Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Differentierede museadipocytter i primær kultur: en model for insulinresistens

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/63979
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

Summary

Denne protokol beskriver isoleringen af musepreadipocytter fra subkutant fedt, deres differentiering i modne adipocytter og induktionen af insulinresistens. Insulinvirkningen evalueres ved phosphorylering/aktivering af medlemmer af insulinsignalvejen gennem western blot. Denne metode muliggør direkte bestemmelse af insulinresistens/følsomhed i primære adipocytter.

Abstract

Insulinresistens er en reduceret virkning af insulin på dets målceller, normalt afledt af nedsat insulinreceptorsignalering. Insulinresistens bidrager til udviklingen af type 2-diabetes (T2D) og andre fedmeafledte sygdomme med høj forekomst på verdensplan. Derfor er forståelse af mekanismerne bag insulinresistens af stor relevans. Flere modeller er blevet brugt til at studere insulinresistens både in vivo og in vitro; Primære adipocytter repræsenterer en attraktiv mulighed for at studere mekanismerne for insulinresistens og identificere molekyler, der modvirker denne tilstand og de molekylære mål for insulinsensibiliserende lægemidler. Her har vi etableret en insulinresistensmodel ved hjælp af primære adipocytter i kultur behandlet med tumornekrosefaktor-α (TNF-α).

Adipocytprecursorceller (APC'er), isoleret fra kollaganasefordøjet musesubkutant fedtvæv ved magnetisk celleseparationsteknologi, differentieres til primære adipocytter. Insulinresistens induceres derefter ved behandling med TNF-α, et proinflammatorisk cytokin, der reducerer tyrosinphosphoryleringen / aktiveringen af medlemmer af insulinsignalkaskaden. Nedsat phosphorylering af insulinreceptor (IR), insulinreceptorsubstrat (IRS-1) og proteinkinase B (AKT) kvantificeres ved western blot. Denne metode giver et fremragende værktøj til at studere de mekanismer, der medierer insulinresistens i fedtvæv.

Introduction

Insulin er et anabolsk hormon produceret af bugspytkirteløen β-celler og nøgleregulatoren for glukose- og lipidmetabolisme. Blandt dets mange funktioner regulerer insulin glukoseoptagelse, glykogensyntese, glukoneogenese, proteinsyntese, lipogenese og lipolyse1. Det indledende molekylære signal efter insulininteraktion med dets receptor (IR) er aktiveringen af den iboende tyrosinproteinkinaseaktivitet afIR2, hvilket resulterer i dets autophosphorylering3 og den efterfølgende aktivering af en familie af proteiner kendt som insulinreceptorsubstrater (IRS), som binder til adaptorproteiner, hvilket fører til aktivering af en kaskade af proteinkinaser4 . Insulin aktiverer to hovedsignalveje: phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-proteinkinase B (AKT) og Ras-mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK). Førstnævnte udgør et vigtigt grenpunkt eller knude 4,5 til aktivering af adskillige downstream-effektorer, der er involveret i forskellige fysiologiske funktioner, herunder regulering af brændstofhomeostase, mens sidstnævnte regulerer cellevækst og differentiering 4,6. Insulinhandlinger afhænger i sidste ende af celletypen og den fysiologiske kontekst7.

Et af de vigtigste insulinresponsive metaboliske væv er fedtvævet. Hvidt fedtvæv er den mest rigelige type fedt hos mennesker og gnavere, fordelt inden for subkutant fedt (mellem hud og muskler) og visceralt fedt (omkring organerne i bughulen). På grund af deres store volumen er adipocytter eller fedtceller den mest rigelige celletype i fedtvæv. Disse fedtceller kan være brune/beige (termogene), lyserøde (i brystkirtlen) og hvide 8,9. Hvide adipocytter holder de vigtigste energireserver i kroppen i form af triglycerider, en insulinafhængig proces. Insulin fremmer glukosetransport og lipogenese, mens det hæmmer lipolyse eller lipidnedbrydning 7,10. Det letter også differentieringen af preadipocytter i adipocytter - de modne fedtlagrende celler11.

Insulinresistens opstår, når et normalt insulinniveau producerer et svækket biologisk respons, hvilket resulterer i kompenserende hyperinsulinæmi12. Insulinresistens er en tilstand forbundet med overvægt og fedme5, at når kombineret fører til type 2-diabetes (T2D) og andre metaboliske sygdomme13. Hyperinsulinæmi kompenserer insulinresistens i perifere væv for at opretholde normale blodsukkerniveauer14. Imidlertid fører eventuelt tab eller udmattelse af β celler sammen med forværret insulinresistens til forhøjede blodsukkerniveauer i overensstemmelse med T2D5. Derfor kan insulinresistens og hyperinsulinæmi bidrage til udviklingen af fedmeafledte metaboliske sygdomme15. Desuden kan fedme forårsage kronisk lavgradig lokal inflammation, der fremmer insulinresistens i fedtvæv15,16,17. Derudover fører fedmeafledte ændringer i fedtvæv, såsom fibrose, inflammation og reduceret angiogenese og adipogenese, til lavere adiponectinserumniveauer (et insulinsensibilisator) og øget sekretion af faktorer såsom plasminogenaktivatorhæmmer 1 (PAI-1), frie fedtsyrer og eksosomer i blodbanen, hvilket forværrer insulinresistens17.

Mange aspekter af insulinresistens forbliver ukendte. In vitro og in vivo modeller er blevet udviklet til at studere de mekanismer, der medierer insulinresistens i større målvæv, herunder fedtvæv. Fordelen ved in vitro-modeller er, at forskerne har mere kontrol over miljøforholdene og kan vurdere insulinresistens i specifikke celletyper. Især har adipocytprecursorceller (APC'er) donorvævets individuelle fænotype, hvilket kan afspejle fysiologi bedre end adipocytcellelinjer. En hovedfaktor, der inducerer insulinresistens in vitro, er tumornekrosefaktor-α (TNF-α). TNF-α er et proinflammatorisk cytokin udskilt af adipocytter og makrofager i fedtvæv18. Mens det er nødvendigt for korrekt fedtvæv remodellering og ekspansion19, langvarig eksponering for TNF-α inducerer insulinresistens i fedtvæv in vivo og i adipocytter in vitro20. Kronisk TNF-α behandling af flere celletyper fører til øget serinphosphorylering af både IR og IRS-1 og derved fremmer nedsat tyrosinphosphorylering21. Øget phosphorylering af IRS-1 på serinrester hæmmer IR-tyrosinkinaseaktiviteten og kan være en af de vigtigste mekanismer, hvormed kronisk TNF-α-behandling forringer insulinvirkningen22,23. TNF-α aktiverer veje, der involverer serin/threoninkinasehæmmeren af kernefaktor ĸB-kinase β (IKKβ) og c-Jun N terminalkinase (JNK)24. JNK inducerer et komplekst proinflammatorisk transkriptionsprogram, men også direkte phosphorylater IRS-16.

Forståelse af patogenesen af insulinresistens er blevet stadig vigtigere for at styre udviklingen af fremtidige terapier mod T2D. APC'er har vist sig at være en fremragende model til undersøgelse af fedtcellebiologi, herunder følsomhed og resistens over for insulin, og til identifikation af de iboende egenskaber ved adipocytter uafhængigt af det systemiske miljø. APC'er kan let opnås fra forskellige fedtdepoter og under passende betingelser differentieres til modne adipocytter. Med denne metode kan direkte virkninger på insulinresistens/følsomhed evalueres i adipocytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle gnaverforsøg blev godkendt af Bioethics Committee of the Institute of Neurobiology of the UNAM, protokolnummer 075.

1. Isolering af museadipocytprecursorceller

  1. Aflive 8-10 uger gamle C57BL/6-hanmus (f.eks. ved CO2 indånding og efterfølgende cervikal dislokation) (fire dyr pr. isolation). Desinficer musene ved at gnide med 70% ethanol og få fedtvævet umiddelbart efter ofring.
    BEMÆRK: Efter eutanasi af gnavere skal du straks isolere fedtvævet og udføre alle trin inde i en steril laminar strømningshætte. Mus holdes under 12 timers lys/mørke cyklusser med fri adgang til mad og vand.
  2. Dissekere det inguinale subkutane fedtvæv fra hver mus. Fjern kun fedtvævet, undgå fjernelse af muskler, hud eller andet væv, og saml det i et 50 ml konisk rør indeholdende 15 ml type 1 kollagenaseopløsning (1,5 mg / ml) på is. Opløs type 1 collagenase i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) højt glukose-1% bovin serumalbumin (BSA) og filtrer gennem 0,2 μm sprøjtefiltre.
  3. Fedtvævet skæres i små stykker med steril kirurgisk saks og fordøjes prøverne ved inkubation med type 1 kollagenaseopløsning ved 37 °C i en orbitalryster (150 omdr./min.) i 30 minutter (anbring røret med fedt og kollagenase vandret for en større rysteoverflade). Kontroller fordøjelsen hvert 10. minut for at sikre, at den virker (vævsnedbrydning er synlig) og for at forhindre overfordøjelse (se supplerende figur S1).
  4. Filtrer ved hjælp af en 200 μm maskesprøjte (tidligere autoklaveret) for at fjerne væv, der ikke er fordøjet med kollaganase. Før filteret over kanten af røret for at dræne så mange celler som muligt ind i opløsningen. Tilsæt 15 ml kold DMEM-1% BSA for at stoppe fordøjelsen og centrifuger ved 400 × g i 10 minutter ved 4 °C.
  5. Opsug det øverste lag, der indeholder modne adipocytter og det meste af det flydende lag; Undgå at røre ved eller forstyrre pelleten. Tilsæt 20 ml koldt fosfatbufret saltvand (PBS)-2% føtalt bovint serum (FBS) og resuspender pelleten. Der centrifugeres ved 400 × g i 5 minutter ved 4 °C.
  6. Supernatanten fjernes, idet det øverste lag først suges til for at fjerne de resterende adipocytter og fedt. Pellet resuspenderes i 1 ml ammoniumchloridkalium (ACK) lyserende buffer (for at lysere røde blodlegemer) og inkuberes på is i 5 min. Tilsæt 10 ml PBS-2% FBS, bland og centrifuger ved 400 × g i 5 minutter ved 4 °C.
  7. Supernatanten suges op, og pelletpen resuspenderes i 200 μL anti-Fc-opløsning (renset CD16/CD32 fortyndet i PBS-2% FBS [1:150]) for at reducere Fc-receptormedieret binding med antistoffer af interesse. Inkuber på is i 5 min. Overfør cellesuspensionen til et 5 ml rør, der passer ind i de forkølede stativer i en magnetisk celleseparator, og centrifuger ved 400 × g i 5 minutter ved 4 °C.
  8. Supernatanten fjernes, tilsættes 200 μL af blandingen af CD31(PECAM-1)monoklonalt antistof (390)-biotin (1:100) og CD45 monoklonalt antistof (30-F11)-biotin (1:100), blandes godt og inkuberes på is i 15 minutter (antistoffortyndinger fremstilles i anti-Fc-opløsning; se tabel 1). Der tilsættes 400 μL PBS-2% FBS og centrifugeres ved 400 × g i 5 minutter ved 4 °C.
    BEMÆRK: CD31 og CD45 er markører for henholdsvis endotelceller og hæmatopoietiske celler.
  9. Supernatanten suges til syn, og der inkuberes i 100 μL antibiotinmikroperler (1:5) i 15 minutter på is (antistoffortyndinger fremstilles i anti-Fc-opløsning, se tabel 1). Der tilsættes 400 μL PBS-2% FBS og centrifugeres ved 400 × g i 5 minutter ved 4 °C.
  10. Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i 350 μliter PBS-2% FBS. Celleaggregater eller store partikler fjernes fra enkeltcellesuspensionerne med et forseparationsfilter (70 μm). Aktivér først filteret med 100 μL PBS-2% FBS, før cellesuspensionen gennem filteret (opsaml i et rent rør), og vask til sidst filteret med 100 μL PBS-2% FBS.
  11. Udfør magnetisk adskillelse af celler ved hjælp af den negative separationsstrategi med en magnetisk celleseparator.
    1. Anbring prøven i position A i kølestativet (sørg for, at stativet er forkølet) og to tomme rør i position B og C for at genvinde henholdsvis de ikke-mærkede og mærkede celler.
    2. Læg vaskebufferen og løbebufferen i de tilsvarende flasker, inden du tænder for udstyret. Programmér udstyret til at udføre magnetisk adskillelse af celler med DEPLETE-protokollen .
      BEMÆRK: Denne protokol er til udtømning i standardtilstand til fjernelse af celler med normal antigenekspression (i dette tilfælde celler mærket med anti-CD31 og anti-CD45), hvis genopretning har højeste prioritet.
    3. I separationsafsnittet skal du vælge antallet af prøver , der skal adskilles, og vælge DETØMME-protokollen . Tryk på Kør , og start adskillelsen. Ved afslutningen af programmet genvindes de umærkede celler og centrifugeres ved 400 × g i 5 minutter ved 4 °C.
  12. Supernatanten fjernes og pellets resuspenderes i 500 μl vækstmedium (tabel 1).
  13. Frø APC'erne i en brønd i en 12-brøndplade, der tidligere var belagt med 2,5% kældermembranmatrix (ca. 50.000-75.000 celler opnås). Tilsæt 400 μL 2,5% kældermembranmatrix for at dække hele overfladen af hver brønd. Umiddelbart efter fjernelse af overskydende opløsning og kun et lille lag, lad pladen tørre (uden låg) inde i laminar strømningshætte i mindst 1 time. Der inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære. Skift mediet hver 48. time, indtil cellerne når 80% sammenløb.
  14. Ved 80% sammenløb fjernes mediet helt og vaskes med 350 μL PBS-2% FBS. Høst cellerne med 350 μL 0,05% trypsin-EDTA i 2 minutter ved 37 °C. Tilsæt 2 ml vækstmedium og saml cellerne i et nyt 50 ml konisk rør, centrifuger derefter ved 400 × g i 5 minutter.
  15. Passage APC'erne til 12-brøndplader (10.000-20.000 celler pr. Brønd), der tidligere var belagt med 2,5% kældermembranmatrix. Der inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2. Skift mediet hver 48. time, indtil cellerne når 80% sammenløb.
    BEMÆRK: APC'er kan passeres én gang. Derefter mister de deres evne til at sprede sig og differentiere. Se arbejdsgangen for APC'ernes isolationsproces i supplerende figur S2.

2. Adipocytdifferentiering og induktion af insulinresistens

BEMÆRK: Oprethold celler ved 37 °C i 5% CO2 og udfør trin, der involverer skift af medium og behandlinger med TNF-α og insulin inde i en steril hætte.

  1. Ved 80% sammenløb begynder differentieringsprocessen; aspirere ethvert vækstmedium og erstatte det med 500 μL differentieringsmedium (tabel 1) indeholdende 3,3 nM knoglemorfogenetisk protein (BMP4) i hvert hul.
  2. Efter 48 timer udskiftes substratet med differentieringssubstratet (500 μL pr. hul) og differentieringscocktailen (tabel 1).
  3. Substratet fjernes 72 timer senere, og der tilsættes 100 nM insulin i 500 μL frisk differentieringsmedium.
    BEMÆRK: Celler begynder at vise et rundt udseende med små lipiddråber indeni.
  4. Opsug ethvert differentieringsmedium og erstat det med 500 μL simpel medium-2% FBS (tabel 1) 48 timer senere. Inducer insulinresistens med 4 ng/ml TNF-α. Inkluder kontrolbrønde uden TNF-α behandling.
  5. Efter 24 timers inkubation tilsættes 4 ng/ml TNF-α i simpel medium-0% FBS (tabel 1). Oprethold kontrolbrønde uden TNF-α behandling.
  6. Aktiver insulinsignalvejen 24 timer senere ved at tilsætte 100 nM insulin og inkuber i 15 minutter ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære. Mediet fjernes og vaskes med 500 μL PBS. Inkluder kontrolhuller uden insulinbehandling.

3. Evaluering af insulinsignalvejen ved western blot

  1. Proteinekstraktion og kvantificering
    1. Hvert hul med celler vaskes med 500 μL PBS og lægges på is for at lyse cellerne i 50 μL RIPA buffer (tabel 1) indeholdende 1% proteasehæmmercocktail tilsat lige før prøveisolering. Skrab hele overfladen af brønden med en spids og overfør lysatet til et 0,6 ml mikrocentrifugerør (hold på is).
    2. Der inkuberes i 1 time ved 4 °C i en roterende ryster, blandes ved hvirvelstrøm, centrifugeres ved 8 000 × g i 15 minutter ved 4 °C, og supernatanten genvindes (opbevares på is).
    3. Bestem proteinkoncentrationen ved hjælp af Bradford-analysen (fortynd ikke prøven for at kvantificere).
    4. Der udtages det nødvendige volumen svarende til 40-60 μg og denatureres med 6x Laemmli buffer (tabel 1) ved at inkubere ved 97 °C i 15 minutter under omrystning ved 550 omdr./min. Frys indtil brug.
  2. SDS-polyacrylamid gel elektroforese
    1. Udfør SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) med en 7,5% polyacrylamidgel med en tykkelse på 1,5 mm. Sæt gelen i tanken og fyld med løbende buffer (tabel 1).
    2. Der tilsættes 3 μL prætaineret proteinstandard til gelens første hul, og hver prøve lægges i efterfølgende huller.
    3. Gelen køres ved 80 V i ca. 15 minutter for at sikre, at prøven kommer ind i polyacrylamidkoncentratorgelmatrixen. Derefter øges spændingen til 90 V i 2,5 timer, eller indtil 37 kDa molekylvægtsmarkøren kan ses ved gelens nederste kant.
    4. Overfør proteinerne fra gelen til en nitrocellulosemembran i et halvtørt kammer i 35 minutter ved 25 V. Nedsænk først gel, membran og filtre i overførselsbuffer (tabel 1) i et par minutter.
  3. Vestlig blottelse
    1. Efter overførsel vaskes membranen med Tris-bufret saltvand (TBS) indeholdende 0,1% Tween 20 (TBS-T 0,1%) (tabel 1) i 3 minutter med omrystning ved 30 omdr./min.
    2. Membranen blokeres med blokeringsopløsning (tabel 1) ved 4 °C i 1 time ved konstant rotation.
    3. Membranen skæres i tre dele i henhold til molekylvægtsmarkøren for at inkubere natten over med forskellige primære antistoffer (fortyndet i blokerende opløsning) ved 4 °C i konstant rotation: phospho-IRS1 (Tyr608) antistof (1:1.000), forventet bånd ved 180 kDa; Fosfo-insulinreceptor β (Tyr1150/1151) antistof (1:1.000), forventet bånd ved 95 kDa; Phospho-Akt (Ser473) antistof (1:1.000), forventet bånd ved 60 kDa.
    4. Vask membranerne 5x i 5 min hver med TBS-T 0,1%.
    5. Inkuber membranerne med det tilsvarende peroxidasekoblede sekundære antistof (fortyndet i blokerende opløsning) i 2 timer ved stuetemperatur i konstant rotation: peroxidaseaffiniPure æselantikanin IgG (H + L) (1: 5.000).
    6. Vask membranerne 5x i 5 min hver med TBS-T 0,1%.
    7. Detekter proteinerne ved hjælp af kemiluminescensdetekteringssystemet. Forbered substratet i henhold til producentens anvisninger.
    8. Anbring blottet i en plastikpose og tilsæt 200 μL kemiluminescerende substrat for helt at dække membranen. Tøm overskydende substrat og fjern eventuelle luftbobler.
    9. Udsæt hver plet i 30-60 s i et højtydende billeddannelsessystem, der er kompatibelt med kemiluminescens.
    10. Strip membranerne (trin 10-13 i den vestlige blotsektion) for at bryde antistof-antigen-interaktionerne og dermed tillade, at nitrocellulosemembraner blottes igen. Genvind membranerne og vask 3x i 5 minutter hver med TBS-T 1% ved 50 o / min.
    11. Inkuber i 7 min med 10 ml 0,2 M NaOH ved 50 rpm.
    12. Vask 3x i 5 minutter hver med postevand ved 50 o / min.
    13. Vask i 10 min med TBS-T 1% ved 50 o / min.
    14. Gentag trin 2-9 i Western blot-sektionen for at inkubere membranen med anti-beta-tubulin (55 kDa) som belastningskontrol ved hjælp af 1:1.000 fortynding.
    15. Udfør densitometrisk analyse25 for hvert protein ved hjælp af ImageJ-software (https://imagej.nih.gov/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I løbet af de sidste par år har den øgede forekomst af fedme og T2D givet anledning til en intens søgning efter de mekanismer, der medierer insulinresistens i fedtvæv. Med protokollen beskrevet her kan APC'er differentieres til modne adipocytter for at evaluere insulinresistens og følsomhed. Når APC'erne når sammenløb, tager det 10 dage at fuldføre deres differentiering i modne adipocytter og deres TNF-α-medierede induktion af insulinresistens (figur 1).

APC'er viser en fibroblastlignende morfologi, der er kendetegnet ved deres flade og aflange form og deres vedhæftning til pladen afsluttet 48 timer efter såning (figur 2A). APC'er tager 2-5 dage at nå 80% sammenløb (afhængigt af antallet af frøede celler), et tidspunkt, hvor differentieringsprocessen startes ved eksponering for den differentierende cocktail (figur 2A). Modne adipocytter begynder at forekomme i de følgende 6-8 dage. Differentierede adipocytter er kendetegnet ved en rund morfologi og den intracellulære akkumulering af lipiddråber. Op til 80% af cellerne differentieres ved afslutningen af differentieringsprocessen (figur 2B).

Insulinresistens induceres i primære adipocytter ved TNF-α behandling (4 ng/ml) i 48 timer; denne koncentration af TNF-α ændrer ikke cellelevedygtigheden (supplerende figur S3). Derefter aktiveres insulinsignalvejen ved tilsætning af 100 nM insulin i 15 minutter, og phosphoryleringen af hovedsignalmolekyler (IR, IRS-1 og AKT) måles ved western blot. Insulin stimulerer phosphoryleringen af disse tre molekyler (figur 3) sammenlignet med kontrol, ikke-behandlede differentierede adipocytter. TNF-α reducerer den insulininducerede phosphorylering af IR (30%), IRS-1 (20%) og AKT (45%) (figur 3). Insulinresistente celler viser mindre aktivering af insulinsignalvejen sammenlignet med insulinfølsomme celler. Desuden reducerer TNF-α-behandling mRNA-ekspressionen af kendte insulinfølsomhedsmarkører: Insr, Irs2, Glut4 og Adipoq (supplerende figur S4). Disse resultater bekræfter, at TNF-α reducerer insulinets virkning i primære adipocytter og derved inducerer insulinresistens.

Figure 1
Figur 1: Skematisk tidslinje, der repræsenterer processen med adipocytprecursorcelledifferentiering og induktion af insulinresistens. APC'er isoleres fra subkutant fedtvæv ved hjælp af kollagenasebehandling og magnetisk celleseparationsteknologi. Derefter gennemgår de en 7-dages differentieringsproces for at opnå primære adipocytter. Derefter induceres insulinresistens med TNF-α i 48 timer, de første 24 timer i medium indeholdende 2% FBS og de næste 24 timer med serumfrit medium for at forhindre aktivering af insulinsignalvejen. Signalkaskaden aktiveres med insulin, og protein ekstraheres til western blot-analyse 10 dage efter start af differentieringsprocessen for at evaluere phosphoryleringen / aktiveringen af IR, IRS-1 og AKT. Forkortelser: APC'er = adipocytforløberceller; BMP4 = Knoglemorfogenetisk protein; IBMX = 3-isobutyl-1-methylxanthin; TNF-α = tumornekrosefaktor-α; FBS = føtalt kvægserum; IR = insulinreceptor; IRS = insulinreceptorsubstrat; AKT = proteinkinase B; Tx = behandling. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Morfologi af adipocytprecursorceller og modne adipocytter . (A) Subkutane APC'er ved 80% sammenløb før inducering af differentiering i 12-brønds kulturplader. B) Subkutane primære adipocytter efter 7 dages inducerende differentiering i 12-brønds kulturplader. Billeder blev taget med 10x forstørrelse. Skalastænger = 100 μm. Forkortelse: APC'er = adipocytprecursorceller. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Insulinresistens induceret af TNF-α i subkutane primære adipocytter demonstreret ved nedsat insulininduceret phosphorylering af IR, IRS-1 og AKT. Subkutane adipocytter blev behandlet med TNF-α (4 ng/ml) i 48 timer og serumsultet i de sidste 24 timer. Efter stimulering med insulin (100 nM) i 15 minutter blev 40 μg total protein fyldt på 7,5% geler og udsat for SDS-PAGE, overført til nitrocellulosemembraner og blokeret i 4% fedtfri mælk i TBS-T 0,1%. Membranen blev undersøgt med anti-phosphoryleret IR (pIR), anti-phosphoryleret IRS-1 (pIRS-1) og anti-phosphoryleret AKT (pAKT) såvel som med et anti-kanin HRP sekundært antistof. Signalet blev visualiseret med kemiluminescensdetektion, og anti-β tubulin blev brugt som belastningskontrol. (A) repræsentative blots og (B) kvantificering fra tre uafhængige forsøg. Data er gennemsnitlige ± SEM; *, p < .05 versus kontrol. Forkortelser: TNF-α = tumornekrosefaktor-α; IR = insulinreceptor; IRS = insulinreceptorsubstrat; pX = phosphoryleret form af X; b-badekar = beta-tubulin; HRP = peberrodsperoxidase; Ctrl = kontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Anti-Fc-opløsning renset rotte anti-mus CD16 / CD32 fortyndet i PBS–2% FBS [1:150]
TBS-T 0,1% 0,01 M Tris-HCl (pH 8), 0,15 M NaCl, 0,1% mellem 20
Blokering løsning 4% fedtfri tør mælk fortyndet i TBS-T 0,1%
Vækstmedium 60% DMEM lav glukose, 40% MCDB 201 medium, 1x penicillin-streptomycin, 1 nM dexamethason, 0,1 mM L-ascorbinsyre 2-phosphat, 1x insulin, transferrin, natrium, selenit (ITS) flydende medietilskud, 1x linolsyrealbumin fra BSA, 10% FBS, 10 ng / ml epidermal vækstfaktor (EGF), 10 ng / ml leukæmihæmmende faktor (LIF), 10 ng / ml blodpladeafledt vækstfaktor BB (PDGF-BB), 5 ng / ml fibroblastvækstfaktor-basisk (bFGF) og 50 μg / ml normocin
Differentieringsmedium 60% DMEM lav glukose, 40% MCDB 201 medium, 1x penicillin-streptomycin, 1 nM dexamethason, 0,1 mM L-ascorbinsyre 2-phosphat, 1x ITS flydende medietilskud, 1x linolsyre-albumin fra BSA og 2% FBS
Differentiering cocktail 0,5 μM 3-isobutyl-1-methylxanthin [IBMX], 1 μM dexamethason, 10 μM rosiglitazon og 100 nM insulin
Enkel medium-2% FBS 60% DMEM lav glukose, 40% MCDB 201 medium, 1x penicillin-streptomycin og 2% FBS
Enkel medium-0% FBS 60% DMEM lav glukose, 40% MCDB 201 medium, 1x penicillin-streptomycin
RIPA buffer 50 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% octylphenoxy poly(ethylenoxy)ethanol, 1 mM Na3VO 4, 48,8 mM NaF, 8,2 mM Na4 P2O7 og 0,26 M sakkarose
6x Laemmli buffer 1,2 g SDS, 6 mg bromphenolblåt, 4,7 ml glycerol, 1,2 ml Tris-base 0,5 M pH 6,8, 845 μL 2- mercaptoethanol og 2,1 mlH2O
Kører buffer 25 mM Tris base, 192 mM glycin, 1% SDS
Overførselsbuffer 25 mM Tris-base, 192 mM glycin, 20% methanol

Tabel 1: Opløsninger anvendt i denne protokol.

Supplerende figur S1: Subkutant fedtvæv fordøjet med kollaganase. Når fedtvævet er fjernet, skæres det i små stykker med en saks for at starte fordøjelsesprocessen (A), derefter inkuberes det i 30 minutter med kollagenase type 1 ved 37 °C, 150 rpm (B). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Skema for adipocytforløbercelleisolationsprocessen. Disseker det inguinale subkutane fedtvæv og fordøje prøverne med collagenase. Fjern modne adipocytter ved centrifugering og vask pelleten for at fjerne overskydende fedt. Lys de røde blodlegemer og bloker for at reducere uspecifik binding. Mærk endotelcellerne og makrofagerne med antistoffer koblet til magnetiske partikler. Udfør den magnetiske adskillelse af celler ved hjælp af den negative separationsstrategi med en magnetisk celleseparator. Frø APC'er (umærkede celler) i plader dækket med kældermembranmatrix. Skift mediet hver 48. time, indtil cellerne når 80% sammenløb. Forkortelser: APC'er = adipocytforløberceller; BSA = bovin serumalbumin FBS = føtalt kvægserum. Oprettet med Biorender.com. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Behandling med TNF-α til inducering af insulinresistens ændrer ikke adipocytternes levedygtighed. Levedygtigheden af modne adipocytter blev målt ved MTT-analysen efter behandling med 4 ng/ml TNF-α i 48 timer. Data er gennemsnitlige ± SEM. Forkortelser: TNF-α = tumornekrosefaktor-α; Ctrl = kontrol. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S4: TNF-α-behandling i adipocytter nedsætter ekspressionen af insulinfølsomhedsmarkører. MRNA-ekspressionen af Insr, Irs, Glut4 og Adipoq blev målt ved realtids-PCR efter behandling med 4 ng/ml TNF-α i 48 timer. Data er gennemsnitlige ± SEM; *, p < .05 versus kontrol. Forkortelser: TNF-α = tumornekrosefaktor-α; Ctrl = kontrol. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette papir giver en metode til undersøgelse af insulinresistens, der bruger primære adipocytter i kultur behandlet med TNF-α. Denne model har den fordel, at primære adipocytter kan dyrkes under definerede betingelser i lange perioder med en stram kontrol af cellulære miljøfaktorer26. Assayvarigheden er 15-20 dage, selvom variationer i procentdelen af differentierede adipocytter kan forekomme mellem eksperimenter. Primære adipocytter har fordele i forhold til cellelinjer, da de ikke kontinuerligt er blevet udvidet i kultur og tættere fanger mangfoldigheden af vævet, hvorfra de stammer27. Desuden tillader primære adipocytter at studere donorer under forskellige fysio-patologiske sammenhænge, såsom magert versus overvægtigt, mand versus kvinde, ung versus gammel og celler fra forskellige fedtdepoter. En anden fordel ved denne metode er, at cellelinjer fra CRE og knockout-mus kan genereres efter APC-isolering.

Et muligt problem under APC's isolering og differentiering er, at disse celler kan miste evnen til at differentiere, hvilket sandsynligvis ville opstå, når 80% sammenløb overskrides i starten af differentieringsprocessen. Mediet bør også ændres meget forsigtigt, især efter lipidakkumulering, da differentierede adipocytter let løsnes fra kulturskålen. Desuden skal hvert parti kollagenase testes for fordøjelseseffektivitet, celleudbytte og cytotoksicitet26. Der er udviklet teknikker til at identificere og isolere APC'er fra den stromovaskulære fraktion af hvidt fedtvæv ved hjælp af negative markører såsom CD31 og CD45 samt positive stamcellepopulationsmarkører såsom CD34 og Sca128,29. I denne protokol udfører vi kun en negativ adskillelse, hvilket eliminerer endotelceller og makrofager fra den stromovaskulære fraktion og dermed undgår tab af preadipocytter i den positive adskillelse.

Selvom primære kulturer tillader undersøgelse af donorvariabilitet og kompleksitet27,30, introducerer indstilling af den eksperimentelle model begrænsninger. For eksempel vil adipocytter isoleret fra gamle dyr have en lavere differentieringskapacitet og en højere lipotoksicitetshastighed sammenlignet med dem fra unge dyr31,32. Protokollen kan også tilpasses til at anvende forskellige celleseparationsteknikker. Hvis en automatisk magnetisk celleseparator ikke er tilgængelig, kan manuel adskillelse af cellerne opnås med kolonner eller FACS-sortering. Den her beskrevne metode til APC-isolering ved hjælp af en magnetisk celleseparator er en tilpasset og forenklet version af FACS-sorteringsprotokollen beskrevet af Macotela et al.28.

Flere inflammatoriske cytokiner er blevet anvendt til at inducere insulinresistens i fedtceller, herunder TNF-α, IL-1β og IL-6 18,33,34,35,36. Dyrkede 3T3-L1-adipocytter udsat for TNF-α bliver insulinresistente inden for flere dage, vurderet ud fra insulins reducerede evne til at stimulere glukoseoptagelse37. Disse resultater viser, at TNF-α nedsætter insulininduceret phosphorylering af IR, IRS-1 og AKT21,23, målt ved western blot-detektion af total protein ekstraheret fra primære adipocytter. Imidlertid kan proteaser og fosfataser frigivet under cellelyse påvirke detektion af western blot. Proteiners aktive tilstand bør bevares ved tilsætning af protease- og fosfatasehæmmere til lysisbufferen og efter proteinkvantificering ved blanding af prøven med Laemmli buffer. Afslutningsvis giver denne metode et nyttigt værktøj til at studere de mekanismer, der medierer insulinresistens i adipocytter differentieret fra mus APC'er.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla og María Antonieta Carbajo for deres tekniske assistance og Jessica Gonzalez Norris for kritisk redigering af manuskriptet. Denne protokol blev støttet af Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (til Y.M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Isolation mouse adipocyte precursor cells
ACK lysing buffer  LONZA 10-548E
Anti-Biotin Microbeads  Miltenyi 130-090-485
Anti-CD31 eBioscience 13-0311-85
AutoMACS Pro Separator Miltenyi
Basement membrane matrix (matrigel) Corning 354234
bFGF Sigma F0291 Growth factor
BSA Equitech-Bio, Inc. BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin  eBioscience 13-0451-85
Collagenase, Type 1 Worthington Biochem LS004197
Dexamethasone Sigma D1756
DMEM GIBCO 12800017
DMEM low glucose GIBCO 31600-034
EGF Peprotech 315-09 Growth factor
FBS GIBCO 26140-079
ITS mix Sigma I3146
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960
LIF Millipore ESG1107 Growth factor
Linoleic acid-albumin Sigma L9530
MCDB 201 medium Sigma M6770
Normocin InvivoGen ant-nr-2
PDGF-BB  Peprotech 315-18 Growth factor
Peniciline-Streptomycine BioWest L0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm) Miltenyi 130-095-823
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32  BD Pharmingen 553142
Trypsin-EDTA  GIBCO 25300062
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] Sigma I5879 Differentiation cocktail
BMP4 R&D Systems 5020-BP-010 Differentiation cocktail
Dexamethasone Sigma D1756 Differentiation cocktail
Insulin Sigma I9278
Rosiglitazone Cayman 71742 Differentiation cocktail
TNFα R&D Systems 210-TA-005 
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot
Anti-beta tubulin antibody Abcam ab6046
Bromophenol blue BioRad 161-0404 Laemmli buffer
EDTA Sigma E5134 RIPA buffer
EGTA Sigma E4378 RIPA buffer
FluorChem E system ProteinSimple
Glycerol Sigma G6279 Laemmli buffer
Glycine Sigma G7126 Running and Transfer buffer
Igepal Sigma I3021 RIPA buffer
2- mercaptoethanol Sigma M3148 Laemmli buffer
Methanol JT Baker 907007 Transfer buffer
NaCl JT Baker 3624-05 TBS-T
NaF Sigma 77F-0379 RIPA buffer
NaOH  JT Baker 3722-19
Na4P2O7 Sigma 114F-0762 RIPA buffer
Na3VO4 Sigma S6508 RIPA buffer
Nitrocellulose membrane  BioRad 1620112
Nonfat dry milk BioRad 1706404 Blocking solution
Prestained protein standard  BioRad 1610395
Protease inhibitor cocktail  Sigma P8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)  Jackson ImmunoResearch 711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β  Cell signaling 3024
Phospho-Akt (Ser473) Antibody Cell signaling 9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody Millipore 9432
Saccharose  JT Baker 407205 RIPA buffer
SDS BioRad 1610302 Running and laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34577
Tris-base Promega H5135 Running, transfer and laemmli buffer
Tris-HCl JT Baker 4103-02 RIPA buffer - TBS
Tween 20 Sigma P1379 TBS-T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
  2. Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
  3. Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
  4. Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
  5. Freeman, A. M., Pennings, N. Insulin Resistance. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021).
  6. Petersen, M. C., Shulm, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  7. Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
  8. Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , Academic Press. 370-384 (2019).
  9. Cinti, S. Pink adipocytes. Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).
  10. Kahn, B. B., Flier, J. S. Obesity and insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).
  11. Klemm, D. J., et al. Insulin-induced adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).
  12. Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).
  13. Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
  14. James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
  15. Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
  16. Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
  17. Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
  18. Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
  19. Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
  20. Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
  21. Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
  22. Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).
  23. Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
  24. Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
  25. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  26. Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
  27. Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
  28. Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
  29. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  30. Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
  31. Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
  32. Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
  33. Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
  34. Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
  35. Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
  36. Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
  37. Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).

Tags

Biologi udgave 192 præadipocytisolering subkutant fedt insulinvirkning TNF-α
Differentierede museadipocytter i primær kultur: en model for insulinresistens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruiz-Herrera, X., Luzardo-Ocampo,… More

Ruiz-Herrera, X., Luzardo-Ocampo, I., Martínez de la Escalera, G., Clapp, C., Macotela, Y. Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance. J. Vis. Exp. (192), e63979, doi:10.3791/63979 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter