur 8). Utfør dette ved å skrive inn ønsket hellingsvinkelverdi i vinduet "Set Tilt" (figur 8A).
    5. Inspiser firkanten "Oversikt" eller det anskaffede "Søk kart", flytt til et område av interesse, og trykk Skaff søk. Inspiser "Søk" -bildet. Hvis interesseområdet ikke er sentrert, høyreklikker du på ønsket posisjon og gjentar deretter Flytt trinn her og Skaff bilde. Still inn Tilt (°) til 0,00 (eller en annen startvinkel som trinnet kan håndtere) for å definere startvinkelen til tomogrammet.
      1. For det første tomogrammet, skriv inn navnet for ønsket tomogram navnekonvensjon og defokus for å angi ønsket defokusverdi for hvert tomogram.
      2. Eventuelt, fra Tomo versjon 5.8 og utover, kan defokusverdiene systematisk endres alt på en gang; for det, klikk på Velg posisjoner, velg posisjonene som skal endres eller merk av for å velge alle posisjoner, og klikk deretter på Oppdater defokus og juster parametrene (figur 7A).
    6. Juster området "Fokus" og "Sporing" (figur 2C). Venstreklikk for å dra sporings- og fokusområdene (gule og blå sirkler). Forsikre deg om at sporings- / fokusområdet er (for det meste) på karbon eller en annen passende sporingsfunksjon, dvs. en lignende funksjon som interesseområdet; Unngå sprekker, isforurensning, altfor tykke områder og tomme hull.
      1. Når du velger tomt karbon uten mange sporingsfunksjoner, må du sørge for at området begynner å brenne halvveis gjennom tomogrammet ved å velge en høy nok dose for fokus, og sporing for å sakte brenne prøven ved høyere tilts. Dette kan være fordelaktig for å opprettholde sporingsnøyaktigheten. Kontroller at sporings-/fokusområdet ikke eksponerer et senere innsamlingsområde.
        MERK: Vær forsiktig med hva som er nært og hva som kommer inn i strålen. Unngå områder med funksjoner som vil gripe inn med sporing og/eller eksponering, inkludert rutenettstenger.
    7. Trykk på Legg til posisjon når alle parametrene er angitt og ønsket interesseområde og "Fokus" og "Sporing" er definert. Gjenta for nye mål.
      MERK: For å kontrollere at den eusentriske høyden er riktig kalibrert for batchposisjonene som er konfigurert, er det flere tilgjengelige strategier. Det anbefales å velge en basert på hvilken type tomografi økt som utføres (molekylær, cellulær, lamell).
    8. For molekylær tomografi, forutsatt at rutenettene er ganske flate og eusentrisk høyde er gjort i midten av hver firkant som inneholder målposisjoner, hopper du over prosedyren "Avgrens alle" (eller Avgrens valgt hvis posisjoner er valgt, figur 7A). Hvis Tomo sliter med auto-eucentric by stage tilt rutine, muligens klikk på Hopp over Eucentric.
      1. For celle- eller lamellprøver kan hver batchposisjon være i forskjellig z-høyde. Bruk enten "Avgrens alle" for å være forsiktig eller ikke merk av for "Hopp over eucentrisk".
        MERK: "Avgrens alle" vil iterere gjennom alle tomogrammene som er satt opp eller valgt via "Velg posisjoner"; Avgrens den eusentriske høyden og utfør sporing og fokus før datainnsamling. Denne prosedyren kan avsløre eventuell overlappende eksponering fra neste tomogramfokus/sporingsområde (figur 7B), som bør vurderes før du fortsetter.
      2. Sjekk og gå tilbake til rutene som har mislyktes raffinement. Med høyre museknapp klikker du på mislykket posisjon for å se alternativer. Hvis eusentrisk høyde mislykkes, finn "Auto-eucentric by stage-tilt" (trinn 1.4.1.), skaff deg et nytt "Søk" -bilde for å oppdatere z-høyden og "Legg til posisjon". Slett den mislykkede/tidligere initialiserte posisjonen. Klikk på alternativet Hopp over eusentrisk , som er gjort med "Avgrens alle".
        MERK: Hvis "Refine All" ikke kjøres, må "Skip Eucentric" ikke sjekkes. Tomo5 vil kjøre eusentrisk raffinement før hvert tomogram er anskaffet; På denne måten vil stillinger som mislykkes i eusentrisk raffinement bli hoppet over.
  6. Utfør automatiske funksjoner ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Kontroller innstillingene for å utføre justeringene via fanen "Autofunksjoner" ved å navigere i atlaset til et område med karbon. Ta dette området til eusentrisk høyde og følg rekkefølgen på justeringer som angitt nedenfor.
      1. Kjør Auto-eucentric ved trinnhelling med forhåndsinnstillingen "Eucentric Height".
      2. Kjør autofokusrutinen med forhåndsinnstillingen "Fokus".
      3. Kjør Autostigmate-rutinen med forhåndsinnstillingen "Thon Ring".
      4. Kjør Autocoma-rutinen med forhåndsinnstillingen "Thon Ring".
      5. Sett inn ønsket objektiv blenderåpning (figur 6B), sannsynligvis 100 μm blenderåpning, som et godt kompromiss for økt prøvekontrast og bare en liten avskjæring i signal ved svært høy oppløsning.
      6. Gjenta Autostigmate-rutinen etter blenderåpning.
        MERK: Ved forstørrelser med pikselstørrelser rundt 3 Å og lavere oppløsninger, kan Autocoma-rutinen mislykkes; I dette tilfellet kontrollerer og justerer du Tomo Rotation Center under Direct Alignments i TEM-brukergrensesnittet.
    2. Sjekk at Auto Zero-Loss-sentreringsrutinen fungerer på prøven din. Med forhåndsinnstillingen "Null tap" i en rimelig høy dose (trinn 1.2.3), vil rutinen i Auto Functions mer sannsynlig lykkes.
  7. Utfør datainnsamling.
    1. For å starte den automatiserte anskaffelsen i "Tomografi" - fanen, velg datainnsamlingsplaten og angi de ønskede parametrene (figur 7C). Definere parametere for datainnsamling: Tilt-trinn (°), Maks. Positiv vinkel (°), Maks. Negativ vinkel (°), sporingsskjema (anbefales: Velg Spor/fokus før innhenting). Velg Lukk kolonneventiler for eusentrisk høydeskjema.
      MERK: Sjelden brukte parametere er "Juster eksponeringstid", "Juster ZLP", "Bruk faseplate" og "Pause etter tilt".
      1. Bruk Juster eksponeringstid for tomogrammer som ikke er beregnet for STA, til å øke eksponeringstiden med et angitt forhold ved høyere hellinger.
      2. Alternativet Juster ZLP vil kjøre en ZLP-raffinement etter hvert tomogram, uansett periodisitetssett. Det er tregt, mislykkes noen ganger uten åpenbare grunner, og vil hoppe over det posisjonsoppkjøpet. Det kan imidlertid være nyttig for svært smal spaltebredde, dvs. 3-5 eV på et Selectris (X) filter.
      3. Bruk faseplate brukes sjelden siden introduksjonen av DED med energifiltre.
      4. Pause After Tilt gjør pause oppkjøpet, men tillater ingen endringer i programvaren.
    2. Dobbeltsjekk datainnsamlingsparametrene (i kategorien "Forberedelse"), enig med doseberegningen og ønsket tiltskjema, spesifiser antall fraksjoner (nr.) i forhåndsinnstillingen "Eksponering", og begynn deretter innsamlingen.
      MERK: Antall fraksjoner avhenger av prøven, innsamlingsparametrene og de planlagte etterbehandlingstrinnene, dvs. STA vs. morfologisk analyse, og må holdes til verdier der bevegelseskorreksjon og CTF-estimering får nok signal. Et område på 4-10 fraksjoner er et godt estimat, hvor 4 er mer egnet for tykkere prøver og 10 for tynnere molekylære prøver.
      1. Klikk deretter på Start for å starte datainnsamlingen og overvåke den første tomograminnsamlingen for å sikre at tomogrammene anskaffes som tiltenkt.
        MERK: Nyere tomografiprogramvareversjoner har en ekstra Movie Player-plate i kategorien "Tomografi" der de kjøpte tomogrammene kan sees. Vær tålmodig under lasteprosessen.

2. Cryo-ET STA av apoferritin ved bruk av emClarity

MERK: Her brukes emClarity-programvare17 til å illustrere kryo-ET-strukturbestemmelse av STA. Figur 9 oppsummerer denne prosessen. Seks tiltserier av apoferritin (EMPIAR-10787) ble tatt som eksempel. Oktaedisk symmetri ble brukt, og det endelige kartet hadde en oppløsning på 2,86 Å, oppnådd fra bare 4 800 partikler og nær Nyquist-frekvensen (2,68 Å).

  1. Kontroller at emClarity-programvarepakke39 er lastet ned og installert (se Materialfortegnelse). Installer IMOD for programvarebehandling40.
    MERK: Grunnleggende kunnskap om Linux-kommandoer er nødvendig. En mer detaljert veiledning finner du i referanse41, som tar et ribosomdatasett (EMPIAR-10304) som et eksempel og beskriver trinnvise prosedyrer. For ulike typer proteinprøver er en tidligere publisert rapport også tilgjengelig42.
  2. Klargjør inndatafilene og katalogene.
    MERK: Rårammene ble bevegelseskorrigert av MotionCor2 (patch 5 x 5)43 (se Materialfortegnelse). De bevegelseskorrigerte bildene ble stablet for å generere tilt-serien ved hjelp av newstack (IMOD) og manuelt justert med patchsporing ved hjelp av Etomo (se Materialtabell), etterfulgt av emClarity. For å få bedre justeringer anbefales det å utføre forskyvninger og vippekompensasjon i Etomo. De seks tilt-seriene blir omdøpt til TS1 til TS6. Nedenfor er instruksjonene og kommandoene for den første tiltserien (TS1) som et eksempel.
    1. Opprette en prosjektmappe.
      MERK: Den nyeste versjonen av programvaren er 1.5.3.11. Alle relaterte programvarelogger finner du i den lokale prosjektmappen (.../logFile/emClarity.logfile).
    2. Under prosjektmappen lager du en ny mappe, "fixedStacks", og klargjør inndatafilene: TS1.fixed, TS1.xf og TS1.tlt.
      MERK: TS1.fixed: den opprinnelige tilt-serien, også kjent som TS1.st i Etomo. TS1.xf: denne filen inneholder transformasjonskoordinatene etter Etomo tiltalign. TS1.tlt: denne filen inneholder tilt-vinkler.
  3. Beregn defokuseringen ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Beregn defokus. Oppdater parameterfilen med mikroskop- og bildeparameterne etter tilleggstabell 1. Kopier en parameterfil til prosjektmappen, endre navnet til param_ctf.m, og kjør: emClarity ctf estimate param_ctf.m TS1.
      MERK: Parameterfilmalen finner du i tilleggsfil 1 eller installasjonsmappen for lokal programvare (.../emClarity_1.5.3.11/docs/exampleParametersAndRunScript/).
  4. Kontroller CTF-estimeringsresultatene for hver stabel.
    1. Kontroller de justerte stablene (for eksempel aliStacks / TS1_ali1.fixed) ved hjelp av 3dmod og sørg for at fiducialperlene slettes riktig.
    2. Kontroller at loggfilen rapporterer at handedness er riktig, som du finner i logfile/emClarity.logfile (figur 9).
    3. Kontroller defokusverdien (for eksempel fixedStacks/ctf/TS_ali1_psRadial_1.pdf), og kontroller at den samsvarer med det teoretiske CTF-estimatet.
  5. Definer underregionene.
    1. Generer et binned tomogram. Kjør i prosjektmappen: sh recScript2.sh -1.
      MERK: Et mindre (i størrelse) tomogram for hver stabel vil bli lagret i en ny mappe "bin10". For å øke hastigheten på prosessen kan koordinatene til en eller flere underregioner defineres i et bin10-tomogram. Skriptfilen vil være i den lokale programvareinstallasjonskatalogen (.../emClarity_1.5.3.11/docs/).
    2. Bestem grensene ved å velge seks punkter, x min, x maks, y min, y maks, zmin og zmaks, for å opprette ett underområde. Under mappen "bin10", kjør: 3dmod TS1_bin10.rec.
      MERK: Hvis fire underregioner skal opprettes i én vippeserie, velger du 6 × 4 = 24 poeng. Hver stakk må ha en modellfil (*.mod) under mappen "bin10".
    3. Konverter modellfilene til emClarity-formatet. Dette vil opprette en ny mappe recon. Lagre alle koordinatene til hvert underområde under denne mappen. Kjør i prosjektmappen: sh recScript2.sh TS1.
  6. Plukk partikler.
    1. Finn en apoferritinmal for plukking av partikler. Last ned en mal fra Electron Microscopy Data Bank (EMD-10101)44. Kontroller at pikselstørrelsen på malen samsvarer med rådataene. Kjør i prosjektmappen: emClarity skalere ApoF.mrc ApoF_Template_rescale.mrc 3.60 1.34 cpu.
    2. Generer CTF-korrigerte tomogrammer for partikkelplukking. Kjør i prosjektmappen: emClarity ctf 3d param_ts.m templateSearch.
