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Medicine

In vitro Apical-out enteroides Modell der nekrotisierenden Enterokolitis

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64003
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center and Center for Pregnancy and Newborn Health

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein apikal-out-nekrotisierendes Enterokolitis-Modell (NEC)-in-a-dish, das Dünndarmenteroide mit umgekehrter Polarität verwendet und den Zugang zur apikalen Oberfläche ermöglicht. Wir bieten ein Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll zum Nachweis von NEC-bedingten Epithelstörungen und eine Methode zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von apikalen Enteroiden, die dem NEC-in-a-dish-Protokoll unterliegen.

Abstract

Die nekrotisierende Enterokolitis (NEC) ist eine verheerende Erkrankung bei Frühgeborenen, die durch Darmentzündungen und Nekrosen gekennzeichnet ist. Enteroide haben sich kürzlich als vielversprechendes System zur Modellierung gastrointestinaler Pathologien herausgestellt. Derzeit verwendete Methoden zur enteroiden Manipulation haben jedoch entweder keinen Zugang zur apikalen Oberfläche des Epithels (dreidimensional [3D]) oder sind zeit- und ressourcenintensiv (zweidimensionale [2D] Monoschichten). Diese Methoden erfordern oft zusätzliche Schritte, wie z.B. Mikroinjektion, damit das Modell physiologisch übersetzbar wird. Hier beschreiben wir ein physiologisch relevantes und kostengünstiges Protokoll zur Untersuchung von NEC in vitro durch Umkehrung der enteroiden Polarität, was dazu führt, dass die apikale Oberfläche nach außen zeigt (apikal-out). Ein Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll zur Untersuchung der Integrität der enteroiden Barriere und der junctionalen Proteinexpression nach Exposition gegenüber Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) oder Lipopolysaccharid (LPS) unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen wird ebenfalls bereitgestellt. Die Lebensfähigkeit von 3D-apikalen Enteroiden, die normoxischen oder hypoxischen LPS oder TNF-α für 24 h ausgesetzt waren, wird ebenfalls bewertet. Enteroide, die entweder LPS oder TNF-α ausgesetzt waren, zeigten in Kombination mit Hypoxie eine Störung der Epithelarchitektur, einen Verlust der Adhärenz-Junction-Proteinexpression und eine Verringerung der Zelllebensfähigkeit. Dieses Protokoll beschreibt ein neues apikales NEC-in-a-dish-Modell, das eine physiologisch relevante und kostengünstige Plattform darstellt, um potenzielle epitheliale Ziele für NEC-Therapien zu identifizieren und die frühgeborene Darmreaktion auf Therapeutika zu untersuchen.

Introduction

Die nekrotisierende Enterokolitis (NEC), eine schwere entzündliche Erkrankung des Dünndarms, die bei bis zu 10% der Frühgeborenen auftritt, ist häufig mit hoher Morbidität und Mortalität verbunden 1,2. Sterblichkeitsraten von fast 50% bei Säuglingen mit sehr niedrigem Geburtsgewicht (<1500 g), die einen chirurgischen Eingriff erfordern, sind nicht ungewöhnlich3. Während die genaue Ätiologie von NEC derzeit nicht verstanden wird, wird angenommen, dass Risikofaktoren wie die Fütterung von Säuglingsnahrung bei der Entwicklung der Krankheit mit physiologischen Anomalien wie Dysbiose, einem unreifen Darmepithel und einer dysfunktionalen Darmbarriere verbunden sind 2,4. Trotz erheblicher Anstrengungen wurden in den letzten zehn Jahren nur geringe Fortschritte bei der Prävention oder Behandlung von NEC erzielt5. Eine neuartige In-vitro-Methode zur Untersuchung von NEC und der damit verbundenen intestinalen Epithelbarriere-Dysfunktion ist erforderlich, um das Verständnis der Pathogenese der Krankheit zu verbessern, da Erkenntnisse aus Tiermodellen bisher schlecht auf das Krankenbett übertragen wurden6.

Eine Reihe von In-vitro-Modellen wurde verwendet, um die Mechanismen während des NEC zu untersuchen. Die humane Darmepithelzelllinie, Caco-2, gehört zu den am häufigsten verwendeten In-vitro-Modellen von NEC 7,8. Caco-2-Zellen emulieren morphologische Merkmale des Dünndarms, differenzieren sich aber als Zelllinie nicht in die Vielzahl von In-vivo-Zelltypen, einschließlich schleimproduzierender Kelchzellen, die für ein hochübersetzbares Modell erforderlich sind. HT-29-MTX, menschliche Dickdarm-Adenokarzinomzellen, umfassen einen gemischten Enterozyten- und Becherzellphänotyp, aber es fehlen immer noch kryptabasierte Zelltypen des Darmepithels9. IEC-6 und IEC-18 sind nicht transformierte Zelllinien mit einer unreifen ilealen kryptenartigen Morphologie, die jedoch nicht aus menschlichem Gewebe stammen, was ihre Translationskapazität einschränkt. FHs 74-Int und H4 Darmzelllinien stammen aus menschlichem fetalem Gewebe und bilden keine Tight Junctions oder polarisierten Monoschichten10,11 und sind daher im Vergleich zu selbst den frühgeborensten Säuglingen, die für NEC anfällig sind, unreif. Typischerweise verwenden NEC-In-vitro-Modelle Lipopolysaccharid-Behandlungen (LPS), um den Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4) zu induzieren, einen Hauptrezeptor, der eine Darmentzündung in NEC12 auslöst. Schäden, die durch die Behandlung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), typischerweise über Wasserstoffperoxid, vermittelt werden, werden häufig verwendet, um NEC-ähnliche oxidative Schäden und Apoptose zu induzieren13,14. Als Haupttreiber der Darmentzündung wird Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α), eine nachgeschaltete Komponente des entzündlichen TLR4-Signalwegs, auch häufig in diesen In-vitro-Modellen verwendet, um die In-vivo-Pathogenese nachzuahmen15.

Organoide, die aus induzierbaren pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) erzeugt werden, haben als In-vitro-Modell des Darms aufgrund ihrer Fähigkeit, die komplexe In-vivo-Architektur und Zelltypzusammensetzung des Gewebes, aus dem sie stammen, zu rekapitulieren, an Popularität gewonnen16,17. Ein verwandtes In-vitro-System, Enteroide, sind Organoide, die aus resezierten Darmkrypten gewonnen werden, die leichter etabliert und aufrechterhalten werden können als iPSC-abgeleitete Organoide. Enteroide werden typischerweise in einer dreidimensionalen (3D) extrazellulären Matrix (ECM) gezüchtet, wobei der experimentelle Zugang auf die basolaterale Zelloberfläche beschränkt ist. Methoden wie die Mikroinjektion18,19 wurden entwickelt, um diese Barriere zur apikalen Oberfläche zu überwinden, aber der Aufbau von abgelösten Zelltrümmern und Schleim im Lumen macht die Mikroinjektion sowohl technisch schwierig als auch inkonsistent. Da kundenspezifische Roboter-Mikroinjektionsplattformen nicht allgemein zugänglich sind20, werden Labor-zu-Labor-Variabilität in Bezug auf technische Fähigkeiten und allgemeine Technik zu bedeutenden Variablen, die mit Mikroinjektionsprotokollen überwunden werden müssen. Zweidimensionale (2D) Monoschichten aus dissoziierten 3D-Enteroiden, die immer noch alle wichtigen Zelltypen des Darmepithels umfassen, ermöglichen den Zugang zur apikalen Oberfläche, waren aber traditionell ohne eine Feederschicht aus mesenchymalen Myofibroblasten schwer aufrechtzuerhalten21. Während Zellkultur-durchlässige Träger verwendet werden können, um sowohl die apikale als auch die basolaterale Seite enteroider Monoschichten ohne die Verwendung von darunter liegenden Myofibroblasten zu erreichen, erfordern diese Einsätze eine Exzision und Montage der Membran vor der Verwendung mit Modalitäten wie konfokaler Mikroskopie, was zu einem technisch anspruchsvolleren und schwierigeren Prozess bei Verwendung herkömmlicher Mikroskopiemethoden führt22. NEC wurde in vitro unter Verwendung herkömmlicher 3D-Enteroide 23,24,25 und durchlässiger Träger 26,27 modelliert, und Darmentzündungen wurden kürzlich mit Darm-on-a-Chip-Modellen 28,29 repliziert. Während Darm-on-a-Chip-Modelle mit Mikrofluidik bei weitem die fortschrittlichsten und übersetzbarsten Modelle sind, ist diese Technologie teuer, komplex und für die meisten Forscher unzugänglich30.

Jüngste Fortschritte bei apikalen enteroiden Techniken haben einen leichteren Zugang zur apikalen Oberfläche von 3D-Enteroiden ermöglicht, ohne die strukturelle Integrität des In-vitro-Epithels zu schädigen31,32,33. Apikale Enteroide teilen sich die Zelltypzusammensetzung und Barrierefunktion des In-vivo-Darmepithels, aber im Gegensatz zu typischen 3D-Enteroiden sind die apikalen Oberflächen dieser Zellen dem Kulturmedium zugewandt, was physiologisch relevantere Studien zur Nährstoffaufnahme, mikrobiellen Infektion und luminalen Sekretion ermöglicht31. Ein weiterer Vorteil von apikalen Enteroiden ist die Fähigkeit, experimentelle Wirkstoffe homogen auf Enteroide zu verteilen. Unterschiedliche Behandlungsvolumina basierend auf der enteroiden Größe sind nicht erforderlich, wie dies bei der Mikroinjektion der Fall ist, und die Fähigkeit, diese Enteroide in Suspensionskultur zu halten, negiert jegliche ECM-Interferenz bei der experimentellen Wirkstoffdiffusion32.

Die nekrotisierende Enterokolitis ist eine multifaktorielle Erkrankung, an der mehrere intestinale Epithelzelltypen und eine Vielzahl von umweltbedingten und pathophysiologischen Faktoren beteiligtsind 34. Die vielfältige Zellzusammensetzung der Darmenteroide ist eine deutliche Verbesserung gegenüber Monokulturen bei der Modellierung einer komplexen Erkrankung wie NEC. Während eine einzige entzündliche Exposition in In-vitro-Monokulturen oft ausreicht, um Schäden zu induzieren, scheinen Enteroide, wie beiMausmodellen 23, mindestens zwei entzündliche Komponenten zu benötigen, um NEC-ähnliche Schäden zu induzieren6. Hier präsentieren wir ein apikales NEC-in-a-dish-Modell, das apikale Enteroide in Kombination mit Hypoxie (ein wichtiges klinisches Merkmal von NEC6) und entweder LPS oder TNF-α als verbessertes und physiologisch relevanteres In-vitro-Modell verwendet, um epitheliale Reaktionen auf NEC-ähnliche Entzündungen zu untersuchen und möglicherweise therapeutische Ziele zu identifizieren. Wir beschreiben ein Protokoll zur Umkehrung der Polarität von Dünndarm-3D-Enteroiden sowie ein Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll zur Identifizierung von epithelialen Barrierestörungen und Veränderungen der junctionalen Proteinexpression. Schließlich demonstrieren wir einen einfachen enteroiden Lebensfähigkeitstest, um die Auswirkungen unseres Dual-Hit-Apical-Out-NEC-in-a-Dish-Modells zu bestimmen.

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Protocol

Alle Tierverfahren in dieser Studie wurden vom University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Dünndarmproben von einem frühgeborenen nichtmenschlichen Primaten (NHP, 90% Trächtigkeit, Olivenpavian, Papio anubis) wurden nach Euthanasie für eine separate Studie gewonnen (Protokoll #101523-16-039-I).

1. Etablierung eines apikalen enteroiden NEC-in-a-dish-Modells

  1. Vorbereitung von Medien und enteroiden Behandlungen
    HINWEIS: Nach der Herstellung nach aseptischer Standardtechnik können die Medien bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.
    1. Bereiten Sie antibiotikafreie Medien (AFM) vor, indem Sie 50 ml humanes Organoid-Wachstumsmedium mit 50 ml Organoid-Ergänzung mischen (siehe Materialtabelle). Herstellung von 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure/1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (EDTA/PBS) durch Zugabe von 100 μL 0,5 M EDTA zu 9.900 μL PBS.
    2. Dulbeccos modifizierte Adler-Mittel-/Nährstoff-Schinkenmischung F12 + 15 mM HEPES-Puffer (DMEM/F12) bei 2-8 °C kühlen.
    3. TNF-α Stammlösung werden durch Suspendieren von 100 μg TNF-α Pulver in 1 ml 1x PBS hergestellt. Verdünnen Sie den TNF-α-Bestand weiter auf 20 ng/ml und 50 ng/ml Konzentrationen unter Verwendung von AFM als Lösungsmittel. Bereiten Sie die LPS-Stammlösung vor, indem Sie 2 mg LPS in 1 ml 1x PBS suspendieren. Weitere Verdünnung von LPS auf 100 μg/ml und 200 μg/ml unter Verwendung von AFM als Lösungsmittel.
  2. Umkehrung der Polarität von 3D-Enteroiden
    HINWEIS: Das folgende Verfahren ist für die Umkehrung einer einzelnen 24-Well-Gewebekulturplatte mit flachem Boden in zwei 24-Well-Gewebekulturplatten mit extrem niedriger Bindung vorgesehen. Die Gewebekulturplatten sollten vor Gebrauch mindestens 30 min auf 37 °C erwärmt werden. Die Ableitung von basolateralen 3D-Enteroiden wurde erreicht, wie zuvor von vielen Gruppen35,36 beschrieben, mit leichten Modifikationen für Medien (siehe oben). Das allgemeine enteroide Ableitungsverfahren unterscheidet sich nicht von dem des Menschen. Kurz gesagt, herausgeschnittenes Gewebe wird gewaschen, in kleine Fragmente geschnitten und im Zellaufschlusspuffer inkubiert. Die Zelllösung wird dann durch ein 70-μM-Zellsieb geführt, was zu Krypten führt, die mit hoher Dichte plattiert werden.
    1. Asspirieren Sie Medien aus jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte mit etablierten 3D-Basolateral-Out-Enteroiden.
    2. Fügen Sie 500 μL 5 mM eiskaltes EDTA/PBS in jede Vertiefung der 24-Well-Platte hinzu und unterbrechen Sie vorsichtig mechanisch den Basalmembranextrakt/ECM-Dom, indem Sie mit einer p200-Pipette mindestens 5x-6x auf und ab pipettieren.
    3. Den Inhalt von vier Vertiefungen in ein 15-ml-konisches Röhrchen überführen und 8 mL eiskaltes EDTA/PBS in das konische Röhrchen geben. Übertragen Sie die restlichen 20 Bohrlöcher auf die gleiche Weise.
    4. 15 ml konische Röhrchen bei 4 °C für 1 h auf einer rotierenden Plattform oder einem Shaker bei 330 U/min inkubieren. Nach der 1-stündigen Inkubation die konischen Röhrchen bei 300 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand aus jedem Röhrchen und entsorgen Sie ihn.
    5. Kombinieren und waschen Sie die Zellpellets mit 5 mL DMEM/F12 und verteilen Sie die Zellsuspension in zwei 15 ml konische Röhrchen.
    6. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 300 x g für 3 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie jedem Röhrchen 12 ml AFM hinzu, um sicherzustellen, dass die Zellpellets resuspendiert sind.
    7. Pipettieren Sie 500 μL der enteroiden Suspension in jede Vertiefung von zwei 24-Well-Ultra-Low-Befestigungsplatten.
    8. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C und 5%CO2 für 2-5 Tage oder bis die Enteroide die Polarität umgekehrt haben.
    9. Um die enteroide Umkehrung zu überprüfen, ermitteln Sie zuerst die bestätigende Immunfluoreszenzfärbung und die durchschnittliche Zeit bis zur Umkehrung (~ 3 Tage) und bestätigen Sie dann die Polaritätsumkehr mit einer grundlegenden lichtmikroskopischen Visualisierung. Apikale Enteroide sind sehr zellulär im Aussehen, während basolaterale Enteroide oft durch das Vorhandensein eines großen zentralen Lumens oder Knospes dominiert werden (siehe ergänzende Abbildung 1).
      HINWEIS: Sobald das Verfahren standardisiert wurde, übersteigt die Umwandlungsrate zu apikalem Ausgang in der Regel 95%. Die Verwendung von apikalen Enteroiden ist als terminales Experiment gedacht, obwohl es theoretisch möglich ist, apikale Enteroide in eine kleine Anzahl von basolateralen Enteroiden zu überführen.
  3. Apical-out NEC-in-a-dish
    HINWEIS: Sobald die Enteroide die Polarität umgekehrt haben, verwenden Sie die Kulturen in nachfolgenden Experimenten schnell, da ihre Langlebigkeit in apikaler Exformation nicht über 3-4 Tage hinaus bestätigt wurde. Für das folgende NEC-in-a-dish-Modell wurden die Enteroide für 24 h behandelt, dann unmittelbar danach gesammelt und für nachgeschaltete Experimente konserviert.
    1. Sobald die Enteroide die visuelle Polarität mit einem Wirkungsgrad von mindestens 95% umgekehrt haben, entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und sammeln Sie acht Vertiefungen einer 24-Well-Platte in einem 15-ml-konischen Röhrchen. Da sich die apikalen Enteroide in Suspension befinden, pipetten Sie einfach die enteroide / mediale Lösung. Zentrifugieren Sie das 15-ml-Röhrchen bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
    2. Sobald die Zellen pelletiert sind, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 4 ml AFM gemischt mit dem gewünschten Volumen (10 μL hier für das höchste hinzugefügte Behandlungsvolumen) von 1x PBS (Kontrolle).
    3. 500 μL enteroid/PBS/AFM-Suspension werden in acht Vertiefungen einer 24-Well-Ultra-Low-Attachment-Platte pipettiert und die Platte bei 37 °C und 5%CO2 für 24 h inkubiert.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1.-1.3.3. für TNF-α (20 ng/ml und 50 ng/ml) und LPS (100 μg/ml und 200 μg/ml) Behandlungen bei Normoxia. Für alle Hypoxiebehandlungen wiederholen Sie die Schritte 1.3.1.-1.3.3., aber legen Sie die Platte in einen separaten Inkubator bei 37 °C, 5% CO2 und 1%O2 für 24 Stunden.
      HINWEIS: Schritt 1.3.4. kann gleichzeitig mit den Schritten 1.3.1.-1.3.3 durchgeführt werden, aber der Klarheit halber wurde das obige Verfahren durch die Behandlung getrennt, um die Komplexität zu reduzieren.

2. Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Mikroskopie

  1. Herstellung von Färbelösungen
    1. Bereiten Sie 0,1% Triton X-100 zu, indem Sie 7 μL Triton X-100 in 1x PBS auf ein Endvolumen von 7 ml mischen. Bereiten Sie PBST (PBS-Tween) vor, indem Sie 30 μL Tween-20 bis 1x PBS zu einem Endvolumen von 30 ml hinzufügen.
    2. Bereiten Sie 10% normales Eselserum (NDS)/PBST vor, indem Sie 700 μL NDS zu 6,3 ml PBST hinzufügen. Bereiten Sie 1% NDS/PBST vor, indem Sie 70 μL NDS zu PBST zu einem Endvolumen von 7 ml hinzufügen.
      HINWEIS: Eselserum wurde hier verwendet, um mit dem sekundären Antikörperwirt zu korrelieren. Die blockierende Serumspezies sollte jedoch mit der sekundären Antikörperspezies übereinstimmen, um die unspezifische Bindung richtig zu blockieren.
  2. Färbung (Tag 1)
    1. Übertragen Sie den Inhalt von vier Vertiefungen einer 24-Well-Platte in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie dies für alle gewünschten Vertiefungen / Behandlungen, wobei jede Behandlung in einem separaten Röhrchen erfolgt. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 x g für 4 min bei 4 °C. Sobald die Enteroide pelletiert sind, entfernen Sie den Überstand.
    2. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 300 μL 4% Formaldehyd-Fixiermittel für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Nach 30 min die Röhrchen bei 300 x g für 4 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand entfernen und das Pellet mit 500 μL sterilem RT 1x PBS waschen.
    3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 x g für 4 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 500 μL 0,1% Triton X-100 hinzu und lassen Sie ihn 1 h bei RT ruhen.
    4. Nach 1 h die Röhrchen bei 300 x g für 4 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. Mit 500 μL 1x PBS waschen und die Röhrchen bei 200 U/min für 15 min bei 2-8 °C auf einen Rotator oder Shaker legen. Wiederholen Sie dies insgesamt 4x.
    5. Die Röhrchen bei 300 x g 4 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. 500 μL 10% NDS/PBST zugeben und 45 min bei RT inkubieren. Während der Inkubation werden primäre Antikörperlösungen hergestellt, indem 20 μL rekombinanter Antivillin-Antikörper, 10 μL E-Cadherin-Antikörper und 1970 μL 1% NDS/PBST für acht Vertiefungen einer 24-Well-Platte kombiniert werden.
    6. Nach der 45-minütigen Inkubation die Röhrchen bei 300 x g für 4 min bei 4 °C zentrifugieren. Legen Sie die Röhrchen auf Eis. Entfernen Sie den Überstand und ersetzen Sie ihn durch 250 μL primäre Antikörperlösung. Die Röhrchen über Nacht bei 2-8 °C inkubieren.
  3. Färbung (Tag 2)
    1. Die Röhrchen bei 300 x g 4 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. Fügen Sie je nach Größe des Pellets 250-500 μL PBST zu jedem Röhrchen hinzu und legen Sie es bei 200 U/min für 1 h bei 2-8 °C auf den Rotator oder Shaker. Wiederholen Sie die PBST-Wäsche 4x.
    2. Sekundäre Antikörperlösung durch Zugabe von 52 μL Cy3 Esel Anti-Kaninchen-IgG (H + L) zu 50% Glycerin und 5,2 μL Esel Anti-Maus fluoreszierend grün 488 sekundäre Antikörper zu 5142,8 μL 1% NDS / PBST.
    3. Nach der letzten PBST-Wäsche und Zentrifugation den Überstand aus den Röhrchen entfernen. Geben Sie 200 μL sekundäre Antikörperlösung in jedes Röhrchen und inkubieren Sie im Dunkeln über Nacht bei 2-8 °C.
  4. Montage gefärbter apikaler Enteroide (Tag 1)
    1. Bringen Sie Mountant auf Glycerinbasis, das blauen Kernfarbstoff enthält, über 1 h auf RT.
    2. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 x g für 4 min bei 4 °C. Entfernen Sie 100 μL des Überstands und resuspendieren Sie die Zellen in den verbleibenden ~ 100 μL Überstand. Übertragen Sie die Zellsuspension in 0,5 ml Röhrchen.
    3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen in einer Minizentrifuge für 20 s, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 100 μL tiefroter Nukleinsäurefärbung. Inkubieren Sie die Röhrchen bei RT für 10 min.
    4. Zentrifugieren Sie die Röhrchen in einer Minizentrifuge für 20 s, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 100 μL 1x PBS. Wiederholen Sie diesen Vorgang für eine zweite Wäsche.
    5. Zentrifugieren Sie die Röhrchen in einer Minizentrifuge für 20 s, um die Zellen zu pelletieren und 70 μL des Überstands zu entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen im verbleibenden PBS-Volumen und übertragen Sie den Inhalt auf ein beschriftetes Deckglas (24 mm x 60 mm).
    6. Tragen Sie 75 μL Mountant direkt auf die Probe auf und entfernen Sie Blasen mit einer Pipettenspitze. Lassen Sie die Deckgläser über Nacht (18-24 h) bei RT im Dunkeln aushärten.
  5. Montage gefärbter apikaler Enteroide (Tag 2)
    1. Nach dem Aushärten über Nacht eine dünne Schicht (~15 μL) Glycerin auf die Deckgläser auftragen. Befestigen Sie das Deckglas am Glasobjektträger und drücken Sie es vorsichtig ein. Tippen Sie, um alle Blasen zwischen dem Deckglas und dem Schieber zu entfernen.
    2. Lassen Sie das Deckglas mindestens 2 h im Dunkeln auf RT einstellen, bevor Sie mit einem konfokalen Mikroskop 20-fache Vergrößerung aufnehmen. Zur mikroskopischen Visualisierung von Enteroiden mit verschiedenen konfokalen Erfassungsmethoden siehe Lallemant et al.37.
  6. Immunfluoreszierende Quantifizierung
    HINWEIS: Diese Methode bestimmt die korrigierte Gesamtfluoreszenz, indem das Hintergrundsignal mit der ImageJ-Software (https://imagej.nih.gov/ij/) entfernt wird.
    1. Öffnen Sie die konfokalen Bilder in ImageJ und umreißen Sie den gewünschten Bereich mit dem ROI-Tool (Region of Interest).
    2. Legen Sie benutzerdefinierte Parameter fest, indem Sie zu Analysieren > Messen festlegen navigieren. Wählen Sie auf der Registerkarte Einstellungen Bereich > Integrierte Dichte > Grauwert .
    3. Navigieren Sie zu Analyze > Measure. Es erscheint ein Popup-Fenster mit den Messungen. Kopieren Sie diese Messungen und fügen Sie sie in eine Tabelle ein.
    4. Um das Hintergrundsignal zu subtrahieren, wählen Sie einen kleinen, nicht fluoreszierenden Bereich des Bildes aus. Navigieren Sie zu Analysieren > Measure für diese Region. Es erscheint ein Popup-Fenster mit den Messungen. Kopieren Sie die Ausgabe und fügen Sie sie in eine Tabelle ein.
    5. Multiplizieren Sie die Fläche der ausgewählten Zelle mit der durchschnittlichen Fluoreszenz der Hintergrundwerte und subtrahieren Sie die Summe von der integrierten Dichte, um die korrigierte Gesamtzellfluoreszenz (CTCF) zu berechnen. Wiederholen Sie die obigen Schritte für alle Bilder von Interesse, während Sie die Aufzeichnungen in einer Tabellenkalkulation oder einem statistischen Softwarepaket aufbewahren (siehe Materialverzeichnis).

3. Lebensfähigkeit von apikalen NEC-in-a-dish-Zellen

  1. Enteroide Behandlungen
    1. Erstellen Sie ein apikales NEC-in-a-dish-Modell für 24 Stunden, wie in Schritt 1.
    2. Auftauzelllebensfähigkeits-Reagenz über Nacht bei 4 °C. Am Tag des Assays das Reagenz 30 min vor Gebrauch auf RT bringen. Kehren Sie das Reagenz um, um es zu mischen.
    3. Entfernen Sie vor der Durchführung des Assays 100 μL Medien aus jeder Vertiefung, wobei die restlichen 400 μL übrig bleiben. Fügen Sie 400 μL Zelllebensfähigkeits-Assay-Reagenz zu jeder Vertiefung hinzu.
    4. Mischen Sie den Inhalt kräftig auf einem Plattenschüttler bei RT für 5 min bei 200 U/min, um die Zelllyse zu induzieren. Nach dem Schütteln die Platte bei RT für weitere 25 Minuten inkubieren.
    5. Mischen Sie nach 25-minütiger Inkubation den Inhalt einer Vertiefung durch Pipettieren und übertragen Sie 200 μL der 800 μL in eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-, opaken Polystyrolplatte mit klarem Boden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen 600 μL, wobei vier technische Replikate pro Bohrloch erstellt werden. Übertragen Sie auf diese Weise den restlichen Inhalt jeder Vertiefung der 24-Well-Platte in eine 96-Well-Platte.
    6. Mit einem lumineszenzfähigen Plattenleser werden Werte bei einer Integration von 0,25 ms aufgezeichnet und die relativen Werte zwischen den Behandlungen verglichen. Alternativ können Sie die Lumineszenz der Behandlung mit einem Adenosintriphosphat (ATP) -Standard vergleichen.

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Representative Results

Die Verwendung von Enteroiden zur Modellierung von Darmentzündungen, auch im Zusammenhang mit nekrotisierender Enterokolitis, ist heute üblich. Die meisten derzeit verwendeten Methoden haben jedoch entweder keinen Zugang zur apikalen Oberfläche von Enteroiden, was die physiologische Relevanz von Verbindungen, die für eine eventuelle Verwendung als orale Therapeutika bestimmt sind, negiert, oder sie sind technisch schwierig und zeitaufwendig, wie bei enteroid-abgeleiteten Monoschichten. Um den Nutzen aktueller in vitro enteroider Modelle von NEC zu erhöhen, haben wir die Polarität von Enteroiden umgekehrt und in Kombination mit 24 h Hypoxie und LPS oder TNF-α ein apikales NEC-in-a-dish-Modell erzeugt. Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigte die apikale Lokalisation von Kernen (blau) in Richtung Lumen und den Nachweis von Villin32 (rot, apikaler Marker) am äußeren Rand des Epithels (Abbildung 1A). Die Exposition bei 200 μg/ml LPS, 50 ng/ml TNF-α oder Hypoxie allein induzierte keine offensichtlichen Veränderungen der grobzelligen Morphologie, E-Cadherin38 (grün) oder Villinlokalisation oder Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Kontrolle (Abbildung 1A-D; Abbildung 2). Die Behandlung mit LPS oder TNF-α in Kombination mit Hypoxie störte die epitheliale Architektur und verursachte einen signifikanten Verlust der Adhärenzverbindung und der Bürstengrenzproteinexpression, was durch den Verlust von E-Cadherin und Zottenfärbung angezeigt wird (Abbildung 1E-F; Abbildung 2). Diese Reduktionen der Enterozytenbürstengrenze und der Adhärenz-Verbindungsproteinexpressionen deuten wahrscheinlich auf eine Verringerung der Integrität der epithelialen Barriere hin und sind ein gemeinsames Merkmal sowohl der menschlichen chirurgischen NEC als auch der In-vitro-Modellierung der Krankheit23.

Um den Einfluss von NEC-in-a-dish-Komponenten auf die Lebensfähigkeit von 3D-apikalen Enteroiden zu bestimmen, wurde die Zelllebensfähigkeit mit einem Zelllebensfähigkeitsassay bewertet, der für 3D-Kulturen entwickelt wurde und sich auf die ATP-Quantifizierung nach der Zelllyse konzentrierte. Enteroide wurden mit LPS (200 μg/ml) oder TNF-α (50 ng/ml) für 24 h unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen behandelt. LPS oder TNF-α allein hatten im Vergleich zur Kontrolle keinen signifikanten Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit (Abbildung 3A). Eine signifikante Verringerung der Lebensfähigkeit trat jedoch auf, wenn apikale Enteroide mit 200 μg/ml LPS oder 50 ng/ml TNF-α in Kombination mit Hypoxie (****p < 0,0001) im Vergleich zu Hypoxie allein behandelt wurden (Abbildung 3B). Diese Experimente demonstrieren die Vielseitigkeit und physiologische Relevanz der Verwendung von apikalen Enteroiden in einem kostengünstigen und unkomplizierten NEC-in-a-dish-Modell.

Figure 1
Abbildung 1: Bestätigung des apikalen Phänotyps und der morphologischen Effekte von Lipopolysaccharid (LPS), Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) und Hypoxie. Repräsentative immunhistochemische Färbung von 3D-apikalen Enteroiden für Enterozytenbürstenrand- und Adhärenzverbindungsproteine nach 24 h. (A) Kontrolle, (B) Hypoxie, (C) LPS (200 μg/ml), (D) TNF-α (50 ng/ml), (E) LPS (200 μg/ml) + Hypoxie, (F) TNF-α (50 ng/ml) + Hypoxie. Maßstabsbalken = 50 μm für jedes Bild. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Quantifizierung der Färbeintensität für Bürstenrand- und Adhärenzverbindungsproteine nach 24 h Lipopolysaccharid (LPS), Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) und Hypoxiebehandlungen. (A) Villin (rot) Spiegel im Vergleich zwischen Behandlungen; a = p < 0,0001 im Vergleich zur Kontrolle; b = p < 0,05 im Vergleich zur Kontrolle; c = p < 0,0001 im Vergleich zu Hypoxie; d = p < 0,05 im Vergleich zu Hypoxie; e = p < 0,001 im Vergleich zu TNF-α; f = p < 0,01 im Vergleich zu LPS + Hypoxie; g = p < 0,0001 im Vergleich zu LPS; und (B) E-Cadherin (grün) Spiegel im Vergleich zwischen Behandlungen; a = p < 0,0001 im Vergleich zur Kontrolle; b = p < 0,0001 im Vergleich zu Hypoxie; c = p < 0,01 im Vergleich zu LPS; d = p < 0,01 im Vergleich zu TNF-α; e = p < 0,05 im Vergleich zu LPS + Hypoxie. Die Signifikanz wurde unter Verwendung der Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Tukey-Test für die Post-hoc-Analyse bewertet, der als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM ) dargestellt wurde (n ≥ 7/Gruppe). Control repräsentiert Normoxia mit PBS als Fahrzeugsteuerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Wirkung von Lipopolysaccharid (LPS), Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) und Hypoxie auf die Lebensfähigkeit apikaler Zelle. Die Lebensfähigkeit von 3D-apikalen Enteroiden, die mit LPS (200 μg/ml) oder TNF-α (50 ng/ml) für 24 h unter (A) normoxischen oder (B) hypoxischen Bedingungen behandelt wurden, wurde mittels Lumineszenz gemessen. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung der Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Tukey-Test für die Post-hoc-Analyse berechnet. Enteroide, die mit LPS (200 μg/ml) und TNF-α (50 ng/ml) behandelt wurden, waren in Kombination mit Hypoxie signifikant weniger lebensfähig als Hypoxie allein, hier mit einer Zunahme der Lumineszenz. LPS (200 μg/ml) oder TNF-α (50 ng/ml) unterschieden sich unter normoxischen Bedingungen nicht von der Kontrolle. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM), n = 8/Gruppe, ****p < 0,0001 dargestellt. Control repräsentiert Normoxia mit PBS als Fahrzeugsteuerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Morphologie dreidimensionaler Enteroide. (A) Während basolaterale Enteroide durch das Auftreten eines großen und offenen zentralen Lumens mit oder ohne Knospung dominiert werden, sind (B) apikale Enteroide durch ein dichtes, zelluläres Erscheinungsbild gekennzeichnet. Maßstabsbalken = 100 μm für jedes Bild. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Die jüngste Entwicklung enteroider Modelle, die aus intestinalen Epithelkrypten abgeleitet werden, ermöglicht ein physiologisch relevanteres In-vitro-Gewebe , in dem die nekrotisierende Enterokolitis-Pathogenese untersucht werden kann. Trotz der Einbeziehung aller wichtigen differenzierten Zelltypen des Darmepithels unterliegen 3D-Enteroide immer noch mehreren signifikanten Einschränkungen. Die herkömmlichen, basolateralen Enteroide sind in 3D-ECM-Hydrogelkuppeln suspendiert, deren Zusammensetzung und Dichte die normale Diffusion innerhalb der Gewebekulturumgebung einschränken kann39. Wichtig ist, dass diese Enteroide einen begrenzten Zugang zur apikalen Oberfläche von Zellen bieten, die in vivo mit luminalen Bakterien und Antigenen wie der Enterozyten-TLR4-Bindung von LPS interagieren würde.

Während die Pathophysiologie von NEC noch unklar ist, wird angenommen, dass eine erhöhte Expression und Aktivierung von apikalem TLR4 im Frühgeborenenepithel eine herausragende Rolle spielt40. Nach der TLR4-Aktivierung führen eine erhöhte Darmpermeabilität, eine verminderte Epithelreparatur und bakterielle Translokation zu einer dysfunktionalen Darmbarriere, die zu einer Nekrose des Darms führt2. Es wird angenommen, dass dieser Entzündungszyklus im distalen Darm von Frühgeborenen im Darmlumen entsteht und an der apikalen Oberfläche von Enterozyten beginnt. Daher rekapitulieren Modelle, die basolaterale 3D-Enteroide in mechanistischen Studien mit bakterieller Translokation des Darmepithels verwenden, nicht die In-vivo-Pathogenese , wie derzeit verstanden wird, und liefern wahrscheinlich suboptimale Informationen.

Hier beschreiben wir die Etablierung eines apikalen NEC-in-a-dish-Modells, das einen einfachen Zugang zur apikalen Oberfläche enteroider Zellen ermöglicht und vermutlich zu einem physiologisch relevanteren Modell im Vergleich zu herkömmlichen basolateralen 3D-Out-Enteroiden führt. Die Polaritätsumkehr in diesen Enteroiden ermöglicht es, potenzielle oral verabreichte Therapeutika einfach dem Medium zuzusetzen und auf natürliche Weise von Enterozyten aufgenommen zu werden, wie es in vivo der Fall wäre. Dieser Ansatz erfordert keine teuren und technisch anspruchsvollen Techniken wie die Mikroinjektion und ist ressourcenschonender als die Etablierung von 2D-Monolagen oder Gut-on-a-Chip-Modellen.

Unsere repräsentativen Ergebnisse deuten darauf hin, dass apikale Enteroide, die LPS oder TNF-α ausgesetzt sind, in Kombination mit Hypoxie eine verminderte Lebensfähigkeit, eine gestörte Epithelarchitektur und eine Verringerung der Adhärenzverbindungsproteinexpression im Vergleich zur Kontrolle oder im Vergleich zur alleinigen Behandlung mit Hypoxie oder Entzündungsmediator aufweisen, was die bekannten Merkmale von In-vivo-NEC nachahmt. Eine Störung der adhärenalen Verbindungen, die für die intestinale Epithelbarrierefunktion41 entscheidend ist, wurde in NEC42,43 berichtet. Tight Junction Architectural Disruption, die auch in NEC44 wichtig ist, ist wahrscheinlich ebenfalls aufgetreten, obwohl diese Änderungen in zukünftigen Studien bewertet werden. In einem physiologisch übersetzbaren Gewebe ermöglicht dieses Dual-Hit-Modell die Untersuchung vorzeitiger Darmreaktionen auf Faktoren, die NEC innewohnen, und bietet gleichzeitig eine Plattform, über die potenziell neue therapeutische Ziele identifiziert werden können. Zukünftige Studien können die Anwendung von apikalen Enteroiden über NEC hinaus auf Studien ausdehnen, die sich auf parasitäre, bakterielle oder virale Infektionen31,32, Wirt-Mikrobiom-Interaktionen 45 und gastrointestinale Absorptionsfunktion 46 konzentrieren, jedoch im physiologischen Kontext des Frühgeborenen.

Dieses Protokoll für apikale NEC-in-a-dish enthält mehrere kritische Schritte, die hervorgehoben werden müssen. Die Zusammensetzung und Frische der Zellkulturmedien sind wichtig, um eine übermäßige longitudinale Variabilität in Experimenten zu vermeiden und sicherzustellen, dass Enteroide vor der experimentellen Behandlung gesund sind. Ebenso sollten Stammlösungen von TNF-α und LPS aliquotiert und bei -80 °C gelagert werden, um übermäßige Gefrier-/Tauzyklen zu vermeiden und eine optimale Aktivität zu erhalten. Schließlich sollte darauf geachtet werden, dass das gesamte ECM während der EDTA/PBS-Inkubation gelöst wird. Eine unvollständige Entfernung der ECM könnte dazu führen, dass Enteroide die Polarität nicht umkehren. Bei Bedarf kann die Inkubationszeit auf 1,5 h verlängert werden, um eine vollständige Entfernung der Matrix zu gewährleisten.

Während dieses apikale NEC-in-a-dish-Modell kostengünstig und unkompliziert ist, unterliegt die Methode mehreren Einschränkungen. Apical-out NEC-in-a-dish ist physiologisch nicht so relevant wie die Gut-on-a-Chip-Modelle28,29, stellt aber eine Zwischenoption dar, wenn Chipoptionen nicht zugänglich sind. Darüber hinaus müssen Enteroide als Suspensionskultur gesammelt, pelletiert und für Medienwechsel resuspendiert werden, wodurch einem ansonsten einfachen Prozess ein Zentrifugationsschritt hinzugefügt wird. Eine weitere Einschränkung ist die Langlebigkeit von apikalen Enteroiden, da sie im Allgemeinen nur für Endpunktanalysen geeignet sind. Da basolaterale Wachstumsfaktorrezeptoren nicht mehr in ständigem Kontakt mit Medienwachstumsfaktoren stehen, sind apikale Enteroide im Vergleich zu basolateralen Out-Enteroiden durch eine reduzierte Proliferation gekennzeichnet, was zu der relativen Unfähigkeit führt, apikale Kulturen zu passieren31,32. Darüber hinaus ist nicht bekannt, ob die genaue Zusammensetzung, einschließlich der relativen Anteile, von Zelltypen in Enteroiden im Vergleich zu in vivo Gewebe dargestellt wird, aber Studien deuten im Allgemeinen auf geringfügige Unterschiede hin31,32. Schließlich kann die 24-Stunden-Entwicklung dieses apikalen NEC-in-a-dish-Modells zwar zweckmäßig sein, aber im Vergleich zu In-vivo-Formel-basierten NEC-Modellen 47 relativ kurz sein, was möglicherweise eine zusätzliche Standardisierung erfordert, wenn längere Interventionszeiträume gewünscht werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen und haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Dieser Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. HC wird durch den Zuschuss P20GM134973 der National Institutes of Health unterstützt. KB wird durch einen Zuschuss der Children's Hospital Foundation (CHF) und der Presbyterian Health Foundation (PHF) unterstützt. Wir danken dem Labor für Molekularbiologie und Zytometrieforschung am OUHSC für die Nutzung der Core Facility, die konfokale Bildgebung zur Verfügung stellte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Fisher Scientific 15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Conical tube VWR 89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates Fisher Scientific 07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm Thermo Scientific 102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Scientific A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate Sigma-Aldrich AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer STEMCELL Technologies 36254
E-cadherin antibody (7H12) Novus Biologicals NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Millipore Sigma 1004960700
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5
ImageJ Fiji N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) STEMCELL Technologies 06010
Leica SP8 Confocal Microscope Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography Millipore Sigma L3012-10MG
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich 566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 Corning 21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue Fisher Scientific P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] Abcam ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg Bio-Techne 210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L Fisher Scientific 3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661) Thermo Scientific T3605
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap Thermo Scientific AB0350
Tween-20 Sigma-Aldrich 9005-64-5

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Medizin Ausgabe 184
<em>In vitro </em> Apical-out enteroides Modell der nekrotisierenden Enterokolitis
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Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H.… More

Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H. In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (184), e64003, doi:10.3791/64003 (2022).

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