Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

В пробирке Апикально-аутентоидная модель некротизирующего энтероколита

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64003
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center and Center for Pregnancy and Newborn Health

Summary

Этот протокол описывает модель апикального некротизирующего энтероколита (NEC) в чашке, использующую энтероиды тонкой кишки с обратной полярностью, позволяющую получить доступ к апикальной поверхности. Мы предоставляем протокол иммунофлуоресцентного окрашивания для обнаружения эпителиальных нарушений, связанных с NEC, и метод определения жизнеспособности апикальных энтероидов, подвергающихся протоколу NEC-in-a-dish.

Abstract

Некротизирующий энтероколит (НЭК) является разрушительным заболеванием, поражающим недоношенных детей, характеризующимся воспалением кишечника и некрозом. Энтероиды в последнее время стали перспективной системой для моделирования желудочно-кишечных патологий. Однако используемые в настоящее время методы энтероидных манипуляций либо не имеют доступа к апикальной поверхности эпителия (трехмерные [3D]), либо являются трудоемкими и ресурсоемкими (двумерные [2D] монослои). Эти методы часто требуют дополнительных шагов, таких как микроинъекция, чтобы модель стала физиологически переводимой. Здесь мы описываем физиологически значимый и недорогой протокол для изучения NEC in vitro путем обращения вспять энтероидной полярности, в результате чего апикальная поверхность обращена наружу (апикально-наружу). Также предусмотрен протокол иммунофлуоресцентного окрашивания для изучения целостности энтероидного барьера и экспрессии соединительного белка после воздействия фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α) или липополисахарида (ЛПС) в нормоксических или гипоксических условиях. Также оценивается жизнеспособность 3D-апикально-ауттероидных энтероидов, подвергшихся воздействию нормоксических или гипоксических ЛПС или TNF-α в течение 24 ч. Энтероиды, подвергшиеся воздействию ЛПС или TNF-α в сочетании с гипоксией, демонстрировали нарушение эпителиальной архитектуры, потерю экспрессии белка соединения адгезий и снижение жизнеспособности клеток. Этот протокол описывает новую апикальную модель NEC-in-a-dish, которая представляет собой физиологически значимую и экономически эффективную платформу для выявления потенциальных эпителиальных целей для терапии NEC и изучения преждевременного кишечного ответа на терапию.

Introduction

Некротизирующий энтероколит (НЭК), тяжелое воспалительное заболевание тонкой кишки, встречающееся у 10% недоношенных детей, обычно связано с высокой заболеваемостью и смертностью 1,2. Показатели смертности, приближающиеся к 50% у младенцев с очень низкой массой тела при рождении (<1500 г), требующих хирургического вмешательства, не редкость3. Хотя точная этиология НЭК в настоящее время не понята, считается, что факторы риска, такие как искусственное вскармливание, сочетаются с физиологическими аномалиями, такими как дисбактериоз, незрелый кишечный эпителий и дисфункциональный кишечный барьер, в развитии заболевания 2,4. Несмотря на значительные усилия, за последнее десятилетие5 был достигнут незначительный прогресс в профилактике или лечении НЭК. Новый метод in vitro для изучения NEC и связанной с ним дисфункции кишечного эпителиального барьера необходим для углубления понимания патогенеза заболевания, поскольку результаты животных моделей до сих пор плохо переводились на прикроватную часть6.

Ряд моделей in vitro был использован для исследования механизмов, действующих во время NEC. Клеточная линия эпителия кишечника человека, Caco-2, является одной из наиболее часто используемых моделей IN VITRO NEC 7,8. Клетки Caco-2 имитируют морфологические особенности границы кисти тонкой кишки, но, как клеточная линия, не дифференцируются в широкий спектр типов клеток in vivo, включая слизь-продуцирующие бокалы, необходимые для высокотранслизируемой модели. HT-29-MTX, клетки аденокарциномы толстой кишки человека, включают смешанный фенотип энтероцитарных и бокаловидных клеток, но все еще не имеют типов клеток на основе крипты кишечного эпителия9. IEC-6 и IEC-18 являются нетрансформированными клеточными линиями с незрелой подвздошной криптоподобной морфологией, но не получены из тканей человека, что ограничивает их поступательную способность. Линии клеток кишечника FHs 74-Int и H4 получены из ткани плода человека и не образуют плотных соединений или поляризованных монослоев10,11 и, таким образом, являются незрелыми по сравнению даже с самыми недоношенными детьми, восприимчивыми к NEC. Как правило, модели NEC in vitro используют лечение липополисахаридами (LPS) для индуцирования толл-подобного рецептора 4 (TLR4), основного рецептора, инициирующего воспаление кишечника в NEC12. Повреждение, опосредованное обработкой активными формами кислорода (АФК), обычно через перекись водорода, часто используется для индуцирования NEC-подобного окислительного повреждения и апоптоза13,14. В качестве основного фактора воспаления кишечника фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α), последующий компонент воспалительной передачи сигналов TLR4, также обычно используется в этих моделях in vitro для имитации патогенеза in vivo 15.

Органоиды, полученные из индуцируемых плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), стали популярными в качестве модели кишечника in vitro из-за их способности повторять сложную архитектуру in vivo и клеточный состав ткани, из которой они получены16,17. Родственная система in vitro, энтероиды, представляют собой органоиды, полученные из резецированных кишечных крипт, которые легче установить и поддерживать, чем органоиды, полученные из iPSC. Энтероиды обычно выращиваются в трехмерном (3D) внеклеточном матриксе (ECM) с экспериментальным доступом, ограниченным базолатеральной клеточной поверхностью. Методы, такие как микроинъекция18,19, были разработаны для преодоления этого барьера на апикальной поверхности, но накопление слоистого клеточного мусора и слизи в просвете делает микроинъекцию как технически сложной, так и непоследовательной. Поскольку пользовательские роботизированные платформы микроинъекции не являются широко доступными20, лабораторная изменчивость технических возможностей и общей техники становится значительными переменными для преодоления с помощью протоколов микроинъекции. Двумерные (2D) монослои, полученные из диссоциированных 3D-энтероидов, все еще включающие все основные типы клеток кишечного эпителия, обеспечивают доступ к апикальной поверхности, но традиционно их трудно поддерживать без питающего слоя мезенхимальных миофибробластов21. В то время как проницаемые опоры клеточной культуры могут быть использованы для доступа как к апикальной, так и к базолатеральной сторонам энтероидных монослоев без использования нижележащих миофибробластов, эти вставки требуют иссечения и монтажа мембраны перед использованием с такими модальностями, как конфокальная микроскопия, что приводит к более технически сложному и сложному процессу при использовании традиционных методов микроскопии22. NEC был смоделирован in vitro с использованием традиционных 3D-энтероидов 23,24,25 и проницаемых опор 26,27, а воспаление кишечника недавно было воспроизведено с моделями gut-on-a-chip28,29. В то время как модели «кишка на чипе», включающие микрофлюидику, на сегодняшний день являются самыми передовыми и переводимыми моделями, эта технология дорога, сложна и недоступна для большинства исследователей30.

Последние достижения в области апикальных энтероидных методов позволили облегчить доступ к апикальной поверхности 3D-энтероидов без риска повреждения структурной целостности эпителия in vitro 31,32,33. Апикальные энтероиды разделяют состав клеточного типа и барьерную функцию кишечного эпителия in vivo, но, в отличие от типичных 3D-энтероидов, апикальные поверхности этих клеток обращены к культуральной среде, что позволяет проводить более физиологически значимые исследования абсорбции питательных веществ, микробной инфекции и люминальной секреции31. Дополнительным преимуществом апикально-ауттероидов является способность гомогенно распределять экспериментальные агенты по энтероидам. Изменение объемов обработки в зависимости от размера энтероидов не требуется, как это происходит при микроинъекции, а способность поддерживать эти энтероиды в культуре суспензии сводит на нет любые интерференции ECM на экспериментальной диффузии агента32.

Некротизирующий энтероколит представляет собой многофакторное заболевание, включающее множественные типы эпителиальных клеток кишечника и различные факторы окружающей среды и патофизиологические факторы34. Разнообразный клеточный состав кишечных энтероидов является явным улучшением по сравнению с монокультурами в моделировании сложного заболевания, такого как NEC. Интересно, что в то время как одного воспалительного воздействия часто достаточно, чтобы вызвать повреждение монокультур in vitro , энтероиды, как и в случае с мышиными моделями23, по-видимому, требуют как минимум двух воспалительных компонентов, чтобы вызвать NEC-подобное повреждение6. Здесь мы представляем апикальную модель NEC-in-a-dish, использующую апикальные энтероиды в сочетании с гипоксией (важная клиническая особенность NEC6) и либо LPS, либо TNF-α, в качестве улучшенной и более физиологически значимой модели in vitro для изучения эпителиальных реакций на воспаление, подобное NEC, и, потенциально, определения терапевтических мишеней. Мы описываем протокол для изменения полярности 3D-энтероидов тонкой кишки, а также протокол иммунофлуоресцентного окрашивания для выявления нарушения эпителиального барьера и изменений экспрессии соединительного белка. Наконец, мы дополнительно демонстрируем простой анализ энтероидной жизнеспособности, чтобы определить влияние нашей модели NEC-in-a-dish с двойным ударом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры для животных в этом исследовании были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Центра медицинских наук Университета Оклахомы. Образцы для удобства тонкой кишки от недоношенного нечеловеческого примата (NHP, 90% беременности, оливковый бабуин, Papio anubis) были получены после эвтаназии для отдельного исследования (Протокол No101523-16-039-I).

1. Создание апикально-ауттероидной модели NEC-in-a-dish

  1. Подготовка средств для лечения сред и энтероидов
    ПРИМЕЧАНИЕ: После приготовления в соответствии со стандартной асептической техникой среду можно хранить при температуре 4 °C в течение 1 недели.
    1. Получают безантибиотиковую среду (AFM), смешивая 50 мл органоидной ростовой среды человека с 50 мл органоидной добавки (см. Таблицу материалов). Приготовьте 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты/1x фосфатно-буферного физиологического раствора (ЭДТА/ПБС), добавив 100 мкл 0,5 М ЭДТА к 9 900 мкл ПБС.
    2. Охладите модифицированную смесь Ветчины F12 + 15 мМ HEPES Buffer (DMEM/F12) при 2-8 °C.
    3. Приготовьте TNF-α растворе, суспендируя 100 мкг порошка TNF-α в 1 мл 1x PBS. Далее разбавляют TNF-α запасы до концентраций 20 нг/мл и 50 нг/мл, используя AFM в качестве растворителя. Приготовьте раствор ЛПС, суспендируя 2 мг ЛПС в 1 мл 1x PBS. Далее разбавляют запас ЛПС до 100 мкг/мл и 200 мкг/мл, используя АСМ в качестве растворителя.
  2. Изменение полярности 3D-энтероидов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура предназначена для разворота одной 24-луночной пластины для культивирования тканей с плоским дном в две 24-луночные пластины для культивирования тканей со сверхнизким прикреплением. Пластины для культивирования тканей следует нагревать до 37 °C в течение не менее 30 мин перед использованием. Выведение базолатеральных 3D-энтероидов было достигнуто, как описано ранее многими группами 35,36, с небольшими модификациями для сред (подробно описано выше). Общая процедура получения энтероидов не отличается от таковой у человека. Короче говоря, иссеченная ткань промывается, разрезается на мелкие фрагменты и инкубируется в буфере разрушения клеток. Затем клеточный раствор пропускают через клеточный сетчатый фильтр 70 мкМ, в результате чего образуются крипты, которые покрыты высокой плотностью.
    1. Аспиратные среды из каждой лунки 24-луночной пластины установленных 3D базолатеральных энтероидов.
    2. Добавьте 500 мкл 5 мМ ледяного ЭДТА/ПБС в каждую скважину плиты из 24 скважин и осторожно механически разрушайте экстракт базальной мембраны/ купол ECM, пипеткой вверх и вниз пипеткой p200 минимум 5x-6x.
    3. Перенесите содержимое четырех скважин в коническую трубку объемом 15 мл и добавьте в коническую трубку 8 мл ледяного ЭДТА/ПБС. Перенесите оставшиеся 20 скважин таким же образом.
    4. Инкубируйте конические трубки объемом 15 мл при 4 °C в течение 1 ч на вращающейся платформе или шейкере при 330 об/мин. После инкубации 1 ч центрифугируют конические трубки при 300 х г в течение 3 мин при 4 °C. Извлеките и выбросьте супернатант из каждой трубки.
    5. Соедините и промывайте гранулы ячейки с 5 мл DMEM/F12 и распределите клеточную суспензию по две конические трубки по 15 мл.
    6. Гранулируйте ячейки центрифугированием при 300 х г в течение 3 мин при 4 °C. Удалите супернатант и добавьте 12 мл AFM в каждую трубку, гарантируя, что гранулы клеток будут повторно суспендированы.
    7. Пипетка 500 мкл энтероидной суспензии в каждую скважину из двух 24-луночных сверхнизких пластин крепления.
    8. Инкубируют пластины при 37 °C и 5% CO2 в течение 2-5 дней или до тех пор, пока энтероиды не изменят полярность.
    9. Чтобы проверить интероидную реверсию, сначала установите подтверждающее иммунофлуоресцентное окрашивание и среднее время до разворота (~ 3 дня), затем подтвердите изменение полярности с помощью базовой визуализации светового микроскопа. Апикально-наружные энтероиды очень клеточны по внешнему виду, в то время как в базолатеральных энтероидах часто преобладает наличие большого центрального просвета или бутонизации (см. Дополнительный рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После стандартизации процедуры коэффициент конверсии в апикальный выход обычно превышает 95%. Использование апикальных энтероидов задумано как терминальный эксперимент, хотя теоретически возможно прохождение апикальных энтероидов в небольшое количество базолатеральных энтероидов.
  3. Апикальный NEC-in-a-dish
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как только энтероиды изменили полярность, быстро используйте культуры в последующих экспериментах, так как их долговечность в апикальной конформации не была подтверждена более 3-4 дней. Для следующей модели NEC-in-a-dish энтероиды обрабатывали в течение 24 ч, а затем собирали сразу после этого и сохраняли для последующих экспериментов.
    1. После того, как энтероиды визуально изменили полярность с эффективностью не менее 95%, извлеките пластины из инкубатора и соберите восемь лунок 24-луночной пластины в коническую трубку объемом 15 мл. Поскольку апикальные энтероиды находятся в суспензии, просто пипетка энтероидного/медиа раствора. Центрифугировать пробирку объемом 15 мл при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    2. После того, как клетки гранулированы, удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки в 4 мл AFM, смешанной с желаемым объемом (10 мкл здесь, чтобы соответствовать наибольшему добавленному объему обработки) 1x PBS (контроль).
    3. Пипетка 500 мкл энтероидной/PBS/AFM суспензии в восемь скважин 24-луночной сверхнизкой крепежной пластины и инкубирует пластину при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 ч.
    4. Повторите шаги 1.3.1.-1.3.3. для лечения TNF-α (20 нг/мл и 50 нг/мл) и ЛПС (100 мкг/мл и 200 мкг/мл) при нормоксии. Для всех методов лечения гипоксии повторите шаги 1.3.1.-1.3.3., но поместите пластину в отдельный инкубатор при 37 °C, 5% CO2 и 1% O2 в течение 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1.3.4. это может быть сделано одновременно с этапами 1.3.1.-1.3.3, но для ясности приведенная выше процедура была разделена обработкой, чтобы уменьшить сложность.

2. Иммунофлуоресцентное окрашивание и конфокальная микроскопия

  1. Приготовление окрашивающих растворов
    1. Приготовьте 0,1% Triton X-100, смешивая 7 мкл Triton X-100 в 1x PBS до конечного объема 7 мл. Подготовьте PBST (PBS-Tween), добавив 30 мкл Tween-20 к 1x PBS к конечному объему 30 мл.
    2. Приготовьте 10% нормальной ослиной сыворотки (NDS)/PBST, добавив 700 мкл NDS к 6,3 мл PBST. Приготовьте 1% НДС/ПБСТ, добавив 70 мкл НДС к ПБСТ к конечному объему 7 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ослиная сыворотка использовалась здесь для корреляции с вторичным антителом хозяина. Тем не менее, блокирующие виды сыворотки должны соответствовать вторичным видам антител, чтобы правильно блокировать неспецифическое связывание.
  2. Окрашивание (День 1)
    1. Перенесите содержимое четырех скважин 24-луночной плиты в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Повторите для всех желаемых лунок / процедур, с каждой обработкой в отдельной трубке. Центрифугируйте пробирки при 300 х г в течение 4 мин при 4 °C. Как только энтероиды будут гранулированы, удалите супернатант.
    2. Повторно суспендируют ячейки гранул в 300 мкл 4% формальдегидного фиксатора в течение 30 мин при комнатной температуре (RT). Через 30 мин центрифугируют пробирки при 300 х г в течение 4 мин при 4 °C, удаляют супернатант и промывают гранулу 500 мкл стерильной, RT 1x PBS.
    3. Центрифугируйте пробирки при 300 х г в течение 4 мин при 4 °C. Удалите надосадочный материал и добавьте 500 мкл 0,1% тритона X-100, и оставьте на 1 ч при RT.
    4. Через 1 ч центрифугируют пробирки при 300 х г в течение 4 мин при 4 °С и удаляют надосадочное вещество. Промыть 500 мкл 1x PBS и поместить трубки на ротатор или шейкер при 200 об/мин в течение 15 мин при 2-8 °C. Повторите это в общей сложности 4x.
    5. Центрифугируйте пробирки при 300 х г в течение 4 мин при 4 °C и удалите супернатант. Добавьте 500 мкл 10% NDS/PBST и инкубируйте на RT в течение 45 мин. Во время инкубации готовят растворы первичных антител, комбинируя 20 мкл рекомбинантного антивиллинового антитела, 10 мкл антитела к Е-кадгерину и 1970 мкл 1% NDS/PBST для восьми лунок 24-луночной пластины.
    6. После 45 мин инкубации центрифугируют пробирки при 300 х г в течение 4 мин при 4 °C. Поместите трубки на лед. Удалить супернатант и заменить 250 мкл раствора первичного антитела. Инкубировать пробирки в течение ночи при температуре 2-8 °C.
  3. Окрашивание (День 2)
    1. Центрифугируйте пробирки при 300 х г в течение 4 мин при 4 °C и удалите супернатант. Добавьте 250-500 мкл ПБСТ в каждую трубку, в зависимости от размера гранулы, и поместите на ротатор или шейкер при 200 об/мин в течение 1 ч при 2-8 °C. Повторите промывку PBST 4x.
    2. Готовят раствор вторичных антител, добавляя 52 мкл Cy3 ослиного анти-кролика IgG (H + L) к 50% глицерину и 5,2 мкл флуоресцентных зеленых 488 вторичных антител против осла к 5142,8 мкл 1% NDS/PBST.
    3. После последней промывки и центрифугирования PBST удалите супернатант из трубок. Вводят по 200 мкл раствора вторичных антител в каждую пробирку и инкубируют в темноте на ночь при 2-8 °C.
  4. Монтаж окрашенных апикальных энтероидов (День 1)
    1. В течение 1 ч доведите до РТ монтант на основе глицерина, содержащий синий ядерный краситель.
    2. Центрифугируйте пробирки при 300 х г в течение 4 мин при 4 °C. Удалите 100 мкл супернатанта и повторно суспендируйте клетки в оставшихся ~100 мкл супернатанта. Переложите клеточную суспензию в пробирки по 0,5 мл.
    3. Центрифугируйте трубки в мини-центрифуге в течение 20 с, чтобы гранулировать ячейки. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулы клеток в 100 мкл пятна дальней красной нуклеиновой кислоты. Инкубировать пробирки на RT в течение 10 мин.
    4. Центрифугируйте трубки в мини-центрифуге в течение 20 с, чтобы гранулировать ячейки. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулы клеток в 100 мкл 1x PBS. Повторите вторую стирку.
    5. Центрифугируйте трубки в мини-центрифуге в течение 20 с, чтобы гранулировать ячейки и удалить 70 мкл супернатанта. Повторно суспендируйте ячейки в оставшемся объеме PBS и перенесите содержимое в помеченный крышку (24 мм x 60 мм).
    6. Нанесите 75 мкл монтажника непосредственно на образец и удалите все пузырьки кончиком пипетки. Дайте покровам затвердеть в течение ночи (18-24 ч) при РТ в темноте.
  5. Монтаж окрашенных апикальных энтероидов (День 2)
    1. После отверждения на ночь нанесите тонкий слой (~15 мкл) глицерина на покровные листы. Прикрепите крышку к стеклянному слайду и осторожно прижмите на место. Нажмите, чтобы удалить пузырьки между обложек и слайдом.
    2. Позвольте крышке установить на RT в темноте в течение как минимум 2 ч, прежде чем визуализировать с 20-кратным увеличением с помощью конфокального микроскопа. Для микроскопической визуализации энтероидов с использованием различных конфокальных методов получения см. Lallemant et al.37.
  6. Иммунофлуоресцентная количественная оценка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод определяет скорректированную общую флуоресценцию путем удаления фонового сигнала с помощью программного обеспечения ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
    1. Откройте конфокальные изображения в ImageJ и наметьте нужную область с помощью инструмента интересующей области (ROI).
    2. Задайте пользовательские параметры, перейдя в раздел Анализ > Набор измерений. Выберите Область > Встроенная плотность > Среднее значение серого цвета на вкладке настроек.
    3. Перейдите в раздел Анализ > меры. Появится всплывающее окно, содержащее измерения. Скопируйте и вставьте эти измерения в электронную таблицу.
    4. Чтобы вычесть фоновый сигнал, выберите небольшую нефлуоресцентную область изображения. Перейдите в раздел Анализ > меры для этого региона. Появится всплывающее окно, содержащее измерения. Скопируйте и вставьте выходные данные в электронную таблицу.
    5. Умножьте площадь выбранной ячейки на среднюю флуоресценцию фоновых показаний и вычтите сумму из интегральной плотности, чтобы вычислить скорректированную общую флуоресценцию ячейки (CTCF). Повторите описанные выше шаги для всех интересующих изображений, сохраняя записи в электронной таблице или пакете статистического программного обеспечения (см. Таблицу материалов).

3. Жизнеспособность ячейки NEC-in-a-dish

  1. Лечение энтероидов
    1. Установите апикальную модель NEC-in-a-dish в течение 24 ч, как показано на шаге 1.
    2. Реагент для анализа жизнеспособности оттаивающих клеток в течение ночи при 4 °C. В день анализа доведите реагент до RT за 30 мин до использования. Переверните реагент для смешивания.
    3. Перед выполнением анализа удалите 100 мкл среды из каждой лунки, оставив оставшиеся 400 мкл. Добавьте 400 мкл реагента для анализа жизнеспособности клеток в каждую лунку.
    4. Энергично хорошо перемешайте содержимое на пластинчатом шейкере на RT в течение 5 мин при 200 об/мин, чтобы вызвать лизис клеток. После встряхивания высиживают пластину в RT в течение дополнительных 25 минут.
    5. После 25 мин инкубации смешайте содержимое одной скважины путем пипетки и перенесите 200 мкл из 800 мкл в одну скважину из 96-луночной, непрозрачной, полистирольной плиты с прозрачным дном. Повторите для оставшихся 600 мкл, создав четыре технические реплики на скважину. Таким образом, перенесите оставшееся содержимое каждой скважины из 24-луночной плиты в плиту из 96 скважин.
    6. Используя пластинчатый считыватель, способный к люминесценции, записывайте значения при интеграции 0,25 мс и сравнивайте относительные значения среди обработок. В качестве альтернативы можно сравнить люминесценцию лечения со стандартом аденозинтрифосфата (АТФ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Использование энтероидов для моделирования воспаления кишечника, даже в контексте некротизирующего энтероколита, в настоящее время распространено. Однако большинство используемых в настоящее время способов либо не имеют доступа к апикальной поверхности энтероидов, что сводит на нет физиологическую значимость соединений, предназначенных для возможного использования в качестве пероральных терапевтических средств, либо являются технически сложными и трудоемкими, как в случае с монослоями, полученными из энтероидов. Чтобы повысить полезность современных энтероидных моделей NEC in vitro, мы обратили вспять полярность энтероидов и, в сочетании с 24-часовой гипоксией и LPS или TNF-α, создали модель NEC-in-a-dish. Иммунофлуоресцентное окрашивание подтвердило апикальную локализацию ядер (синий) по направлению к просвету и обнаружение виллина32 (красный, апикальный маркер) на внешнем краю эпителия (рисунок 1А). Воздействие 200 мкг/мл LPS, 50 нг/мл TNF-α или гипоксии сами по себе не вызывали явных изменений в морфологии грубых клеток, E-кадгерине38 (зеленый) или локализации виллина или флуоресцентной интенсивности по сравнению с контролем (рисунок 1A-D; Рисунок 2). Лечение ЛПС или ФНО-α, в сочетании с гипоксией, нарушало архитектуру эпителия и вызывало значительную потерю адгезионного соединения и экспрессии белка границы кисти, о чем свидетельствует потеря окрашивания Е-кадгерина и виллина (рисунок 1Е-F; Рисунок 2). Эти сокращения экспрессии белка границы энтероцитовой щетки и адгезивного соединения, вероятно, указывают на снижение целостности эпителиального барьера и являются общей чертой как хирургического НЭК человека, так и моделирования заболевания in vitro 23.

Чтобы определить влияние компонентов NEC-in-a-dish на жизнеспособность 3D-апикальных энтероидов, жизнеспособность клеток оценивали с использованием анализа жизнеспособности клеток, разработанного для 3D-культур, с центром на количественной оценке АТФ после лизиса клеток. Энтероиды лечили ЛПС (200 мкг/мл) или ФНО-α (50 нг/мл) в течение 24 ч в нормоксических или гипоксических условиях. ЛПС или ФНО-α сами по себе не оказывали существенного влияния на жизнеспособность клеток по сравнению с контролем (рисунок 3А). Однако значительное снижение жизнеспособности происходило, когда апикальные энтероиды лечились 200 мкг/мл ЛПС или 50 нг/мл TNF-α в сочетании с гипоксией (****p < 0,0001) по сравнению с одной только гипоксией (рисунок 3B). Эти эксперименты демонстрируют универсальность и физиологическую значимость использования апикальных энтероидов в экономически эффективной и простой модели NEC-in-a-dish.

Figure 1
Рисунок 1: Подтверждение апикального фенотипа и морфологических эффектов липополисахарида (ЛПС), фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) и гипоксии. Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание 3D-апикальных энтероидов для границы кисти энтероцитов и адгезивных соединений белков через 24 ч. (A) Контроль, (B) гипоксия, (C) LPS (200 мкг/мл), (D) TNF-α (50 нг/мл), (E) LPS (200 мкг/мл) + гипоксия, (F) TNF-α (50 нг/мл) + гипоксия. Шкала = 50 мкм для каждого изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Количественная оценка интенсивности окрашивания для белков границы кисти и соединения адгезий после 24 ч липополисахарида (ЛПС), фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) и лечения гипоксии. (А) Уровни Виллина (красный) сравниваются между методами лечения; a = p < 0,0001 по сравнению с контролем; b = p < 0,05 по сравнению с контролем; c = p < 0,0001 по сравнению с гипоксией; d = p < 0,05 по сравнению с гипоксией; e = p < 0,001 по сравнению с TNF-α; f = p < 0,01 по сравнению с ЛПС + гипоксией; g = p < 0,0001 по сравнению с LPS; и B) уровни E-кадгерина (зеленый) в сравнении между методами лечения; a = p < 0,0001 по сравнению с контролем; b = p < 0,0001 по сравнению с гипоксией; c = p < 0,01 по сравнению с LPS; d = p < 0,01 по сравнению с TNF-α; e = p < 0,05 по сравнению с ЛПС + гипоксия. Значимость оценивалась с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с тестом Туки для пост-хос-анализа, представленным как среднее ± стандартной погрешности среднего (SEM) (n ≥ 7/группа). Контроль представляет собой нормоксию с PBS в качестве управления транспортным средством. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Влияние липополисахарида (ЛПС), фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) и гипоксии на жизнеспособность клеток. Жизнеспособность 3D-апикальных энтероидов, получавших ЛПС (200 мкг/мл) или ФНО-α (50 нг/мл) в течение 24 ч при (А) нормоксических или (В) гипоксических условиях, измеряли с помощью люминесценции. Статистическая значимость была рассчитана с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с тестом Туки для пост-специального анализа. Энтероиды, получавшие ЛПС (200 мкг/мл) и ФНО-α (50 нг/мл) в сочетании с гипоксией, были значительно менее жизнеспособными по сравнению с одной только гипоксией, наблюдаемой здесь с увеличением люминесценции. ЛПС (200 мкг/мл) или ФНО-α (50 нг/мл) в нормоксических условиях не отличались от контрольных. Данные представлены в виде средней ± стандартной погрешности среднего значения (SEM), n = 8/группа, ****p < 0,0001. Контроль представляет собой нормоксию с PBS в качестве управления транспортным средством. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Морфология трехмерных энтероидов. (A) В то время как в базолатеральных энтероидах преобладает появление большого и открытого центрального просвета, с почкованием или без него, (B) апикально-наружные энтероиды характеризуются плотным, клеточным внешним видом. Шкала = 100 мкм для каждого изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Недавняя разработка энтероидных моделей, полученных из кишечных эпителиальных крипт, позволяет получить более физиологически значимую ткань in vitro , в которой можно изучать патогенез некротизирующего энтероколита. Несмотря на включение всех основных дифференцированных типов клеток кишечного эпителия, 3D-энтероиды по-прежнему подвержены нескольким значительным ограничениям. Обычные, базолатеральные энтероиды суспендируют в 3D ECM гидрогелевых куполах, состав и плотность которых могут ограничивать нормальную диффузию в среде39 культуры тканей. Важно отметить, что эти энтероиды обеспечивают ограниченный доступ к апикальной поверхности клеток, которая является поверхностью, которая in vivo взаимодействует с просветными бактериями и антигенами, такими как энтероцитное TLR4-связывание LPS.

В то время как патофизиология NEC остается неясной, повышенная экспрессия и активация апикального TLR4 в преждевременном кишечном эпителии, как полагают, играют заметную роль40. После активации TLR4 повышенная проницаемость кишечника, снижение восстановления эпителия и бактериальная транслокация приводят к дисфункциональному кишечному барьеру, что приводит к некрозу кишечника2. Считается, что этот воспалительный цикл в дистальной кишке недоношенных детей возникает в просвете кишечника, инициируясь на апикальной поверхности энтероцитов. Таким образом, модели, использующие базолатеральные 3D-энтероиды в механистических исследованиях, включающих бактериальную транслокацию кишечного эпителия, не повторяют патогенез in vivo, как это понимается в настоящее время, и, вероятно, дадут неоптимальную информацию.

Здесь мы описываем создание апикальной модели NEC-in-a-dish, обеспечивающей легкий доступ к апикальной поверхности энтероидных клеток и, по-видимому, приводящей к более физиологически значимой модели по сравнению с обычными 3D-базолатеральными энтероидами. Изменение полярности в этих энтероидах позволяет просто добавлять потенциальные перорально вводимые терапевтические средства в среду и естественным образом поглощаться энтероцитами, как это происходит in vivo. Этот подход не требует дорогостоящих и технически сложных методов, таких как микроинъекция, и является более ресурсоемким, чем создание 2D-монослоев или моделей «кишка на чипе».

Наши репрезентативные результаты указывают на то, что апикальные энтероиды, подвергшиеся воздействию ЛПС или TNF-α, в сочетании с гипоксией страдают от снижения жизнеспособности, нарушения эпителиальной архитектуры и снижения экспрессии белка адгезивного соединения по сравнению с контролем или по сравнению с гипоксией или лечением медиаторами воспаления, имитируя известные особенности IN VIVO NEC. Нарушение соединений адгезии, критических для кишечной эпителиальной барьерной функции41, было зарегистрировано в NEC42,43. Архитектурное нарушение плотного соединения, которое также важно в NEC44, вероятно, также произошло, хотя эти изменения будут оценены в будущих исследованиях. В физиологически транслируемой ткани эта модель двойного удара позволяет изучать преждевременные кишечные реакции на факторы, присущие NEC, обеспечивая при этом платформу, с помощью которой могут быть идентифицированы потенциально новые терапевтические цели. Будущие исследования могут расширить применение апикальных энтероидов за пределами NEC до исследований, ориентированных на паразитарные, бактериальные или вирусные инфекции31,32, взаимодействия хозяин-микробиом45 и абсорбционную функцию желудочно-кишечного тракта46, но в физиологическом контексте недоношенного ребенка.

Этот протокол для апикального выхода NEC-in-a-dish включает в себя несколько критических шагов, требующих особого внимания. Состав и свежесть среды клеточной культуры важны для предотвращения чрезмерной продольной изменчивости в экспериментах и обеспечения здоровья энтероидов до экспериментального лечения. Аналогичным образом, исходные растворы TNF-α и LPS следует аликвотировать и хранить при -80 °C, чтобы избежать чрезмерных циклов замораживания/оттаивания и сохранить оптимальную активность. Наконец, следует позаботиться о том, чтобы все ECM были солюбилизированы во время инкубации EDTA/PBS. Неполное удаление ECM может привести к тому, что энтероиды не смогут обратить вспять полярность. При необходимости инкубационный период может быть продлен до 1,5 ч для обеспечения полного удаления матрицы.

Хотя эта модель NEC-in-a-dish является экономически эффективной и простой, метод подвержен нескольким ограничениям. Apical-out NEC-in-a-dish не так физиологически актуален, как модели gut-on-a-chip 28,29, но представляет собой промежуточный вариант там, где и когда варианты чипов недоступны. Кроме того, в качестве культуры суспензии энтероиды должны быть собраны, гранулированы и повторно суспендированы для изменения среды, добавляя стадию центрифугирования к простому процессу. Другим ограничением является долговечность апикальных энтероидов, поскольку они, как правило, считаются подходящими только для анализа конечных точек. Поскольку рецепторы базолатерального фактора роста больше не находятся в постоянном контакте с факторами роста сред, апикальные энтероиды характеризуются сниженной пролиферацией по сравнению с базолатеральными энтероидами, что приводит к относительной неспособности к прохождению апикальных культур31,32. Кроме того, не известно, представлен ли точный состав, включая относительные пропорции, типов клеток в энтероидах по сравнению с тканью in vivo, но исследования в целом предполагают незначительные различия31,32. Наконец, 24-часовая разработка этой модели NEC-in-a-dish, хотя и удобная, может быть относительно короткой по сравнению с моделями NEC47 на основе формул in vivo, что потенциально требует дополнительной стандартизации, если требуются более длительные периоды вмешательства.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать и у них нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Этот контент является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. HC поддерживается грантом P20GM134973 от Национальных институтов здравоохранения. KB поддерживается грантом Фонда детских больниц (CHF) и Фонда пресвитерианского здравоохранения (PHF). Мы благодарим Лабораторию молекулярной биологии и исследований цитометрии в OUHSC за использование Core Facility, которая обеспечивала конфокальную визуализацию.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Fisher Scientific 15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Conical tube VWR 89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates Fisher Scientific 07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm Thermo Scientific 102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Scientific A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate Sigma-Aldrich AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer STEMCELL Technologies 36254
E-cadherin antibody (7H12) Novus Biologicals NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Millipore Sigma 1004960700
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5
ImageJ Fiji N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) STEMCELL Technologies 06010
Leica SP8 Confocal Microscope Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography Millipore Sigma L3012-10MG
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich 566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 Corning 21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue Fisher Scientific P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] Abcam ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg Bio-Techne 210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L Fisher Scientific 3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661) Thermo Scientific T3605
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap Thermo Scientific AB0350
Tween-20 Sigma-Aldrich 9005-64-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Bazacliu, C., Neu, J. Necrotizing enterocolitis: long term complications. Current Pediatric Reviews. 15 (2), 115-124 (2019).
  4. Lim, J. C., Golden, J. M., Ford, H. R. Pathogenesis of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatric Surgery International. 31 (6), 509-518 (2015).
  5. Neu, J. Necrotizing enterocolitis: the future. Neonatology. 117 (2), 240-244 (2020).
  6. Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
  7. Emami, C. N., Mittal, R., Wang, L., Ford, H. R., Prasadarao, N. V. Recruitment of dendritic cells is responsible for intestinal epithelial damage in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by Cronobacter sakazakii. Journal of Immunology. 186 (12), Baltimore, Md. 7067-7079 (2011).
  8. Chen, L., et al. Human β-defensin-3 reduces excessive autophagy in intestinal epithelial cells and in experimental necrotizing enterocolitis. Scientific Reports. 9 (1), 19890 (2019).
  9. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  10. Gimeno-Alcañiz, J. V., Collado, M. C. Impact of human milk on the transcriptomic response of fetal intestinal epithelial cells reveals expression changes of immune-related genes. Food & Function. 10 (1), 140-150 (2019).
  11. Claud, E. C., Savidge, T., Walker, W. A. Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatric Research. 53 (3), 419-425 (2003).
  12. De Plaen, I. G. Inflammatory signaling in necrotizing enterocolitis. Clinics in Perinatology. 40 (1), 109-124 (2013).
  13. Subramanian, S., Geng, H., Tan, X. D. Cell death of intestinal epithelial cells in intestinal diseases. Sheng Li Xue Ba : [Acta Physiologica Sinica]. 72 (3), 308-324 (2020).
  14. Li, B., et al. Intestinal epithelial cell injury is rescued by hydrogen sulfide. Journal of Pediatric Surgery. 51 (5), 775-778 (2016).
  15. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum reduces apoptosis in the intestinal epithelium in necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (5), 1118-1127 (2010).
  16. Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - a review of methods. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
  17. Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (12), 1359-1363 (2012).
  18. Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (105), e53359 (2015).
  19. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  20. Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  21. Moorefield, E. C., Blue, R. E., Quinney, N. L., Gentzsch, M., Ding, S. Generation of renewable mouse intestinal epithelial cell monolayers and organoids for functional analyses. BMC Cell Biology. 19 (1), 15 (2018).
  22. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  23. Werts, A. D., et al. A novel role for necroptosis in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 403-423 (2020).
  24. Li, B., et al. Intestinal epithelial tight junctions and permeability can be rescued through the regulation of endoplasmic reticulum stress by amniotic fluid stem cells during necrotizing enterocolitis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 35 (1), 21265 (2021).
  25. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. JoVE:Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
  26. Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  27. Li, B., et al. Activation of Wnt signaling by amniotic fluid stem cell-derived extracellular vesicles attenuates intestinal injury in experimental necrotizing enterocolitis. Cell Death & Disease. 11 (9), 750 (2020).
  28. Beaurivage, C., et al. Development of a human primary gut-on-a-chip to model inflammatory processes. Scientific Reports. 10 (1), 21475 (2020).
  29. Jeon, M. S., et al. Contributions of the microbiome to intestinal inflammation in a gut-on-a-chip. Nano Convergence. 9 (1), 8 (2022).
  30. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
  31. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  32. Co, J. Y., Margalef-Català, M., Monack, D. M., Amieva, M. R. Controlling the polarity of human gastrointestinal organoids to investigate epithelial biology and infectious diseases. Nature Protocols. 16 (11), 5171-5192 (2021).
  33. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
  34. Li, B., et al. Neonatal intestinal organoids as an ex vivo approach to study early intestinal epithelial disorders. Pediatric Surgery International. 35 (1), 3-7 (2019).
  35. Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
  36. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (97), e52483 (2015).
  37. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  38. Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
  39. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
  40. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  41. Schneider, M. R., et al. A key role for E-cadherin in intestinal homeostasis and Paneth cell maturation. PLoS One. 5 (12), 14325 (2010).
  42. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum improves intestinal integrity in a rat model of necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (5), 940-949 (2009).
  43. Khailova, L., et al. Changes in hepatic cell junctions structure during experimental necrotizing enterocolitis: effect of EGF treatment. Pediatric Research. 66 (2), 140-144 (2009).
  44. Ravisankar, S., et al. Necrotizing enterocolitis leads to disruption of tight junctions and increase in gut permeability in a mouse model. BMC Pediatrics. 18 (1), 372 (2018).
  45. Han, X., et al. Creating a more perfect union: modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 769-782 (2021).
  46. Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals: An Open Access Journal from MDPI. 12 (3), 372 (2022).
  47. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocols. 2 (4), 100951 (2021).

Tags

Медицина выпуск 184
<em>В пробирке </em> Апикально-аутентоидная модель некротизирующего энтероколита
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H.… More

Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H. In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (184), e64003, doi:10.3791/64003 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter