Summary
يفصل هذا البروتوكول طريقة لتشريح مستودعات الفئران الدهنية وعزل وهضم الشرايين المعنية لتحرير ومن ثم تحديد مجموعة الخلايا البطانية. الخلايا المعزولة حديثا المستخدمة في تطبيقات المصب ستعزز فهم بيولوجيا الخلايا الوعائية وآليات خلل الأوعية الدموية.
Abstract
تلعب الخلايا البطانية الوعائية المبطنة لجدار نظام الأوعية الدموية أدوارا مهمة في مجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية ، بما في ذلك تنظيم نغمة الأوعية الدموية ، ووظائف الحاجز ، وتكوين الأوعية. يعد خلل الخلايا البطانية مؤشرا مميزا ومحركا رئيسيا لتطور أمراض القلب والأوعية الدموية الحادة ، ومع ذلك لا تزال الآليات الأساسية غير مفهومة بشكل جيد. إن القدرة على عزل وإجراء التحليلات على الخلايا البطانية من مختلف أسرة الأوعية الدموية في شكلها الأصلي ستعطي نظرة ثاقبة على عمليات أمراض القلب والأوعية الدموية. يقدم هذا البروتوكول إجراء تشريح الأنسجة الدهنية تحت الجلد والمساريقي للفئران ، يليه عزل الأوعية الدموية الشريانية لكل منها. ثم يتم هضم الشرايين المعزولة باستخدام مزيج محدد من الإنزيمات الهضمية التي تركز على تحرير الخلايا البطانية القابلة للحياة وظيفيا. يتم تقييم الأنسجة المهضومة عن طريق تحليل التدفق الخلوي باستخدام خلايا CD31 + / CD45 − كعلامات لتحديد الخلايا البطانية الإيجابية. يمكن فرز الخلايا لإجراء فحوصات وظيفية فورية في المصب أو استخدامها لإنشاء خطوط خلايا أولية. ستوفر تقنية عزل وهضم الشرايين من أسرة الأوعية الدموية المختلفة خيارات للباحثين لتقييم الخلايا الوعائية المعزولة حديثا من الشرايين ذات الأهمية والسماح لهم بإجراء مجموعة واسعة من الاختبارات الوظيفية على أنواع معينة من الخلايا.
Introduction
الخلايا البطانية معروفة جيدا لأدوارها الهامة في مجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية ، بما في ذلك وظائف الحاجز ، وتكوين الأوعية الدموية ، وتنظيم نغمة الأوعية الدموية 1,2. على الرغم من أن خلل الخلايا البطانية موثق جيدا في تعزيز تصلب الشرايين وارتفاع ضغط الدم والسكري وما إلى ذلك ، إلا أن الآليات الأساسية التي تؤدي إلى الخلل البطاني لا تزال غير مفهومة بشكل جيد ومن المحتمل أن تختلف بين أسرة الأوعية الدموية المتميزة2،3،4. إن الجهود المبذولة لكشف هذه الآليات المرضية لخلل الخلايا البطانية تواجه تحديا يتمثل في محدودية الوصول إلى مجموعة نقية من الخلايا البطانية من الأنسجة و / أو التغيرات المظهرية للخلايا البطانية في الثقافة 5,6. لذلك ، فإن القدرة على عزل وإجراء تحليلات على الخلايا البطانية من مختلف أسرة الأوعية الدموية في شكلها الأصلي ستعطي نظرة ثاقبة على عمليات أمراض القلب والأوعية الدموية.
يقدم هذا البروتوكول إجراء تشريح الأنسجة الدهنية تحت الجلد والمساريقي من الفئران ، يليه عزل الأوعية الدموية الشريانية الخاصة بكل منها. يتم تحرير الخلايا البطانية القابلة للحياة وظيفيا التي تبطن جدران الشرايين باستخدام مزيج محدد من الإنزيمات. تم إيلاء عناية خاصة لتحسين ظروف بروتوكول الهضم للحصول على عائد كاف من الخلايا البطانية من <1 ملغ من الأنسجة الأولية مع الحفاظ على العلامات الجزيئية الحيوية سليمة للتحليل. يتم تحديد الخلايا البطانية المعزولة بعد ذلك باستخدام قياس التدفق الخلوي. يستخدم وجود CD31 (PECAM) لتحديد الخلايا البطانية في المقام الأول. بسبب التعبير عن CD31 في أنواع الخلايا الأخرى ، بما في ذلك العديد من أصل المكونة للدم التي تعبر أيضا عن CD45 ، تم تعزيز نقاء الخلايا البطانية المعزولة من خلال استبعاد الخلايا التي تعبر عن كل من CD31 و CD45 5,6,7,8. علاوة على ذلك ، اعتمادا على سؤال البحث والتطبيقات النهائية التي سيتم استخدامها ، يجب على الباحثين النظر في اختيار مجموعة واسعة من علامات الاختيار الإيجابية والسلبية لتحسين نقاء مجموعة الخلايا ذات الاهتمام.
على الرغم من أن تقنية تشريح وعزل شرايين مستودع الدهون قد استخدمت في المنشورات السابقة9،10،11،12،13 ، إلا أنه لم يتم بعد تقديم بروتوكول مفصل يصف عزل الشرايين المدمجة. إن إظهار تقنية عزل وهضم الشرايين من أسرة وعائية مختلفة من نوع معين ذي أهمية سيوفر خيارات للباحثين لتقييم الخلايا الوعائية المعزولة حديثا من الشرايين ذات الأهمية والسماح لهم بإجراء مجموعة واسعة من الاختبارات الوظيفية على أنواع محددة من الخلايا. قد تشمل الاختبارات على سبيل المثال لا الحصر قياس التدفق الخلوي لفرز الخلايا والتعبير عن بروتين الغشاء 5,8 ، والفيزيولوجيا الكهربية لنشاط القناة الأيونية9 ، والتنميط الجزيئي (البروتينات / التحليلات الجينومية ، وما إلى ذلك) 14,15 ، وتوليد خطوط الخلايا الأولية لفحص المخدرات في المختبر16,17.
Protocol
تمت الموافقة على استخدام الحيوانات في هذه الدراسات من قبل جامعة ديلاوير ، لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (# 1372).
1. تشريح الأنسجة وتنظيفها
ملاحظة: يتم استخدام الفئران C57BL/6J التي يتراوح عمرها بين 10 و12 أسبوعا في بروتوكول الفيديو. يرجى الرجوع إلى الشكل 1 للحصول على النتائج التخطيطية والمرجوة من تشريح الأنسجة وتنظيف الشرايين والرجوع إلى جدول المواد للحصول على قائمة اللوازم ومعلومات الشركة المصنعة.
- القتل الرحيم للفأر عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون2 يليه خلع عنق الرحم.
- قم بتأمين الماوس باستخدام دبابيس التشريح ورش السطح البطني بنسبة 70٪ من الإيثانول.
- عزل الأنسجة الدهنية تحت الجلد الموجودة في كل طرف خلفي
ملاحظة: أدوات التشريح اللازمة: مقص بون مستقيم (9 سم) وملقط Graefe حاد ومنحني.- استخدم الملقط لرفع الجلد مباشرة فوق الأعضاء التناسلية وإجراء شق صغير (2 مم) في الجلد.
- أدخل طرف المقص في موقع الشق وقم بعمل شق خط الوسط 4-5 سم ، بدءا من الشق الأولي وتشريح الجمجمة إلى قاعدة القص. كن حذرا لعدم اختراق تجويف البطن.
- قم بعمل شق جانبي 1 سم ، يمتد أفقيا من خط الوسط مباشرة أسفل الطرف الأمامي.
- قم بعمل شق قطري 1 سم بين الطرف الخلفي والأعضاء التناسلية.
- قم بإجراء جروح صغيرة على طول شقوق الجلد في خط الوسط لتقشير النسيج الضام المرتبط بها وفضح مستودع الدهون تحت الجلد. ثبت الجلد لأسفل.
- تحديد الأنسجة الدهنية تحت الجلد "على شكل C" والشريان / الوريد الذي يمتد عموديا على تجويف البطن.
- ابدأ من أسفل الشكل C بالقرب من الأعضاء التناسلية وأمسك الأنسجة الدهنية بلطف لفضح الأنسجة الضامة. قم بعمل جروح صغيرة في النسيج الضام لفصل الدهون عن الجلد. تجنب إزعاج الأوعية الدموية المكشوفة.
- استمر في تشريح النسيج الضام حتى يمكن إزالة الأنسجة الدهنية تحت الجلد سليمة. افصل الشريان المكشوف بعناية عن النسيج الضام المحيط.
- قم بتخزين الدهون المعزولة تحت الجلد في مخزن HEPES العازل على الجليد حتى يصبح جاهزا لعزل السرير الوعائي محل الاهتمام.
- كرر الخطوات 1.3.3.-1.3.5. لمستودع الدهون الخلفي المتبقي تحت الجلد.
- عزل مستودع الدهون المساريقي
ملاحظة: أدوات التشريح اللازمة: مقص بون مستقيم (9 سم) ، ملقط Graefe ، زوج من الملقط # 5 ، مقص القزحية المستقيم ، ومقص بون المنحني (9 سم).- استخدم ملقط Graefe لرفع جدار التجويف البريتوني الرقيق فوق المثانة البولية وإجراء شق صغير باستخدام مقص مستقيم.
- ارفع ببطء جدار التجويف البريتوني المخترق ، وأدخل مقص القزحية المستقيم بعناية في موقع الشق ، وقم بعمل شق 4-5 سم من المثانة البولية إلى القص.
- قم بعمل شقين أفقيين بطول 1 سم باستخدام مقص القزحية المستقيم ، ويمتد أفقيا من خط الوسط إلى أعلى الطرف الخلفي مباشرة وأسفل الطرف الأمامي. استخدم ملقط Graefe لتقشير عضلات البطن مرة أخرى وفضح الأحشاء البريتونية.
- كرر الخطوة 1.4.3. على الجانب الآخر.
- استخدم زوج الملقط رقم 5 لرفع الأمعاء من التجويف الحشوي للكشف عن الدهون المساريقية.
- استخدم المقص المنحني والملقط رقم 5 لفصل الدهون على طول القولون ، بدءا من الكاكوم إلى حيث ينحدر القولون عن الأنظار.
- عد إلى الكاكوم واستخدم المقص المنحني والملقط رقم 5 لفصل الدهون على طول الأمعاء الدقيقة إلى البنكرياس. إزالة جزء صغير من البنكرياس لعزل الدهون المساريقي تماما.
ملاحظة: إزالة جزء صغير من البنكرياس جنبا إلى جنب مع الدهون المساريقية قد يساعد في تنظيف الشرايين لأنه يوفر الاستقرار أثناء التنظيف. - قم بتخزين الدهون المساريقية المعزولة في مخزن HEPES العازل على الجليد حتى يصبح جاهزا لعزل الشرايين المساريقية.
- عزل الشرايين المعنية عن الأنسجة الدهنية تحت الجلد والمساريقي
ملاحظة: أدوات التشريح اللازمة: طبق تشريح ومنظار مجسمة مع مصدر ضوء، وزوج من الملقط # 55، وزوج من الملقط # 5.- ضع ~ 10 مل من مخزن HEPES البارد في طبق التشريح وانقل الأنسجة الدهنية إلى الطبق باستخدام الملقط رقم 5.
- استخدم المنظار المجسمة عند التكبير 1x لعرض الأنسجة الدهنية ووضعها لفضح زوج (أزواج) الشريان / الوريد (الشكل 2).
- استخدم الملقط رقم 55 لإزالة الدهون المتنية بعناية من الشريان. قم بإزالة قطع صغيرة من الدهون في كل مرة وراقب بعناية أزواج الشرايين / الأوردة تحت المنظار لتحديد وتجنب إتلاف الأوعية الدموية ذات الاهتمام.
ملاحظه: اضبط التكبير ومصدر الضوء وفقا لذلك لتنظيف الشرايين. زيادة التكبير وشدة الضوء لرؤية أفضل للشرايين كما تتم إزالة الدهون. يجب أن يتم التنظيف الدقيق للشرايين تحت تكبير 4x-5x. من المهم التمييز بين الأنسجة الضامة (الكولاجين) والأوردة والشرايين. الأنسجة الضامة وألياف الكولاجين لها مظهر يشبه الخيط بدون فروع ، وهي مخططة ، ولها لون أبيض. على عكس ألياف الكولاجين والأنسجة الضامة ، فإن الشرايين والأوردة شفافة ولها فروع متعددة مع تجويف محدد. قد تظهر الشرايين والأوردة الصغيرة متشابهة في المظهر عندما تكون خالية من الأنسجة المتني. وجود الدم في التجويف يمكن أن يساعد المرء على تحديد الشرايين من الأوردة. تحتوي الأوردة على جدران أوعية دموية أرق وتجويف أكبر وتحتوي على المزيد من الدم مقارنة بالشرايين ذات الحجم المقارن. - كرر الخطوة 1.5.3. حتى تصبح الشرايين خالية تماما من الأنسجة الدهنية المتني.
- استخدم الملقط رقم 5 لنقل الشرايين التي تم تنظيفها إلى أنبوب جديد مع مخزن مؤقت HEPES طازج واحتفظ به على الثلج حتى يصبح جاهزا للهضم.
2. هضم الشرايين المعزولة لعزل الخلايا البطانية
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الشكل 2 للحصول على مخطط هضم الأنسجة وعزل الخلايا البطانية وجدول المواد للحصول على قائمة كاملة باللوازم اللازمة للبروتوكول.
- أضف 1 ملغ لكل من dispase و elastase إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق 2 مل. أضف 2 مل من محلول التفكك إلى كل أنبوب. دوامة وحضانة في 37 درجة مئوية حتى تذوب تماما. استخدم الملقط #5 لنقل الشرايين التي تم تنظيفها (الخطوة 1.5.5) إلى أنابيب العينة المعنية. التركيز النهائي لكل إنزيم هو 0.5 ملغ / مل.
- احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع إثارة لطيفة عن طريق الانعكاس كل 10-15 دقيقة ، بحيث يتم تعليق الشرايين في محلول للحفاظ على اتصال ثابت وموحد بين الإنزيمات والشرايين.
- وزن 1 ملغ من الكولاجيناز من النوع الأول لكل عينة وإضافته إلى أنابيب جديدة.
- اسمح للشرايين بالاستقرار في قاع الأنبوب. قم بإزالة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت من الأعلى دون إزعاج الشرايين ونقله إلى أنابيب معينة تحتوي على الكولاجيناز. دوامة وإعادة الحل إلى العينات المعنية في أنابيب العينة الأصلية. التركيز النهائي للكولاجيناز من النوع الأول هو 0.5 ملغ / مل.
- تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تأكد من انفصال الشرايين إلى قطع بعد اهتزاز أنبوب العينة لفترة وجيزة. إذا لم تنفصل الشرايين إلى قطع بعد الاضطراب ، فقم باحتضانها بزيادات مدتها 5 دقائق حتى يصبح انهيار الشرايين مرئيا.
- باستخدام ماصة زجاجية ، قم بمضاعفة الأنسجة المهضومة بقوة 10x-15x لفصل الخلايا ميكانيكيا.
- مرر المحلول والأنسجة المهضومة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر أو مصفاة أنبوب قياس التدفق الخلوي للحصول على معلقات أحادية الخلية.
3. تلطيخ الخلايا البطانية قبل قياس التدفق الخلوي
ملاحظة: يتم تلطيخ ومعالجة الخلايا البطانية على الجليد لتحسين صلاحية الخلايا، ما لم يتم تلقي تعليمات. يتم طرد أنابيب البوليسترين ذات القاع المستدير سعة 5 مل بسرعة 1,163 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- جهاز الطرد المركزي للمعلقات أحادية الخلية عند 1,163 × g لمدة 3 دقائق في RT.
- قم بإزالة السوبرناتانت وأعد تعليق بيليه الخلية في 1 مل من PBS + 5٪ BSA لمدة 30 دقيقة في RT.
ملاحظة: يجب على الباحثين النظر في منع مستقبلات FC اعتمادا على نوع الخلية والهدف محل الاهتمام والأجسام المضادة المستخدمة18,19. - أضف 1 ميكرولتر من بقعة بقاء الخلية (إثارة 405 نانومتر) (جدول المواد) واحتضنها في الظلام لمدة 30 دقيقة في RT.
- الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 1,163 × g لمدة 3 دقائق في RT. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من PBS + 1٪ BSA.
- إلى العينات، أضف الأجسام المضادة الأولية المترافقة مع CD31 (CD31-PE، 0.75 ميكروغرام/عينة) وCD45 (CD45-FITC، 2.5 ميكروغرام/عينة) واحتضنها على آلة هزاز في الثلاجة لمدة 15 دقيقة بعد تغطية العينات بورق الألومنيوم.
ملاحظة: لتحديد و / أو الحصول على مجموعة نقية من الخلايا البطانية ، قم بالتحقيق في كل من CD31 و CD45 باستخدام الأجسام المضادة الأولية المترافقة مع CD31 و CD45 مع تألق الإثارة / الانبعاثات المتميز وخلايا البوابة / الفرز مع ملف تعريف التعبير CD31 + CD45 −. قد تكون هناك حاجة إلى تعويض اعتمادا على الفلوروفورات المستخدمة18،20،21. - اغسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من PBS + 1٪ BSA مباشرة إلى تعليق الخلية.
- جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 1,163 × g لمدة 3 دقائق في RT. قم بإزالة supernatant وإعادة التعليق في 200 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 1٪ مع 0.1٪ BSA. يحفظ في الثلاجة المغطاة بورق الألمنيوم حتى يصبح جاهزا لقياس التدفق الخلوي.
ملاحظة: يتم تحسين إنتاجية الخلايا عن طريق تقليل خطوات الغسيل والطرد المركزي. وقد يلزم تغييرها تبعا لنهج النتائج. يجب تحليل العينة في المثبت في غضون 24 ساعة.
Representative Results
يظهر مخطط سير العمل في الشكل 1. يسلط المخطط الضوء على خطوات البروتوكول الموضحة بمزيد من التفصيل في نص البروتوكول. ويبين الشكل 2 صورا للدهون تحت الجلد (الشكل 2 ألف، يسار) بعد التشريح وممر شريان تحت الجلد (الشكل 2 ألف، يمين) بعد تنظيف النسيج المتني. ويبين الشكل 2 أيضا الدهني المساريقي (الشكل 2 ب، إلى اليسار) بعد التشريح والممر الشرياني المساريقي (الشكل 2 ب، إلى اليمين) بعد تنظيف النسيج المتني.
تم تصميم البروتوكول المعروض هنا لمساعدة الباحثين المهتمين المحتملين ب أ) مقارنة أسرة الأوعية الدموية المميزة في مستودع الدهون في مناهج العلوم الأساسية و / أو نماذج الأمراض ، ب) هضم أسرة الأوعية الدموية قبل عزل الخلايا الوعائية ذات الأهمية للتطبيق في اتجاه المصب ، و ج) استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد خلايا الأوعية الدموية ذات الأهمية (الشكل 3 ) لمجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، تحليلات التعبير عن البروتين كما يتم إجراؤها هنا (الشكل 4). يفصل الشكل 3 مثالا على نهجنا لتحديد الخلايا البطانية من شرايين الفئران المهضومة باستخدام قياس التدفق الخلوي. كانت المستحضرات الخلوية التي تم الحصول عليها من الشرايين الدهنية المهضومة تحت الجلد (الشكل 3A) أو المساريقية (الشكل 3B) ملطخة ب CD31-PE و CD45-FITC وصبغة صلاحية الخلية قبل تثبيت وتحديد الخلايا البطانية CD31 + CD45− القابلة للحياة باستخدام قياس التدفق الخلوي ، كما هو الحال في أماكن أخرى8. سمحت وصمة بقاء الخلية بتحديد فقط تلك الخلايا القابلة للحياة التي نجت من بروتوكول العزل والهضم قبل التثبيت. سيسمح استخدام هذه الطريقة للباحثين بتقييم تعبير أو وظيفة الخلايا الوعائية القابلة للحياة ذات الاهتمام.
لتحديد ما إذا كانت الخلايا البطانية المعزولة من الأوعية الدموية المميزة لمستودع الدهون قد أظهرت اختلافات في التعبير عن بروتين الغشاء ، تم فحص الخلايا المعزولة بحثا عن ترانسلوكاد الأحماض الدهنية ، CD36 (الشكل 4) ، حيث ثبت مؤخرا أن هذا البروتين الغشائي ضروري في التوزيع البطاني للأحماض الدهنية على الأنسجة22 . لذلك ، فإن تحديد اختلافات التعبير النسبية بين الغشاء CD36 ، على سبيل المثال ، في أسرة الأوعية الدموية المتميزة قد أ) يدعم البيانات الحالية المتعلقة بالتفضيل التفاضلي لاستخدام الأحماض الدهنية بين الأنسجة المختلفة و / أو ب) يكشف النقاب عن اختلافات جديدة محتملة في توزيع الأنسجة للأحماض الدهنية في الصحة والمرض. من نفس المستحضرات للخلايا الوعائية المهضومة الموضحة في الشكل 3 ، تم تحديد الخلايا البطانية CD31 + CD45−CD36 + في الدهون تحت الجلد (الشكل 4A) والمساريقي (الشكل 4B) ، وتم تحديد تعبير CD36 كميا في هذه المجموعة في كل سرير وعائي. يكشف الشكل 4C والشكل 4D أن النسبة المئوية للخلايا البطانية التي تعبر عن CD36 وشدة التعبير CD36 كانت أكبر في الخلايا البطانية تحت الجلد مقارنة بتلك التي لوحظت في الخلايا البطانية المساريقية. تدعم هذه النتائج الأولية استخدام منهجيتنا لتحديد الاختلافات المتميزة بين أسرة الأوعية الدموية.
الشكل 1: مخطط عمل لعزل الخلايا البطانية عن الأنسجة الدهنية تحت الجلد والحشوية للتطبيقات النهائية . (A) تم قتل الفئران C57BL/6J البالغة من العمر 10-12 أسبوعا واستخدامها لإثبات هذا الإجراء. (ثنائي) أولا ، تتم إزالة الدهون تحت الجلد. (بيي) ثم ، تتم إزالة الأنسجة الدهنية المساريقية (الحشوية) في وقت لاحق. تشير الخطوط البيضاء المتقطعة إلى مواقع المستودعات الدهنية تحت الجلد (يسار) والمساريقي (يمين) بعد التشريح والإزالة. يتم عزل الشرايين المعنية للتطبيقات النهائية. (ج) في هذا البروتوكول ، يتم هضم الشرايين المعزولة بعد ذلك باستخدام كوكتيل إنزيم معين كخطوة أولى في تحرير الخلايا البطانية القابلة للحياة وظيفيا. (د) يتم تحديد الخلايا البطانية المعزولة عن طريق فحص خلايا CD31+ و CD45− باستخدام الأجسام المضادة المترافقة قبل تحليل التدفق الخلوي. الخلايا التي تحتوي على ملف تعريف تعبير CD31+/CD45− هي الخلايا البطانية ذات الأهمية لإجراء تحليلات إضافية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الأنسجة الدهنية المعزولة تحت الجلد والحشوية والشرايين المعنية. (أ) اليسار: الأنسجة الدهنية المعزولة "على شكل حرف C" تحت الجلد من الأطراف الخلفية. يتم الكشف عن فرع رئيسي من الشريان الدهني تحت الجلد ، يشار إليه بالسهم (1) ، عند إزالة الدهون المتني. على اليمين: شرايين دهنية معزولة تحت الجلد. (ب) اليسار: يتم عزل الأنسجة الدهنية المساريقية (الحشوية) من الأمعاء. على اليمين: يتم عزل الممر الشرياني المعني عن طريق إزالة النسيج المتني. يتم استخدام مقاييس مختلفة بين صور الدهون (5 مم) والشرايين (1 مم). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحديد الخلايا البطانية بعد هضم الأنسجة الشريانية عن طريق قياس التدفق الخلوي. مخططات تمثيلية تظهر الخلايا المحررة من الشرايين الدهنية المعزولة (أ) تحت الجلد أو (ب) المساريقية. تعرضت الخلايا للأجسام المضادة المترافقة التي استهدفت الظهارة خارج الخلية من CD31 (PE) و CD45 (FITC) قبل التثبيت. تم استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد مجموعة الخلايا البطانية CD31 + CD45−. تم استخدام وصمة عار صلاحية الخلية لاختيار الخلايا التي نجت فقط من بروتوكولات العزل والهضم للتحليلات اللاحقة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البوابة المناسبة في هذه المرحلة ستزيد من فصل مجموعة الخلايا المقصودة عن الخلايا الملوثة إذا كان حجم نوع الخلية محل الاهتمام معروفا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل التعبير الغشائي CD36 في الخلايا البطانية للشريان الدهني تحت الجلد مقابل المساريقي عن طريق قياس التدفق الخلوي. مخططات سكانية تمثيلية ورسوم بيانية تظهر تعبير غشاء CD36 البطاني (APC) في (A) تحت الجلد أو (B) الشرايين الدهنية المساريقية. (ج) النسبة المئوية للخلايا البطانية (ECs) التي تعبر عن CD36 في ECs تحت الجلد مقابل المساريقي (n = 5 ، 3 ذكور ، 2 إناث ؛ * p < 0.05 بعد اختبار t للطالب). (د) التعبير الطبيعي لغشاء EC CD36 في الشرايين الدهنية تحت الجلد مقابل المساريقي (n = 5 ، 3 ذكور ، 2 إناث ؛ * p < 0.05 بعد اختبار t للطالب). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
الخلل البطاني هو مقدمة لحالات مرضية حادة ، من المحتمل أن يؤدي إلى تطور تصلب الشرايين وارتفاع ضغط الدم والسكتة الدماغية 3,23. في حين أن الآليات المحددة الكامنة وراء الخلل البطاني في حالة مرضية معينة كثيرة ، فمن المرجح أن تتأثر الأسرة الوعائية المتميزة بشكل تفاضلي بالحالات المرضية 4,24. علاوة على ذلك ، فإن عوامل الخطر القلبية الوعائية المختلفة (مثل السمنة وارتفاع ضغط الدم وخلل شحوم الدم والتدخين والسكري) تحفز الخلل الوظيفي من خلال مجموعة متنوعة من الآليات المتميزة23,25. لذلك ، من الأهمية بمكان عزل مجموعات الخلايا البطانية عن النماذج الحيوانية الراسخة للمرض أو الأنسجة البشرية التي يمكن الوصول إليها وإجراء اختبارات على الخلايا التي تمت إزالتها على الفور من البيئة في الجسم الحي. تتمتع الخلايا المعزولة بهذه الطريقة بميزة فريدة على دراسة الخلايا في الثقافة من حيث أنها خالية من التغيرات الظاهرية التي تسببها الثقافة 5,6. علاوة على ذلك ، بما في ذلك مجموعة الخلايا البطانية غير المتجانسة ، كما لوحظ في الجسم الحي 26,27 (والتي يمكن فصلها بشكل أكبر باستخدام فرز الخلايا بمساعدة التدفق) ، من كائن حي يبلغ بشكل أفضل البيئة في الجسم الحي. وأخيرا، تنطبق هذه الطريقة على التحقيق في العديد من النماذج الحيوانية والأنسجة البشرية المحتملة، ويمكن استخدامها لتوليد خطوط زراعة الخلايا الأولية، إذا كانت هناك ما يبرر مثل هذه الحاجة.
الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول ، والخطوة التي ستحتاج إلى تعديل أكبر لأسرة الأوعية الدموية المختلفة أو أنواع الخلايا غير المعروضة هنا ، هي هضم الأنسجة الوعائية. يجب تحسين هذه الخطوة لصحة الخلية دون تقليل إنتاجية الخلايا. تعتبر الإنزيمات المحددة المستخدمة ومدة الهضم ضرورية لتحسين صحة الخلايا والعائد لتكون قادرة على إجراء الفحوصات النهائية بشكل كاف. لتحديد التعبير الغشائي ل CD36 ، كما تم اكتشافه بواسطة قياس التدفق الخلوي في الخلايا البطانية تحت الجلد والمساريقي (الشكل 4) ، تم تطوير نسخة معدلة من بروتوكول الهضم المصمم أصلا للفيزيولوجيا الكهربيةالمشبك بالتصحيح 28 . وشمل ذلك تمديد وقت هضم الكولاجيناز I إلى 30 دقيقة لزيادة غلة الخلايا لتلبية متطلبات قياس التدفق الخلوي بشكل أفضل مقابل ما هو مطلوب لدراسات المشبك التصحيحي. وبما أن هذا التعديل قد يؤثر على صحة الخلية إلى حد ما، فقد تم استخدام بقعة بقاء الخلية في تحليلات قياس التدفق الخلوي لضمان تقييم الخلايا البطانية القابلة للحياة فقط بعد هذا البروتوكول (الشكل 3). يوصى بأن تتضمن الدراسات التي تهدف إلى عزل الخلايا عن الأنسجة الوعائية علامة على صلاحية الخلايا قبل تقييم النهج المطلوب.
البروتوكول الموصوف كاف لتحرير الخلايا البطانية القابلة للحياة للتحليل والتطبيقات النهائية من عينات شريانية ≤1 ملغ مشتقة من الفئران. ومع ذلك ، إذا تم عزل الشرايين ذات الأهمية من أنسجة أو كائنات حية مختلفة (مثل البشر) مما سيؤدي إلى كتل شريانية مختلفة بشكل كبير ، فسيتعين على المرء تحسين محتوى إنزيم الهضم ومدة الحضانة لعزل مجموعة الخلايا ذات الاهتمام بكفاءة. بالنسبة لبعض الأسرة الوعائية التي تبدأ بكميات أصغر من الأنسجة الأولية مقارنة بالأسرة تحت الجلد والمساريقي المعروضة هنا (على سبيل المثال ، الشرايين التاجية) ، قد يكون تجميع الشرايين من عدة فئران ضروريا لكل عينة. في الواقع ، قد تكون هذه خطوة ضرورية لأي سرير وعائي معين بالنظر إلى أن نهج النتائج يتطلب عائدا مرتفعا نسبيا من الخلايا. أحد القيود الرئيسية هو أنه نظرا لطبيعة الاختلافات لكل عينة من عمليات الهضم ، يمكن أن تختلف غلة الخلايا في بعض الأحيان اختلافا كبيرا عبر الدفعات حتى عندما تكون من نفس السرير الوعائي. هذا يمكن أن يسبب مشاكل عند تحليل البيانات ويجب حسابه عن طريق التطبيع عند الاقتضاء. على سبيل المثال ، كان تعبير CD36 متغيرا للغاية في البيانات الخام بسبب التغيرات في غلة الخلايا عبر عينات فردية من الشرايين الدهنية تحت الجلد والمساريقي. لذلك ، تم تطبيع البيانات الخام إلى CD31 + CD45 - متوسط كثافة التألق مع افتراض أن هذه الطريقة ستصحح اختلافات الدفعات (الشكل 4). وبطبيعة الحال، واعتمادا على النهج، قد تكون هناك حاجة إلى تحليلات إحصائية أكثر تطورا وأساليب تطبيع.
باختصار ، تقدم هذه الورقة طريقة لتشريح وعزل وهضم الشرايين تحت الجلد والمساريقي من الفئران للتحقيق في تعبير و / أو وظيفة الأهداف البطانية ذات الاهتمام. مع التعديلات على البروتوكول المقدم ، يمكن التحقيق في أسرة الأوعية الدموية المختلفة وأنواع الخلايا (على سبيل المثال ، خلايا العضلات الملساء). هذا البروتوكول ، كأساس لعدد كبير من الأساليب التجريبية المتاحة ، لديه القدرة على تعزيز فهم بيولوجيا الخلايا الوعائية وآليات خلل الأوعية الدموية.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
في ذكرى محبة لريتش ويست ، عالم لامع وزميل وصديق عزيز. نود أن نشكر جامعة ديلاوير Flow Cytometry و BioImaging Core كجزء من معهد ديلاوير للتكنولوجيا الحيوية على مساهماتهم المستمرة في دراساتنا. كما نود أن نشكر إيما هودجينز على المراجعة الدقيقة للمخطوطة وتحريرها. يتم دعم عملنا من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). تم دعم هذا المشروع أيضا من قبل برنامج ديلاوير INBRE ، مع منحة من NIGMS (P20GM103446) من المعاهد الوطنية للصحة وولاية ديلاوير (I.S. Fancher) ، ومنحة أبحاث جامعة ديلاوير العامة (I.S. Fancher). هذا المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue dissection tools | |||
| 5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
| 55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
| Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
| Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
| Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
| Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
| Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
| Solutions Recipes | |||
| HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
| Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
| Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
| Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
| CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
| CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
| Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |
References
- Krüger-Genge, A., Blocki, A., Franke, R. P., Jung, F. Vascular endothelial cell biology: An update. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4411 (2019).
- Choi, S., Kim, J. A., Kim, K. C., Suh, S. H. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 19 (1), 35-42 (2015).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Nunan, E., et al. Obesity as a premature aging phenotype - Implications for sarcopenic obesity. Geroscience. , (2022).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1599-1604 (1997).
- Amici, S. A., Dong, J., Guerau-de-Arellano, M. Molecular mechanisms modulating the phenotype of macrophages and microglia. Frontiers in Immunology. 8, 1520 (2017).
- Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key SoxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K+ channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. The Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- Ahn, S. J., et al. Cholesterol-induced suppression of endothelial Kir channels is a driver of impairment of arteriolar flow-induced vasodilation in humans. Hypertension. 79 (1), 126-138 (2022).
- Ahn, S. J., et al. Differential effects of obesity on visceral versus subcutaneous adipose arteries: Role of shear-activated Kir2.1 and alterations to the glycocalyx. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 322 (2), 156-166 (2022).
- Fancher, I. S., et al. Impairment of flow-sensitive inwardly rectifying K(+) channels via disruption of glycocalyx mediates obesity-induced endothelial dysfunction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (9), 240-255 (2020).
- van Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: Specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Research. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Ades, E. W., et al. HMEC-1: Establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. Journal of Investigative Dermatology. 99 (6), 683-690 (1992).
- Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncology Reports. 15 (2), 381-386 (2006).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), e54641 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine Peyer's patches. Journal of Visualized Experiments. (73), e50167 (2013).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of cell suspensions isolated from solid tissues by spectral flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Son, N. -H., et al. Endothelial cell CD36 optimizes tissue fatty acid uptake. The Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4329-4342 (2018).
- Bakker, W., Eringa, E. C., Sipkema, P., van Hinsbergh, V. W. M. Endothelial dysfunction and diabetes: roles of hyperglycemia, impaired insulin signaling and obesity. Cell and Tissue Research. 335 (1), 165-189 (2008).
- Farb, M. G., Gokce, N. Visceral adiposopathy: A vascular perspective. Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation. 21 (2), 125-136 (2015).
- Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. International Journal of Obesity. 26 (6), 754-764 (2002).
- Cleuren, A. C. A., et al. The in vivo endothelial cell translatome is highly heterogeneous across vascular beds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (47), 23618-23624 (2019).
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429 (2012).
- Sonkusare, S. K., Dalsgaard, T., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Inward rectifier potassium (Kir2.1) channels as end-stage boosters of endothelium-dependent vasodilators. The Journal of Physiology. 594 (12), 3271-3285 (2016).
