Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

In vitro Apikal-out enteroid model af nekrotiserende enterocolitis

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64003
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center and Center for Pregnancy and Newborn Health

Summary

Denne protokol beskriver en apikal-ud nekrotiserende enterocolitis (NEC)-in-a-dish model ved hjælp af tyndtarmsindatoider med omvendt polaritet, hvilket giver adgang til den apikale overflade. Vi leverer en immunfluorescerende farvningsprotokol til påvisning af NEC-relateret epitelforstyrrelse og en metode til at bestemme levedygtigheden af apikale enteroider, der udsættes for NEC-in-a-dish-protokollen.

Abstract

Nekrotiserende enterocolitis (NEC) er en ødelæggende sygdom, der påvirker for tidligt fødte spædbørn, karakteriseret ved tarmbetændelse og nekrose. Enteroider er for nylig opstået som et lovende system til modellering af gastrointestinale patologier. Imidlertid mangler de i øjeblikket anvendte metoder til enteroid manipulation enten adgang til epitelets apikale overflade (tredimensionel [3D]) eller er tidskrævende og ressourceintensive (todimensionelle [2D] monolag). Disse metoder kræver ofte yderligere trin, såsom mikroinjektion, for at modellen kan oversættes fysiologisk. Her beskriver vi en fysiologisk relevant og billig protokol til undersøgelse af NEC in vitro ved at vende enteroid polaritet, hvilket resulterer i, at den apikale overflade vender udad (apikal-ud). En immunofluorescerende farvningsprotokol til undersøgelse af enteroid barriereintegritet og junctional proteinekspression efter eksponering for tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) eller lipopolysaccharid (LPS) under normoxiske eller hypoxiske forhold er også tilvejebragt. Levedygtigheden af 3D apikale enteroider udsat for normoxisk eller hypoxisk LPS eller TNF-α i 24 timer evalueres også. Enteroider udsat for enten LPS eller TNF-α i kombination med hypoxi udviste forstyrrelse af epitelarkitektur, et tab af tilhængere junction proteinekspression og en reduktion i cellelevedygtighed. Denne protokol beskriver en ny apikal-out NEC-in-a-dish-model, der præsenterer en fysiologisk relevant og omkostningseffektiv platform til at identificere potentielle epitelmål for NEC-terapier og studere det for tidlige tarmrespons på terapi.

Introduction

Nekrotiserende enterocolitis (NEC), en alvorlig inflammatorisk sygdom i tyndtarmen, der forekommer hos op til 10% af for tidligt fødte spædbørn, er almindeligvis forbundet med høj sygelighed og dødelighed 1,2. Dødelighed, der nærmer sig 50% hos spædbørn med meget lav fødselsvægt (<1500 g), der kræver kirurgisk indgreb, er ikke ualmindelige3. Mens den nøjagtige ætiologi af NEC i øjeblikket ikke forstås, menes risikofaktorer, såsom formelfodring, at forbinde med fysiologiske anomalier, såsom dysbiose, et umodent tarmepitel og en dysfunktionel tarmbarriere i udviklingen af sygdommen 2,4. På trods af en betydelig indsats er der kun sket få fremskridt med hensyn til forebyggelse eller behandling af NEC i løbet af det sidste årti5. En ny in vitro-metode til undersøgelse af NEC og tilhørende dysfunktion i tarmepitelbarrieren er nødvendig for at fremme forståelsen af patogenesen af sygdommen, da fund fra dyremodeller hidtil har oversat dårligt til sengekanten6.

En række in vitro-modeller er blevet brugt til at undersøge de mekanismer, der er i spil under NEC. Den humane tarmepitelcellelinje, Caco-2, er blandt de mest almindeligt anvendte in vitro-modeller af NEC 7,8. Caco-2-celler emulerer børstekantmorfologiske træk ved tyndtarmen, men som cellelinje differentierer de ikke til den brede vifte af in vivo-celletyper, herunder slimproducerende bægerceller, der kræves til en meget oversættelig model. HT-29-MTX, humane kolon adenocarcinomceller, inkluderer en blandet enterocyt- og bægercellefænotype, men mangler stadig kryptbaserede celletyper af tarmepitelet9. IEC-6 og IEC-18 er ikke-transformerede cellelinjer med en umoden ileal kryptlignende morfologi, men er ikke afledt af humant væv, hvilket begrænser deres translationelle kapacitet. FHs 74-Int og H4 tarmcellelinjer er afledt af humant føtalvæv og danner ikke tætte kryds eller polariserede monolag10,11 og er således umodne sammenlignet med selv de mest for tidligt fødte spædbørn, der er modtagelige for NEC. Typisk anvender NEC in vitro-modeller lipopolysaccharidbehandlinger (LPS) til at inducere tolllignende receptor 4 (TLR4), en vigtig receptor, der initierer tarmbetændelse i NEC12. Skader medieret gennem reaktive iltarter (ROS) behandling, typisk via hydrogenperoxid, bruges ofte til at inducere NEC-lignende oxidativ skade og apoptose 13,14. Som den vigtigste drivkraft for tarmbetændelse anvendes tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α), en nedstrøms komponent i den inflammatoriske TLR4-signalering, også almindeligt anvendt i disse in vitro-modeller til at efterligne in vivo patogenese15.

Organoider, der genereres fra inducerbare pluripotente stamceller (iPSC'er), er vokset i popularitet som en in vitro-model af tarmen på grund af deres evne til at rekapitulere den komplekse in vivo-arkitektur og celletypesammensætning af det væv, hvorfra de er afledt16,17. Et beslægtet in vitro-system, enteroider, er organoider afledt af resekterede tarmkrypter, der er lettere etableret og vedligeholdt end iPSC-afledte organoider. Enteroider dyrkes typisk i en tredimensionel (3D) ekstracellulær matrix (ECM) med eksperimentel adgang begrænset til den basolaterale celleoverflade. Metoder, såsom mikroinjektion18,19, er blevet udviklet til at overvinde denne barriere mod den apikale overflade, men opbygningen af sloughed cellulært affald og slim i lumen gør mikroinjektion både teknisk vanskelig og inkonsekvent. Da brugerdefinerede robotmikroinjektionsplatforme ikke er bredt tilgængelige20, bliver lab-to-lab-variation i teknisk evne og generel teknik betydelige variabler, der skal overvindes med mikroinjektionsprotokoller. Todimensionale (2D) monolag afledt af dissocierede 3D-enteroider, der stadig omfatter alle større celletyper i tarmepitelet, giver adgang til den apikale overflade, men har traditionelt været vanskelige at opretholde uden et fødelag af mesenkymale myofibroblaster21. Mens cellekulturpermeable understøtninger kan bruges til at få adgang til både de apikale og basolaterale sider af enteroide monolag uden brug af underliggende myofibroblaster, kræver disse indsatser udskæring og montering af membranen før brug med modaliteter såsom konfokal mikroskopi, hvilket resulterer i en mere teknisk krævende og vanskelig proces ved anvendelse af traditionelle mikroskopimetoder22. NEC er blevet modelleret in vitro ved hjælp af traditionelle 3D-enteroider 23,24,25 og permeable understøtter 26,27, og tarmbetændelse er for nylig blevet replikeret med gut-on-a-chip modeller28,29. Mens gut-on-a-chip-modeller, der indeholder mikrofluidik, er langt de mest avancerede og oversættelige modeller, er denne teknologi dyr, kompleks og utilgængelig for de fleste efterforskere30.

Nylige fremskridt inden for apikale enteroide teknikker har givet lettere adgang til den apikale overflade af 3D-enteroider uden at risikere skade på den strukturelle integritet af in vitro-epitelet 31,32,33. Apikale enteroider deler celletypesammensætningen og barrierefunktionen af in vivo intestinal epitel, men i modsætning til typiske 3D-enteroider vender de apikale overflader af disse celler mod kulturmediet, hvilket giver mulighed for mere fysiologisk relevante undersøgelser af næringsstofabsorption, mikrobiel infektion og luminal sekretion31. En yderligere fordel ved apikale enteroider er evnen til homogent at distribuere eksperimentelle midler til enteroider. Varierende behandlingsvolumener baseret på enteroid størrelse er ikke påkrævet, som det er med mikroinjektion, og evnen til at opretholde disse enteroider i suspensionskultur negerer enhver ECM-interferens på eksperimentel middeldiffusion32.

Nekrotiserende enterocolitis er en multifaktoriel sygdom, der involverer flere intestinale epitelcelletyper og en række miljømæssige og patofysiologiske faktorer34. Den varierede cellesammensætning af intestinale enteroider er en klar forbedring i forhold til monokulturer i modellering af en kompleks sygdom som NEC. Interessant nok, mens en enkelt inflammatorisk eksponering ofte er tilstrækkelig til at fremkalde skade i in vitro-monokulturer , synes enteroider, som med musemodeller23, at kræve mindst to inflammatoriske komponenter for at inducere NEC-lignende skade6. Her præsenterer vi en apikal NEC-in-a-dish-model ved hjælp af apikale enteroider i kombination med hypoxi (et vigtigt klinisk træk ved NEC6) og enten LPS eller TNF-α som en forbedret og mere fysiologisk relevant in vitro-model til at studere epitelresponser på NEC-lignende inflammation og potentielt identificere terapeutiske mål. Vi beskriver en protokol til at vende polariteten af tyndtarms 3D-enteroider samt en immunofluorescerende farvningsprotokol til identifikation af epitelbarriereforstyrrelse og junctional proteinekspressionsændringer. Endelig demonstrerer vi yderligere et simpelt enteroid levedygtighedsassay for at bestemme virkningen af vores dual-hit, apikale NEC-in-a-dish-model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg i denne undersøgelse blev godkendt af University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Tyndtarmens bekvemmelighedsprøver fra en for tidlig ikke-human primat (NHP, 90% drægtighed, olivenbavian, Papio anubis) blev opnået efter eutanasi til en separat undersøgelse (protokol #101523-16-039-I).

1. Etablering af apikal-out enteroid NEC-in-a-dish model

  1. Forberedelse af medier og enteroid behandlinger
    BEMÆRK: Når mediet er fremstillet efter standard aseptisk teknik, kan det opbevares ved 4 °C i op til 1 uge.
    1. Forbered antibiotikafrie medier (AFM) ved at blande 50 ml humant organoidvækstmedie med 50 ml organoidtilskud (se materialetabel). 5 mM ethylendiamintetraeddikesyre/1x phosphatbufferet saltvand (EDTA/PBS) fremstilles ved tilsætning af 100 μL 0,5 M EDTA til 9.900 μL PBS.
    2. Chill Dulbecco's modificerede eagle's medium/næringsstof Skinke blanding F12 + 15 mM HEPES Buffer (DMEM/F12) ved 2-8 °C.
    3. TNF-α stamopløsning fremstilles ved at suspendere 100 μg TNF-α pulver i 1 ml 1x PBS. TNF-α-stammen fortyndes yderligere til 20 ng/ml og 50 ng/ml ved hjælp af AFM som opløsningsmiddel. Lps-stamopløsning fremstilles ved at suspendere 2 mg LPS i 1 ml 1x PBS. Yderligere fortyndet lager LPS til 100 μg / ml og 200 μg / ml ved hjælp af AFM som opløsningsmiddel.
  2. Vending af polariteten af 3D-enteroider
    BEMÆRK: Følgende procedure er beregnet til vending af en enkelt 24-brønd fladbundet vævskulturplade i to 24-brønd ultra-lave fastgørelsesvævskulturplader. Vævskulturpladerne skal opvarmes til 37 °C i mindst 30 minutter før brug. Afledningen af basolateral-out 3D-enteroider blev opnået som beskrevet tidligere af mange grupper 35,36, med små ændringer for medier (beskrevet ovenfor). Den generelle enteroide afledningsprocedure adskiller sig ikke fra menneskers. Kort sagt vaskes udskåret væv, skæres i små fragmenter og inkuberes i celleforstyrrelsesbuffer. Celleopløsningen køres derefter gennem en 70 μM cellesi, hvilket resulterer i krypter, der er belagt med en høj densitet.
    1. Aspirere medier fra hver brønd af en 24-brønd plade af etablerede 3D basolateral-out enteroider.
    2. Der tilsættes 500 μL 5 mM iskold EDTA/PBS til hver brønd på pladen med 24 brønde, og forstyrrelse af kældermembranekstraktet/ECM-kuplen forsigtigt mekanisk ved at pipettere op og ned med en p200-pipette på mindst 5x-6x.
    3. Indholdet af fire huller overføres til et 15 ml konisk rør, og der tilsættes 8 ml iskold EDTA/PBS til det koniske rør. Overfør de resterende 20 brønde på samme måde.
    4. Inkuber 15 ml koniske rør ved 4 °C i 1 time på en roterende platform eller ryster ved 330 o /min. Efter inkubationen på 1 time centrifugeres de koniske rør ved 300 x g i 3 minutter ved 4 °C. Fjern og kassér supernatanten fra hvert rør.
    5. Kombiner og vask cellepillerne med 5 ml DMEM / F12 og fordel cellesuspensionen i to 15 ml koniske rør.
    6. Pellet cellerne ved centrifugering ved 300 x g i 3 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten, og tilsæt 12 ml AFM til hvert rør, hvilket sikrer, at cellepillerne resuspenderes.
    7. Pipetter 500 μL af den enteroide suspension i hver brønd af to 24-brønd ultralave fastgørelsesplader.
    8. Pladerne inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i 2-5 dage, eller indtil enteroiderne har omvendt polaritet.
    9. For at kontrollere enteroid vending skal du først etablere den bekræftende immunfluorescerende farvning og den gennemsnitlige tid til vending (~ 3 dage) og derefter bekræfte polaritetsvendingen ved hjælp af en grundlæggende lysmikroskopvisualisering. Apikale enteroider er meget cellulære i udseende, mens basolateral-out enteroider ofte domineres af tilstedeværelsen af et stort centralt lumen eller spirende (se supplerende figur 1).
      BEMÆRK: Når proceduren er standardiseret, overstiger konverteringsfrekvensen til apikal-out typisk 95%. Brugen af apikale enteroider er beregnet som et terminalt eksperiment, selvom det teoretisk er muligt at passere apikale enteroider i et lille antal basolaterale enteroider.
  3. Apikal-ud NEC-i-en-skål
    BEMÆRK: Når enteroiderne har vendt polariteten, skal du bruge kulturerne i efterfølgende eksperimenter hurtigt, da deres levetid i apikal-ud-konformation ikke er blevet bekræftet ud over 3-4 dage. For den følgende NEC-in-a-dish-model blev enteroiderne behandlet i 24 timer, derefter opsamlet umiddelbart efter og konserveret til nedstrøms eksperimenter.
    1. Når enteroiderne har visuelt vendt polaritet med mindst 95% effektivitet, skal du fjerne pladerne fra inkubatoren og samle otte brønde af en 24-brøndplade i et 15 ml konisk rør. Da de apikale enteroider er i suspension, skal du blot pipettere enteroid/ medieopløsningen. 15 ml-røret centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    2. Når cellerne er pelleteret, fjernes supernatanten og resuspenderer cellepillen i 4 ml AFM blandet med det ønskede volumen (10 μL her for at matche det højeste tilsatte behandlingsvolumen) på 1x PBS (kontrol).
    3. 500 μL enteroid/PBS/AFM-suspension afpipetteres i otte huller på en 24-brønd ultralav fastgørelsesplade, og pladen inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer.
    4. Gentag trin 1.3.1.-1.3.3. til TNF-α (20 ng/ml og 50 ng/ml) og LPS (100 μg/ml og 200 μg/ml) behandlinger ved normoxia. For alle hypoxibehandlinger gentages trin 1.3.1.-1.3.3, men pladen anbringes i en separat inkubator ved 37 °C, 5 % CO2 og 1 %O2 i 24 timer.
      BEMÆRK: Trin 1.3.4. kan udføres samtidigt med trin 1.3.1.-1.3.3, men for klarhedens skyld blev proceduren ovenfor adskilt ved behandling for at reducere kompleksiteten.

2. Immunofluorescerende farvning og konfokal mikroskopi

  1. Fremstilling af farvningsopløsninger
    1. 0,1% Triton X-100 fremstilles ved at blande 7 μL Triton X-100 i 1x PBS til et endeligt volumen på 7 ml. Pbst (PBS-Tween) fremstilles ved at tilsætte 30 μL Tween-20 til 1x PBS til et slutvolumen på 30 ml.
    2. Der fremstilles 10 % normalt æselserum (NDS)/PBST ved tilsætning af 700 μL NDS til 6,3 ml PBST. NDS/PBST forberedes ved at tilsætte 70 μL NDS til PBST til et slutvolumen på 7 ml.
      BEMÆRK: Æselserum blev brugt her til at korrelere med den sekundære antistofvært. De blokerende serumarter bør dog matche den sekundære antistofart for korrekt at blokere ikke-specifik binding.
  2. Farvning (dag 1)
    1. Overfør indholdet af fire brønde i en 24-brøndplade til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Gentag for alle ønskede brønde/behandlinger, med hver behandling i et separat rør. Rørene centrifugeres ved 300 x g i 4 minutter ved 4 °C. Når enteroiderne er pelleteret, skal du fjerne supernatanten.
    2. Resuspender cellepillerne i 300 μL 4% formaldehydfikseringsmiddel i 30 minutter ved stuetemperatur (RT). Efter 30 min centrifugeres rørene ved 300 x g i 4 min ved 4 °C, supernatanten fjernes, og pelleten vaskes med 500 μL steril RT 1x PBS.
    3. Rørene centrifugeres ved 300 x g i 4 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten og tilsæt 500 μL 0,1% Triton X-100, og lad den sidde i 1 time ved RT.
    4. Efter 1 time centrifugeres rørene ved 300 x g i 4 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes. Der vaskes med 500 μL 1x PBS, og rørene anbringes på en rotator eller ryster ved 200 o/min i 15 minutter ved 2-8 °C. Gentag dette i alt 4x.
    5. Rørene centrifugeres ved 300 x g i 4 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes. Der tilsættes 500 μL 10 % NDS/PBST, og der inkuberes ved RT i 45 min. Under inkubationen fremstilles primære antistofopløsninger ved at kombinere 20 μL rekombinant anti-villinantistof, 10 μL E-cadherin-antistof og 1970 μL 1% NDS / PBST til otte brønde af en 24-brøndplade.
    6. Efter 45 minutters inkubation centrifugeres rørene ved 300 x g i 4 minutter ved 4 °C. Læg rørene på is. Fjern supernatanten og udskift med 250 μL primær antistofopløsning. Rørene inkuberes natten over ved 2-8 °C.
  3. Farvning (dag 2)
    1. Rørene centrifugeres ved 300 x g i 4 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes. Der tilsættes 250-500 μL PBST til hvert rør, afhængigt af pelletens størrelse, og rotatoren eller rysteren anbringes på rotatoren eller rysteren ved 200 o/min i 1 time ved 2-8 °C. Gentag PBST-vasken 4x.
    2. Der fremstilles sekundær antistofopløsning ved at tilsætte 52 μL Cy3 æsel anti-kanin IgG (H + L) til 50% glycerol og 5,2 μL æsel antimus fluorescerende grøn 488 sekundære antistoffer til 5142,8 μL 1% NDS / PBST.
    3. Efter den sidste PBST-vask og centrifugering fjernes supernatanten fra rørene. Der dispenseres 200 μL sekundær antistofopløsning til hvert rør, og der inkuberes i mørke natten over ved 2-8 °C.
  4. Montering af farvede apikale enteroider (dag 1)
    1. Bring glycerolbaseret monteringsmiddel indeholdende blåt nukleart farvestof til RT over 1 time.
    2. Rørene centrifugeres ved 300 x g i 4 minutter ved 4 °C. Fjern 100 μL af supernatanten og resuspend cellerne i de resterende ~ 100 μL supernatant. Overfør celleophænget til 0,5 ml rør.
    3. Centrifuger rørene i en minicentrifuge i 20 s for at pelletere cellerne. Fjern supernatanten, og resuspend cellepillerne i 100 μL farrød nukleinsyreplet. Inkuber rørene ved RT i 10 min.
    4. Centrifuger rørene i en minicentrifuge i 20 s for at pelletere cellerne. Supernatanten fjernes, og cellepillerne resuspenderes i 100 μL 1x PBS. Gentag for en anden vask.
    5. Rørene centrifugeres i en minicentrifuge i 20 s for at pelletere cellerne, og 70 μL af supernatanten fjernes. Cellerne i det resterende volumen PBS sættes igen, og indholdet overføres til en mærket dækslip (24 mm x 60 mm).
    6. Påfør 75 μL mountant direkte på prøven, og fjern eventuelle bobler med en pipettespids. Lad dækslipsene hærde natten over (18-24 timer) ved RT i mørke.
  5. Montering af farvede apikale enteroider (dag 2)
    1. Efter hærdning natten over påføres et tyndt lag (~ 15 μL) glycerol på dækslipsene. Monter dækslen på glasglasset, og tryk forsigtigt på plads. Tryk for at fjerne eventuelle bobler mellem dækslen og diaset.
    2. Lad dækslen sætte sig ved RT i mørke i mindst 2 timer, før billeddannelse ved 20x forstørrelse med et konfokalt mikroskop. For mikroskopisk visualisering af enteroider ved hjælp af forskellige konfokale erhvervelsesmetoder henvises til Lallemant et al.37.
  6. Immunofluorescerende kvantificering
    BEMÆRK: Denne metode bestemmer den korrigerede total fluorescens ved at fjerne baggrundssignalet ved hjælp af ImageJ-software (https://imagej.nih.gov/ij/).
    1. Åbn de konfokale billeder i ImageJ, og skitsér det ønskede område med værktøjet interesseområde (ROI).
    2. Angiv brugerdefinerede parametre ved at gå til Analysér > Angiv målinger. Vælg Område > Integreret tæthed > Middelgrå værdi under fanen Indstillinger.
    3. Naviger til Analyser > måling. Der vises et pop op-vindue, der indeholder målingerne. Kopiér og indsæt disse målinger i et regneark.
    4. For at trække baggrundssignalet fra skal du vælge et lille ikke-fluorescerende område af billedet. Naviger til Analyser > måling for det pågældende område. Der vises et pop op-vindue, der indeholder målingerne. Kopier og indsæt outputtet i et regneark.
    5. Multiplicer arealet af den valgte celle med den gennemsnitlige fluorescens af baggrundsaflæsninger, og træk summen fra den integrerede densitet for at beregne den korrigerede totale cellefluorescens (CTCF). Gentag ovenstående trin for alle billeder af interesse, mens du opretholder poster i et regneark eller en statistisk softwarepakke (se Materialetabel).

3. Apikal-ud NEC-i-en-skål celle levedygtighed

  1. Enteroid behandlinger
    1. Opret apikal NEC-in-a-dish-model i 24 timer, som i trin 1.
    2. Optø celle levedygtighed assay reagens natten over ved 4 °C. På analysedagen bringes reagenset til RT 30 min før brug. Vend reagenset om for at blande.
    3. Før du udfører analysen, skal du fjerne 100 μL medier fra hver brønd og efterlade de resterende 400 μL. Tilsæt 400 μL cellelevedygtighedsassayreagens til hver brønd.
    4. Bland indholdet kraftigt på en pladeryster ved RT i 5 minutter ved 200 o / min for at inducere cellelysis. Efter omrystning inkuberes pladen ved RT i yderligere 25 min.
    5. Efter 25 minutters inkubation blandes indholdet af en brønd via pipettering og overføres 200 μL af 800 μL til en enkelt brønd med en 96-brønd, uigennemsigtig, polystyren, klarbundet plade. Gentag for de resterende 600 μL, og opret fire tekniske replikater pr. Brønd. Overfør det resterende indhold af hver brønd i 24-brøndpladen til en 96-brøndplade på denne måde.
    6. Ved hjælp af en pladelæser, der er i stand til luminescens, skal du registrere værdier ved 0,25 ms integration og sammenligne de relative værdier blandt behandlinger. Alternativt kan du sammenligne behandlings luminescens med en adenosintrifosfat (ATP) standard.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Brugen af enteroider til modellering af tarmbetændelse, selv inden for rammerne af nekrotiserende enterocolitis, er nu almindelig. Imidlertid mangler de fleste metoder, der i øjeblikket anvendes, enten adgang til den apikale overflade af enteroider, hvilket negerer den fysiologiske relevans af forbindelser beregnet til eventuel anvendelse som oral terapi eller er teknisk vanskelige og tidskrævende, som med enteroidafledte monolag. For at øge nytten af nuværende in vitro enteroide modeller af NEC vendte vi polariteten af enteroider og genererede i kombination med 24 timers hypoxi og LPS eller TNF-α en apikal NEC-in-a-dish model. Immunofluorescerende farvning bekræftede apikal lokalisering af kerner (blå) mod lumen og påvisning af villin32 (rød, apikal markør) ved epitelets ydre kant (figur 1A). Eksponering for 200 μg / ml LPS, 50 ng / ml TNF-α eller hypoxi alene inducerede ikke åbenlyse ændringer i bruttocellemorfologi, E-cadherin38 (grøn) eller villinlokalisering eller fluorescerende intensitet sammenlignet med kontrol (figur 1A-D; Figur 2). Behandling med LPS eller TNF-α i kombination med hypoxi forstyrret epitelarkitektur og forårsagede et signifikant tab af klæbende kryds og børstegrænseproteinekspression, indikeret ved tab af E-cadherin og villinfarvning (figur 1E-F; Figur 2). Disse reduktioner i enterocytbørstekant og tilhængere krydsproteinudtryk indikerer sandsynligvis en reduktion i epitelbarrierens integritet og er et fælles træk ved både human kirurgisk NEC og in vitro-modellering af sygdommen23.

For at bestemme virkningen af NEC-in-a-dish-komponenter på levedygtigheden af 3D apikale enteroider blev cellelevedygtighed evalueret ved hjælp af et cellelevedygtighedsassay designet til 3D-kulturer, centreret om ATP-kvantificering efter cellelyse. Enteroider blev behandlet med LPS (200 μg/ml) eller TNF-α (50 ng/ml) i 24 timer under normoxiske eller hypoxiske forhold. LPS eller TNF-α alene påvirkede ikke signifikant cellelevedygtighed sammenlignet med kontrol (figur 3A). Der forekom imidlertid betydelige reduktioner i levedygtigheden, når apikale enteroider blev behandlet med 200 μg/ml LPS eller 50 ng/ml TNF-α i kombination med hypoxi (****p < 0,0001) sammenlignet med hypoxi alene (figur 3B). Disse eksperimenter demonstrerer alsidigheden og den fysiologiske relevans af at udnytte apikale enteroider i en omkostningseffektiv og ligetil NEC-in-a-dish-model.

Figure 1
Figur 1: Bekræftelse af apikal-out fænotype og morfologiske virkninger af lipopolysaccharid (LPS), tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) og hypoxi. Repræsentativ immunohistokemisk farvning af 3D apikale enteroider til enterocytbørstekant og klæber krydsproteiner efter 24 timer. (A) Kontrol, (B) hypoxi, (C) LPS (200 μg / ml), (D) TNF-α (50 ng / ml), (E) LPS (200 μg / ml) + hypoxi, (F) TNF-α (50 ng / ml) + hypoxi. Skalalinje = 50 μm for hvert billede. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kvantificering af farvningsintensitet for børstekant og klæber krydsproteiner efter 24 h lipopolysaccharid (LPS), tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) og hypoxibehandlinger. (A) Villin (rød) niveauer sammenlignet blandt behandlinger; a = p < 0,0001 sammenlignet med kontrol; b = p < 0,05 sammenlignet med kontrol; c = p < 0,0001 sammenlignet med hypoxi; d = p < 0,05 sammenlignet med hypoxi; e = p < 0,001 sammenlignet med TNF-α; f = p < 0,01 sammenlignet med LPS + hypoxi; g = p < 0,0001 sammenlignet med LPS; og (B) E-cadherin (grønne) niveauer sammenlignet blandt behandlinger; a = p < 0,0001 sammenlignet med kontrol; b = p < 0,0001 sammenlignet med hypoxi; c = p < 0,01 sammenlignet med LPS; d = p < 0,01 sammenlignet med TNF-α; e = p < 0,05 sammenlignet med LPS + hypoxi. Signifikansen blev vurderet ved hjælp af envejsanalyse af varians (ANOVA) med Tukeys test til post hoc-analyse, præsenteret som middelværdi ± standardfejl i middelværdien (SEM) (n ≥ 7/gruppe). Kontrol repræsenterer normoxia med PBS som køretøjskontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Effekt af lipopolysaccharid (LPS), tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) og hypoxi på apikal celle levedygtighed. Levedygtigheden af 3D apikale enteroider behandlet med LPS (200 μg/ml) eller TNF-α (50 ng/ml) i 24 timer under (A) normoxiske eller (B) hypoxiske forhold blev målt via luminescens. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af envejsanalyse af varians (ANOVA) med Tukeys test til post-hoc analyse. Enteroider behandlet med LPS (200 μg / ml) og TNF-α (50 ng / ml) i kombination med hypoxi var signifikant mindre levedygtige sammenlignet med hypoxi alene, set her med en stigning i luminescens. LPS (200 μg/ml) eller TNF-α (50 ng/ml) under normoxiske forhold adskilte sig ikke fra kontrol. Data præsenteres som middelværdien ± standardfejlen i middelværdien (SEM), n = 8/gruppe, ****p < 0,0001. Kontrol repræsenterer normoxia med PBS som køretøjskontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Morfologi af tredimensionelle enteroider. (A) Mens basolaterale enteroider domineres af udseendet af et stort og åbent centralt lumen, med eller uden spirende, er (B) apikale enteroider kendetegnet ved et tæt, cellulært udseende. Skalalinje = 100 μm for hvert billede. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nylige udvikling af enteroide modeller afledt af intestinale epitelkrypter giver mulighed for et mere fysiologisk relevant in vitro-væv , hvor man kan studere nekrotiserende enterocolitis patogenese. På trods af at alle større differentierede celletyper af tarmepitelet er 3D-enteroider stadig underlagt flere væsentlige begrænsninger. De konventionelle, basolaterale enteroider suspenderes i 3D ECM hydrogelkupler, hvis sammensætning og densitet kan begrænse normal diffusion inden for vævskulturmiljøet39. Det er vigtigt, at disse enteroider giver begrænset adgang til den apikale overflade af celler, som er den overflade, der in vivo ville interagere med luminale bakterier og antigener, såsom enterocyt TLR4-binding af LPS.

Mens patofysiologien af NEC forbliver uklar, menes øget ekspression og aktivering af apikal TLR4 i det for tidligt fødte tarmepitel at spille en fremtrædende rolle40. Nedstrøms for TLR4-aktivering resulterer øget tarmpermeabilitet, reduceret epitelreparation og bakteriel translokation i en dysfunktionel tarmbarriere, hvilket fører til nekrose i tarmen2. Denne inflammatoriske cyklus i den distale tarm hos for tidligt fødte spædbørn menes at stamme fra tarmens lumen, der initierer ved den apikale overflade af enterocytter. Således rekapitulerer modeller, der anvender basolateral-out 3D-enteroider i mekanistiske undersøgelser, der involverer bakteriel translokation af tarmepitelet , ikke in vivopatogenese , som det i øjeblikket forstås, og vil sandsynligvis give suboptimal information.

Her beskriver vi etableringen af en apikal NEC-in-a-dish-model, der giver let adgang til den apikale overflade af enteroide celler og formodentlig resulterer i en mere fysiologisk relevant model sammenlignet med konventionelle 3D basolateral-out enteroider. Polaritetsvendingen i disse enteroider gør det muligt for potentielle oralt administrerede terapier simpelthen at blive tilsat til mediet og optaget naturligt af enterocytter, som det ville forekomme in vivo. Denne tilgang kræver ikke dyre og teknisk udfordrende teknikker, såsom mikroinjektion, og er mere ressourcevenlig end etablering af 2D-monolag eller gut-on-a-chip-modeller.

Vores repræsentative resultater indikerer apikale enteroider, der udsættes for LPS eller TNF-α i kombination med hypoxi, lider nedsat levedygtighed, forstyrret epitelarkitektur og en reduktion i tilhængere junction proteinekspression sammenlignet med kontrol eller sammenlignet med hypoxi eller inflammatorisk mediatorbehandling alene, der efterligner de kendte træk ved in vivo NEC. Forstyrrelse af klæbende kryds, kritisk for tarmepitelbarrierefunktion41, er rapporteret i NEC 42,43. Tæt kryds arkitektonisk forstyrrelse, som også er vigtig i NEC44, opstod sandsynligvis også, selvom disse ændringer vil blive evalueret i fremtidige undersøgelser. I et fysiologisk oversætteligt væv giver denne dual-hit-model mulighed for undersøgelse af for tidlig tarmrespons på faktorer, der er forbundet med NEC, samtidig med at den giver en platform, hvorigennem potentielt nye terapeutiske mål kan identificeres. Fremtidige undersøgelser kan udvide anvendelsen af apikale enteroider ud over NEC til undersøgelser med fokus på parasitære, bakterielle eller virale infektioner 31,32, værtsmikrobiominteraktioner45 og gastrointestinal absorberende funktion46, men inden for den fysiologiske kontekst af det for tidligt fødte spædbarn.

Denne protokol til apikal-out NEC-in-a-dish indeholder flere kritiske trin, der berettiger vægt. Sammensætningen og friskheden af cellekulturmediet er vigtigt for at undgå overdreven langsgående variabilitet i forsøg og sikre, at enteroider er sunde før eksperimentel behandling. På samme måde bør stamopløsninger af TNF-α og LPS alikvoteres og opbevares ved -80 °C for at undgå for høje fryse-/optøningscyklusser og bevare optimal aktivitet. Endelig skal det sikres, at al ECM opløses under EDTA/PBS-inkubationen. Ufuldstændig fjernelse af ECM kan resultere i, at enteroider ikke vender polariteten. Om nødvendigt kan inkubationsperioden forlænges til 1,5 timer for at sikre fuldstændig fjernelse af matrixen.

Mens denne apikale NEC-in-a-dish-model er omkostningseffektiv og ligetil, er metoden underlagt flere begrænsninger. Apikal-out NEC-in-a-dish er ikke så fysiologisk relevant som gut-on-a-chip modeller28,29, men repræsenterer en mellemliggende mulighed, hvor og når chipmuligheder ikke er tilgængelige. Derudover skal enteroider som en suspensionskultur opsamles, pelleteres og resuspenderes til medieændringer, hvilket tilføjer et centrifugeringstrin til en ellers enkel proces. En anden begrænsning er levetiden for apikale enteroider, da de generelt kun anses for egnede til slutpunktsanalyser. Da basolaterale vækstfaktorreceptorer ikke længere er i konstant kontakt med medievækstfaktorer, er apikale enteroider karakteriseret ved reduceret proliferation sammenlignet med basolaterale enteroider, hvilket resulterer i den relative manglende evne til at passere apikale kulturer31,32. Derudover vides det ikke, om den nøjagtige sammensætning, inklusive de relative proportioner, af celletyper er repræsenteret i enteroider sammenlignet med in vivo-væv, men undersøgelser tyder generelt på mindre forskelle31,32. Endelig kan udviklingen på 24 timer af denne apikale NEC-in-a-dish-model, selvom den er praktisk, være relativt kort sammenlignet med in vivo-formelbaserede NEC-modeller47, hvilket potentielt kræver yderligere standardisering, hvis der ønskes længere interventionsperioder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre og har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette indhold er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health. HC er støttet af tilskud P20GM134973 fra National Institutes of Health. KB er støttet af en Children's Hospital Foundation (CHF) og Presbyterian Health Foundation (PHF) bevilling. Vi takker Laboratoriet for Molekylærbiologi og Cytometriforskning på OUHSC for brugen af Kernefaciliteten, som gav konfokal billeddannelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Fisher Scientific 15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Conical tube VWR 89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates Fisher Scientific 07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm Thermo Scientific 102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Scientific A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate Sigma-Aldrich AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer STEMCELL Technologies 36254
E-cadherin antibody (7H12) Novus Biologicals NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Millipore Sigma 1004960700
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5
ImageJ Fiji N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) STEMCELL Technologies 06010
Leica SP8 Confocal Microscope Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography Millipore Sigma L3012-10MG
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich 566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 Corning 21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue Fisher Scientific P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] Abcam ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg Bio-Techne 210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L Fisher Scientific 3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661) Thermo Scientific T3605
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap Thermo Scientific AB0350
Tween-20 Sigma-Aldrich 9005-64-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Bazacliu, C., Neu, J. Necrotizing enterocolitis: long term complications. Current Pediatric Reviews. 15 (2), 115-124 (2019).
  4. Lim, J. C., Golden, J. M., Ford, H. R. Pathogenesis of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatric Surgery International. 31 (6), 509-518 (2015).
  5. Neu, J. Necrotizing enterocolitis: the future. Neonatology. 117 (2), 240-244 (2020).
  6. Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
  7. Emami, C. N., Mittal, R., Wang, L., Ford, H. R., Prasadarao, N. V. Recruitment of dendritic cells is responsible for intestinal epithelial damage in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by Cronobacter sakazakii. Journal of Immunology. 186 (12), Baltimore, Md. 7067-7079 (2011).
  8. Chen, L., et al. Human β-defensin-3 reduces excessive autophagy in intestinal epithelial cells and in experimental necrotizing enterocolitis. Scientific Reports. 9 (1), 19890 (2019).
  9. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  10. Gimeno-Alcañiz, J. V., Collado, M. C. Impact of human milk on the transcriptomic response of fetal intestinal epithelial cells reveals expression changes of immune-related genes. Food & Function. 10 (1), 140-150 (2019).
  11. Claud, E. C., Savidge, T., Walker, W. A. Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatric Research. 53 (3), 419-425 (2003).
  12. De Plaen, I. G. Inflammatory signaling in necrotizing enterocolitis. Clinics in Perinatology. 40 (1), 109-124 (2013).
  13. Subramanian, S., Geng, H., Tan, X. D. Cell death of intestinal epithelial cells in intestinal diseases. Sheng Li Xue Ba : [Acta Physiologica Sinica]. 72 (3), 308-324 (2020).
  14. Li, B., et al. Intestinal epithelial cell injury is rescued by hydrogen sulfide. Journal of Pediatric Surgery. 51 (5), 775-778 (2016).
  15. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum reduces apoptosis in the intestinal epithelium in necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (5), 1118-1127 (2010).
  16. Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - a review of methods. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
  17. Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (12), 1359-1363 (2012).
  18. Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (105), e53359 (2015).
  19. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  20. Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  21. Moorefield, E. C., Blue, R. E., Quinney, N. L., Gentzsch, M., Ding, S. Generation of renewable mouse intestinal epithelial cell monolayers and organoids for functional analyses. BMC Cell Biology. 19 (1), 15 (2018).
  22. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  23. Werts, A. D., et al. A novel role for necroptosis in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 403-423 (2020).
  24. Li, B., et al. Intestinal epithelial tight junctions and permeability can be rescued through the regulation of endoplasmic reticulum stress by amniotic fluid stem cells during necrotizing enterocolitis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 35 (1), 21265 (2021).
  25. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. JoVE:Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
  26. Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  27. Li, B., et al. Activation of Wnt signaling by amniotic fluid stem cell-derived extracellular vesicles attenuates intestinal injury in experimental necrotizing enterocolitis. Cell Death & Disease. 11 (9), 750 (2020).
  28. Beaurivage, C., et al. Development of a human primary gut-on-a-chip to model inflammatory processes. Scientific Reports. 10 (1), 21475 (2020).
  29. Jeon, M. S., et al. Contributions of the microbiome to intestinal inflammation in a gut-on-a-chip. Nano Convergence. 9 (1), 8 (2022).
  30. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
  31. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  32. Co, J. Y., Margalef-Català, M., Monack, D. M., Amieva, M. R. Controlling the polarity of human gastrointestinal organoids to investigate epithelial biology and infectious diseases. Nature Protocols. 16 (11), 5171-5192 (2021).
  33. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
  34. Li, B., et al. Neonatal intestinal organoids as an ex vivo approach to study early intestinal epithelial disorders. Pediatric Surgery International. 35 (1), 3-7 (2019).
  35. Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
  36. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (97), e52483 (2015).
  37. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  38. Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
  39. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
  40. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  41. Schneider, M. R., et al. A key role for E-cadherin in intestinal homeostasis and Paneth cell maturation. PLoS One. 5 (12), 14325 (2010).
  42. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum improves intestinal integrity in a rat model of necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (5), 940-949 (2009).
  43. Khailova, L., et al. Changes in hepatic cell junctions structure during experimental necrotizing enterocolitis: effect of EGF treatment. Pediatric Research. 66 (2), 140-144 (2009).
  44. Ravisankar, S., et al. Necrotizing enterocolitis leads to disruption of tight junctions and increase in gut permeability in a mouse model. BMC Pediatrics. 18 (1), 372 (2018).
  45. Han, X., et al. Creating a more perfect union: modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 769-782 (2021).
  46. Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals: An Open Access Journal from MDPI. 12 (3), 372 (2022).
  47. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocols. 2 (4), 100951 (2021).

Tags

Medicin udgave 184
<em>In vitro </em> Apikal-out enteroid model af nekrotiserende enterocolitis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H.… More

Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H. In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (184), e64003, doi:10.3791/64003 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter