Summary
De fleste svømmende fotoautotrofe organismer viser fotoinducerede adfærdsændringer (fotoadfærd). Den nuværende protokol observerer den nævnte fotoadfærd i modelorganismen Chlamydomonas reinhardtii.
Abstract
For overlevelsen af de bevægelige fototrofe mikroorganismer er det afgørende at være under ordentlige lysforhold. Derfor viser de fotoinduceret adfærd (eller fotoadfærd) og ændrer deres bevægelsesretning som reaktion på lys. Typiske fotoadfærd inkluderer fotoshock (eller fotofobisk) respons og fototaxis. Photoshock er en reaktion på en pludselig ændring i lysintensitet (f.eks. Flashbelysning), hvor organismer forbigående holder op med at bevæge sig eller bevæger sig baglæns. Under fototaxi bevæger organismer sig mod lyskilden eller i modsat retning (kaldet henholdsvis positiv eller negativ fototaxi). Den encellede grønne alge Chlamydomonas reinhardtii er en fremragende organisme til at studere fotoadfærd, fordi den hurtigt ændrer sit svømmemønster ved at modulere slag af cilia (alias flagella) efter fotoreception. Her vises forskellige enkle metoder til at observere fotoadfærd i C. reinhardtii. Forskning i C. reinhardtiis fotoadfærd har ført til opdagelsen af fælles reguleringsmekanismer mellem eukaryote cilier og channelrhodopsiner, som kan bidrage til en bedre forståelse af ciliopathier og udvikling af nye optogenetiske metoder.
Introduction
Lys er en uundværlig energikilde for fotosyntetiske organismer, men for meget lys kan forårsage foto-oxidativ skade. Således skal fototrofe organismer overleve under moderat intensitetslys, hvor de kan fotosyntetisere, men ikke lide foto-oxidativ skade1. I landplanter kan kloroplaster ikke bevæge sig ud fra bladet og vise fotobevægelser i cellen; kloroplaster bevæger sig til periferien af cellen under højt lys og celleoverfladen under svagt lys2, mens mange bevægelige alger viser fotoadfærd, der giver dem mulighed for at finde ordentlige lysforhold for fotosyntese og dermed lette deres overlevelse3.
Chlamydomonas reinhardtii er en encellet grøn alge, der betragtes som en modelorganisme inden for forskningsområder som cilia (alias flagella), fotosyntese og fotoadfærd. C. reinhardtii præsenterer med en øjenpotte og to cilia pr. celle, der anvendes til henholdsvis fotoreception og svømning. Eyespot har to komponenter: channelrhodopsiner (ChR'er), lys-gated ionkanaler i plasmamembranen og de carotenoidrige granulatlag placeret lige bag ChR'erne. Eyespot fungerer som en retningsbestemt lysreceptor, da de carotenoidrige granulatlag fungerer som en lysreflektor 4,5.
ChR'er blev oprindeligt identificeret som fotoreceptorer, der forårsagede fotoadfærd i C. reinhardtii 6,7,8,9. Selvom to isoformer, ChR1 og ChR2, findes i øjenpotten, viste knock-down eksperimenter, at ChR1 er den primære fotoreceptor for fotoadfærd10. På trods af dette har ChR2 fået mere opmærksomhed og spillet en central rolle i udviklingen af optogenetik, en teknik til at kontrollere celle excitation ved lys11. Derfor vil undersøgelse af reguleringsmekanismerne for fotoadfærd i C. reinhardtii fremme forståelsen af ChR-funktion og forbedre optogenetik.
Efter fotoreception viser C. reinhardtii-celler to typer fotoadfærd: fototaxis og fotoshock respons12. Fototaxis er opførelsen af celler, der svømmer i retning af lyskilden eller den modsatte retning, kaldet henholdsvis positiv eller negativ fototaxis. Fotoshock-respons er en adfærd, som celler viser efter at have registreret en pludselig ændring i lysintensiteten, såsom når den oplyses af en flash. Celler holder op med at svømme eller svømme baglæns (dvs. svømme med cellelegemet fremad) i en kort periode, typisk <1 s.
Ciliære bevægelser i C. reinhardtii er involveret i dens fotoadfærd. To cilia slår normalt som et menneskes brystsvømning, og dette er moduleret til fotoadfærd. For fototaxis er de kræfter, der genereres af de to cilier, ubalanceret ved modulering af slagfrekvensen og bølgeformamplituden for hvert cilium13. Cilium tættest på øjenpotten kaldes cis cilium, og den anden kaldes trans cilium. Disse to cilia adskiller sig på forskellige punkter. For eksempel er ciliary slagfrekvensen af trans cilium in vitro 30% -40% højere14. Derudover er deres Ca2+ følsomhed anderledes. Reaktivering af demembranerede cellemodeller15 viste, at cis-cilium slår stærkere end transcilium for Ca2+ <1 x 10-8 M, mens det modsatte er tilfældet for Ca2+ >1 x 10-7 M. Denne asymmetri i Ca2+ følsomhed er muligvis vigtig for fototaktiske sving, da mutanter, der mangler denne asymmetri, ikke udviser normal fototaxa16,17. Omvendt er bølgeformkonvertering nødvendig for fotoshock. Den ciliære bølgeform forvandler sig fra den asymmetriske bølgeform i fremad svømning til den symmetriske bølgeform i bagudsvømning. Denne bølgeformkonvertering reguleres også af Ca2+, ved en tærskel på 1 x 10-4 M18,19. Da defekter i reguleringen af ciliære bevægelser forårsager primær ciliær dyskinesi hos mennesker, kan undersøgelse af fotoadfærd i C. reinhardtii hjælpe med bedre forståelse af disse sygdomme og terapeutiske udviklinger20.
Heri demonstreres fire enkle metoder til at observere fotoadfærd i C. reinhardtii . For det første vises et fototaxisassay ved hjælp af petriskåle, og for det andet et fototaxisassay mod cellesuspensionsdråber. Fænomenet observeret i begge tilfælde er ikke strengt fototaxis, men fotoakkumulering, hvor cellerne har tendens til at akkumulere tæt på lyskildesiden eller den modsatte side. I C. reinhardtii er fotoakkumulering hovedsageligt forårsaget af fototaxis på en måde, der kan bruges som en tilnærmelse til fototaxis. For det tredje vises et strengere assay for fototaxis under et mikroskop, og sidst er et fotoshock-assay under et mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denne undersøgelse blev en vildtypestamme af Chlamydomonas reinhardtii, et afkom af korset CC-124 x CC-125 med agg1+mt-, anvendt21. CC-124 og CC-125 blev opnået fra Chlamydomonas Resource Center (se materialetabel) og opretholdt på et Tris-acetatphosphat (TAP)22, 1,5% agarosemedium ved 20-25 °C. Enhver bevægelig stamme kan bruges til denne protokol.
1. Cellekultur
- Kultur en stamme af interesse for Chlamydomonas reinhardtii i TAP flydende medium med beluftning ved boblende steril luft i en 12 h / 12 h lys-mørk periode (lys periode, ~ 50 μmol fotoner · m- 2 · s - 1 hvidt lys) ved 20-25 ° C i 2 dage.
BEMÆRK: Celler i en midtlogaritmisk vækstfase skal anvendes. Lang kultur (>3 dage i den sene logaritmiske vækstfase) gør cellerne mindre følsomme over for lysstimuleringen og øger antallet af døde celler i kulturen, hvilket forhindrer udlæsning af resultater.
Figur 1: Flydende kultur efter 2-dages dyrkning. Fra en TAP-1,5% agarplade blev en del af vildtypeceller, der fyldte platinsløjfen, podet i ~ 150 ml TAP-flydende medium i en kolbe. Celletætheden efter 2-dages dyrkning var ~ 5,0 x 106 celler / ml. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Forbehandling af celler
- Bland ~ 10 μL af kulturen med et lige stort volumen decileringsopløsning for at forhindre cellerne i at svømme og måle celletætheden ved hjælp af en celletæller eller hæmocytometer.
BEMÆRK: Der er ca. 1-5 x 106 celler / ml efter en 2 dages kultur (figur 1). Sammensætningen af decileringsopløsningen er som følger23: 40 mM kaliumacetat, 1 mMCaCl2, pH 4,5 justeret med HCI. - Centrifuger den nødvendige mængde væskekultur ved 1000 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Et eksperiment kræver 3 ml 2 x 107 celler / ml for standardbetingelser for fototaxasassay i en petriskål. Hvis der skal udføres to eksperimenter med 1 x 106 celler / ml kultur, skal 120 ml kultur centrifugeres. - Suspender cellepillen med den nødvendige mængde fotobehavior eksperimentel opløsning til ~ 2 x 107 celler / ml (til skålfototaxisassay) eller 1 x 106 celler / ml (til fototaxisassay på celleniveau eller fotoshock response assay) og sæt cellesuspensionen i et konisk rør.
BEMÆRK: Celletæthed behøver ikke at blive kontrolleret meget strengt for en grov estimering af fotoadfærd eller kan ændre sig afhængigt af formålet med analysen. Fotoadfærd eksperimentel opløsning14: 5 mM HEPES (pH 7,4), 0,2 mM EGTA, 1 mM KCl, 0,3 mM CaCl2. Dette bufferudvekslingstrin kan udelades for et simpelt assay om evnen til at udvise fotoadfærd, og eksperimentet kan udføres med kulturmediet. Men fordi opløsningens ioniske sammensætning påvirker fototaktiske tegn24, og mediets ioniske sammensætning efter dyrkning muligvis ikke er konstant, anbefales det at anvende denne opløsning til et strengere assay. Udskiftning med frisk TAP-medium kan være en mulighed. - Anbring røret under svagt rødt lys (10-30 μmol fotoner · m-2 · s-1) i ~ 1 time (figur 2).
BEMÆRK: Dette trin øger cellernes følsomhed over for lysstimuleringen.
Figur 2: Celleophæng under rødt lys. Et regelmæssigt fluorescerende hvidt lys dækket med et ark rød cellofan. Et rør indeholdende cellesuspensionen placeres under ~ 10 μmol fotoner · m-2 · s- 1 rødt lys. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Fototaxis assay ved hjælp af petriskålen (såkaldt "skålassay")
- Sæt 2-3 ml celleophæng i en petriskål (3,5 cm), læg den på en lyskasse (alternativt et hvidt ark papir eller en hvid plastplade), ryst forsigtigt for at fordele cellerne ensartet og få et billede før belysning.
BEMÆRK: Skålens størrelse kan ændre sig afhængigt af formålet. Afhængigt af stammen og kulturens tilstand kan cellerne holde sig til bunden af petriskålen. I et sådant tilfælde skal de fastlåste celler fjernes ved pipettering før analysen. - Oplys fadet fra den ene side med en grøn lysdiode (LED, se Materialetabel) i et skrivebordsmørkammer (figur 3).
BEMÆRK: Typiske lysforhold er λ = 525 nm og 50-100 μmol fotoner·m−2·s−1. Se diskussionen om valg af lyskildebølgelængde i diskussionsafsnittet. Dæk både opvasken og LED'en med en kasse eller sort klud, når der bruges en lille LED. - Lad dem stå i ≥5 min og derefter erhverve billeder.
BEMÆRK: Tidspunktet for lysbelysning kan ændres afhængigt af petriskålens størrelse eller formål (figur 4). - Importer billedfilen til Fiji (se Materialetabel) til kvantificering.
BEMÆRK: Fiji er en distribution af ImageJ2, der samler mange plugins. - Skift farvebilledet til gråtoner via Billede > Type > 8-bit (Figur 5).
- Vend sort og hvid gennem Rediger > Inverter.
- Omgiv hele skålen som en interesseregion (ROI), og mål densiteten gennem Analyser > måle.
BEMÆRK: Tætheden af den samlede skål kan beregnes som (Areal) x (Middel). - Omgiv halvdelen af skålen tættest på lyskilden som en ROI og mål densiteten.
- Beregn det fototaktiske indeks som (tæthed af fototaktiske celler) pr. (tæthed af samlede celler).
Figur 3: Sidebelysning til fototaxis fadassay. (A) En petriskål indeholdende en celleophæng anbragt på en lyskasse i et skrivebordsmørrum. Grønt lys (525 nm LED-plade, ~ 100 μmol fotoner · m - 2 · s - 1) oplyst fra siden. B) Alternativ belysningsmetode. En 5 mm kanonkugle-type LED. (C) For at blokere lys udefra kan en kasse med en sort klud på indersiden bruges i stedet for et skrivebordsmørkammer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Eksempel på negativ fototaxi efter 5 min sidebelysning. (A) Celleophæng af vildtype i en petriskål oplyst i 5 min. De fleste celler akkumuleres på den modsatte side af lyskilden. Disse data kan fortolkes som negativ fototaxa. (B) Billede af skålen fra toppen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kvantificering af skålens fototaxisassay. Et eksempel på celler, der viser negativ fototaxa (lyskilden er på højre side). Farvebilledet konverteres til en gråtonetone (trin 3.5) og inverteres derefter (trin 3.6). Interesseområder (ROI), hele skålen (trin 3.7.) og skålens lyskildeside (trin 3.8.) blev afgrænset. Tætheden af hver ROI blev målt (trin 3.9.). I dette tilfælde er det fototaktiske indeks (PI) ca. 0,18 ([1,512 x 11,671] / [2,970 x 26,077]). PI er 1 eller 0, når alle celler viser henholdsvis positiv eller negativ fototaxa. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Fototaxis assay ved hjælp af cellekulturdråber
- 25 μL cellesuspensionsdråber (trin 2.4) anbringes direkte på en hvid plastplade ved hjælp af en mikropipette.
- Oplys dråberne fra den ene side med en grøn LED i et skrivebordsmørkammer (figur 6).
BEMÆRK: Typiske lysforhold er λ = 525 nm og 50-100 μmol fotoner m-2 s-1. Dæk både plader og LED med en kasse eller en sort klud, når der bruges en lille LED. - Lad dem stå i 3 minutter, og indhent derefter billeder.
BEMÆRK: Dette assay er velegnet til en hurtig kontrol af fototaxis af mange prøver på én gang, såsom i mutant screening eller tetradanalyse. En cellekultur i midten af logfasen dyrket i en 96-brøndplade kan belyses direkte for lettere ydeevne. I begge tilfælde kan trin 2 (celleforbehandling) udelades.
Figur 6: Dråbefototaxis assay. (A) Ni dråber af en 25 μL celleophæng placeret på en hvid plastplade og oplyst fra siden af en grøn LED. (B) Efter 3 minutters belysning. I hver dråbe akkumulerede celler enten på lyskildesiden (positiv fototaxis), akkumuleret på den modsatte side (negativ fototaxis) eller diffunderet ind i dråben (ingen fototaxis). Skalabjælke = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Fototaxis assay under et mikroskop
- Tag ~ 30 μL cellesuspension (1 x 106 celler / ml i fotoadfærd eksperimentel opløsning) på et glasglas og læg en dækslip (18 mm x 18 mm) med afstandsstykker ovenpå (figur 7).
BEMÆRK: Afstandsstykkerne kan laves med hvid petroleum eller dobbeltklæbende tape på to modsatte sider af en dækslip. Lyset skal komme fra en retning, hvor der ikke er afstandsstykker. - Belys prøven fra den ene side af dækslen uden en afstandsstykke med en grøn LED, og observer cellerne under et mørkt feltmikroskop med en 10x objektiv linse under svagt rødt lys (λ > 630 nm, ~ 5 μmol fotoner · m - 2 · s - 1, figur 8).
BEMÆRK: Undgå at udsætte cellerne på scenen for andet lys end LED eller observationslys, såsom rumbelysning eller lys fra en pc-skærm. Den passende forstørrelse af et objektivglas afhænger af kameraets synsvinkel. Vælg et objektiv med en forstørrelse, der gør det muligt for cellen at svømme i ~2 s uden at forlade synsfeltet. For at spore celler er et billede med høj kontrast ønskeligt; således anbefales brugen af en mørkfeltkondensator til mikroskopisk observation. Imidlertid kan andre kondensatorer, såsom lysfelt, bruges til at observere fototaxa. Sørg for, at lyset fra LED skinner på cellerne. - Optag cellebevægelse i ~ 20 s efter lysbelysning ved hjælp af et kameraudstyret mikroskop.
BEMÆRK: Et par sekunder efter starten af grøn LED-belysning kan der forekomme et fotoshock-svar, og / eller den fototaktiske orientering (eller tegn) er ikke stabil; således anbefales en 20 s optagelse til responsstabilisering (film 1).
Figur 7: Fremstilling af afstandsstykker på dækslipkanter. (A) Et tyndt lag vaseline blev påført håndfladen. En lille mængde hvid petroleum blev skrabet af med kanten af en dækslip. (B) En afstandsstykke på kanten af en dækslip. (C) En anden afstandsstykke på den modsatte kant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Sidebelysning under mikroskop. (A) Opsætning af en grøn LED. En grøn LED af kanonkugletypen er fastgjort til muffen og fastgjort til stativet ved siden af mikroskopet. Celler blev observeret under et mørkt feltmikroskop med et skarpt skåret filter (λ > 630 nm). (B) Sidebelysning af den grønne LED. Klik her for at se en større version af denne figur.
Film 1: Fototaxis assay under et mikroskop. Grønt lys tændt ved ~ 0 s fra højre. På det tidspunkt havde celler en tendens til at svømme i en tilfældig retning. Efter 0 s i tidstælleren svømmede celler enten til højre eller venstre og viste positiv eller negativ fototaxi. Lyset blev slukket ved ~ 15 s, da cellerne begyndte at svømme i en tilfældig retning igen. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at downloade denne film.
6. Sporing af fototaktiske celler og polær histogramtegning
- Uddrag 1,5 s fra den optagede video, startende 15 s efter belysning.
BEMÆRK: Banevarigheden kan ændre sig afhængigt af cellens svømmehastighed. En 1.5 s video indeholder 46 billeder ved 30 fps optagelse. - Importer filen til Fiji som en tagbilledfilformatbilledsekvens via File > Import > Image Sequence.
- Kør pluginet "Manuel sporing" til cellesporing ved hjælp af plugins > sporing > manuel sporing.
- Klik på Tilføj spor, og den første ramme vises.
- Klik på en celle af interesse, og den anden ramme vises.
- Flyt skyderen til den sidste ramme, og klik på den samme celle som i trin 6.5.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at spore celler i hver ramme. Kun vinklen mellem lysaksen og linjesegmentet dannet af start- og slutpunkterne er afgørende. - Gentag trin 6.4.-6.6. for ~ 30 celler.
BEMÆRK: Vælg celler, der forbliver inden for synsvinklen i hele 1,5 s. Hvis celletætheden er tilstrækkelig lav, og ingen cellesvømmebaner skærer hinanden i 1,5 s, kan automatisk sporing udføres. I så fald skal du vælge pluginet "MTrack2" (typiske indstillinger: Minimum objektstørrelse = 1; Maksimal objektstørrelse = 10.000; Maksimal hastighed = 100; Mindste hæftelængde [rammer] = 46). Det anbefales at verificere korrespondancen mellem celler på videoen og sporingsresultaterne ved at hente dataene ved at markere Vis tekst? > Overlay Dots &Lines. - Kopier og indsæt resultaterne i regnearkssoftware (f.eks. Excel).
BEMÆRK: Heri vises, hvordan man tegner et polært histogram med Excel. - Mål vinklen mellem lysaksen og svømmeretningen af en celle ved "= grader (atan2 (x2-x1), -(y2-y1))", hvor cellens startposition (udsnit # 1) er (x1, y1), og den sidste position (skive # 46) er (x2, y1).
BEMÆRK: På et Fiji-billede er det øverste venstre hjørne oprindelsen (0, 0). - Gentag trin 6.9. for alle de målte celler (typisk ~30 celler).
- Forbered en frekvensfordelingstabel for alle data opnået med beholderne fra -180° til +180°, opdelt i 15° i begge ender og 30° for resten af området ved hjælp af funktionen "FREKVENS".
BEMÆRK: Når du har valgt kolonnerne med det samme til placeringskolonnerne, skal du indtaste følgende i den øverste kolonne = FREKVENS (data_array, bins_array) og trykke på shift + ctrl + enter (Supplerende figur 1). - Genskabe en frekvensfordelingstabel med de værdier, der er beregnet i trin 6.8. roteret -90° for at indstille højre side til 0° (dvs. konvertere tallet i området fra -15° til 15° til området fra -105° til -75°), da celler, der svømmer opad, med ovenstående metode anses for at svømme i en vinkel på 0° til lyset (dvs. viser positiv fototaxa), selvom lyset kommer fra højre (supplerende figur 2).
- Indtast vinkelværdien i midten af området for en 30° beholder (f.eks. 30° for 15°-45°), spring en kolonne over, og indtast det tilsvarende prøveantal til højre (supplerende figur 3).
- Konverter hver prøvetællingsværdi til en procentdel, og angiv 0 i den kolonne, der svarer til den tomme kolonne mellem placeringer.
- Tegn et radardiagram ved hjælp af vinkelværdierne som de vandrette akseetiketter og de procentvise (%) værdier som forklaring (supplerende figur 4).
- Beregn det fototaktiske indeks (PI) til yderligere kvantificering ved at beregne gennemsnittet af cosθ (θ = vinklen mellem lysaksen og svømmeretningen)16.
BEMÆRK: PI er 0, når celler svømmer i en tilfældig retning og 1 eller -1, når 100% af cellerne viser henholdsvis positiv eller negativ fototaxa.
7. Fotoshock respons assay under et mikroskop
- Anbring ~30 μL cellesuspension (1 x 106 celler/ml i den fotobehavior eksperimentelle opløsning) på et glasglas, og anbring en dækslip (18 mm x 18 mm) med afstandsstykker ovenpå, som i trin 4.1.
- Overhold cellerne under et mikroskop med svagt rødt lys (λ > 630 nm, ~ 5 μmol fotoner · m-2 · s-1).
- Påfør blitzbelysning ved hjælp af en kamerablitz (film 2,3).
BEMÆRK: En anden måde at fremkalde et fotoshock-svar på er hurtigt at fjerne et rødt filter manuelt fra observationslysstien. Denne metode er dog mere variabel, da hastigheden af filterfjernelse varierer fra person til person (film 4,5). - Optag cellebevægelse ved hjælp af et kameraudstyret mikroskop.
- Til kvantificering skal du udføre et eller begge af følgende: (1) beregne forholdet mellem celler, der viser fotoshock-responsen pr. Samlede celler16; (2) for celler, der viser fotoshock-responsen, måles tiden fra fotoshock-stimulansen til genopretning af fremadsvømning25.
Film 2: Fotoshock belysning af en kamerablitz. Kamerablitzen blev holdt op til mikroskopstadiet og tændt. Klik her for at downloade denne film.
Film 3: Fotoshock respons forårsaget af en flash under et mikroskop. Celler blev observeret under svagt rødt lys. En flash blev udsendt ved ~ 0 s. Næsten alle celler stoppede fremad svømning, svømmede baglæns i en kort periode og kom sig fremad svømning. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at downloade denne film.
Film 4: Fotoshock-respons forårsaget af fjernelse af et rødt filter under et mikroskop. Celler blev observeret under svagt rødt lys. Det røde filter blev fjernet ved ~ 5 s. Næsten alle celler stoppede fremad svømning, svømmede baglæns i en kort periode og kom sig fremad svømning. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at downloade denne film.
Film 5: Fjernelse af et rødt filter. Hurtig fjernelse af et rødt filter indstillet i lysstien for at levere fotoshock. Klik her for at downloade denne film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiske C. reinhardtii fototaxaer og fotoshock respons assays er vist her. Efter celletæthedsestimering blev vildtypecellekultur (et afkom af krydset CC-124 × CC-125 med agg1+ mt -)23 vasket med fotoadfærd eksperimentel opløsning til fototaxis skålassay. Cellesuspensionen blev anbragt under svagt rødt lys i ~ 1 time. En 2 ml celle suspension blev anbragt i en 3,5 cm petriskål. Petriskålen blev rystet forsigtigt, sat på en lyskasse og fotograferet med et kamera fastgjort på et stativ. Cellerne viste klar negativ fototaxis i dette tilfælde (dvs. celler akkumuleret til den modsatte side af lyskilden) (figur 4B).
Fototaxasen og fotoshock responsassays under et mikroskop blev udført i et mørkt rum for at undgå lysinterferens. En anden vildtypestamme, CC-125, som viser positiv fototaxase, blev brugt til disse assays26. Til fototaxas-analysen udføres optagelsen normalt i ~ 25 s. Cellernes baner blev sporet fra hver celles position ved 15 s til den ved 16,5 s af Fiji.
Fotoshock-responsanalysen blev udført ved hjælp af en kamerablitz. Næsten alle celler udviste fotoshock-responsen, svømmede baglæns i en kort periode (~ 0,3 s) og genvandt fremad svømning (film 3). For at kvantificere dataene fra denne film blev der fulgt to metoder (se tidligere offentliggjorte rapporter16,25): beregning af procentdelen af celler, der viser fotoshock-respons blandt alle celler16, og måling af tiden fra begyndelsen af hver celles bagudsvømning til genopretning af fremadgående svømning25. Afhængigheden af disse værdier af lysintensitet kan verificeres ved at placere neutral densitetsfiltre (ND) mellem lyskilden og prøven16.
Supplerende figur 1: Frekvensfordelingstabel. Kolonne A viser eksempelnummeret, og kolonne B viser vinklen i trin 6.6. Kolonne D viser skraldespandene (12 placeringer på 30°). Kolonne E viser vinkelområdet pr. placering som reference. Når du har valgt F2-F14, indtastes FREKVENS-funktionen i F2 som vist i fx-vinduet, og Shift + Ctrl + Enter trykkes for at forberede frekvensfordelingstabellen. Summen (F15) skal være lig med det samlede antal prøver i kolonne A. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Datarotation. For at matche retningen af de polære histogrammer med den faktiske retning af lysbelysning (fra højre) roteres beholdernes vinkler i frekvensfordelingstabellen med -90°. For eksempel skifter prøveantallet i området 165°-135° (F3) til 75°-45° (I6). Tællingerne i intervallerne 180°-165° (F2) og −165°-−180° (F14) kombineres til det nye område 105°-75° (I5). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Indstilling af nye beholdere til tegning af polarhistogrammet. Omdøb placeringerne ved hjælp af den midterste værdi af hver 30°-placering (kolonne K: omdøb f.eks. beholderen til 165°-−165° til −180°). Radardiagrammet i Excel er sat op med den første placering ved 90°. Skift antallet af stikprøver (kolonne L) til en procentdel (kolonne M) for at sammenligne forskellige data uanset antallet af prøver. Indtast 0 mellem hvert datum (f.eks. M3, M5, M7...) for at repræsentere værdierne for hver placering som en linje i radardiagrammet. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 4: Radardiagram, der repræsenterer et polært histogram til et fototaxisassay. Tegn et radardiagram ved hjælp af placeringerne (kolonne K) som vandrette aksenavne og procentværdierne (kolonne M) som en forklaring. Et typisk polært histogram, der viser procentdelen af CC-125-celler, der bevæger sig i en bestemt retning i forhold til lys oplyst fra højre (0°) (12 bakker på 30°; n = 30 celler). Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende protokol er let og ikke tidskrævende. Hvis en C. reinhardtii-mutant mistænkes for at præsentere defekter i fotoreception eller ciliær bevægelse, kan denne metode tjene som primær fænotypisk analyse.
Der findes dog nogle kritiske trin. Den ene er at bruge celler i eksperimentet i den tidlige til midterste vækstfase. Efter dyrkning i lange perioder bliver cellerne mindre bevægelige, mindre lysfølsomme og danner endda palmelloider (celleklumper)27. Et andet vigtigt skridt er at udsætte cellerne for det røde lys før eksperimentet (trin 2.4.). Celler udviser høj lysrespons og bevægelighed ved at undgå ChR-stimulering, samtidig med at fotosyntetisk aktivitet opretholdes. Celleobservation under et mikroskop skal bekræfte, at lyset skinner på cellerne. Især når du bruger en lille, meget retningsbestemt LED, kan en lille afvigelse af den optiske akse forhindre lyset i at belyse cellerne.
En klar ulempe ved skålen og dråbefototaxis assays er, at de er ret kvalitative. Selv om resultaterne kan kvantificeres, som vist i trin 3.4.-3.9., kan andre fænomener end fototaxa påvirke resultaterne. For eksempel kan celler klæbe til tallerkener eller plastplader afhængigt af kulturforhold eller skålen / tallerkenmaterialet. Der skal derfor udvises forsigtighed, hvis data tyder på ingen eller dårlig fototaxa. Det er vigtigt at vælge den passende metode i henhold til formålet, fordi disse metoder viser den store fordel ved enkelhed.
Disse metoder er bemærkelsesværdige, fordi de er lette og enkle. Flere sofistikerede metoder er tilgængelige til at vurdere fotoadfærd i Chlamydomonas28 eller Euglena29. De kan dog være vanskelige at udføre i mange laboratorier. De metoder, der er beskrevet her, kræver ikke et specielt mikroskop, men en billig LED eller en kamerablitz. På grund af denne enkle indstilling er metoderne også meget alsidige. For eksempel for at studere effekten af lysintensitet på fotoadfærd kan ND-filter placeres mellem lyskilden og prøven16. For at undersøge adfærdens handlingsspektrum kan farven på LED-lyskilden udveksles30.
Begrundelsen for at bruge grønt lys (λ = 525 nm) til fototaxisassays er, at den maksimale absorptionsbølgelængde for ChR1, fotoreceptoren til fototaxis, er ~ 485 nm, tæt på absorptionstoppen af klorofyl b ved ~ 470 nm10,31. Da en ændring i fotosyntetisk aktivitet kan påvirke fototaktiske tegn, anbefales det at bruge grønt, da det kan absorberes af ChR1, men ikke så godt af klorofyl32. Men hvis kun fototaktisk evne testes, kan blåt lys bruges som lyskilde i stedet. For at undersøge tidsmæssige ændringer i fotosyntetisk aktivitet over fototaktiske tegn anbefales det at anvende en hvid lyskilde indeholdende bølgelængdeområdet mellem 425-550 nm, som absorberes godt af ChR1.
Fototaktiske tegn reguleres af cellulære reaktive iltarter (ROS). Når ROS akkumuleres, viser celler positiv fototaxase, og når de er udtømt, viser celler negativ fototaxi26. Membranpermeable ROS-reagenser eller ROS-rensningsreagenser inducerer henholdsvis positiv eller negativ fototaxa. Typisk anvendesH2O2eller t-BOOH som ROS-reagenser, mens dimethylthiourea (DMTU) anvendes som en ROS-scavenger. Således kan et fototaktisk assay i disse reagenser bruges til at screene for mutanter med defekter i fototaxas tegnskift, som kan vedrøre defekter i fotoreception eller ROS-relateret metabolisme 4,21,33.
Fotoshock-svar er forårsaget af Ca2+ tilstrømning fra spidsen af cilia via spændingsafhængige Ca2+ kanaler efter ciliary waveform konvertering18,34. Selvom den Ca2+-afhængige bølgeformkonvertering af cilier er fælles for mange eukaryote organismer, er dens molekylære mekanisme endnu ikke fuldt ud forstået35. Hvis en C. reinhardtii mutant viser defekter i fotoshock respons, men normal fototaxis, ville det foreslå normal fotoreception evne. Kort sagt kan det hurtige og enkle assay for fotoshock-responsen vist her hjælpe med at forstå den fælles molekylære mekanisme for ca2 +-afhængig bølgeformkonvertering i eukaryote cilier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) til NU (19K23758, 21K06295), TH (16H06556) og KW (19H03242, 20K21420, 21H00420), fra Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) til KW og fra Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) til NU, TH og KW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| 5 mm Cannonball green LED | Optosupply | OSPG5161P | |
| 50 mL conical tube | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| AC adaptor for the light box | ATTO | 2196161 | |
| Auto cell counter | DeNovix | CellDrop BF | |
| CaCl2 | Nakalai tesque | 06731-05 | |
| Camera flash | NEWWER | TT560 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| C-mout CCD camera | Wraymer | 1129HMN1/3 | |
| Desktop darkroom | Scientex | B-S8 | |
| Digital still camera | SONY | RX100II | |
| EGTA | Dojindo | G002 | |
| Fiji | https://fiji.sc/ | ||
| Green LED plate | CCS | ISLM-150X150-GG | |
| HCl | Fujifilm WAKO | 080-01066 | |
| HEPES | Dojindo | GB70 | |
| KCl | Nakalai tesque | 238514-75 | |
| Lightbox (Flat viewer) | ATTO | 2196160 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Petri dish (φ3.5 cm) | IWAKI | 1000-035 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Power supply for the green LED plate | CCS | ISC-201-2 | |
| Red filter | Shibuya Optical | S-RG630 |
References
- Demmig-Adams, B., Adams, W. W. Photoprotection and other responses of plants to high light stress. Annual Reviews Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 43, 599-626 (1992).
- Wada, M.
- Sgarbossa, A., Checcucci, G., Lenci, F.
- Ueki, N., et al. Eyespot-dependent determination of the phototactic sign in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5299-5304 (2016).
- Foster, K. W., Smyth, R. D.
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Sineshchekov, O. A., Jung, K. -H., Spudich, J. L. Two rhodopsins mediate phototaxis to low- and high-intensity light in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (13), 8689-8694 (2002).
- Suzuki, T., et al. Archaeal-type rhodopsins in Chlamydomonas: model structure and intracellular localization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 711-717 (2003).
- Berthold, P., et al. Channelrhodopsin-1 initiates phototaxis and photophobic responses in Chlamydomonas by immediate light-induced depolarization. Plant Cell. 20 (6), 1665-1677 (2008).
- Deisseroth, K., et al. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. Journal of Neuroscience. 26 (41), 10380-10386 (2006).
- Wakabayashi, K., Isu, A., Ueki, N. Channelrhodopsin-dependent photo-behavioral responses in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. Optogenetics (Advances in Experimental Medicine and Biology), 2nd ed. , Springer. 21-33 (2021).
- Rüffer, U., Nultsch, W. Flagellar photoresponses of Chlamydomonas cells held on micropipettes: II. Change in flagellar beat pattern. Cell Motility and the Cytoskeleton. 18 (4), 269-278 (1991).
- Kamiya, R., Hasegawa, E. Intrinsic difference in beat frequency between the two flagella of Chlamydomonas reinhardtii. Experimental Cell Research. 173, 299-304 (1987).
- Kamiya, R., Witman, G. B. Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).
- Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein. Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).
- Horst, C. J., Witman, G. B. ptx1, a nonphototactic mutant of Chlamydomonas, lacks control of flagellar dominance. Journal of Cell Biology. 120 (3), 733-741 (1993).
- Hyams, J. S., Borisy, G. G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro. Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).
- Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).
- Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
- Ide, T., et al. Identification of the agg1 mutation responsible for negative phototaxis in a "wild-type" strain of Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry and Biophysics Reports. 7, 379-385 (2016).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Finst, R. J., Kim, P. J., Quarmby, L. M.
- Morel-Laurens, N. Calcium control of phototactic orientation in Chlamydomonas reinhardtii: sign and strength of response. Photochemistry and Photobiology. 45 (1), 119-128 (1987).
- Wakabayashi, K., King, S. M. Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).
- Wakabayashi, K., Misawa, Y., Mochiji, S., Kamiya, R. Reduction-oxidation poise regulates the sign of phototaxis in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11280-11284 (2011).
- Harris, E. H. in The Chlamydomonas Sourcebook Second Edition. 1, Academic Press. Ch. 2 25-64 (2009).
- Mergenhagen, D. Circadian clock: genetic characterization of a short period mutant of Chlamydomonas reinhardii. European Journal of Cell Biology. 33 (1), 13-18 (1984).
- Ozasa, K., Lee, J., Song, S., Hara, M., Maeda, M. Two-dimensional optical feedback control of Euglena confined in closed-type microfluidic channels. Lab on a Chip. 11 (11), 1933-1940 (2011).
- Tanno, A., et al. The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability. PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).
- Ueno, Y., Aikawa, S., Kondo, A., Akimoto, S. Adaptation of light-harvesting functions of unicellular green algae to different light qualities. Photosynthesis Research. 139 (1-3), 145-154 (2019).
- Takahashi, T., Watanabe, M. Photosynthesis modulates the sign of phototaxis of wild-type Chlamydomonas reinhardtii. Effects of red background illumination and 3-(3',4'-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea. FEBS Letters. 336 (3), 516-520 (1993).
- Morishita, J., Tokutsu, R., Minagawa, J., Hisabori, T., Wakabayashi, K. I. Characterization of Chlamydomonas reinhardtii mutants that exhibit strong positive phototaxis. Plants (Basel). 10 (7), (2021).
- Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion. Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).
- Inaba, K. Calcium sensors of ciliary outer arm dynein: functions and phylogenetic considerations for eukaryotic evolution. Cilia. 4 (1), 6 (2015).
