Summary
De flesta simmande fotoautotrofa organismer visar fotoinducerade beteendeförändringar (fotobeteende). Det nuvarande protokollet observerar nämnda fotobeteende i modellorganismen Chlamydomonas reinhardtii.
Abstract
För överlevnaden av de rörliga fototrofa mikroorganismerna är det avgörande att vara under lämpliga ljusförhållanden. Följaktligen visar de fotoinducerade beteenden (eller fotobeteende) och ändrar deras rörelseriktning som svar på ljus. Typiska fotobeteenden inkluderar fotochock (eller fotofob) respons och fototaxis. Photoshock är ett svar på en plötslig förändring i ljusintensitet (t.ex. blixtbelysning), där organismer övergående slutar röra sig eller röra sig bakåt. Under fototaxi rör sig organismer mot ljuskällan eller i motsatt riktning (kallas positiva respektive negativa fototaxi). Den encelliga gröna algen Chlamydomonas reinhardtii är en utmärkt organism för att studera fotobeteende eftersom den snabbt ändrar sitt simmönster genom att modulera slagen av cilia (aka flageller) efter fotoreception. Här visas olika enkla metoder för att observera fotobeteenden i C. reinhardtii. Forskning om C. reinhardtiis fotobeteenden har lett till upptäckten av gemensamma regleringsmekanismer mellan eukaryota flimmerhår och kanalrhodopsiner, vilket kan bidra till en bättre förståelse av ciliopatier och utvecklingen av nya optogenetiska metoder.
Introduction
Ljus är en oumbärlig energikälla för fotosyntetiska organismer, men för mycket ljus kan orsaka fotooxidativ skada. Således måste fototrofa organismer överleva under måttligt intensitetsljus, där de kan fotosyntetisera men inte drabbas av fotooxidativ skada1. I markväxter kan kloroplaster inte röra sig ut från bladet och visa fotorörelser i cellen; kloroplaster rör sig till cellens periferi under högt ljus och cellytan under svagt ljus2, medan många rörliga alger visar fotobeteenden som gör att de kan hitta lämpliga ljusförhållanden för fotosyntes och därmed underlätta deras överlevnad3.
Chlamydomonas reinhardtii är en encellig grön alg som betraktas som en modellorganism inom forskningsområden som cilia (aka flagella), fotosyntes och fotobeteende. C. reinhardtii presenterar med en ögonpott och två cilia per cell, som används för fotoreception respektive simning. Ögonspotten har två komponenter: channelrhodopsiner (ChRs), ljusstyrda jonkanaler i plasmamembranet och de karotenoidrika granulatskikten som ligger precis bakom ChR. Ögonspotten fungerar som en riktad ljusreceptor eftersom de karotenoidrika granulatskikten fungerar som en ljusreflektor 4,5.
ChRs identifierades initialt som fotoreceptorer som orsakade fotobeteenden i C. reinhardtii 6,7,8,9. Även om två isoformer, ChR1 och ChR2, finns i ögonspotten, visade knock-down-experiment att ChR1 är den primära fotoreceptorn för fotobeteende10. Trots detta har ChR2 fått mer uppmärksamhet och spelat en central roll i utvecklingen av optogenetik, en teknik för att kontrollera cellexcitation med ljus11. Därför kommer studier av de reglerande mekanismerna som styr fotobeteenden i C. reinhardtii att främja förståelsen av ChR-funktionen och förbättra optogenetiken.
Efter fotoreception visar C. reinhardtii-celler två typer av fotobeteenden: fototaxi och fotochockrespons12. Fototaxi är beteendet hos celler som simmar i riktning mot ljuskällan eller motsatt riktning, kallad positiv respektive negativ fototaxi. Photoshock-svar är ett beteende som celler visar efter att ha känt av en plötslig förändring i ljusintensitet, till exempel när de belyses av en blixt. Celler slutar simma eller simma bakåt (dvs simma med cellkroppen framåt) under en kort period, vanligtvis <1 s.
Ciliära rörelser i C. reinhardtii är involverade i dess fotobeteenden. Två flimmerhår slår vanligtvis som en människas bröstsimsimning, och detta moduleras för fotobeteenden. För fototaxi är krafterna som genereras av de två cilia obalanserade genom modulering av slagfrekvensen och vågformamplituden för varje cilium13. Cilium närmast ögonpotten kallas cis cilium, och den andra kallas trans cilium. Dessa två cilia skiljer sig åt på olika punkter. Till exempel är den ciliära slagfrekvensen för transcilium in vitro 30% -40% högre14. Dessutom är deras Ca2+ känslighet annorlunda. Reaktivering av demembranerade cellmodeller15 visade att cis-ciliumet slår starkare än transciliumet för Ca2+ <1 x 10−8 M, medan motsatsen gäller för Ca2+ >1 x 10−7 M. Denna asymmetri i Ca2+ känslighet är möjligen viktig för fototaktiska svängar eftersom mutanter som saknar denna asymmetri inte uppvisar normal fototaxi16,17. Omvänt är vågformskonvertering nödvändig för fotoskalv. Den ciliära vågformen transformeras från den asymmetriska vågformen i framåtsimning till den symmetriska vågformen i bakåtsimning. Denna vågformsomvandling regleras också av Ca2+, vid en tröskel på 1 x 10−4 M18,19. Eftersom defekter vid reglering av ciliära rörelser orsakar primär ciliär dyskinesi hos människor, kan studier av fotobeteenden i C. reinhardtii hjälpa till att bättre förstå dessa sjukdomar och terapeutisk utveckling20.
Häri demonstreras fyra enkla metoder för att observera fotobeteenden i C. reinhardtii . Först visas en fototaxianalys med petriskålar, och för det andra en fototaxianalys mot cellsuspensionsdroppar. Fenomenet som observerats i båda fallen är inte strikt fototaxi utan fotoackumulering, där cellerna tenderar att ackumuleras nära ljuskällans sida eller motsatt sida. I C. reinhardtii orsakas fotoackumulering huvudsakligen av fototaxi på ett sätt som kan användas som en approximation till fototaxi. För det tredje visas en mer rigorös analys för fototaxi under ett mikroskop, och sist är en fotoskalvanalys under ett mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I den aktuella studien användes en vildtypsstam av Chlamydomonas reinhardtii, en avkomma av korset CC-124 x CC-125 med agg1+mt-,21. CC-124 och CC-125 erhölls från Chlamydomonas Resource Center (se materialtabell) och upprätthölls på ett Tris-acetatfosfat (TAP)22, 1,5% agarosmedium vid 20-25 °C. Alla rörliga stammar kan användas för detta protokoll.
1. Cellodling
- Odla en stam av intresse för Chlamydomonas reinhardtii i TAP flytande medium med luftning genom att bubbla steril luft i en 12 h /12 h ljus-mörk period (ljusperiod, ~ 50 μmol fotoner · m − 2 · s - 1 vitt ljus) vid 20-25 ° C i 2 dagar.
OBS: Celler i en mitten av logaritmisk tillväxtfas måste användas. Lång odling (>3 dagar, i den sena logaritmiska tillväxtfasen) gör cellerna mindre känsliga för ljusstimulansen och ökar antalet döda celler i kulturen, vilket hindrar avläsningen av resultaten.
Figur 1: Flytande kultur efter 2-dagars odling. Från en TAP-1,5% agarplatta inokulerades en bit vildtypsceller som fyllde platinaslingan i ~ 150 ml TAP-flytande medium i en kolv. Celltätheten efter 2-dagars odling var ~ 5,0 x 106 celler / ml. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Förbehandling av celler
- Blanda ~ 10 μL av kulturen med en lika stor volym decileringslösning för att stoppa cellerna från att simma och mäta celltätheten med hjälp av en cellräknare eller hemocytometer.
OBS: Det finns ungefär 1-5 x 106 celler / ml efter en 2 dagars kultur (figur 1). Sammansättningen av decileringslösningen är som följer23: 40 mM kaliumacetat, 1 mMCaCl2, pH 4,5 justerat med HCl. - Centrifugera den erforderliga mängden flytande kultur vid 1000 x g i 3 min vid rumstemperatur.
OBS: Ett experiment kräver 3 ml 2 x 107 celler / ml för standardförhållanden för fototaxianalys i en petriskål. Om två experiment ska utföras med 1 x 106 celler/ml odling måste 120 ml kultur centrifugeras. - Suspendera cellpelleten med den erforderliga mängden fotobeteende experimentell lösning till ~ 2 x 107 celler / ml (för skålfototaxianalys) eller 1 x 106 celler / ml (för fototaxianalys på cellnivå eller fotoskalvresponsanalys) och lägg cellsuspensionen i ett koniskt rör.
OBS: Celltätheten behöver inte kontrolleras särskilt strikt för en grov uppskattning av fotobeteenden eller kan ändras beroende på syftet med analysen. Fotobeteende experimentell lösning14: 5 mM HEPES (pH 7,4), 0,2 mM EGTA, 1 mM KCl, 0,3 mM CaCl2. Detta buffertutbytessteg kan utelämnas för en enkel analys av förmågan att uppvisa fotobeteenden, och experimentet kan utföras med odlingsmediet. Eftersom lösningens joniska sammansättning påverkar fototaktiska tecken24, och mediets joniska sammansättning efter odling kanske inte är konstant, rekommenderas emellertid att använda denna lösning för en mer rigorös analys. Ersättning med nytt TAP-medium kan vara ett alternativ. - Placera röret under svagt rött ljus (10-30 μmol fotoner·m−2·s−1) i ~1 h (figur 2).
OBS: Detta steg ökar cellernas känslighet för ljusstimulansen.
Bild 2: Cellsuspension under rött ljus. Ett vanligt fluorescerande vitt ljus täckt med ett ark med röd cellofan. Ett rör som innehåller cellsuspensionen placeras under ~10 μmol fotoner·m−2·s−1 rött ljus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Phototaxis-analys med petriskålen (så kallad "maträttanalys")
- Lägg 2-3 ml cellsuspension i en petriskål (3,5 cm), placera den på en ljuslåda (alternativt ett vitt pappersark eller en vit plastplatta), skaka försiktigt för att jämnt fördela cellerna och få en bild före belysning.
OBS: Skålens storlek kan ändras beroende på syftet. Beroende på stammen och kulturens tillstånd kan cellerna hålla fast vid botten av petriskålen. I ett sådant fall måste de fasta cellerna avlägsnas genom pipettering före analysen. - Belys skålen från ena sidan med en grön lysdiod (LED, se materialtabell) i ett mörkrum på skrivbordet (figur 3).
OBS: Typiska ljusförhållanden är λ = 525 nm och 50-100 μmol fotoner ·m−2·s−1. Se diskussionen om att välja våglängd för ljuskällan i diskussionsavsnittet. Täck både disk och LED med en låda eller svart trasa när en liten LED används. - Lämna dem i ≥5 minuter och skaffa sedan bilder.
OBS: Tiden för ljusbelysning kan ändras beroende på petriskålens storlek eller syfte (figur 4). - Importera bildfilen till Fiji (se materialtabell) för kvantifiering.
OBS: Fiji är en distribution av ImageJ2, buntning många plugins. - Ändra färgbilden till gråskala via Bild > Typ > 8-bitars (bild 5).
- Vänd svartvitt genom Redigera > Invertera.
- Omge hela maträtten som en intressant region (ROI) och mät densiteten genom Analysera > Mått.
OBS: Densiteten för den totala skålen kan beräknas som (Area) x (Medelvärde). - Omge den halva av skålen som ligger närmast ljuskällan som roi och mät densiteten.
- Beräkna det fototaktiska indexet som (densiteten hos fototaktiska celler) per (densitet av totala celler).
Figur 3: Sidobelysning för fototaxiskålanalys. Grönt ljus (525 nm LED-platta, ~100 μmol fotoner·m−2·s−1) belyst från sidan. B) Alternativ belysningsmetod. En 5 mm 5 mm LED av kanonkulatyp. (C) För att blockera ljus från utsidan kan en låda med en svart trasa på insidan användas istället för ett skrivbordsrum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Exempel på negativ fototaxi efter 5 min sidobelysning. De flesta celler ackumulerades på motsatt sida av ljuskällan. Dessa data kan tolkas som negativa fototaxi. (B) Bild av skålen från toppen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Kvantifiering av skålens fototaxianalys. Ett exempel på celler som visar negativ fototaxi (ljuskällan är på höger sida). Färgbilden konverteras till en gråskala (steg 3.5) och inverteras sedan (steg 3.6). Regioner av intresse (ROI), hela skålen (steg 3.7.) och ljuskällans halva av skålen (steg 3.8.) avgränsades. Densiteten för varje ROI mättes (steg 3.9.). I detta fall är det fototaktiska indexet (PI) cirka 0,18 ([1 512 x 11,671] / [2 970 x 26,077]). PI är 1 eller 0 när alla celler visar positiva respektive negativa fototaxi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Fototaxianalys med cellodlingsdroppar
- Placera 25 μl cellsuspensionsdroppar (steg 2.4) direkt på en vit plastplatta med hjälp av en mikropipett.
- Belys dropparna från ena sidan med en grön lysdiod i ett mörkrum på skrivbordet (bild 6).
OBS: Typiska ljusförhållanden är λ = 525 nm och 50-100 μmolfotoner m−2 s−1. Täck både plattor och LED med en låda eller en svart trasa när en liten LED används. - Lämna dem i 3 minuter och skaffa sedan bilder.
OBS: Denna analys är lämplig för en snabb kontroll av fototaxi av många prover samtidigt, till exempel vid mutantscreening eller tetradanalys. En cellodling i mitten av loggfasen som odlas i en 96-brunnsplatta kan belysas direkt för enklare prestanda. I båda fallen kan steg 2 (cellförbehandling) utelämnas.
(A) Nio droppar av en 25 μL cellsuspension placerad på ett vitt plastark och upplyst från sidan av en grön lysdiod. (B) Efter 3 min belysning. I varje droppe ackumulerades celler antingen på ljuskällans sida (positiv fototaxi), ackumulerades på motsatt sida (negativ fototaxi) eller diffunderades in i droppen (ingen fototaxi). Skalstreck = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
5. Fototaxianalys under ett mikroskop
- Ta ~ 30 μL cellsuspension (1 x 106 celler / ml i fotobeteende experimentell lösning) på en glasskiva och placera en täckglas (18 mm x 18 mm) med distanser ovanpå (figur 7).
OBS: Distanserna kan tillverkas med vit petroleum eller dubbelhäftande tejp på två motsatta sidor av ett täckglas. Ljuset måste komma från ett håll där det inte finns några distanser. - Belys provet från ena sidan av täckglaset utan distans med en grön lysdiod och observera cellerna under ett mörkfältmikroskop med en 10x objektivlins under svagt rött ljus (λ > 630 nm, ~ 5 μmol fotoner · m − 2 · s - 1, figur 8).
OBS: Undvik att utsätta cellerna på scenen för annat ljus än LED- eller observationsljus, till exempel rumsbelysning eller ljus från en PC-skärm. Den lämpliga förstoringen av en objektivlins beror på kamerans synvinkel. Välj en lins med en förstoring som gör att cellen kan simma i ~ 2 s utan att lämna synfältet. För att spåra celler är en bild med hög kontrast önskvärd; Således rekommenderas användning av en mörkfältskondensor för mikroskopisk observation. Andra kondensorer, såsom ljusfält, kan dock användas för att observera fototaxi. Se till att ljuset från lysdioden lyser på cellerna. - Spela in cellrörelser i ~ 20 s efter ljusbelysning med hjälp av ett kamerautrustat mikroskop.
OBS: Några sekunder efter början av grön LED-belysning kan ett fotochocksvar inträffa, och / eller den fototaktiska orienteringen (eller tecknet) är inte stabil; således rekommenderas en 20 s inspelning för svarsstabilisering (film 1).
Figur 7: Göra distanser på täckglaskanter. En liten mängd vit petroleum skrapades av med kanten på ett täckglas. (B) En distans på kanten av ett täckglas. (C) En annan distans på motsatt kant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 8: Sidobelysning under ett mikroskop. En grön LED av kanonkuletyp är fixerad på muffen och fixerad på stativet bredvid mikroskopet. Celler observerades under ett mörkfältmikroskop med ett skarpt skärfilter (λ > 630 nm). (B) Sidobelysning av den gröna lysdioden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: Fototaxianalys under ett mikroskop. Grönt ljus lyser med ~0 s från höger. Vid den tidpunkten tenderade celler att simma i slumpmässig riktning. Efter 0 s i tidsräknaren simmade cellerna antingen till höger eller vänster och visade positiva eller negativa fototaxi. Ljuset släcktes vid ~15 s när celler började simma i slumpmässig riktning igen. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
6. Spårning av fototaktiska celler och polär histogramritning
- Extrahera 1,5 s från den inspelade videon, med början 15 s efter belysning.
OBS: Banans varaktighet kan ändras beroende på cellens simhastighet. En 1,5 s-video innehåller 46 bilder vid inspelning av 30 fps. - Importera filen till Fiji som en taggbildfilformatbildsekvens via File > Import > Image Sequence.
- Kör plugin "Manuell spårning" för cellspårning med plugins > spårning > manuell spårning.
- Klicka på Lägg till spår så visas den första ramen.
- Klicka på en cell av intresse och den andra ramen visas.
- Flytta skjutreglaget till den sista bildrutan och klicka på samma cell som i steg 6.5.
DET ÄR INTE NÖDVÄNDIGT att spåra celler i varje bildruta. Endast vinkeln mellan ljusaxeln och linjesegmentet som bildas av start- och slutpunkterna är avgörande. - Upprepa steg 6.4.-6.6. för ~30 celler.
OBS: Välj celler som förblir inom synvinkeln för hela 1,5 s. Om celltätheten är tillräckligt låg och inga cellsimbanor skär varandra i 1,5 s kan automatisk spårning utföras. Välj i så fall plugin "MTrack2" (typiska inställningar: Minsta objektstorlek = 1; Maximal objektstorlek = 10 000; Maximal hastighet = 100; Minsta klibblängd [Ramar] = 46). Det rekommenderas att verifiera korrespondensen mellan celler på videon och spårningsresultaten genom att få data genom att markera Visa text? > Overlay Dots &Lines. - Kopiera och klistra in resultaten i kalkylprogram (t.ex. Excel).
OBS: Häri visas hur man ritar ett polärt histogram med Excel. - Mät vinkeln mellan ljusaxeln och en cells simriktning med "=degrees(atan2(x2-x1),-(y2-y1))", där cellens startposition (segment #1) är (x1, y1) och den sista positionen (segment #46) är (x2, y1).
OBS: I en Fiji-bild är det övre vänstra hörnet ursprunget (0, 0). - Upprepa steg 6.9. för alla celler som mäts (vanligtvis ~ 30 celler).
- Förbered en frekvensfördelningstabell för alla data som erhållits med facken från −180° till +180°, uppdelad i 15° i båda ändar och 30° för resten av intervallet med hjälp av funktionen "FREQUENCY".
OBS: När du har valt kolumnerna omedelbart till fackkolumnerna anger du följande i den övre kolumnen = FREKVENS (data_array, bins_array) och trycker på skift + ctrl + enter (kompletterande bild 1). - Återskapa en frekvensfördelningstabell med de värden som beräknades i steg 6.8. roterade −90° för att ställa in höger sida till 0° (dvs konvertera talet i intervallet från −15° till 15°, till intervallet från −105° till −75°), eftersom celler som simmar uppåt med ovanstående metod anses simma i en vinkel på 0° mot ljuset (dvs. visa positiv fototaxi), även om ljuset kommer från höger (kompletterande figur 2).
- Ange vinkelvärdet i mitten av intervallet för en 30° bin (t.ex. 30° för 15°-45°), hoppa över en kolumn och ange motsvarande provantal till höger (kompletterande bild 3).
- Konvertera varje provantalsvärde till ett procenttal och ange 0 i kolumnen som motsvarar den tomma kolumnen mellan lagerplatserna.
- Rita ett radardiagram med vinkelvärdena som de vågräta axeletiketterna och procentvärdena (%) som förklaring (kompletterande bild 4).
- Beräkna det fototaktiska indexet (PI) för ytterligare kvantifiering genom att beräkna medelvärdet av cosθ (θ = vinkeln mellan ljusaxeln och simriktningen)16.
OBS: PI är 0 när celler simmar i slumpmässig riktning och 1 eller −1 när 100% av cellerna visar positiva respektive negativa fototaxi.
7. Fotochockresponsanalys under ett mikroskop
- Placera ~30 μL cellsuspension (1 x 106 celler/ml i experimentlösningen med fotobeteende) på en glasskiva och placera ett täckglas (18 mm x 18 mm) med distanser ovanpå, som i steg 4.1.
- Observera cellerna under ett mikroskop med svagt rött ljus (λ > 630 nm, ~ 5 μmol fotoner · m − 2 · s - 1).
- Använd blixtbelysning med en kamerablixt (film 2,3).
OBS: Ett annat sätt att inducera ett fotochocksvar är att snabbt ta bort ett rött filter för hand från observationsljusvägen. Denna metod är dock mer variabel eftersom hastigheten för borttagning av filter varierar från person till person (film 4,5). - Spela in cellrörelser med hjälp av ett kamerautrustat mikroskop.
- För kvantifiering, utför endera eller båda av följande: (1) beräkna förhållandet mellan celler som visar fotochocksvaret per totalt antal celler16; (2) för celler som visar fotochockresponsen, mäta tiden från fotochockstimulansen till återhämtningen av framåt simning25.
Film 2: Fotochockbelysning med en kamerablixt. Kamerablixten hölls upp till mikroskopstadiet och slogs på. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 3: Fotochocksvar orsakat av en blixt under ett mikroskop. Celler observerades under svagt rött ljus. En blixt avgavs vid ~0 s. Nästan alla celler slutade simma framåt, simmade bakåt under en kort period och återhämtade sig framåt simning. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 4: Fotochocksvar orsakat av att ett rött filter tas bort under ett mikroskop. Celler observerades under svagt rött ljus. Det röda filtret togs bort vid ~5 s. Nästan alla celler slutade simma framåt, simmade bakåt under en kort period och återhämtade sig framåt simning. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 5: Ta bort ett rött filter. Snabb borttagning av ett rött filter i ljusvägen för att leverera fotochock. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiska C. reinhardtii phototaxis och photoshock response assays visas här. Efter celldensitetsuppskattning tvättades cellodling av vild typ (en avkomma av korset CC-124 × CC-125 med agg1+ mt -)23 med fotobeteende experimentell lösning för fototaxiskålanalysen. Cellsuspensionen placerades under svagt rött ljus i ~ 1 timme. En 2 ml cellsuspension placerades i en 3,5 cm petriskål. Petriskålen skakades försiktigt, sattes på en ljuslåda och fotograferades med en kamera fixerad på ett stativ. Cellerna visade tydliga negativa fototaxi i detta fall (dvs celler ackumulerade till motsatt sida av ljuskällan) (Figur 4B).
Fototaxi- och fotochockresponsanalyserna under ett mikroskop utfördes i ett mörkt rum för att undvika ljusstörningar. En annan vildtypsstam, CC-125, som visar positiv fototaxi, användes för dessa analyser26. För fototaxianalysen utförs inspelningen vanligtvis i ~ 25 s. Cellernas banor spårades från varje cells position vid 15 s till den vid 16,5 s av Fiji.
Fotochockresponsanalysen utfördes med hjälp av en kamerablixt. Nästan alla celler uppvisade fotochockresponsen, simmade bakåt under en kort period (~ 0,3 s) och återhämtade sig framåt simning (film 3). För att kvantifiera data från den här filmen följdes två metoder (se tidigare publicerade rapporter16,25): beräkning av procentandelen celler som visar fotochockrespons bland alla celler16 och mätning av tiden från början av varje cells bakåtsimning till återhämtning av framåt simning25. Beroendet av dessa värden på ljusintensitet kan verifieras genom att placera filter med neutral densitet (ND) mellan ljuskällan och provet16.
Kompletterande figur 1: Fördelningstabell för frekvenser. Kolumn A visar exempelnumret och kolumn B visar vinkeln i steg 6.6. Kolumn D visar facken (12 fack med 30°). Kolumn E visar vinkelområdet per fack som referens. Efter att ha valt F2-F14 anges FREKVENS-funktionen i F2 som visas i fx-fönstret och Shift + Ctrl + Enter trycks in för att förbereda frekvensfördelningstabellen. Summan (F15) måste vara lika med det totala antalet prover i kolumn A. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Datarotation. För att matcha riktningen för de polära histogrammen med den faktiska ljusriktningen (från höger) roteras fackens vinklar i frekvensfördelningstabellen med −90°. Till exempel skiftar provantalet i intervallet 165 ° -135 ° (F3) till 75 ° -45 ° (I6). Räkningarna i intervallen 180 ° -165 ° (F2) och −165 ° -−180 ° (F14) kombineras till det nya intervallet 105 ° -75 ° (I5). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande bild 3: Ställa in nya fack för att rita det polära histogrammet. Byt namn på facken med hjälp av mittvärdet för varje 30° fack (Kolumn K: t.ex. byt namn på facket på 165°-−165° till −180°). Radardiagrammet i Excel är inställt med den första papperskorgen vid 90 °. Ändra antalet prover (kolumn L) till en procentandel (kolumn M) för att jämföra olika data oavsett antalet prover. Ange 0 mellan varje datum (t.ex. M3, M5, M7 ...) för att representera värdena för varje fack som en linje i radardiagrammet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 4: Radardiagram som representerar ett polärt histogram för en fototaxianalys. Rita ett radardiagram med facken (kolumn K) som vågräta axeletiketter och procentvärdena (kolumn M) som en förklaring. Ett typiskt polärt histogram som visar procentandelen CC-125-celler som rör sig i en viss riktning i förhållande till ljus upplyst från höger (0 °) (12 fack med 30 °; n = 30 celler). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det nuvarande protokollet är enkelt och inte tidskrävande. Om en C. reinhardtii mutant misstänks uppvisa defekter i fotoreception eller ciliär rörelse, kan denna metod fungera som primär fenotypisk analys.
Vissa kritiska steg finns dock. Det ena är att använda celler i experimentet i den tidiga till mitten av logtillväxtfasen. Efter odling under långa perioder blir cellerna mindre rörliga, mindre ljuskänsliga och bildar till och med palmelloider (cellklumpar)27. Ett annat viktigt steg är att utsätta cellerna för rött ljus före experimentet (Steg 2.4.). Celler uppvisar hög ljusrespons och rörlighet genom att undvika ChR-stimulering samtidigt som fotosyntetisk aktivitet bibehålls. Cellobservation under ett mikroskop måste bekräfta att ljuset lyser på cellerna. Speciellt när du använder en liten, mycket riktad LED, en liten avvikelse från den optiska axeln kan förhindra att ljuset lyser upp cellerna.
En tydlig nackdel med skålen och droppfototaxianalyserna är att de är ganska kvalitativa. Även om resultaten kan kvantifieras, som visas i steg 3.4.-3.9., kan andra fenomen än fototaxi påverka resultaten. Till exempel kan celler hålla fast vid tallrikar eller plastplattor beroende på odlingsförhållanden eller skålen / tallriksmaterialet. Således måste försiktighet iakttas om data tyder på ingen eller dålig fototaxi. Att välja lämplig metod enligt syftet är viktigt eftersom dessa metoder visar den stora fördelen med enkelhet.
Dessa metoder är anmärkningsvärda genom att de är enkla och enkla. Flera sofistikerade metoder finns tillgängliga för att bedöma fotobeteende i Chlamydomonas28 eller Euglena29. De kan dock vara svåra att utföra i många laboratorier. Metoderna som beskrivs här kräver inte ett speciellt mikroskop utan en billig LED eller en kamerablixt. På grund av denna enkla inställning är metoderna också mycket mångsidiga. Till exempel, för att studera effekten av ljusintensitet på fotobeteende, ND-filter kan placeras mellan ljuskällan och provet16. För att undersöka beteendets handlingsspektrum, färgen på LED-ljuskällan kan bytas ut30.
Motiveringen för att använda grönt ljus (λ = 525 nm) för fototaxianalyser är att den maximala absorptionsvåglängden för ChR1, fotoreceptorn för fototaxi, är ~ 485 nm, nära absorptionstoppen för klorofyll b vid ~ 470 nm10,31. Eftersom en förändring i fotosyntetisk aktivitet kan påverka fototaktiska tecken rekommenderas användning av grönt eftersom det kan absorberas av ChR1 men inte så bra av klorofyll32. Men om endast fototaktisk förmåga testas kan blått ljus användas som ljuskälla istället. För att undersöka tidsmässiga förändringar i fotosyntetisk aktivitet över fototaktiska tecken rekommenderas att man använder en vit ljuskälla som innehåller våglängdsområdet mellan 425-550 nm, vilket absorberas väl av ChR1.
Fototaktiska tecken regleras av cellulära reaktiva syrearter (ROS). När ROS ackumuleras visar celler positiva fototaxi, och när de är utarmade visar cellerna negativ fototaxi26. Membrangenomsläppliga ROS-reagenser eller ROS-rensande reagens inducerar positiva respektive negativa fototaxi. Vanligtvis användsH2O2eller t-BOOH som ROS-reagenser, medan dimetyltiourea (DMTU) används som ros-rensare. Således kan en fototaktisk analys i dessa reagenser användas för att screena för mutanter med defekter i fototaxis teckenväxling, vilket kan relatera till defekter i fotoreception eller ROS-relaterad metabolism 4,21,33.
Fotochocksvar orsakas av Ca2+ tillströmning från spetsen av flimmerhåren via spänningsberoende Ca2+ kanaler efter ciliär vågformsomvandling18,34. Även om den Ca2+-beroende vågformsomvandlingen av cilia är vanlig för många eukaryota organismer, är dess molekylära mekanism ännu inte helt förstådd35. Om en C. reinhardtii mutant visar defekter i fotochocksvaret men normal fototaxi, skulle det föreslå normal fotoreceptionsförmåga. Kort sagt, den snabba och enkla analysen för fotochocksvaret som visas här kan hjälpa till att förstå den gemensamma molekylära mekanismen för Ca2+-beroende vågformsomvandling i eukaryota cilia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) till NU (19K23758, 21K06295), TH (16H06556) och KW (19H03242, 20K21420, 21H00420), från Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) till KW och från Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) till NU, TH och KW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| 5 mm Cannonball green LED | Optosupply | OSPG5161P | |
| 50 mL conical tube | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| AC adaptor for the light box | ATTO | 2196161 | |
| Auto cell counter | DeNovix | CellDrop BF | |
| CaCl2 | Nakalai tesque | 06731-05 | |
| Camera flash | NEWWER | TT560 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| C-mout CCD camera | Wraymer | 1129HMN1/3 | |
| Desktop darkroom | Scientex | B-S8 | |
| Digital still camera | SONY | RX100II | |
| EGTA | Dojindo | G002 | |
| Fiji | https://fiji.sc/ | ||
| Green LED plate | CCS | ISLM-150X150-GG | |
| HCl | Fujifilm WAKO | 080-01066 | |
| HEPES | Dojindo | GB70 | |
| KCl | Nakalai tesque | 238514-75 | |
| Lightbox (Flat viewer) | ATTO | 2196160 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Petri dish (φ3.5 cm) | IWAKI | 1000-035 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Power supply for the green LED plate | CCS | ISC-201-2 | |
| Red filter | Shibuya Optical | S-RG630 |
References
- Demmig-Adams, B., Adams, W. W. Photoprotection and other responses of plants to high light stress. Annual Reviews Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 43, 599-626 (1992).
- Wada, M.
- Sgarbossa, A., Checcucci, G., Lenci, F.
- Ueki, N., et al. Eyespot-dependent determination of the phototactic sign in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5299-5304 (2016).
- Foster, K. W., Smyth, R. D.
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Sineshchekov, O. A., Jung, K. -H., Spudich, J. L. Two rhodopsins mediate phototaxis to low- and high-intensity light in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (13), 8689-8694 (2002).
- Suzuki, T., et al. Archaeal-type rhodopsins in Chlamydomonas: model structure and intracellular localization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 711-717 (2003).
- Berthold, P., et al. Channelrhodopsin-1 initiates phototaxis and photophobic responses in Chlamydomonas by immediate light-induced depolarization. Plant Cell. 20 (6), 1665-1677 (2008).
- Deisseroth, K., et al. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. Journal of Neuroscience. 26 (41), 10380-10386 (2006).
- Wakabayashi, K., Isu, A., Ueki, N. Channelrhodopsin-dependent photo-behavioral responses in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. Optogenetics (Advances in Experimental Medicine and Biology), 2nd ed. , Springer. 21-33 (2021).
- Rüffer, U., Nultsch, W. Flagellar photoresponses of Chlamydomonas cells held on micropipettes: II. Change in flagellar beat pattern. Cell Motility and the Cytoskeleton. 18 (4), 269-278 (1991).
- Kamiya, R., Hasegawa, E. Intrinsic difference in beat frequency between the two flagella of Chlamydomonas reinhardtii. Experimental Cell Research. 173, 299-304 (1987).
- Kamiya, R., Witman, G. B. Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).
- Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein. Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).
- Horst, C. J., Witman, G. B. ptx1, a nonphototactic mutant of Chlamydomonas, lacks control of flagellar dominance. Journal of Cell Biology. 120 (3), 733-741 (1993).
- Hyams, J. S., Borisy, G. G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro. Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).
- Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).
- Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
- Ide, T., et al. Identification of the agg1 mutation responsible for negative phototaxis in a "wild-type" strain of Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry and Biophysics Reports. 7, 379-385 (2016).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Finst, R. J., Kim, P. J., Quarmby, L. M.
- Morel-Laurens, N. Calcium control of phototactic orientation in Chlamydomonas reinhardtii: sign and strength of response. Photochemistry and Photobiology. 45 (1), 119-128 (1987).
- Wakabayashi, K., King, S. M. Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).
- Wakabayashi, K., Misawa, Y., Mochiji, S., Kamiya, R. Reduction-oxidation poise regulates the sign of phototaxis in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11280-11284 (2011).
- Harris, E. H. in The Chlamydomonas Sourcebook Second Edition. 1, Academic Press. Ch. 2 25-64 (2009).
- Mergenhagen, D. Circadian clock: genetic characterization of a short period mutant of Chlamydomonas reinhardii. European Journal of Cell Biology. 33 (1), 13-18 (1984).
- Ozasa, K., Lee, J., Song, S., Hara, M., Maeda, M. Two-dimensional optical feedback control of Euglena confined in closed-type microfluidic channels. Lab on a Chip. 11 (11), 1933-1940 (2011).
- Tanno, A., et al. The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability. PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).
- Ueno, Y., Aikawa, S., Kondo, A., Akimoto, S. Adaptation of light-harvesting functions of unicellular green algae to different light qualities. Photosynthesis Research. 139 (1-3), 145-154 (2019).
- Takahashi, T., Watanabe, M. Photosynthesis modulates the sign of phototaxis of wild-type Chlamydomonas reinhardtii. Effects of red background illumination and 3-(3',4'-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea. FEBS Letters. 336 (3), 516-520 (1993).
- Morishita, J., Tokutsu, R., Minagawa, J., Hisabori, T., Wakabayashi, K. I. Characterization of Chlamydomonas reinhardtii mutants that exhibit strong positive phototaxis. Plants (Basel). 10 (7), (2021).
- Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion. Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).
- Inaba, K. Calcium sensors of ciliary outer arm dynein: functions and phylogenetic considerations for eukaryotic evolution. Cilia. 4 (1), 6 (2015).