    3. Kjør partikkelplukking for hvert underområde. For datasettet apoferritin utfører du et malsøk på bin6. Endre de Tmp_angleSearch parameterne (θ ut, Δut, θ inn, Δinn) for å bestemme vinkelområdet og intervallene for søk i plan eller utenfor plan i grader. Kjør i prosjektmappen: emClarity templateSearch param_ts.m TS1 1 ApoF_Template_rescale.mrc O 1.
      MERK: En mappe "convmap_wedge_Type2_bin6" vil bli generert i dette trinnet. CSV-filen under denne mappen (for eksempel TS1_1_bin6.csv) inneholder all informasjon om partiklene som er plukket.
    4. Fjern feil partikler ved hjelp av 3dmod. Under mappen "convmap_wedge_Type2_bin6", kjør: 3dmod .. /cache/TS1_1_bin6.rec TS1_1_bin6.mod.
      MERK: Det er vanlig å finne feil partikler ved siden av karbonkanter eller isforurensninger i disse områdene. Utfør et høyre museklikk på feil punkter og trykk tilbake på tastaturet for å slette dem. I dette trinnet må du sørge for at de fleste falske positive punktene fjernes (figur 10).
    5. Endre mappenavnet "convmap_wedge_Type2_bin6" til "convmap", da emClarity vil gå og finne underregioninformasjon under convmap i de følgende trinnene.
  7. Initialiser prosjektet. Kjør emClarity init param0.m i prosjektmappen for å opprette en database for emClarity, ApoF.mat.
  8. Utfør tomogramrekonstruksjon før STA og justering. For å generere CTF-korrigerte sub-region tomogrammer ved bin4, kjør: emClarity ctf 3d param0.m.
    MERK: CTF-korrigerte tomogrammer (for eksempel cache / TS1_1_bin4.rec)  vil bli generert i en ny mappe "cache".
  9. Utfør STA og justering.
    1. Utfør gjennomsnittet ved hjelp av CTF-korrigerte sub-tomogrammer som starter på bin4. Kjør i prosjektmappen: emClarity avg param0.m 0 RawAlignment.
    2. Fortsett å gjøre justeringer og kjør: emClarity alignRaw param0.m 0.
      MERK: Gjennomsnittstrinnet genererer en referanse, som vil bli brukt av emClarity i dette trinnet for å justere partiklene. De Raw_angleSearch parametrene (θ ut, Δut, θ inn, Δinn) kan endres for å angi vinkelområde og trinnstørrelser for hver syklus. Siden de fleste feil partikler fjernes fra databasen (trinn 2.6.4), kan disse vinkelinnstillingene for justering starte med en relativt liten grad.
    3. Oppdater Raw_angleSearch-parameterne og kjør noen flere sykluser (trinn 2.9.1 og 2.9.2). For å øke hastigheten på prosessen, utfør justeringer i plan og utenfor plan separat.
      MERK: For hver binning anbefales det å kjøre flere sykluser og gradvis redusere vinkelinnstillingene. For ApoF-datasettet ble det utført ytterligere fem sykluser ved bin 4, og ytterligere detaljer er tilgjengelig i supplerende tabell 2. For cycle001, i prosjektmappen, kjør: emClarity gj.sn. param1.m 1 RawAlignment, etterfulgt av emClarity alignRaw param1.m 1.
    4. Rengjør de overlappede partiklene. Kjør i prosjektmappen: emClarity removeDuplicates param5.m 5.
  10. Utfør Tilt-serien raffinement med tomoCPR.
    MERK: Dette trinnet er valgfritt.
    1. Kjør tomoCPR for å finjustere stakkgeometrien. Kjør i prosjektmappen: emClarity tomoCPR param5.m 5.
    2. Generer nylig justerte stabler og oppdater geometrifilene. Kjør i prosjektmappen: emClarity ctf update param6.m.
      Kontroller at de nye geometrifilene (for eksempel fixedStacks/ctf/TS1_ali2_ctf.tlt) og de nylig justerte stakkene (for eksempel aliStacks/TS1_ali2.fixed) genereres riktig.
    3. Opprett nye undertomogrammer på bin2. Kjør i prosjektmappen: emClarity ctf 3d param6.m.
      MERK: Dette vil bli fulgt av noen få sykluser for gjennomsnitt og justering ved bin2 (trinn 2.9.1, 2.9.2 og 2.9.3), duplikatrengjøring (trinn 2.9.4) og valgfri tomoCPR (trinn 2.10). På grunn av høy symmetri ble ytterligere fem sykluser ved bin2 utført for apoferritin. Oppdater de Raw_angleSearch parameterne for hver syklus.
  11. Utfør endelig rekonstruksjon.
    1. Fortsett å kjøre noen sykluser på bin1 og tomoCPR (trinn 2.9 og trinn 2.10). Ytterligere 10 sykluser ved bin1 ble utført for apoferritin-datasettet. Flere detaljer om kommandoene og parametrene finner du i tabell 2.
    2. Utfør endelig rekonstruksjon ved å kombinere de to halve datasettene. Kjør i prosjektmappen: emClarity avg param21.m 21 RawAlignment, etterfulgt av emClarity avg param21.m 21 FinalAlignment.
      MERK: Det endelige kartet (for eksempel med en B-faktor på 10, cycle021_ApoF_class0_final_bFact-10.mrc) vil bli generert, figur 11.

Representative Results

For celle- og lamellprøver avhenger datainnsamlingsstrategien i stor grad av utvalget og målet for bildediagnostikken (figur 1). Målrettingsmetoden avhenger av om det molekylære målet er in situ eller fremstilt fra det rensede makromolekylære komplekset for høyoppløselige rekonstruksjonsprøver som inneholder molekylære mål. For rensede komplekser vitrifisert på hullete (karbon) rutenett, kan målretting ganske enkelt baseres på avbildning i hullene i (karbon) støttefilmen. For in situ-arbeid krever målrettingsmetoden kunnskap om plasseringen av den molekylære enheten basert på korrelative data eller kjente cellulære landemerker med lav forstørrelse. Cellulære landemerker vil ideelt sett være identifiserbare når du tar oversiktsbilder, og hvis det er tilstrekkelig til å grovt lokalisere interesseområder, kan det gi en rask måte å bekrefte målidentitet med et søkebilde. Men hvis de observerbare hendelsene er sjeldne, kan det være nødvendig med søkebilder med middels forstørrelse for å kvalifisere målet er riktig. Søkekart er middels forstørrelsesmontasjer av søkebilder og kan dermed gjøre målfinning mye enklere, der de kan anskaffes ved en forstørrelse der funksjonen av interesse er synlig. Søkekart kan deretter screenes for å finne og definere målgruppeposisjoner. For prøver som inneholder cellulære egenskaper for ultrastrukturell rekonstruksjon, er målrettingsmetoden lik, men like avhengig av synligheten av den cellulære hendelsen ved forskjellige forstørrelser og dens utbredelse i prøven.

Datainnsamlingsstrategien må også vurderes; I alle tilfeller bestemmer studiens mål i stor grad hvordan dataene samles inn. For rekonstruksjon av den cellulære ultrastrukturen kan lav forstørrelse (20-5 Å/px) og stort synsfelt være aktuelt, men det kreves høye forstørrelser for å rekonstruere molekylære eller høyoppløselige detaljer (5-1 Å/px). Et datasett samlet inn på 1,5 Å/px under ideelle forhold vil kun fysisk kunne produsere en rekonstruksjon med Nyquist-frekvensen på 3,0 Å/px; I virkeligheten påvirker imidlertid mange faktorer, inkludert, men ikke begrenset til prøvetykkelse, størrelse og heterogenitet, den oppnådde rekonstruksjonskvaliteten. De nøyaktige bildeparametrene balanserer også forstørrelsen basert på studiens mål med synsfeltet for å inneholde nok informasjon. Denne artikkelen presenterer et subtomogram gjennomsnittlig tilfelle som når 2,86 Å, men tilleggsstudier 17,42,43,44,45 er presentert i tabell 1 for å illustrere innsamlingsparametrene knyttet til studier rettet mot ulike utfall17,42,45,46.

Når en målrettet arbeidsflyt og datainnsamlingsregime for cryo-ET er etablert, er datainnsamling av mange forskjellige prøvetyper mulig. Representative tomogrammer av en rekke prøver presenteres her: molekylære prøver som apoferritin (film 1), tynne cellulære prosesser (film 2) og FIB-freset lamell av den tykke celleprøven (film 3).

Figure 1
Figur 1: Oversikt over oppsettet av tomografiarbeidsflyten. Arbeidsflyten for cryo-ET-avbildning beskrevet i protokollen vises som et flytskjema. Bildene som forventes å bli anskaffet, vises for den cellulære og molekylære arbeidsflyten. Den presenterte navngivningen følger Tomo5-konvensjonen, selv om de fleste tomografioppkjøpsprogramvare deler felles prinsipper for å samle disse bildene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Kategorien Klargjøring og forhåndsinnstilte søkebetingelser . (A) Oversiktsbilde av hele fanen. Forhåndsinnstillinger for bildetilstand er angitt i denne kategorien, og "Calibrate Image Shift" og "Image Filter Settings" finner du i rullegardinmenyen "Oppgaver". (B) Zoom inn på rullegardinmenyen "Forhåndsinnstillinger" der hver forhåndsinnstilling kan velges for oppsett av individuelle bildeforhold. (C) Bilde som viser en tilstrekkelig forstørrelse for å passe både eksponeringen og "Fokus og sporing" -området inn i synsfeltet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Doseberegninger. Eksempel på doseberegninger for mulige tomograminnsamlingsordninger der dosehastigheten er målt over vakuum. De to beregningene bestemmer eksponeringstiden(e) for hver tilt, enten det er rettet mot en optimal dose per tilt eller en optimal totaldose for hele tiltserien. I gjennomsnitt av subtomogram er det vanlig å målrette en optimal dose per vippet bilde i området 3,0-3,5 e-/Å2. I begge tilfeller er "Fraksjonene (Nr.)" satt til 6 for å oppnå ~0,5 e-/Å2 dose per filmramme av vippingen for tilstrekkelig signal til å utføre bevegelseskorreksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Atlas-fanen. Oversiktsbilde av "Atlas" -fanen. Bildet er beskåret for å unngå tomme rutenettposisjoner. Menyen "Oppgaver" inneholder innstillinger for øktoppsett og rutenettvalg for individuelt valg av alle lagrede rutenett og et alternativ for å skaffe et enkelt atlas etter at kassetten er fjernet fra autoloaderen. Et valgt rutenett kan tilbakestilles og deretter anskaffes på nytt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Kalibrerte bildeforskyvninger. Bildet viser et eksponerings- og søkebilde. Det røde krysset i søkebildet er den forskjøvne markøren for å korrigere forskyvningen mellom eksponering og søk. Man bør gjøre om bildeskiftkalibreringer ved øktstart eller etter endring av forhåndsinnstillingene for bildetilstand. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Autofunksjoner og blenderåpninger . (A) Fanen "Autofunksjoner" viser rullegardinmenyen "Forhåndsinnstillinger" og "Oppgave". Understreket i blått er forhåndsinnstillingen "Thon Ring" som kreves for "Autostigmate" (også understreket i blått) og "Autokoma". Man bør velge respektive forhåndsinnstillinger for hver oppgave og deretter trykke på Start-knappen . (B) Blenderåpninger finnes i TEM-brukergrensesnittet. Velg ønsket "Objektiv blenderåpning" etter at autofunksjonene er utført og kjør "Autostigmate" med blenderåpningen i. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Oversikt over tomografifanen. Bilder viser Tomo 5.8-brukergrensesnittet. (A) Batch-stillinger. De nyeste funksjonene som er avbildet på bildet: alternativet "Skaff søkekart"; Tomogramposisjoner vises i Atlas-visning med zoom-inn-alternativet; uthevet øverst til høyre er "Velg posisjoner"; under alle fire posisjonene er valgt til "Oppdater Defokus" parametere. (B) Tre posisjoner er valgt på søkekartet, merket 1, 2 og 3. Posisjon 1 vil ikke utgjøre et problem når "Avgrens alle" kjøres. Men hvis du er i en innstilling med høy måltetthet, for eksempel når lamellposisjoner velges, som vist for posisjon 2 og posisjon 3, vil "Avgrens alle" kjøre rutinen "Sporing" og "Fokus" på "Eksponering" -området i posisjon 2, og eksponere målet før tomogrammet er anskaffet. Rutenetttypen er R1.2/1.3. Skala bar = 1,2 μm. (C) Datainnsamling. Valgte stillinger oppsett i "Batch Positions" kan nå kjøpes individuelt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: Definere maksimal hellingsvinkel. Figuren viser en trinnvis tilnærming til fastsettelse av maksimalt tiltområde for tomogramanskaffelser. (A) 0° oversikt og et søkekart i midten av rutenettet. For å teste hellingsområdet kan vinkelen stilles inn i tomografiprogramvaren med "Set Tilt (°)" ved å skrive inn ønsket verdi og deretter trykke på Set. (B) Trinnet er vippet til −60°, som viser at et hjørne av søkekartet ikke ville bli fullstendig anskaffet ved −60°. (C) Trinnet er vippet til 60°. Ved å telle hullene som har forsvunnet ved ±60°, kan man få en ide om hellingsområdet til et rutenett. Skala barer = 2,5 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: emClarity-flytskjema. Flytskjemaet beskrev de forskjellige trinnene for gjennomsnitt av kryo-sub-tomogram. Skala barer = 50 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: Malmatching ved hjelp av emClarity . (A) En typisk mikrograf av apoferritin på et grafenbelagt rutenett. Defokusering: −3.430 μm. (B) En bit av tomogrammet overlappet med modellpunkter etter malsøk. (C) En topp og (D) en sideprojeksjonsvisning av modellpunkter, som indikerer et enkelt flatt lag av monodisperserte apoferritinpartikler. Skala barer = 50 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11: Cryo-ET STA av apoferritin . (A) Det endelige kartet etter 21 sykluser av sub-tomogram justering. (B) Det endelige kartets Fourier shell correlation (FSC) plott med en rapportert oppløsning på 2,86 Å, som inneholder 38 kjegle FSCs. (C) Representative tetthetskart (utstyrt med PDB modell 6s6147). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Eksempel Kryo-ET-type Å/px Vippeområde (+/-) Vippetrinn (°) Defokuseringsområde (μm) Total dose (e-/Å2) Resolusjon Rådata Referanse
Apoferritin Renset / molekylær (STA) 1.34 60 3 1.5 – 3.5 102 2.86 EMPIAR-10787 17 & denne artikkelen
HIV-1 knebling Renset / molekylær (STA) 1.35 60 3 1.5 – 3.96 120 3.1 EMPIAR-10164 17
Ribosom Renset / molekylær (STA) 2.1 60 3 2.2 – 4.3 120 7 EMPIAR-10304 42
SARS-CoV-2-topp Lamella/molekylær (STA) 2.13 54 3 2 – 7 120 16 EMPIAR-10753 45
Neuron axon struktur Cellulær (ultrastrukturell) 5.46 60 2 3.5 – 5 90 N.D. EMPIAR-10922 47

Tabell 1: Oppsamlingsparametere for flere kryo-ET-studier. Studier rettet mot rekonstruksjon av molekylære detaljer fra rensede eller in situ proteiner sammenlignet med en studie som tar sikte på å løse og segmentere de ultrastrukturelle cellulære egenskapene.

Film 1: Et tomogram av apoferritinprøver på et vanlig EM-rutenett og deretter avbildet med et kryo-TEM utstyrt med et ultrahøyoppløselig kamera med et kompatibelt filter. Tilt-serien ble oppnådd med et dosesymmetrisk skjema, med et tiltspenn på 54 ° og en total dose på 134 e- / A2 i elektrontomografiprogramvaren. Skala bar = 50 nm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.

Film 2: Et tomogram av et primært nevron dyrket på et EM-rutenett og deretter direkte avbildet med et kryo-TEM utstyrt med et ultrahøyoppløselig kamera med et kompatibelt filter. Tiltserien ble oppnådd med et dosesymmetrisk skjema, med et tiltspenn på 60 ° og en total dose på 120 e- / A2 i elektrontomografiprogramvaren. Skala bar = 100 nm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.

Film 3: Et tomogram av en cyanobakterie på et EM-rutenett, utsatt for FIB-fresing og deretter avbildet med en kryo-TEM utstyrt med et høyhastighetskamera og et kompatibelt filter. Tiltserien ble oppnådd med et dosesymmetrisk skjema, med et tiltspenn på 50 ° og en total dose på 120 e- / A2 i elektrontomografiprogramvaren. Skala bar = 87,2 nm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.

Tilleggsfil 1: Parameterfilmalen for estimering av defokus. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 1: Detaljer om datainnsamling og oppsett av mikroskop. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 2: Liste over kommandoer i utførelsesrekkefølgen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Tomo5
Arbeidsflytbeskrivelsen av tomografiprogramvaren fremhever en potensiell og mest strømlinjeformet måte for et (eksternt) batch-tomografiøktoppsett. Mens programvaren er enkel for nybegynnere, kan noen innledende cryo-EM-erfaring og grunnleggende tomografiforståelse hjelpe med oppsettet. Kritiske trinn er uthevet i protokollen og skal bidra til å feilsøke selv om en annen oppsettsmetode er brukt. Utviklingen av programvaren vil lette (ekstern) datainnsamling og gjøre cryo-ET mer tilgjengelig for en bred brukerbase. Noen tips og triks som kan hjelpe deg med å feilsøke vanlige problemer, er beskrevet nedenfor.

Et viktig poeng å diskutere er valget av rutenett fordi ved vipping av prøven til ±60° kan rutenettstenger ved høye hellinger skjule visningen (figur 8). På et TEM-rutenett refererer maskestørrelsen til antall rutenettkvadrater per lengdeenhet på rutenettet. Større masketall har flere rutenettkvadrater per enhetslengde, en høyere tetthet av rutenettkvadrater og mindre rutenett, det vil si at et rutenett på 400 nett har mindre firkanter enn et rutenett med 200 nett. Et godt utvalg av rutenett for tomografi er 200-mesh eller 300-mesh rutenett. Som vist i figur 8, reduseres det tilgjengelige området for innsamling når rutenettet vippes. Ved ±60 ° tilt vil et 300-mesh rutenett ha et lite synsfelt som et fullt tomogram kan kjøpes på. Fordelene med 200-mesh rutenett er at de større rutenettene gjør molekylærtomografioppsettet raskere, og med det økte rutenett-kvadratområdet vil en firkant sannsynligvis være nok for en samling over natten. Ulempen er at 200-mesh rutenett er mer skjøre, så håndtering og klipping krever mer finesse.

Videre, hvis du bruker hullete støttefilm (se Materialtabell) på EM-rutenett, må hullavstanden vurderes for oppsett av fokus- og sporingsområdet i forhold til eksponeringsområdet. Ideelt sett bør strålediameteren ved ønsket forstørrelse være liten nok til å dekke karbonområdet ved siden av eksponeringsområdet langs vippeaksen for optimalt og raskt oppsett. På denne måten kan potensielle regioner av interesse i hvert hull anskaffes.

Siden programvarens eusentriske høyderutine for øyeblikket ikke er like robust, for eksempel serialEM-rutinen, kan følgende tips omgå det problemet. Hvis den eusentriske høydebestemmelsen mislykkes ved hjelp av den eusentriske høydeforhåndsinnstillingen, kan man bruke oversiktsforhåndsinnstillingen i stedet og kjøre "Auto-eucentric by stage tilt"; Dette kan løse problemer hvis den eusentriske høyden er langt unna 0. Hvis dette lykkes, kan man kjøre "Auto-eucentric by stage tilt" med "Eucentric Height" forhåndsinnstillinger for å forbedre presisjonen. Hvis det mislykkes, kan man kjøre "Auto-Eucentric by beam tilt" med den eucentriske høyden forhåndsinnstilt og deretter kjøre "Auto-Eucentric by stage tilt" eller manuelt stille inn z-høyden konsolidert med "Auto-Eucentric by beam tilt" i TEM-brukergrensesnittet under "Stage" -innstillingene. I tilfelle rutenett med et repeterende mønster av hull brukes, kan de forhindre identifisering av en enkelt krysskorrelasjonstopp. Man kan prøve å endre den eusentriske høydeforhåndsinnstillingen til en lavere defokusforskyvning som -25 μm og / eller en kortere eksponeringstid for å redusere krysskorrelasjon fra hullmønstrene. På den annen side kan bruk av blondegitter / lamell ikke gi tilstrekkelig signal for en sterk krysskorrelasjonstopp. Man kan prøve å endre den eucentriske høydeforhåndsinnstillingen til en større defokusforskyvning som -75 μm og / eller en utvidet eksponeringstid for å forbedre krysskorrelasjonstoppen. Et annet alternativ er å justere innstillingene for bildefilter; de finner du i kategorien "Forberedelse". Alternativer for å justere filterinnstillingene kan angis for lav (Oversikt/rutenett), middels (Eusentrisk høyde) og høy forstørrelse (Sporing/fokus) for å finne den optimale krysskorrelasjonstoppen for hver forhåndsinnstilling. Den nødvendige inngangen er ett bilde, dvs. ved 0 ° og ett ved 5 °, etterfulgt av å klikke på Sammenlign for å sammenligne begge bildene. Anbefalt startverdi for den lengste bølgelengden er en fjerdedel av skalalinjen i bildet, og for den korteste bølgelengden er en førtiendedel av skalalinjen. Hvis toppen ikke er robust identifisert, kan man optimalisere innstillingene til en overbevisende topp kan bli funnet. Det er ikke nødvendig å skaffe bilder på nytt hver gang; bare å trykke på "Sammenlign" er nok. Hvis TOMO fortsatt ikke automatisk finner den eusentriske høyden, kan den manuelle eusentriske høydekalibreringen brukes. Man bør sentrere over en rimelig stor iskrystall i oversiktsforstørrelse i "Forberedelse" -fanen, deretter gå til "Stage control" i TEM-brukergrensesnittet, sett alfa til -30 °, og juster scenen z-verdien for å sentrere krystallet på nytt ved hjelp av det fluorescerende skjermbildet. Hvis du velger innstillingene "High Resolution" og "High Contrast" i TEM-brukergrensesnittet, blir dette enkelt (knapper nederst i det fluorescerende skjermvinduet). Eventuelt, hvis det er tilgang til et kamera med live-modus, kan dette brukes til å bestemme den eucentriske høyden; Det blir lettere enn på fluorescerende skjerm.

De største begrensningene i Tomo5-versjoner før 5.8 er de manglende mediumforstørrelsesmontasjene, manglende dosesymmetrisk skjema og problemer knyttet til eusentrisk høydefunn. Disse finnes i serialEM, et freeware med rask utvikling og samfunnsstøtte, en robust eusentrisk høyderutine og muligheten til å skripte, dvs. et spesialbygd dosesymmetrisk skjema. Fra versjon 5.8 og utover i Tomo5 har det vanligste problemet for å finne den eusentriske høyden, det vil si en mislykket løkke rundt målet z-verdien, blitt løst ved å implementere muligheten til å sette et eusentrisk høydeakseptkriterium. Med forskjellige rutenett og prøvetyper anbefales det imidlertid sterkt å justere innstillingene for bildefilteret for å gjenspeile de unike bildeforholdene for individuelle økter og for å gi best mulig krysskorrelasjonstopp for å finne den eusentriske høyden og for at fokus- og sporingsområdet skal fungere pålitelig under tomograminnsamling.

Samlet sett har mange anlegg raskt tilpasset seg fjerndrift under pandemien. Tomo5-programvaren gir en enkel tilgang og brukervennlig rute til tomografi som er godt egnet for fjernbetjening. Fremskrittene i programvaren vil uten tvil fortsette å gjøre eksterne datasamlinger og tomografiinnsamling generelt mer vanlig i samfunnet.

emClarity
Siden emClarity bruker en malbasert partikkelplukkingsmetode, trenger den en mal for objektet av interesse. Partikkelplukkingen (trinn 2.6) er svært følsom og nøkkelen til den endelige strukturen. Før gjennomsnitt og justering (trinn 2.9), må man sørge for å sjekke nøye og manuelt fjerne falske positiver. Når en mal ikke er tilgjengelig, kan det hende at emClarity ikke er enkel å bruke, men det er mulig å bruke annen programvare, for eksempel Dynamo37 og PEET48, for å lage en første modell.

For heterogene prøver er emClarity utstyrt med en klassifiseringsmetode som gjør det mulig for brukere å fokusere på spesifikke funksjoner med forskjellige skalaer. Det er nyttig å kjøre noen justeringssykluser før klassifisering og kjøre den ved en høyere binning (for eksempel bin 4 eller bin 3).

Den oppdaterte versjonen av programvaren (V1.5.3.11) har betydelige oppdateringer sammenlignet med den første versjonen (V1.0) 17. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, en håndkontroll under CTF-estimering (trinn 2.3); symmetri for justeringer (CX, I, I2, O); beregning av 3D-prøvetakingsfunksjoner per partikkel (3DSF); en bytte til MATLAB 2019a for kompatibilitet og stabilitet; og rekonstruksjon ved hjelp av råprojeksjonsbildene (cisTEM). Programvaren vil fortsette å forbedre seg for ulike eksempler, og de nyeste kunngjøringene finner du på nettet (se Materialfortegnelse).

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi anerkjenner Diamond Light Source for tilgang til og støtte av cryo-EM-fasilitetene ved Storbritannias nasjonale Electron Bio-Imaging Centre (eBIC), finansiert av Wellcome Trust, MRC og BBRSC. Vi vil også takke Andrew Howe for oppkjøpet av Apoferritin tomogram (Movie 1), Ishika Kumar for utarbeidelse og oppkjøp av neuron tomogram (Movie 2), og Craig MacGregor-Chatwin for Cyanobacteria lamella-tomogram (Movie 3).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Software
Tomography Thermo Fisher Scientific 5.9.0 Internal terminology: Tomo5 in document
TEM server Thermo Fisher Scientific 7.10.1
TIA Thermo Fisher Scientific 5.10.1
DigitalMicrograph Gatan 3.44
emClarity Open-Source software 1.5.3.11 Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging
IMOD Open-Source software 4.11 Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data
MotionCor2 Free for academic use 1.1.0 A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded
on dose fractionated movie stacks
ETomo Open-Source software 4.11 ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands. 
NoMachine NoMachine, freeware 7.9.2 Remote desktop software
TeamViewer TeamViewer AG - Remote access and remote control computer software
Materials
Quantifoil (holey support film) EM grids Quantifoil - A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement
Instrumentation
Titan Krios microscope Thermo Fisher Scientific Titan Krios G2
K3 camera and GIB energy filter Gatan -
Falcon 4 camera and Selectris X energy filter Thermo Fisher Scientific -
Website
Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/ - - Link to download the emClarity software package
Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/ - - Link to download IMOD
Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial - - Link to the emClarity online tutorial
Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software - - Link to download MotionCor2
Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki - - Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bai, X. -C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2, 00461 (2013).
  2. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  3. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  4. Kato, T., et al. CryoTEM with a cold field emission gun that moves structural biology into a new stage. Microscopy and Microanalysis. 25, 998-999 (2019).
  5. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  6. Mastronarde, D. N. SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position. Microscopy and Microanalysis. 9, 1182-1183 (2003).
  7. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  8. Deng, Y., et al. Smart EPU: SPA getting intelligent. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 454-455 (2021).
  9. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  10. Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
  11. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  12. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
  13. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166 (2018).
  14. Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. New tools for automated cryo-EM single-particle analysis in RELION-4.0. Biochemical Journal. 478 (24), 4169-4185 (2021).
  15. Galaz-Montoya, J. G., Flanagan, J., Schmid, M. F., Ludtke, S. J. Single particle tomography in EMAN2. Journal of Structural Biology. 190 (3), 279-290 (2015).
  16. Bharat, T. A. M., Scheres, S. H. W. Resolving macromolecular structures from electron cryo-tomography data using subtomogram averaging in RELION. Nature protocols. 11 (11), 2054-2065 (2016).
  17. Himes, B. A., Zhang, P. emClarity: Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Nature Methods. 15 (11), 955-961 (2018).
  18. Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM. Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
  19. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
  20. Orlova, E. V., Saibil, H. R. Structural analysis of macromolecular assemblies by electron microscopy. Chemical Reviews. 111 (12), 7710-7748 (2011).
  21. Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).
  22. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction of electron tomograms with deep learning. bioRxiv. , (2021).
  23. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ-The potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
  24. Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
  25. Allegretti, M., et al. In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover. Nature. 586 (7831), 796-800 (2020).
  26. Wang, Z., et al. The molecular basis for sarcomere organization in vertebrate skeletal muscle. Cell. 184 (8), 2135-2150 (2021).
  27. Winey, M., Meehl, J. B., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. Conventional transmission electron microscopy. Molecular Biology of the Cell. 25 (3), 319-323 (2014).
  28. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (34), 14121 (2011).
  29. Wagner, J., Schaffer, M., Fernández-Busnadiego, R. Cryo-electron tomography-The cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).
  30. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  31. Erdmann, P. S., et al. In situ cryo-electron tomography reveals gradient organization of ribosome biogenesis in intact nucleoli. Nature Communications. 12 (1), 5364 (2021).
  32. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  33. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  34. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  35. Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: Image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 3-18 (2007).
  36. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  37. Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: A flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of Structural Biology. 178 (2), 139-151 (2012).
  38. Hrabe, T., et al. PyTom: A python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of Structural Biology. 178 (2), 177-188 (2012).
  39. Himes, B. A. emClarity. GitHub. , (2021).
  40. Mastronarde, D. N. The IMOD Home Page. , Available from: https://bio3d.colorado.edu/imod/ (2020).
  41. Frosio, T. GitHub: emClarity-tutorial. , Available from: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial (2021).
  42. Ni, T., et al. High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity. Nature Protocols. 17 (2), 421-444 (2022).
  43. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. -P., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2. , Available from: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software (2016).
  44. Mills, D. J., Pfeil-Gardiner, O., Vonck, J. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution. , Available from: https://www.emdataresource.org/EMD-10101 (2022).
  45. Nedozralova, H., et al. In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development. Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086 (2022).
  46. Mendonça, L., et al. Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress. Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).
  47. Vonck, J., Pfeil-Gardiner, O., Mills, D. J. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution. , Available from: https://www.rcsb.org/structure/6s61 (2019).
  48. Nicastro, D., et al. The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).

Tags

Biologi utgave 185
Kryo-elektrontomografi ekstern datainnsamling og subtomografi gjennomsnitt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J.,… More

Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging. J. Vis. Exp. (185), e63923, doi:10.3791/63923 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter