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Biology

प्राथमिक संस्कृति में विभेदित माउस एडिपोसाइट्स: इंसुलिन प्रतिरोध का एक मॉडल

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/63979
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

Summary

यह प्रोटोकॉल चमड़े के नीचे की वसा से माउस प्रीडिपोसाइट्स के अलगाव, परिपक्व एडिपोसाइट्स में उनके भेदभाव और इंसुलिन प्रतिरोध के प्रेरण का वर्णन करता है। पश्चिमी धब्बा के माध्यम से इंसुलिन सिग्नलिंग मार्ग के सदस्यों के फॉस्फोराइलेशन / सक्रियण द्वारा इंसुलिन कार्रवाई का मूल्यांकन किया जाता है। यह विधि प्राथमिक एडिपोसाइट्स में इंसुलिन प्रतिरोध / संवेदनशीलता के प्रत्यक्ष निर्धारण की अनुमति देती है।

Abstract

इंसुलिन प्रतिरोध अपने लक्ष्य कोशिकाओं पर इंसुलिन का कम प्रभाव है, जो आमतौर पर इंसुलिन रिसेप्टर सिग्नलिंग में कमी से प्राप्त होता है। इंसुलिन प्रतिरोध टाइप 2 मधुमेह (टी 2 डी) और दुनिया भर में उच्च प्रसार के अन्य मोटापे से व्युत्पन्न रोगों के विकास में योगदान देता है। इसलिए, इंसुलिन प्रतिरोध के अंतर्निहित तंत्र को समझना बहुत प्रासंगिक है। विवो और इन विट्रो दोनों में इंसुलिन प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए कई मॉडलों का उपयोग किया गया है; प्राथमिक एडिपोसाइट्स इंसुलिन प्रतिरोध के तंत्र का अध्ययन करने और अणुओं की पहचान करने के लिए एक आकर्षक विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं जो इस स्थिति और इंसुलिन-संवेदीकरण दवाओं के आणविक लक्ष्यों का मुकाबला करते हैं। यहां, हमने ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α (टीएनएफ-α) के साथ इलाज किए गए संस्कृति में प्राथमिक एडिपोसाइट्स का उपयोग करके एक इंसुलिन प्रतिरोध मॉडल स्थापित किया है।

चुंबकीय कोशिका पृथक्करण तकनीक द्वारा कोलेजनेज-पचने वाले माउस चमड़े के नीचे वसा ऊतक से अलग एडिपोसाइट्स अग्रदूत कोशिकाओं (एपीआई) को प्राथमिक एडिपोसाइट्स में विभेदित किया जाता है। इंसुलिन प्रतिरोध को तब टीएनएफ-α के साथ उपचार द्वारा प्रेरित किया जाता है, एक प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन जो इंसुलिन सिग्नलिंग कैस्केड के सदस्यों के टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन / सक्रियण को कम करता है। इंसुलिन रिसेप्टर (आईआर), इंसुलिन रिसेप्टर सब्सट्रेट (आईआरएस -1), और प्रोटीन काइनेज बी (एकेटी) के फॉस्फोराइलेशन में कमी को पश्चिमी धब्बा द्वारा निर्धारित किया जाता है। यह विधि वसा ऊतक में इंसुलिन प्रतिरोध की मध्यस्थता करने वाले तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करती है।

Introduction

इंसुलिन अग्नाशयी आइलेट β-कोशिकाओं और ग्लूकोज और लिपिड चयापचय के प्रमुख नियामक द्वारा निर्मित एक उपचय हार्मोन है। इसके कई कार्यों में, इंसुलिन ग्लूकोज अपटेक, ग्लाइकोजन संश्लेषण, ग्लूकोनोजेनेसिस, प्रोटीन संश्लेषण, लिपोजेनेसिस और लिपोलिसिस1 को नियंत्रित करता है। अपने रिसेप्टर (आईआर) के साथ इंसुलिन इंटरैक्शन के बाद प्रारंभिक आणविक संकेत आईआर2 की आंतरिक टायरोसिन प्रोटीन काइनेज गतिविधि का सक्रियण है, जिसके परिणामस्वरूप इसके ऑटोफॉस्फोराइलेशन3 और बाद में इंसुलिन रिसेप्टर सब्सट्रेट्स (आईआरएस) नामक प्रोटीन के एक परिवार की सक्रियता होती है, जो एडाप्टर प्रोटीन को बांधता है जिससे प्रोटीन किनेसेस4 का एक कैस्केड सक्रिय होता है। . इंसुलिन दो मुख्य सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय करता है: फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल 3-काइनेज (पीआई 3 के)-प्रोटीन काइनेज बी (एकेटी) और रास-माइटोजन-सक्रिय प्रोटीन काइनेज (एमएके)। पूर्व ईंधन होमियोस्टैसिस के विनियमन सहित विभिन्न शारीरिक कार्यों में शामिल कई डाउनस्ट्रीम प्रभावकों के सक्रियण के लिए एक प्रमुख शाखा बिंदु या नोड 4,5 का गठन करता है, जबकि बाद वाला सेल विकास और भेदभाव 4,6 को नियंत्रित करता है। इंसुलिन क्रियाएं अंततः सेल प्रकार और शारीरिक संदर्भपर निर्भर करती हैं।

मुख्य इंसुलिन-उत्तरदायी चयापचय ऊतकों में से एक वसा ऊतक है। सफेद वसा ऊतक मनुष्यों और कृन्तकों में वसा का सबसे प्रचुर प्रकार है, जो चमड़े के नीचे वसा (त्वचा और मांसपेशियों के बीच) और आंत की वसा (पेट की गुहा में अंगों के आसपास) के भीतर वितरित होता है। उनकी बड़ी मात्रा को देखते हुए, एडिपोसाइट्स या वसा कोशिकाएं वसा ऊतक में सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिका प्रकार हैं। ये वसा कोशिकाएं भूरे / बेज (थर्मोजेनिक), गुलाबी (स्तन ग्रंथि में), और सफेद 8,9 हो सकती हैं। सफेद एडिपोसाइट्स शरीर में मुख्य ऊर्जा भंडार को ट्राइग्लिसराइड्स, एक इंसुलिन-निर्भर प्रक्रिया के रूप में रखते हैं। इंसुलिन ग्लूकोज परिवहन और लिपोजेनेसिस को बढ़ावा देता है, जबकि यह लिपोलिसिस या लिपिड ब्रेकडाउन 7,10 को रोकता है। यह प्रीडिपोसाइट्स को एडिपोसाइट्स में विभेदित करने की सुविधा भी प्रदान करता है - परिपक्व वसा-भंडारण कोशिकाएं11।

इंसुलिन प्रतिरोध तब होता है जब एक सामान्य इंसुलिन स्तर एक क्षीण जैविक प्रतिक्रिया पैदा करता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिपूरक हाइपरइन्सुलिनमिया12 होता है। इंसुलिन प्रतिरोध अधिक वजन और मोटापे5 से जुड़ी एक स्थिति है, जिसे संयुक्त करने पर टाइप 2 मधुमेह (टी 2 डी) और अन्य चयापचय रोगहोते हैं। हाइपरइन्सुलिनमिया सामान्य रक्त शर्करा के स्तर को बनाए रखने के लिए परिधीय ऊतकों में इंसुलिन प्रतिरोध की भरपाई करताहै। हालांकि, अंतिम β-सेल हानि या थकावट, इंसुलिन प्रतिरोध को बढ़ाने के साथ, टी 2 डी 5 के अनुरूप उच्च रक्त शर्करा के स्तर की ओर जाताहै। इसलिए, इंसुलिन प्रतिरोध और हाइपरइन्सुलिनमिया मोटापे से व्युत्पन्न चयापचय रोगों के विकास में योगदान करसकते हैं। इसके अलावा, मोटापा पुरानी निम्न श्रेणी की स्थानीय सूजन का कारण बन सकता है जो वसा ऊतक 15,16,17 में इंसुलिन प्रतिरोध को बढ़ावा देता है। इसके अलावा, वसा ऊतक में मोटापा-व्युत्पन्न परिवर्तन, जैसे फाइब्रोसिस, सूजन, और कम एंजियोजेनेसिस और एडिपोजेनेसिस, कम एडिपोनेक्टिन सीरम स्तर (एक इंसुलिन संवेदीकारक) और प्लास्मिनोजेन एक्टिवेटर इनहिबिटर 1 (पीएआई -1), मुक्त फैटी एसिड और रक्तप्रवाह में एक्सोसोम जैसे कारकों के स्राव में वृद्धि करते हैं, जिससे इंसुलिन प्रतिरोध17 बढ़ जाता है।

इंसुलिन प्रतिरोध के अंतर्निहित कई पहलू अज्ञात रहते हैं। इन विट्रो और विवो मॉडल को वसा ऊतक सहित प्रमुख लक्ष्य ऊतकों में इंसुलिन प्रतिरोध की मध्यस्थता करने वाले तंत्र का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। इन विट्रो मॉडल का लाभ यह है कि शोधकर्ताओं के पास पर्यावरणीय स्थितियों का अधिक नियंत्रण है और विशिष्ट सेल प्रकारों में इंसुलिन प्रतिरोध का मूल्यांकन कर सकते हैं। विशेष रूप से, एडिपोसाइट्स अग्रदूत कोशिकाओं (एपीसी) में दाता ऊतक का व्यक्तिगत फेनोटाइप होता है, जो एडिपोसाइट्स सेल लाइनों की तुलना में शरीर विज्ञान को बेहतर ढंग से प्रतिबिंबित कर सकता है। विट्रो में इंसुलिन प्रतिरोध को प्रेरित करने वाला एक मुख्य कारक ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α (टीएनएफ-α) है। टीएनएफ-α एक प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन है जो वसा ऊतक18 में एडिपोसाइट्स और मैक्रोफेज द्वारा स्रावित होता है। जबकि यह उचित वसा ऊतक रीमॉडेलिंग और विस्तार19 के लिए आवश्यक है, टीएनएफ-α के लिए दीर्घकालिक जोखिम विवो में वसा ऊतक में और विट्रो20 में एडिपोसाइट्स में इंसुलिन प्रतिरोध को प्रेरित करता है। कई सेल प्रकारों के क्रोनिक टीएनएफ-α उपचार से आईआर और आईआरएस -1 दोनों के सेरीन फॉस्फोराइलेशन में वृद्धि होती है, जिससे टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन में कमी आतीहै। सेरीन अवशेषों पर आईआरएस -1 का बढ़ा हुआ फॉस्फोराइलेशन आईआर टायरोसिन किनेज गतिविधि को रोकता है और उन प्रमुख तंत्रों में से एक हो सकता है जिसके द्वारा क्रोनिक टीएनएफ -α उपचार इंसुलिन कार्रवाई22,23 को बाधित करता है। टीएनएफ-α परमाणु कारक 2 बी किनेज β (आईकेके) और सी-जून एन टर्मिनल किनेज (जेएनके) 24 के सेरीन /थ्रेओनिन किनेज अवरोधक से जुड़े मार्गों को सक्रिय करता है। जेएनके एक जटिल प्रोइन्फ्लेमेटरी ट्रांसक्रिप्शनल प्रोग्राम को प्रेरित करता है लेकिन सीधे आईआरएस -16 को फॉस्फोराइलेट भी करता है।

इंसुलिन प्रतिरोध के रोगजनन को समझना टी 2 डी के खिलाफ भविष्य के उपचारों के विकास का मार्गदर्शन करने के लिए तेजी से महत्वपूर्ण हो गया है। एपीसी वसा कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल साबित हुए हैं, जिसमें इंसुलिन के प्रति संवेदनशीलता और प्रतिरोध शामिल है, और प्रणालीगत वातावरण से स्वतंत्र एडिपोसाइट्स के आंतरिक गुणों की पहचान करने के लिए। एपीआई को आसानी से विभिन्न वसा डिपो से प्राप्त किया जा सकता है, और उपयुक्त परिस्थितियों में, परिपक्व एडिपोसाइट्स में विभेदित किया जा सकता है। इस विधि के साथ, एडिपोसाइट्स में इंसुलिन प्रतिरोध / संवेदनशीलता पर प्रत्यक्ष प्रभाव का मूल्यांकन किया जा सकता है।

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Protocol

सभी कृंतक प्रयोगों को यूएनएएम के इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोबायोलॉजी की बायोएथिक्स समिति, प्रोटोकॉल नंबर 075 द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. माउस एडिपोसाइट्स अग्रदूत कोशिकाओं का अलगाव

  1. 8-10 सप्ताह के नर सी 57बीएल /6 चूहों (उदाहरण के लिए, सीओ2 इनहेलेशन और बाद में ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा) (प्रति अलगाव चार जानवर)। 70% इथेनॉल के साथ रगड़कर चूहों को कीटाणुरहित करें और बलिदान के तुरंत बाद वसा ऊतक प्राप्त करें।
    नोट: कृन्तकों की इच्छामृत्यु के बाद, वसा ऊतक को तुरंत अलग करें और बाँझ लैमिनार प्रवाह हुड के अंदर सभी चरणों का प्रदर्शन करें। चूहों को भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ 12 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र के तहत रखा जाता है।
  2. प्रत्येक माउस से इनगुइनल चमड़े के नीचे के वसा ऊतक को विच्छेदित करें। मांसपेशियों, त्वचा या किसी अन्य ऊतक को हटाने से बचते हुए केवल वसा ऊतक को हटा दें, और इसे बर्फ पर टाइप 1 कोलेजनेज समाधान (1.5 मिलीग्राम / एमएल) के 15 एमएल युक्त 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें। डलबेको के मॉडिफाइड ईगल मीडियम (डीएमईएम) उच्च ग्लूकोज -1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) में टाइप 1 कोलेजनेज को भंग करें और 0.2 μm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  3. बाँझ सर्जिकल कैंची के साथ वसा ऊतक को छोटे टुकड़ों में काटें और 30 मिनट के लिए कक्षीय शेकर (150 आरपीएम) में 37 डिग्री सेल्सियस पर टाइप 1 कोलेजनेज समाधान के साथ इनक्यूबेशन करके नमूने को पचाएं (वसा और कोलेजनेज युक्त ट्यूब को अधिक हिलाने वाली सतह के लिए क्षैतिज स्थिति में रखें)। यह सुनिश्चित करने के लिए हर 10 मिनट में पाचन की जांच करें कि यह काम करता है (ऊतक क्षरण दिखाई दे रहा है) और अतिचक्राव को रोकने के लिए ( पूरक चित्र एस 1 देखें)।
  4. कोलेजनेज के साथ पचने वाले ऊतक को खत्म करने के लिए 200 μm जाल-सिरिंज (पहले आटोक्लेव) का उपयोग करके फ़िल्टर करें। समाधान में अधिक से अधिक कोशिकाओं को निकालने के लिए ट्यूब के किनारे पर फ़िल्टर पास करें। पाचन को रोकने के लिए 15 एमएल ठंडा डीएमईएम -1% बीएसए जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 × ग्राम सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. परिपक्व एडिपोसाइट्स और अधिकांश तरल परत युक्त शीर्ष परत को एस्पिरेट करें; गोली को छूने या परेशान करने से बचें। 20 एमएल ठंडा फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) -2% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) जोड़ें और गोली को फिर से निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर।
  6. शेष एडिपोसाइट्स और वसा को खत्म करने के लिए ऊपरी परत को पहले एस्पिरेट करते हुए सुपरनैटेंट को हटा दें। पेलेट को अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम (एसीके) लाइसिंग बफर (लाल रक्त कोशिकाओं को लाइस करने के लिए) के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें और 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर पीबीएस -2% एफबीएस, मिक्स और सेंट्रीफ्यूज का 10 एमएल जोड़ें।
  7. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें और एंटी-एफसी समाधान (शुद्ध चूहा एंटी-माउस सीडी 16/सीडी 32 पीबीएस -2% एफबीएस [1: 150] में पतला) के 200 μL में गोली को फिर से निलंबित करें ताकि रुचि के एंटीबॉडी द्वारा एफसी रिसेप्टर-मध्यस्थता बंधन को कम किया जा सके। 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। सेल सस्पेंशन को 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जो चुंबकीय सेल विभाजक के प्रीचाइल्ड रैक में फिट बैठता है और सेंट्रीफ्यूज 400 × ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए फिट बैठता है।
  8. सुपरनैटेंट को हटा दें, सीडी 31 (पीईसीएएम -1) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (390)-बायोटिन (1: 100) और सीडी 45 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (30-एफ 11)-बायोटिन (1: 100) के मिश्रण का 200 μL जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं, और 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें (एंटी-एफसी समाधान में एंटीबॉडी कमजोर पड़ने तैयार करें; तालिका 1 देखें)। पीबीएस -2% एफबीएस के 400 μL जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें।
    नोट: सीडी 31 और सीडी 45 क्रमशः एंडोथेलियल कोशिकाओं और हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के मार्कर हैं।
  9. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और बर्फ पर 15 मिनट के लिए एंटी-बायोटिन माइक्रोबीड्स (1: 5) के 100 μL में इनक्यूबेट करें (एंटी-एफसी समाधान में एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की तैयारी करें, तालिका 1 देखें)। पीबीएस -2% एफबीएस के 400 μL जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें।
  10. सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और पीबीएस -2% एफबीएस के 350 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। एकल-सेल निलंबन से सेल समुच्चय या बड़े कणों को पूर्वसंयोग फ़िल्टर (70 μm) के साथ हटा दें। सबसे पहले, पीबीएस -2% एफबीएस के 100 μL के साथ फ़िल्टर को सक्रिय करें, फ़िल्टर के माध्यम से सेल निलंबन पारित करें (एक साफ ट्यूब में एकत्र करें), और अंत में फ़िल्टर को पीबीएस -2% एफबीएस के 100 μL के साथ धो लें।
  11. चुंबकीय कोशिका विभाजक के साथ नकारात्मक पृथक्करण रणनीति का उपयोग करके कोशिकाओं का चुंबकीय पृथक्करण करें।
    1. नमूने को चिल रैक की स्थिति ए में रखें (सुनिश्चित करें कि रैक प्रीकूल्ड है) और दो खाली ट्यूबों को क्रमशः गैर-लेबल और लेबल कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करने के लिए स्थिति बी और सी में रखें।
    2. उपकरण को चालू करने से पहले वाशिंग बफर और रनिंग बफर को संबंधित बोतलों में लोड करें। क्षीण प्रोटोकॉल के साथ कोशिकाओं के चुंबकीय पृथक्करण को करने के लिए उपकरण को प्रोग्राम करें ।
      नोट: यह प्रोटोकॉल सामान्य एंटीजन अभिव्यक्ति (इस मामले में, एंटी-सीडी 31 और एंटी-सीडी 45 के साथ लेबल की गई कोशिकाओं) के साथ कोशिकाओं को हटाने के लिए मानक मोड में कमी के लिए है, यदि वसूली सर्वोच्च प्राथमिकता है।
    3. पृथक्करण अनुभाग में, अलग किए जाने वाले नमूनों की संख्या का चयन करें और समाप्त प्रोटोकॉल का चयन करें। चलाएँ दबाएँ और पृथक्करण प्रारंभ करें. कार्यक्रम के अंत में, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर अनलेबल कोशिकाओं और सेंट्रीफ्यूज को पुनर्प्राप्त करें।
  12. सतह पर तैरने वाले को हटा दें और गोली को 500 μL विकास माध्यम में पुन: निलंबित करें (तालिका 1)।
  13. एपीसी को 12-वेल प्लेट के एक कुएं में बीज दें जो पहले 2.5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (लगभग 50,000-75,000 कोशिकाएं प्राप्त होती हैं) के साथ लेपित होती हैं। प्रत्येक कुएं की पूरी सतह को कवर करने के लिए 2.5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स का 400 μL जोड़ें। अतिरिक्त घोल को हटाने और केवल एक छोटी परत छोड़ने के तुरंत बाद, प्लेट को कम से कम 1 घंटे के लिए लैमिनार प्रवाह हुड के अंदर सूखने (ढक्कन के बिना) दें। 5% CO2 वातावरण में 37 °C पर इनक्यूबेट करें। हर 48 घंटे में माध्यम बदलें जब तक कि कोशिकाएं 80% संगम तक न पहुंच जाएं।
  14. 80% संगम पर, माध्यम को पूरी तरह से हटा दें और पीबीएस -2% एफबीएस के 350 μL से धो लें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 350 μL के साथ कोशिकाओं की कटाई करें। 2 एमएल विकास माध्यम जोड़ें और कोशिकाओं को एक नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें, फिर 5 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  15. एपीसी को 12-वेल प्लेटों (10,000-20,000 कोशिकाओं प्रति कुएं) में पारित करें जो पहले 2.5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ लेपित थे। 5% CO2 के साथ 37 °C पर इनक्यूबेट करें। हर 48 घंटे में माध्यम बदलें जब तक कि कोशिकाएं 80% संगम तक न पहुंच जाएं।
    नोट: एपीआई को एक बार पारित किया जा सकता है। इसके बाद, वे प्रसार और अंतर करने की अपनी क्षमता खो देते हैं। पूरक चित्रा एस 2 में एपीआई अलगाव प्रक्रिया के लिए वर्कफ़्लो देखें।

2. एडिपोसाइट्स भेदभाव और इंसुलिन प्रतिरोध का प्रेरण

नोट: 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखें और एक बाँझ हुड के अंदर टीएनएफ -α और इंसुलिन के साथ माध्यम और उपचार के परिवर्तन से जुड़े चरणों का प्रदर्शन करें।

  1. 80% संगम पर, भेदभाव प्रक्रिया शुरू करें; किसी भी विकास माध्यम से एस्पिरेट करें और इसे 500 μL विभेदन माध्यम (तालिका 1) के साथ प्रतिस्थापित करें जिसमें प्रत्येक कुएं में 3.3 nM हड्डी मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन (BMP4) होता है।
  2. 48 घंटे के बाद, माध्यम को विभेदन माध्यम (500 μL प्रति अच्छी तरह से) और विभेदन कॉकटेल (तालिका 1) के साथ बदलें।
  3. 72 घंटे बाद माध्यम को हटा दें और ताजा भेदभाव माध्यम के 500 μL में 100 nM इंसुलिन जोड़ें।
    नोट: कोशिकाएं अंदर छोटी लिपिड बूंदों के साथ एक गोल उपस्थिति दिखाना शुरू करती हैं।
  4. किसी भी विभेदन माध्यम से एस्पिरेटेड करें और इसे 500 μL के सरल मध्यम-2% FBS (तालिका 1) 48 घंटे बाद प्रतिस्थापित करें। टीएनएफ-α के 4 एनजी / एमएल के साथ इंसुलिन प्रतिरोध को प्रेरित करना। टीएनएफ-α उपचार के बिना नियंत्रण कुओं को शामिल करें।
  5. इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद, सरल मध्यम-0% एफबीएस (तालिका 1) में 4 एनजी / एमएल टीएनएफ -α जोड़ें। टीएनएफ-α उपचार के बिना नियंत्रण कुओं को बनाए रखें।
  6. 24 घंटे बाद 100 एनएम इंसुलिन जोड़कर इंसुलिन सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय करें और 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। माध्यम को निकालें और पीबीएस के 500 μL से धो लें। इंसुलिन उपचार के बिना नियंत्रण कुओं को शामिल करें।

3. पश्चिमी धब्बा द्वारा इंसुलिन सिग्नलिंग मार्ग का मूल्यांकन

  1. प्रोटीन निष्कर्षण और परिमाणीकरण
    1. कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं को 500 μL PBS के साथ धोएं और कोशिकाओं को 50 μL RIPA बफर (तालिका 1) में 1% प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल में विभाजित करने के लिए बर्फ पर रखें। एक टिप के साथ कुएं की पूरी सतह को खुरचें और लाइसेट को 0.6 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें (बर्फ पर रखें)।
    2. घूर्णन शेकर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, भंवर द्वारा मिलाएं, और सेंट्रीफ्यूज को 8,000 × ग्राम पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए और सतह पर तैरने वाले को ठीक करें (बर्फ पर रखें)।
    3. ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें (मात्रा निर्धारित करने के लिए नमूने को पतला न करें)।
    4. 40-60 μg के अनुरूप आवश्यक मात्रा लें और 6x Laemmmli बफर (तालिका 1) के साथ 550 आरपीएम पर हिलते हुए 15 मिनट के लिए 97 °C पर इनक्यूबेट करके डिनेचर लें। उपयोग होने तक फ्रीज करें।
  2. एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन
    1. 1.5 मिमी मोटाई के 7.5% पॉलीक्रिलामाइड जेल के साथ एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) करें। टैंक में जेल डालें और रनिंग बफर (तालिका 1) से भरें।
    2. जेल के पहले कुएं में 3 μL प्रीसाइन्ड प्रोटीन मानक जोड़ें और प्रत्येक नमूने को बाद के कुओं में लोड करें।
    3. लगभग 15 मिनट के लिए जेल को 80 वी पर चलाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि नमूना पॉलीक्रिलामाइड कंसंट्रेटर जेल मैट्रिक्स में प्रवेश करता है। इसके बाद, वोल्टेज को 2.5 घंटे के लिए 90 वी तक बढ़ाएं या जब तक कि जेल के निचले किनारे पर 37 केडीए आणविक भार मार्कर नहीं देखा जा सकता है।
    4. प्रोटीन को जेल से नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में 35 मिनट के लिए 25 वोल्ट पर 35 मिनट के लिए एक अर्ध-शुष्क कक्ष में स्थानांतरित करें।
  3. पश्चिमी धब्बा
    1. स्थानांतरण के बाद, झिल्ली को ट्राइस-बफर्ड सेलाइन (टीबीएस) के साथ धोएं जिसमें 0.1% ट्वीन 20 (टीबीएस-टी 0.1%) (तालिका 1) 30 आरपीएम पर हिलने के साथ 3 मिनट के लिए हो।
    2. निरंतर घूर्णन में 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉकिंग समाधान (तालिका 1) के साथ झिल्ली को अवरुद्ध करें।
    3. आणविक भार मार्कर के अनुसार झिल्ली को तीन भागों में काटें ताकि निरंतर रोटेशन में 4 डिग्री सेल्सियस पर विभिन्न प्राथमिक एंटीबॉडी (ब्लॉकिंग समाधान में पतला) के साथ रात भर इनक्यूबेट किया जा सके: फॉस्फो-आईआरएस 1 (टायर 608) एंटीबॉडी (1: 1,000), 180 केडीए पर अपेक्षित बैंड; फॉस्फो-इंसुलिन रिसेप्टर β (टायर 1150/1151) एंटीबॉडी (1: 1,000), 95 केडीए पर अपेक्षित बैंड; फॉस्फो-एकेटी (Ser473) एंटीबॉडी (1: 1,000), 60 kDA पर अपेक्षित बैंड।
    4. टीबीएस-टी 0.1% के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए झिल्ली को 5x धोएं।
    5. निरंतर रोटेशन में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए संबंधित पेरोक्सीडेज-युग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी (ब्लॉकिंग समाधान में पतला) के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें: पेरोक्सीडेज एफिनीप्योर गधे विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल) (1: 5,000)।
    6. टीबीएस-टी 0.1% के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए झिल्ली को 5x धोएं।
    7. केमिलुमिनेसेंस डिटेक्शन सिस्टम का उपयोग करके प्रोटीन का पता लगाएं। निर्माता के निर्देशों के अनुसार सब्सट्रेट तैयार करें।
    8. धब्बे को एक प्लास्टिक बैग में रखें और झिल्ली को पूरी तरह से कवर करने के लिए 200 μL केमिल्यूमिनेसेंट सब्सट्रेट जोड़ें। अतिरिक्त सब्सट्रेट को निकालें और किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें।
    9. केमिल्यूमिनेसेंस के साथ संगत उच्च प्रदर्शन इमेजिंग सिस्टम में 30-60 सेकंड के लिए प्रत्येक धब्बा को उजागर करें।
    10. एंटीबॉडी-एंटीजन इंटरैक्शन को तोड़ने के लिए झिल्ली (पश्चिमी धब्बा अनुभाग के चरण 10-13) को पट्टी करें और इस प्रकार नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को फिर से धब्बा लगाने की अनुमति दें। झिल्ली को पुनर्प्राप्त करें और 50 आरपीएम पर टीबीएस-टी 1% के साथ 5 मिनट के लिए 3x धोएं।
    11. 50 आरपीएम पर 0.2 एम एनएओएच के 10 एमएल के साथ 7 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    12. 50 आरपीएम पर नल के पानी से 5 मिनट के लिए 3x धो लें।
    13. 50 आरपीएम पर टीबीएस-टी 1% के साथ 10 मिनट के लिए धो लें।
    14. 1: 1,000 कमजोर पड़ने का उपयोग करके लोडिंग नियंत्रण के रूप में एंटी-बीटा ट्यूबुलिन (55 केडीए) के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करने के लिए पश्चिमी धब्बा अनुभाग के चरण 2-9 को दोहराएं।
    15. इमेजजे सॉफ्टवेयर (https://imagej.nih.gov/) का उपयोग करके प्रत्येक प्रोटीन के लिए डेंसिटोमेट्रिक विश्लेषण25 करें।

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Representative Results

पिछले कुछ वर्षों में, मोटापे और टी 2 डी के बढ़ते प्रसार ने वसा ऊतक में इंसुलिन प्रतिरोध की मध्यस्थता करने वाले तंत्र के लिए एक गहन खोज को प्रेरित किया है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल के साथ, इंसुलिन प्रतिरोध और संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए एपीआई को परिपक्व एडिपोसाइट्स में विभेदित किया जा सकता है। एक बार जब एपीआई संगम तक पहुंच जाते हैं, तो परिपक्व एडिपोसाइट्स और इंसुलिन प्रतिरोध के उनके टीएनएफ-α-मध्यस्थता प्रेरण में उनके भेदभाव को पूरा करने में 10 दिन लगते हैं (चित्रा 1)।

एपीसी एक फाइब्रोब्लास्ट जैसी आकृति विज्ञान दिखाते हैं, जो उनके सपाट और लम्बी आकार की विशेषता है और सीडिंग के 48 घंटे बाद पूरा हुआ प्लेट से उनका आसंजन (चित्रा 2 ए)। एपीसी को 80% संगम (बीज कोशिकाओं की संख्या के आधार पर) तक पहुंचने में 2-5 दिन लगते हैं, एक समय जिस पर विभेदन प्रक्रिया विभेदक कॉकटेल (चित्रा 2 ए) के संपर्क में शुरू होती है। परिपक्व एडिपोसाइट्स अगले 6-8 दिनों में दिखाई देने लगते हैं। विभेदित एडिपोसाइट्स को एक गोल आकृति विज्ञान और लिपिड बूंदों के इंट्रासेल्युलर संचय की विशेषता है। विभेदन प्रक्रिया के अंत में 80% तक कोशिकाओं को विभेदित किया जाता है (चित्रा 2 बी)।

इंसुलिन प्रतिरोध 48 घंटे के लिए टीएनएफ-α उपचार (4 एनजी / एमएल) द्वारा प्राथमिक एडिपोसाइट्स में प्रेरित होता है; टीएनएफ-α की यह एकाग्रता सेल व्यवहार्यता (पूरक चित्रा एस 3) को नहीं बदलती है। इसके बाद, इंसुलिन सिग्नलिंग मार्ग को 15 मिनट के लिए 100 एनएम इंसुलिन जोड़कर सक्रिय किया जाता है, और मुख्य सिग्नलिंग अणुओं (आईआर, आईआरएस -1, और एकेटी) के फॉस्फोराइलेशन को पश्चिमी धब्बा द्वारा मापा जाता है। इंसुलिन नियंत्रण, गैर-उपचारित विभेदित एडिपोसाइट्स की तुलना में इन तीन अणुओं (चित्रा 3) के फॉस्फोराइलेशन को उत्तेजित करता है। टीएनएफ-α आईआर (30%), आईआरएस -1 (20%), और एकेटी (45%) के इंसुलिन-प्रेरित फॉस्फोराइलेशन को कम करता है (चित्रा 3)। इंसुलिन प्रतिरोधी कोशिकाएं इंसुलिन-संवेदनशील कोशिकाओं की तुलना में इंसुलिन सिग्नलिंग मार्ग की कम सक्रियता दिखाती हैं। इसके अलावा, टीएनएफ-α उपचार ज्ञात इंसुलिन-संवेदनशीलता मार्करों की एमआरएनए अभिव्यक्ति को कम करता है: इन्सर, आईआरएस 2, ग्लूट 4, और एडिपोक (पूरक चित्रा एस 4)। ये निष्कर्ष पुष्टि करते हैं कि टीएनएफ -α प्राथमिक एडिपोसाइट्स में इंसुलिन की कार्रवाई को कम करता है, और इस तरह इंसुलिन प्रतिरोध को प्रेरित करता है।

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध समयरेखा एडिपोसाइट्स अग्रदूत सेल भेदभाव और इंसुलिन प्रतिरोध के प्रेरण की प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करती है। एपीसी को कोलेजनेस उपचार और चुंबकीय कोशिका पृथक्करण तकनीक का उपयोग करके चमड़े के नीचे वसा ऊतक से अलग किया जाता है। फिर, वे प्राथमिक एडिपोसाइट्स प्राप्त करने के लिए 7 दिन की भेदभाव प्रक्रिया से गुजरते हैं। इसके बाद, इंसुलिन सिग्नलिंग मार्ग के सक्रियण को रोकने के लिए इंसुलिन प्रतिरोध को 48 घंटे के लिए टीएनएफ-α के साथ प्रेरित किया जाता है, माध्यम में पहले 24 घंटे में 2% एफबीएस होता है और अगले 24 घंटे सीरम-मुक्त माध्यम के साथ होता है। सिग्नलिंग कैस्केड इंसुलिन के साथ सक्रिय होता है और आईआर, आईआरएस -1 और एकेटी के फॉस्फोराइलेशन / सक्रियण का मूल्यांकन करने के लिए भेदभाव प्रक्रिया शुरू करने के 10 दिन बाद पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए प्रोटीन निकाला जाता है। संक्षेप: एपीसी = एडिपोसाइट्स अग्रदूत कोशिकाएं; बीएमपी 4 = हड्डी मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन; आईबीएमएक्स = 3-आइसोब्यूटिल-1-मिथाइलक्सैंथिन; टीएनएफ-α = ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α; एफबीएस = भ्रूण गोजातीय सीरम; आईआर = इंसुलिन रिसेप्टर; आईआरएस = इंसुलिन रिसेप्टर सब्सट्रेट; एकेटी = प्रोटीन काइनेज बी; Tx = उपचार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: एडिपोसाइट्स अग्रदूत कोशिकाओं और परिपक्व एडिपोसाइट्स की आकृति विज्ञान। (ए) 12-वेल कल्चर प्लेटों में भेदभाव को प्रेरित करने से पहले 80% संगम पर चमड़े के नीचे के एपीआई। (बी) 12-वेल कल्चर प्लेटों में विभेदन को प्रेरित करने के 7 दिनों के बाद चमड़े के नीचे प्राथमिक एडिपोसाइट्स। छवियों को 10x आवर्धन पर लिया गया था। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षिप्त नाम: एपीसी = एडिपोसाइट अग्रदूत कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: चमड़े के नीचे प्राथमिक एडिपोसाइट्स में टीएनएफ-α द्वारा प्रेरित इंसुलिन प्रतिरोध आईआर, आईआरएस -1 और एकेटी के इंसुलिन-प्रेरित फॉस्फोराइलेशन में कमी से प्रदर्शित होता है। चमड़े के नीचे एडिपोसाइट्स को 48 घंटे के लिए टीएनएफ-α (4 एनजी / एमएल) के साथ इलाज किया गया और पिछले 24 घंटे के लिए सीरम-भूखा था। 15 मिनट के लिए इंसुलिन (100 एनएम) के साथ उत्तेजना के बाद, कुल प्रोटीन का 40 μg 7.5% जैल पर लोड किया गया और एसडीएस-पेज के अधीन किया गया, नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित किया गया, और टीबीएस-टी 0.1% में 4% गैर-वसा वाले दूध में अवरुद्ध किया गया। झिल्ली की जांच एंटी-फॉस्फोराइलेटेड आईआर (पीआईआर), एंटी-फॉस्फोराइलेटेड आईआरएस -1 (पीआईआरएस -1), और एंटी-फॉस्फोराइलेटेड एकेटी (पीएकेटी) के साथ-साथ एक एंटी-खरगोश एचआरपी द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ की गई थी। सिग्नल को केमिलुमिनेसेंस डिटेक्शन के साथ कल्पना की गई थी और एंटी-β ट्यूबुलिन का उपयोग लोडिंग कंट्रोल के रूप में किया गया था। (ए) प्रतिनिधि धब्बा और (बी) तीन स्वतंत्र प्रयोगों से परिमाणीकरण। डेटा एसईएम ± मतलब है; *, पी < .05 बनाम नियंत्रण। संक्षिप्तीकरण: टीएनएफ-α = ट्यूमर नेक्रोसिस कारक-α; आईआर = इंसुलिन रिसेप्टर; आईआरएस = इंसुलिन रिसेप्टर सब्सट्रेट; पीएक्स = एक्स का फॉस्फोराइलेटेड रूप; बी-टब = बीटा-ट्यूबुलिन; एचआरपी = हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज; Ctrl = नियंत्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एंटी-एफसी समाधान शुद्ध चूहा एंटी-माउस सीडी 16 / सीडी 32 पीबीएस में पतला -2% एफबीएस [1:150]
टीबीएस-टी 0.1% 0.01 M Tris-HCl (pH 8), 0.15 M NaCl, 0.1% ट्वीन 20
ब्लॉकिंग समाधान टीबीएस-टी में पतला 4% नॉनफैट सूखा दूध 0.1%
विकास का माध्यम 60% डीएमईएम कम ग्लूकोज, 40% एमसीडीबी 201 मीडियम, 1एक्स पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 एनएम डेक्सामेथासोन, 0.1 एमएम एल-एस्कॉर्बिक एसिड 2-फॉस्फेट, 1एक्स इंसुलिन, ट्रांसफरिन, सोडियम, सेलेनाइट (आईटीएस) तरल मीडिया पूरक, बीएसए से 1 एक्स लिनोलिक एसिड-एल्ब्यूमिन, 10% एफबीएस, 10 एनजी / एमएल एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), 10 एनजी / 5 एनजी / एमएल फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक-बुनियादी (बीएफजीएफ), और 50 μg / mL normocin
विभेदन माध्यम 60% डीएमईएम कम ग्लूकोज, 40% एमसीडीबी 201 मध्यम, 1 एक्स पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 एनएम डेक्सामेथासोन, 0.1 एमएम एल-एस्कॉर्बिक एसिड 2-फॉस्फेट, 1 एक्स आईटीएस तरल मीडिया पूरक, बीएसए से 1 एक्स लिनोलिक एसिड-एल्ब्यूमिन, और 2% एफबीएस
विभेदन कॉकटेल 0.5 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine [IBMX], 1 μM dexamethasone, 10 μM रोज़िग्लिटाज़ोन, और 100 nM इंसुलिन
सरल मध्यम -2% एफबीएस 60% डीएमईएम कम ग्लूकोज, 40% एमसीडीबी 201 मध्यम, 1 एक्स पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2% एफबीएस
सरल मध्यम-0% एफबीएस 60% डीएमईएम कम ग्लूकोज, 40% एमसीडीबी 201 मध्यम, 1 एक्स पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन
RIPA बफर 50 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% ऑक्टाइलफेनोक्सी पॉली (एथिलीनॉक्सी) इथेनॉल, 1 mM Na3VO4, 48.8 mM NaF, 8.2 mM Na4P2O7, और 0.26 M सैकरास
6x Laemmli buffer 1.2 ग्राम एसडीएस, 6 मिलीग्राम ब्रोमोफेनॉल ब्लू, 4.7 एमएल ग्लिसरॉल, 1.2 एमएल ट्राइस बेस 0.5 एम पीएच 6.8, 845 μL 2- मर्काप्टोएथेनॉल, और 2.1 एमएल एच2ओ
रनिंग बफर 25 mM Tris बेस, 192 mM ग्लाइसिन, 1% SDS
स्थानांतरण बफर 25 mM Tris-base, 192 mM ग्लाइसिन, 20% मेथनॉल

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधान।

पूरक चित्रा एस 1: कोलेजनेज के साथ पचने वाले चमड़े के नीचे वसा ऊतक। एक बार वसा ऊतक को हटा दिए जाने के बाद, पाचन प्रक्रिया (ए) शुरू करने के लिए इसे कैंची के साथ छोटे टुकड़ों में काट दिया जाता है, फिर इसे 37 डिग्री सेल्सियस, 150 आरपीएम (बी) पर कोलेजनेज टाइप 1 के साथ 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: एडिपोसाइट अग्रदूत सेल अलगाव प्रक्रिया की योजना। इंगुइनल चमड़े के नीचे वसा ऊतक को विच्छेदित करें और कोलेजनेज के साथ नमूने को पचाएं। सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा परिपक्व एडिपोसाइट्स को हटा दें और अतिरिक्त वसा को हटाने के लिए गोली को धो लें। गैर-विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए लाल रक्त कोशिकाओं और ब्लॉक को अलग करें। एंडोथेलियल कोशिकाओं और मैक्रोफेज को चुंबकीय कणों के साथ युग्मित एंटीबॉडी के साथ लेबल करें। चुंबकीय कोशिका विभाजक के साथ नकारात्मक पृथक्करण रणनीति का उपयोग करके कोशिकाओं का चुंबकीय पृथक्करण करें। बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स से ढकी प्लेटों में बीज एपीआई (बिना लेबल वाली कोशिकाएं)। हर 48 घंटे में माध्यम बदलें जब तक कि कोशिकाएं 80% संगम तक न पहुंच जाएं। संक्षेप: एपीसी = एडिपोसाइट्स अग्रदूत कोशिकाएं; बीएसए = गोजातीय सीरम एल्बुमिन; एफबीएस = भ्रूण गोजातीय सीरम। Biorender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 3: इंसुलिन प्रतिरोध को प्रेरित करने के लिए टीएनएफ-α के साथ उपचार एडिपोसाइट्स की व्यवहार्यता को नहीं बदलता है। परिपक्व एडिपोसाइट्स की व्यवहार्यता को एमटीटी परख द्वारा 48 घंटे के लिए टीएनएफ -α के 4 एनजी / एमएल के साथ उपचार के बाद मापा गया था। संक्षेप: टीएनएफ-± α = ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α; Ctrl = नियंत्रण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 4: एडिपोसाइट्स में टीएनएफ-α उपचार इंसुलिन संवेदनशीलता मार्करों की अभिव्यक्ति को कम करता है। इंसर, आईआरएस, ग्लूट 4 और एडिपोक की एमआरएनए अभिव्यक्ति को 48 घंटे के लिए टीएनएफ-α के 4 एनजी / एमएल के साथ उपचार के बाद वास्तविक समय पीसीआर द्वारा मापा गया था। डेटा एसईएम ± मतलब है; *, पी < .05 बनाम नियंत्रण। संक्षिप्तीकरण: टीएनएफ-α = ट्यूमर नेक्रोसिस कारक-α; Ctrl = नियंत्रण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह पेपर इंसुलिन प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है जो टीएनएफ -α के साथ इलाज की गई संस्कृति में प्राथमिक एडिपोसाइट्स का उपयोग करता है। इस मॉडल का लाभ यह है कि प्राथमिक एडिपोसाइट्स को सेलुलर पर्यावरणीय कारकों के कड़े नियंत्रण के साथ लंबे समय तक परिभाषित परिस्थितियों में सुसंस्कृत किया जा सकताहै। परख की अवधि 15-20 दिन है, हालांकि प्रयोगों के बीच विभेदित एडिपोसाइट्स के प्रतिशत में भिन्नता हो सकती है। प्राथमिक एडिपोसाइट्स में सेल लाइनों पर फायदे हैं क्योंकि उन्हें संस्कृति में लगातार विस्तारित नहीं किया गया है और ऊतक की विविधता को अधिक बारीकी से कैप्चर करते हैं जिससे वे प्राप्तहोते हैं। इसके अलावा, प्राथमिक एडिपोसाइट्स विभिन्न फिजियो-पैथोलॉजिकल संदर्भों के तहत दाताओं का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं, जैसे कि दुबला बनाम मोटापे, पुरुष बनाम महिला, युवा बनाम बूढ़े, और विभिन्न वसा डिपो से कोशिकाएं। इस विधि का एक और लाभ यह है कि सीआरई और नॉकआउट चूहों से सेल लाइनें एपीआई अलगाव के बाद उत्पन्न की जा सकती हैं।

एपीआई अलगाव और भेदभाव के दौरान एक संभावित समस्या यह है कि ये कोशिकाएं अंतर करने की क्षमता खो सकती हैं, जो संभवतः तब होगी जब भेदभाव प्रक्रिया की शुरुआत में 80% संगम पार हो जाएगा। माध्यम को भी बहुत धीरे से बदला जाना चाहिए, खासकर लिपिड संचय के बाद, क्योंकि विभेदित एडिपोसाइट्स आसानी से संस्कृति डिश से अलग हो जाते हैं। इसके अलावा, कोलेजनेज के प्रत्येक लॉट को पाचन दक्षता, सेल उपज और साइटोटॉक्सिसिटी26 के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। सीडी 31 और सीडी 45 जैसे नकारात्मक मार्करों के साथ-साथ सीडी 34 और एससीए 128,29 जैसे सकारात्मक स्टेम सेल जनसंख्या मार्करों का उपयोग करके सफेद वसा ऊतक के स्ट्रोमोवास्कुलर अंश से एपीआई की पहचान और अलग करने के लिए तकनीकों का विकास किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, हम केवल एक नकारात्मक पृथक्करण करते हैं, स्ट्रोमोवास्कुलर अंश से एंडोथेलियल कोशिकाओं और मैक्रोफेज को समाप्त करते हैं, इस प्रकार सकारात्मक पृथक्करण में प्रीडिपोसाइट्स के नुकसान से बचते हैं।

यद्यपि प्राथमिक संस्कृतियां दाता परिवर्तनशीलता और जटिलता27,30 के अध्ययन की अनुमति देती हैं, प्रयोगात्मक मॉडल स्थापित करना सीमाओं का परिचय देता है। उदाहरण के लिए, पुराने जानवरों से अलग एडिपोसाइट्स मेंयुवा जानवरों की तुलना में कम विभेदन क्षमता और लिपोटॉक्सिसिटी की उच्च दर होगी। प्रोटोकॉल को विभिन्न सेल पृथक्करण तकनीकों का उपयोग करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। यदि एक स्वचालित चुंबकीय सेल विभाजक उपलब्ध नहीं है, तो स्तंभों या एफएसीएस सॉर्टिंग के साथ कोशिकाओं का मैन्युअल पृथक्करण प्राप्त किया जा सकता है। चुंबकीय सेल विभाजक का उपयोग करके एपीआई अलगाव के लिए यहां वर्णित विधि मैकोटेला एट अल.28 द्वारा वर्णित एफएसीएस सॉर्टिंग प्रोटोकॉल का एक अनुकूलित और सरलीकृत संस्करण है।

वसा कोशिकाओं में इंसुलिन प्रतिरोध को प्रेरित करने के लिए कई भड़काऊ साइटोकिन्स का उपयोग किया गया है, जिसमें टीएनएफ-α, आईएल -1, और आईएल -6 18,33,34,35,36 शामिल हैं। टीएनएफ-α के संपर्क में आने वाले सुसंस्कृत 3टी3-एल 1 एडिपोसाइट्स कई दिनों के भीतर इंसुलिन प्रतिरोधी हो जाते हैं, जैसा कि ग्लूकोज अपटेक को उत्तेजित करने के लिए इंसुलिन की कम क्षमता द्वारा मूल्यांकन कियागया है। इन परिणामों से पता चलता है कि टीएनएफ-α आईआर, आईआरएस -1 और एकेटी21,23 के इंसुलिन-प्रेरित फॉस्फोराइलेशन को कम करता है, जिसे प्राथमिक एडिपोसाइट्स से निकाले गए कुल प्रोटीन के पश्चिमी धब्बा का पता लगाने से मापा जाता है। हालांकि, सेल लाइसिस के दौरान जारी प्रोटीज और फॉस्फेटेस पश्चिमी धब्बा का पता लगाने को प्रभावित कर सकते हैं। प्रोटीन की सक्रिय स्थिति को लाइसिस बफर में प्रोटीज और फॉस्फेट इनहिबिटर के अलावा और प्रोटीन परिमाणीकरण के बाद, नमूने को लैमली बफर के साथ मिलाकर संरक्षित किया जाना चाहिए। निष्कर्ष में, यह विधि माउस एपीआई से विभेदित एडिपोसाइट्स में इंसुलिन प्रतिरोध की मध्यस्थता करने वाले तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करती है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम डैनियल मोंद्रागोन, एंटोनियो प्राडो, फर्नांडो लोपेज़-बैरेरा, मार्टिन गार्सिया-सर्विन, एलेजांद्रा कैस्टिला और मारिया एंटोनीटा कार्बाजो को उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं, और पांडुलिपि को गंभीर रूप से संपादित करने के लिए जेसिका गोंजालेज नॉरिस। इस प्रोटोकॉल को कंसेजो नेशनल डी सिएन्सिया और टेक्नोलोजिया डी मेक्सिको (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigacion para la Educacion Grant 284771 (Y.M.) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Isolation mouse adipocyte precursor cells
ACK lysing buffer  LONZA 10-548E
Anti-Biotin Microbeads  Miltenyi 130-090-485
Anti-CD31 eBioscience 13-0311-85
AutoMACS Pro Separator Miltenyi
Basement membrane matrix (matrigel) Corning 354234
bFGF Sigma F0291 Growth factor
BSA Equitech-Bio, Inc. BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin  eBioscience 13-0451-85
Collagenase, Type 1 Worthington Biochem LS004197
Dexamethasone Sigma D1756
DMEM GIBCO 12800017
DMEM low glucose GIBCO 31600-034
EGF Peprotech 315-09 Growth factor
FBS GIBCO 26140-079
ITS mix Sigma I3146
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960
LIF Millipore ESG1107 Growth factor
Linoleic acid-albumin Sigma L9530
MCDB 201 medium Sigma M6770
Normocin InvivoGen ant-nr-2
PDGF-BB  Peprotech 315-18 Growth factor
Peniciline-Streptomycine BioWest L0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm) Miltenyi 130-095-823
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32  BD Pharmingen 553142
Trypsin-EDTA  GIBCO 25300062
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] Sigma I5879 Differentiation cocktail
BMP4 R&D Systems 5020-BP-010 Differentiation cocktail
Dexamethasone Sigma D1756 Differentiation cocktail
Insulin Sigma I9278
Rosiglitazone Cayman 71742 Differentiation cocktail
TNFα R&D Systems 210-TA-005 
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot
Anti-beta tubulin antibody Abcam ab6046
Bromophenol blue BioRad 161-0404 Laemmli buffer
EDTA Sigma E5134 RIPA buffer
EGTA Sigma E4378 RIPA buffer
FluorChem E system ProteinSimple
Glycerol Sigma G6279 Laemmli buffer
Glycine Sigma G7126 Running and Transfer buffer
Igepal Sigma I3021 RIPA buffer
2- mercaptoethanol Sigma M3148 Laemmli buffer
Methanol JT Baker 907007 Transfer buffer
NaCl JT Baker 3624-05 TBS-T
NaF Sigma 77F-0379 RIPA buffer
NaOH  JT Baker 3722-19
Na4P2O7 Sigma 114F-0762 RIPA buffer
Na3VO4 Sigma S6508 RIPA buffer
Nitrocellulose membrane  BioRad 1620112
Nonfat dry milk BioRad 1706404 Blocking solution
Prestained protein standard  BioRad 1610395
Protease inhibitor cocktail  Sigma P8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)  Jackson ImmunoResearch 711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β  Cell signaling 3024
Phospho-Akt (Ser473) Antibody Cell signaling 9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody Millipore 9432
Saccharose  JT Baker 407205 RIPA buffer
SDS BioRad 1610302 Running and laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34577
Tris-base Promega H5135 Running, transfer and laemmli buffer
Tris-HCl JT Baker 4103-02 RIPA buffer - TBS
Tween 20 Sigma P1379 TBS-T

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References

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Ruiz-Herrera, X., Luzardo-Ocampo, I., Martínez de la Escalera, G., Clapp, C., Macotela, Y. Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance. J. Vis. Exp. (192), e63979, doi:10.3791/63979 (2023).

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