Summary
Opisujemy to test na przyczepność drożdży i inwazji agar jako miara zróżnicowania inwazyjne i pseudohyphal. Ten prosty test może być wykorzystane do oceny inwazyjnym fenotypem różnych mutantów, jak również wpływu na środowisko pamięci i szlaków sygnałowych różnicowania drożdży.
Abstract
Drożdże są na naturalnych biofilmu, gdzie wielu mikroorganizmów kolonizacji powierzchni. W sztucznych warunkach, takich jak powierzchnie obiekty stworzone przez człowieka, biofilmu może zmniejszyć wydajności przemysłu, zniszczyć struktury i zagrażają ludzkiemu życiu. 03/01 Z drugiej strony, wykorzystanie mocy biofilmu może pomóc czyste środowisko oraz zrównoważony energii. 08/04 Możliwość S. cerevisiae do kolonizacji powierzchni i uczestniczą w złożonych biofilm był zazwyczaj ignorowane aż do ponownego odkrycia programów zróżnicowanie wywołane przez różne szlaki sygnałowe i wskazówki dla środowiska w tym organizmie. 9, 10 nadal zainteresowanie wykorzystaniem S. cerevisiae jako organizm modelowy do zrozumienia interakcji i zbieżności ścieżek sygnałowych, takich jak Ras-PKA, Kss1 MAPK i Hog1 osmolarności ścieżek, szybko umieścić S. cerevisiae w zbiegu biofilmu biologii i badaniach transdukcji sygnału. 20/11 W tym celu różnicowania komórek drożdży w długie, klej, nici pseudohyphal stał się wygodny odczyt do aktywacji szlaków transdukcji sygnału na różne zmiany w środowisku. Jednak filamentacji jest złożonym kolekcji fenotypów, co sprawia, oznaczanie to tak, jakby był prosty fenotyp mylące. W ciągu ostatniej dekady, kilka testów udało się przyjąć od bakteryjnego biofilmu badań do badań drożdże, takie jak testy formacji MAT do pomiaru rozprzestrzeniania kolonii w miękkim agarze i barwienia fioletem krystalicznym ilościowego pomiaru powierzchni komórek przestrzegania. 12, 21 Jednak nie było pewne zamieszanie w testach opracowanych do jakościowo ocenić kleju i inwazyjne fenotypy drożdży w agar. Poniżej przedstawiamy proste i niezawodne metody oceny kleju i inwazyjne jakości szczepy drożdży z łatwym do zrozumienia kroki w celu odizolowania oceny przyczepności z oceny inwazji. Nasze metody, przyjęte z poprzednich badań, 10, 16 dotyczy komórek rosnących w ciekłych i poszycia na różnicy odżywczych warunków dla wzrostu dużych punktów, które następnie zmyć wodą w celu oceny przyczepności i pocierać komórek całkowicie z powierzchni agaru ocenić inwazję agar. Eliminujemy potrzebę smug komórek na agar, co wpływa na inwazję komórek w agar. Ogólnie rzecz biorąc, zauważyliśmy, że haploidalnych szczepów, które atakują agar zawsze kleju, ale nie wszystkie szczepy kleju można najechać agarze. Nasze podejście może być stosowany w połączeniu z innymi testy dokładnie przeanalizujemy kroki różnicowania i wymagania transdukcji sygnału drożdży, różnicowanie, wykrywania kworum, a tworzenie biofilmu.
Protocol
- Umieść 200ul kultur rosnących odsetek od syntetycznych mediów płytkach z wymaganych warunków głodu (SC z 2% glukozy w porównaniu z SC z 0,2% glukozy, na przykład) Jeżeli gęstość kultur różnią się zbytnio od siebie, zmienić liczbę komórek na kulturę 200ul więc każda kropla jest w przybliżeniu taką samą ilość komórek.
- Upewnij się, że do prowadzenia ewidencji, które spadku na płytach, które jest kultura.
- Przechowywać uchylone wieko płyty i pozostawić albo w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 30 ° C, aż krople są suche.
- Płyty Seal z parafilmie i folią (opcjonalne) i pozostawić w temperaturze 30 ° C przez 3-7 dni.
- Dokument wzrost komórek na płytkach (przez skanowanie, biorąc obrazu cyfrowego, itp.)
- Przemyć komórki z powierzchni agaru z wodą pod wysokim ciśnieniem (najlepiej wody DI) przez około minutę dbanie o agar nie do zniesienia i zmiany orientacji.
- Pozbyć się nadmiaru wody, wybierając płyty na ręczniki papierowe i pozostawiając je otwarte do wyschnięcia.
- Gdy płyty są suche przyczepność dokument na każdej płytce (przez skanowanie lub robienie cyfrowych zdjęć)
- Z palec w rękawiczce, delikatnie zetrzeć komórki tworzą na powierzchni agaru pod bieżącą wodą przez około minutę.
- Wysuszyć płytki jak wcześniej.
- Jeśli korzystasz z zakresu prosektorium, usunąć igłę przed umieszczeniem płyty na platformę mikroskopem.
- Inwazja dokumentu w powiększeniu 10x lub 40x. Upewnij się, że koncentrują się na środkowej części każdego okręgu, do krawędzi będą zbyt zatłoczone, aby zobaczyć poszczególne morfologii komórek. Krawędzie mogą wskazywać poziom nitkowatych wzrostu i może być udokumentowane w przyszłości. Skanowanie lub biorąc cyfrowy obraz całego tabliczka może być również pomocne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drożdże wyświetlania różnych rodzajów zróżnicowania w zależności od składników odżywczych dostępności i warunków środowiskowych, w tym formowanie sporów w warunkach głodu i stresu, filamentacji w różnych substancji odżywczych podkreśla i flokulacji. Różne drożdży, w tym S. cerevisiae i C. albicans, można znaleźć również w biofilm utworzony przez zestaw różnorodnych mikroorganizmów. Choć istnieje pewna korelacja z filamentacji i zachowania inwazyjne, nie jest jasne, jak dokładnie filamentacji może spowodować inwazję i kolonizację powierzchni i tkanek. Drożdże z pewnością można znaleźć zarówno wegetatywnego i nitkowate formy w biofilmu w przyrodzie, jak również miejsca, w których zagrożenie dla zdrowia ludzi, takich jak cewniki i zakażonych narządów człowieka. 13/10 W celu zrozumienia ścieżek sygnałowych wykorzystywane przez drożdże do zakażenia zwierząt i do udziału w biofilmów szkodliwe i pożyteczne, musimy opracować dostępne i wiarygodne testy. Tutaj mamy opracowany test, przyjęty od już istniejących przyczepność i testy inwazji dostępna dla drożdży, które pozwalają określić jakościowo klej i inwazyjne fenotypy szczepów drożdży i mutantów w różnych warunkach. Test przedstawiony tutaj eliminuje wymóg smug komórek drożdży na agar, gdzie sama akcja smug na powierzchni agaru zmian inwazyjnych i adhezyjne drożdży. Obrazowania cyfrowego zwłaszcza komórek inwazji przez mikroskop pozwala na pół-ilościowej oceny stopnia inwazji i przyczepność. Takie wykrywanie komórek inwazyjnych i klej jest bezpłatne jednolitego agar komórek testu inwazji opracowany przez laboratorium Sprague 9 i mogą być dostosowane do eksperymentów oczywiście czasu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Chcielibyśmy podziękować Lisa Schneper i Katrin Duevel ich wgląd w rozwój tego testu.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Moticam 350 | Camera | Motic | discontinued (new model: Moticam 352) | A relatively cheap camera that attaches to eye pieces of microscopes and captures digital images for PC or Mac. |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
- Elortondo, F. J. P., Salmeron, J., Albisu, M., Casas, C. Biofilms in the food industry. Food Science and Technology International. 5, 25-30 (1999).
- Keinanen, M. M., Martikainen, P. J., Kontro, M. H. Microbial community structure and biomass in developing drinking water biofilms. Can J Microbiol. 50, 183-191 (2004).
- Biffinger, J. C., Pietron, J., Ray, R., Little, B., Ringeisen, B. R. A biofilm enhanced miniature microbial fuel cell using Shewanella oneidensis DSP10 and oxygen reduction cathodes. Biosens Bioelectron. 22, 1672-1679 (2007).
- Kim, G. T. Bacterial community structure, compartmentalization and activity in a microbial fuel cell. J Appl Microbiol. 101, 698-710 (2006).
- Kim, J. R., Jung, S. H., Regan, J. M., Logan, B. E. Electricity generation and microbial community analysis of alcohol powered microbial fuel cells. Bioresour Technol. 98, 2568-2577 (2007).
- Picioreanu, C., Head, I. M., Katuri, K. P., Loosdrecht, M. C. van, Scott, K. A computational model for biofilm-based microbial fuel cells. Water Res. 41, 2921-2940 (2007).
- Singh, R., Paul, D., Jain, R. K. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14, 389-397 (2006).
- Cullen, P. J., Sprague, G. F. Glucose depletion causes haploid invasive growth in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13619-13224 (2000).
- Gimeno, C. J., Ljungdahl, P. O., Styles, C. A., Fink, G. R. Unipolar cell divisions in the yeast S. cerevisiae lead to filamentous growth: regulation by starvation and RAS. Cell. 68, 1077-1090 (1992).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Reynolds, T. B., Fink, G. R. Bakers' yeast, a model for fungal biofilm formation. Science. 291, 878-881 (2001).
- Verstrepen, K. J., Klis, F. M. Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts. Mol Microbiol. 60, 5-15 (2006).
- Liu, H., Styles, C. A., Fink, G. R. Elements of the yeast pheromone response pathway required for filamentous growth of diploids. Science. 262, 1741-1744 (1993).
- Madhani, H. D., Fink, G. R. The control of filamentous differentiation and virulence in fungi. Trends Cell Biol. 8, 348-353 (1998).
- Mosch, H. U., Kubler, E., Krappmann, S., Fink, G. R., Braus, G. H. Crosstalk between the Ras2p-controlled mitogen-activated protein kinase and cAMP pathways during invasive growth of Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 10, 1325-1335 (1999).
- Mosch, H. U., Roberts, R. L., Fink, G. R. Ras2 signals via the Cdc42/Ste20/mitogen-activated protein kinase module to induce filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5352-5356 (1996).
- Pan, X., Heitman, J. Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 19, 4874-4887 (1999).
- Roberts, R. L., Fink, G. R. Elements of a single MAP kinase cascade in Saccharomyces cerevisiae mediate two developmental programs in the same cell type: mating and invasive growth. Genes Dev. 8, 2974-2985 (1994).
- Robertson, L. S., Fink, G. R. The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13783-13787 (1998).
- Reynolds, T. B., Jansen, A., Peng, X., Fink, G. R. Mat formation in Saccharomyces cerevisiae requires nutrient and pH gradients. Eukaryot Cell. , (2007).
