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Medicine

In vitro Modelo enteróide apical-out de enterocolite necrotizante

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64003
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center and Center for Pregnancy and Newborn Health

Summary

Este protocolo descreve um modelo de enterocolite necrosante a apical (NEC)-in-a-dish utilizando pequenos enteróides intestinais com polaridade invertida, permitindo o acesso à superfície apical. Fornecemos um protocolo de coloração imunofluorescente para detectar interrupção epitelial relacionada à NEC e um método para determinar a viabilidade de enteróides apical-out submetidos ao protocolo NEC-in-a-dish.

Abstract

A enterocolite necrosante (NEC) é uma doença devastadora que afeta bebês prematuros, caracterizada por inflamação intestinal e necrose. Os enteróides surgiram recentemente como um sistema promissor para modelar patologias gastrointestinais. No entanto, atualmente utilizados métodos para manipulação enteróide ou não têm acesso à superfície apical do epitélio (tridimensional [3D]) ou são demorados e intensivos em recursos (monocamadas bidimensionais [2D]). Esses métodos muitas vezes requerem etapas adicionais, como a microinjeção, para que o modelo se torne fisiologicamente translacionável. Aqui, descrevemos um protocolo fisiologicamente relevante e barato para estudar nec in vitro , invertendo a polaridade enteroid, resultando na superfície apical voltada para fora (apical-out). Um protocolo de coloração imunofluorescente para examinar a integridade da barreira enteróide e a expressão da proteína juncional após a exposição ao fator de necrose tumoral -alfa (TNF-α) ou lipopólise (LPS) sob condições normóxicas ou hipoxicas também são fornecidos. Também é avaliada a viabilidade de enteróides apical-out 3D expostos a LPS normóxicos ou hipoxicos ou TNF-α por 24 h. Enteroides expostos a LPS ou TNF-α, em combinação com a hipóxia, apresentaram interrupção da arquitetura epitelial, perda de expressão proteica de junção e redução da viabilidade celular. Este protocolo descreve um novo modelo nec-in-a-dish apical-out que apresenta uma plataforma fisiologicamente relevante e econômica para identificar potenciais alvos epiteliais para terapias NEC e estudar a resposta intestinal pré-clusão à terapêutica.

Introduction

A enterocolite necrosante (NEC), doença inflamatória grave do intestino delgado que ocorre em até 10% dos bebês prematuros, está comumente associada à alta morbidade e mortalidade 1,2. As taxas de mortalidade que se aproximam de 50% em bebês com baixo peso ao nascer (<1500 g), que necessitam de intervenção cirúrgica, não são incomuns3. Embora a etiologia exata da NEC não seja compreendida atualmente, acredita-se que fatores de risco, como a alimentação de fórmulas, se compõem com anomalias fisiológicas, como disbiose, epitélio intestinal imaturo e barreira intestinal disfuncional, no desenvolvimento da doença 2,4. Apesar do esforço significativo, pouco progresso na prevenção ou tratamento da NEC ocorreu na última década5. Um novo método in vitro para estudar nec e disfunção da barreira epitelial intestinal associada é necessário para avançar na compreensão da patogênese da doença, uma vez que os achados de modelos animais têm, até agora, traduzido mal para a cabeceira6.

Vários modelos in vitro foram utilizados para investigar os mecanismos em jogo durante a NEC. A linha de células epiteliais intestinais humanas, Caco-2, está entre os modelos in vitro mais utilizados da NEC 7,8. As células caco-2 emulam características morfológicas da borda da escova do intestino delgado, mas, como linha celular, não se diferenciam na grande variedade de tipos de células in vivo, incluindo células de cálice produtoras de muco, necessárias para um modelo altamente traduzível. HT-29-MTX, células humanas de adenocarcinoma de cólon, incluem um fenótipo de células de cálice e cálice misto, mas ainda não possuem tipos de células baseadas em criptografia do epitéliointestinal 9. IEC-6 e IEC-18 são linhas celulares não transformadas com uma morfologia imatura semelhante a criptologia ileal, mas não são derivadas do tecido humano, limitando sua capacidade translacional. As linhas de células intestinais FHs 74-Int e H4 são derivadas do tecido fetal humano e não formam junções apertadas ou monocamadas polarizadas10,11, sendo assim imaturas em comparação até mesmo com os bebês mais prematuros suscetíveis à NEC. Tipicamente, os modelos in vitro nec utilizam tratamentos de lipopolisacarídeo (LPS) para induzir o receptor 4 (TLR4), um receptor importante que inicia inflamação intestinal na NEC12. Os danos mediados através do tratamento reativo de espécies de oxigênio (ROS), tipicamente via peróxido de hidrogênio, é frequentemente usado para induzir danos oxidativos semelhantes à NEC e à apoptose13,14. Como principal condutor da inflamação intestinal, o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), um componente a jusante da sinalização inflamatória TLR4, também é comumente utilizado nestes modelos in vitro para imitar a patogênese in vivo 15.

Os organoides, gerados a partir de células-tronco pluripotentes indutíveis (iPSCs), cresceram em popularidade como modelo in vitro do intestino devido à sua capacidade de recapitular a complexa arquitetura in vivo e a composição do tipo celular do tecido do qual são derivados16,17. Um sistema in vitro relacionado, enteroids, são organoides derivados de criptas intestinais resseccionadas que são mais facilmente estabelecidas e mantidas do que organoides derivados do iPSC. Os enteróides são tipicamente cultivados em uma matriz extracelular tridimensional (3D) (ECM) com acesso experimental limitado à superfície celular basolateral. Métodos, como a microinjeção 18,19, foram desenvolvidos para superar essa barreira à superfície apical, mas o acúmulo de detritos celulares e muco sloughed dentro do lúmen torna a microinjeção tecnicamente difícil e inconsistente. Como as plataformas de microinjeção robótica personalizadas não são amplamente acessíveis20, a variabilidade de laboratório para laboratório em capacidade técnica e técnica geral tornam-se variáveis significativas para serem superadas com protocolos de microinjeção. Monocamadas bidimensionais (2D) derivadas de enteróides 3D dissociados, ainda compreendendo todos os principais tipos celulares do epitélio intestinal, permitem o acesso à superfície apical, mas têm sido tradicionalmente difíceis de manter sem uma camada alimentador de miofibroblastsmesenquimais 21. Embora a cultura celular suportes permeáveis possam ser usados para acessar os lados apical e basolateral das monocamadas enteróides sem o uso de miofibroblasts subjacentes, essas inserções requerem excisão e montagem da membrana antes do uso com modalidades como microscopia confocal, resultando em um processo mais exigente e difícil ao usar métodos tradicionais de microscopia22. A NEC foi modelada in vitro usando enteróides 3D tradicionais 23,24,25 e suportes permeáveis 26,27, e a inflamação intestinal foi recentemente replicada com modelos 3D-on-a-chip28,29. Embora os modelos gut-on-a-chip que incorporam microfluidos sejam, de longe, os modelos mais avançados e traduzíveis, essa tecnologia é cara, complexa e inacessível para a maioria dos investigadores30.

Os recentes avanços nas técnicas de enteroid apical-out permitiram acesso mais fácil à superfície apical de enteróides 3D sem correr o risco de danos à integridade estrutural do epitélio in vitro 31,32,33. Os enteróides apical-out compartilham a composição do tipo celular e a função de barreira do epitélio intestinal in vivo, mas, ao contrário dos enteróides 3D típicos, as superfícies apical dessas células enfrentam o meio da cultura, permitindo estudos mais fisiologicamente relevantes sobre absorção de nutrientes, infecção microbiana e secreção luminal31. Uma vantagem adicional dos enteróides apical-out é a capacidade de distribuir homogeneamente agentes experimentais para enteróides. Não é necessário variar os volumes de tratamento com base no tamanho do enteroid, como é com a microinjeção, e a capacidade de manter esses enteróides na cultura de suspensão nega qualquer interferência de ECM na difusão de agente experimental32.

Enterocolite necrosante é uma doença multifatorial que envolve múltiplos tipos de células epiteliais intestinais e uma variedade de fatores ambientais e fisiopacionológicos34. A composição celular variada de enteróides intestinais é uma clara melhora sobre monoculturas na modelagem de uma doença complexa como a NEC. Curiosamente, enquanto uma única exposição inflamatória é muitas vezes suficiente para induzir danos em monoculturas in vitro , os enteróides, como acontece com os modelos de camundongos23, parecem exigir um mínimo de dois componentes inflamatórios para induzir danos semelhantes à NEC6. Aqui, apresentamos um modelo nec-in-a-dish apical-out, usando enteróides apical-out em combinação com hipóxia (uma característica clínica importante da NEC6) e LPS ou TNF-α, como um modelo in vitro melhorado e mais fisiologicamente relevante para estudar respostas epiteliais à inflamação semelhante à NEC e, potencialmente, identificar alvos terapêuticos. Descrevemos um protocolo para reverter a polaridade de pequenos enteróides intestinais 3D, bem como um protocolo de coloração imunofluorescente para identificar a interrupção da barreira epitelial e alterações na expressão da proteína juncional. Finalmente, demonstramos ainda um simples ensaio de viabilidade enteroid para determinar o impacto do nosso modelo NEC-in-a-dish de dois sucessos.

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Protocol

Todos os procedimentos animais deste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Oklahoma Health Sciences Center. Amostras de conveniência do intestino delgado de um primata não humano pré-médio (NHP, 90% de gestação, babuíno de oliva, Papio anubis) foram obtidas após eutanásia para estudo separado (Protocolo nº 101523-16-039-I).

1. Estabelecimento do modelo enteroid nec-in-a-dish apical-out

  1. Preparação de mídias e tratamentos enteróides
    NOTA: Uma vez preparada seguindo a técnica asséptica padrão, a mídia pode ser armazenada a 4 °C por até 1 semana.
    1. Prepare a mídia livre de antibióticos (AFM) misturando 50 mL de mídia de crescimento organoide humano com 50 mL de suplemento organoide (ver Tabela de Materiais). Prepare 5 mM ácido etilenodiaminatotraacético/1x salina tamponada de fosfato (EDTA/PBS) adicionando 100 μL de 0,5 M EDTA a 9.900 μL de PBS.
    2. Chill Dulbecco's modified eagle's medium/nutrient Ham's mistura F12 + 15 mM HEPES Buffer (DMEM/F12) a 2-8 °C.
    3. Prepare a solução de estoque TNF-α suspendendo 100 μg de pó de α TNF em 1 mL de PBS 1x. Diluir ainda mais o estoque de TNF-α para 20 ng/mL e 50 ng/mL concentrações usando AFM como solvente. Prepare a solução de estoque LPS suspendendo 2 mg de LPS em 1 mL de 1x PBS. LpS de estoque diluído para 100 μg/mL e 200 μg/mL usando AFM como solvente.
  2. Invertendo a polaridade dos enteróides 3D
    NOTA: O procedimento a seguir destina-se à reversão de uma única placa de cultura de tecido de fundo plano de 24 poços em duas placas de cultura de tecido de apego ultra-baixo de 24 poços. As placas de cultura tecidual devem ser aquecidas a 37 °C por pelo menos 30 minutos antes do uso. A derivação de enteróides 3D basolateral foi alcançada como descrito anteriormente por muitos grupos35,36, com pequenas modificações para mídia (detalhado acima). O procedimento geral de derivação enteróide não difere do dos humanos. Resumindo, o tecido excisado é lavado, cortado em pequenos fragmentos e incubado no tampão de interrupção celular. A solução celular é então executada através de um coador de células de 70 μM, resultando em criptas que são banhadas a uma alta densidade.
    1. Aspirar mídia de cada poço de uma placa de 24 poços de enteróides basolaterais 3D estabelecidos.
    2. Adicione 500 μL de EDTA/PBS gelado de 5 mM a cada poço da placa de 24 poços e interrompa suavemente a cúpula da membrana do porão/ECM, tubulando para cima e para baixo com uma pipeta p200 um mínimo de 5x-6x.
    3. Transfira o conteúdo de quatro poços para um tubo cônico de 15 mL e adicione 8 mL de EDTA/PBS gelado ao tubo cônico. Transfira os 20 poços restantes da mesma forma.
    4. Incubar tubos cônicos de 15 mL a 4 °C por 1h em uma plataforma rotativa ou agitador a 330 rpm. Após a incubação de 1 h, centrifugar os tubos cônicos a 300 x g por 3 min a 4 °C. Remova e descarte o sobrenatante de cada tubo.
    5. Combine e lave as pelotas celulares com 5 mL de DMEM/F12 e distribua a suspensão da célula em dois tubos cônicos de 15 mL.
    6. Pelota as células por centrifugação a 300 x g por 3 min a 4 °C. Remova o supernatante e adicione 12 mL de AFM a cada tubo, garantindo que as pelotas celulares sejam resuspendidas.
    7. Pipeta 500 μL da suspensão enteróide em cada poço de duas placas de fixação ultra-baixas de 24 poços.
    8. Incubar as placas a 37 °C e 5% de CO2 por 2-5 dias ou até que as enteroids tenham invertido a polaridade.
    9. Para verificar a reversão enteróide, primeiro estabeleça a coloração imunofluorescente confirmatória e o tempo médio de reversão (~3 dias), depois confirme a reversão da polaridade usando uma visualização básica do microscópio de luz. Enteroids apical-out são muito celulares na aparência, enquanto enteróides basolaterais são frequentemente dominados pela presença de um grande lúmen central ou brotação (ver Figura Suplementar 1).
      NOTA: Uma vez padronizado o procedimento, a taxa de conversão para apical-out normalmente excede 95%. O uso de enteróides apical-out é destinado como um experimento terminal, embora seja teoricamente possível passar enteróides apical-out em um pequeno número de enteróides basolaterais.
  3. Apical-out NEC-in-a-dish
    NOTA: Uma vez que os enteróides tenham invertido a polaridade, use as culturas em experimentos subsequentes rapidamente, pois sua longevidade na conformação apical-out não foi confirmada além de 3-4 dias. Para o modelo nec-in-a-dish seguinte, os enteróides foram tratados por 24 horas, depois coletados imediatamente depois e preservados para experimentos a jusante.
    1. Uma vez que os enteróides tenham visualmente invertido polaridade com pelo menos 95% de eficiência, remova as placas da incubadora e colete oito poços de uma placa de 24 poços em um tubo cônico de 15 mL. Como os enteróides apical-out estão em suspensão, basta pipeta a solução enteroid/mídia. Centrifugar o tubo de 15 mL a 300 x g por 5 min a 4 °C.
    2. Uma vez que as células são pelotas, remova o supernaspecido e resuspenque a pelota celular em 4 mL de AFM misturado com o volume desejado (10 μL aqui para corresponder ao maior volume de tratamento adicionado) de 1x PBS (controle).
    3. Pipeta 500 μL de suspensão enteróide/PBS/AFM em oito poços de uma placa de fixação ultra-baixa de 24 poços e incubar a placa a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h.
    4. Repetição passos 1.3.1.-1.3.3. para tratamentos TNF-α (20 ng/mL e 50 ng/mL) e LPS (100 μg/mL e 200 μg/mL) em normoxia. Para todos os tratamentos de hipóxia, repita as etapas 1.3.1.-1.3.3., mas coloque a placa em uma incubadora separada a 37 °C, 5% CO2 e 1% O2 por 24 h.
      NOTA: Passo 1.3.4. pode ser feito simultaneamente com as Etapas 1.3.1.-1.3.3, mas, para maior clareza, o procedimento acima foi separado pelo tratamento, a fim de reduzir a complexidade.

2. Coloração imunofluorescente e microscopia confocal

  1. Elaboração de soluções de coloração
    1. Prepare 0,1% Triton X-100 misturando 7 μL de Triton X-100 em 1x PBS a um volume final de 7 mL. Prepare PBST (PBS-Tween) adicionando 30 μL de Tween-20 a 1x PBS a um volume final de 30 mL.
    2. Prepare 10% de soro de burro normal (NDS)/PBST adicionando 700 μL de NDS a 6,3 mL de PBST. Prepare 1% NDS/PBST adicionando 70 μL de NDS ao PBST a um volume final de 7 mL.
      NOTA: O soro de burro foi usado aqui para se correlacionar com o hospedeiro de anticorpos secundários. No entanto, as espécies de soro de bloqueio devem corresponder às espécies de anticorpos secundários, a fim de bloquear adequadamente a ligação não específica.
  2. Manchas (Dia 1)
    1. Transfira o conteúdo de quatro poços de uma placa de 24 poços para um tubo de microcentrifus de 1,5 mL. Repita para todos os poços/tratamentos desejados, com cada tratamento em um tubo separado. Centrifugar os tubos a 300 x g por 4 min a 4 °C. Uma vez que os enteróides são pelotas, remova o supernatante.
    2. Resuspenda as pelotas de célula em 300 μL de 4% de formaldeído fixador por 30 min a temperatura ambiente (RT). Depois de 30 min, centrifugar os tubos a 300 x g por 4 min a 4 °C, remover o supernasal e lavar a pelota com 500 μL de estéril, RT 1x PBS.
    3. Centrifugar os tubos a 300 x g por 4 min a 4 °C. Remova o supernasal e adicione 500 μL de 0,1% Triton X-100, e deixe sentar por 1h no RT.
    4. Depois de 1h, centrifufique os tubos a 300 x g por 4 min a 4 °C e remova o sobrenatante. Lave com 500 μL de 1x PBS e coloque os tubos em um rotador ou agitador a 200 rpm por 15 min a 2-8 °C. Repita isso um total de 4x.
    5. Centrifugar os tubos a 300 x g por 4 min a 4 °C e remover o sobrenatante. Adicione 500 μL de 10% NDS/PBST e incubar na RT por 45 min. Durante a incubação, prepare soluções primárias de anticorpos combinando 20 μL de anticorpo anti-villin recombinante, 10 μL de anticorpo E-cadherin e 1970 μL de 1% NDS/PBST para oito poços de uma placa de 24 poços.
    6. Após a incubação de 45 min, centrifugar os tubos a 300 x g por 4 min a 4 °C. Coloque os tubos no gelo. Remova o supernatante e substitua por 250 μL de solução de anticorpos primários. Incubar os tubos durante a noite a 2-8 °C.
  3. Manchas (Dia 2)
    1. Centrifugar os tubos a 300 x g por 4 min a 4 °C e remover o sobrenatante. Adicione 250-500 μL de PBST a cada tubo, dependendo do tamanho da pelota, e coloque no rotador ou agitador a 200 rpm por 1h a 2-8 °C. Repita a lavagem PBST 4x.
    2. Prepare a solução de anticorpos secundários adicionando 52 μL de Cy3 burro anti-coelho IgG (H + L) a 50% glicerol e 5,2 μL de anti-rato de burro verde fluorescente 488 anticorpos secundários a 5142,8 μL de 1% NDS/PBST.
    3. Após a última lavagem pbst e centrifugação, remova o sobrenatante dos tubos. Dispense 200 μL de solução de anticorpos secundários para cada tubo e incubar no escuro durante a noite a 2-8 °C.
  4. Montagem de enteróides apical-out manchados (Dia 1)
    1. Leve o montador à base de glicerol contendo corante nuclear azul para RT acima de 1 h.
    2. Centrifugar os tubos a 300 x g por 4 min a 4 °C. Remova 100 μL do supernante e resuspense as células no restante ~100 μL de supernante. Transfira a suspensão celular para tubos de 0,5 mL.
    3. Centrifugar os tubos em uma mini centrífuga por 20 s para pellet as células. Remova o supernatante e resuspende as pelotas celulares em 100 μL de mancha de ácido nucleico vermelho distante. Incubar os tubos na RT por 10 minutos.
    4. Centrifugar os tubos em uma mini centrífuga por 20 s para pellet as células. Remova o supernasciente e resuspense as pelotas de célula em 100 μL de 1x PBS. Repita para uma segunda lavagem.
    5. Centrifugar os tubos em uma mini centrífuga por 20 s para pelotar as células e remover 70 μL do supernatante. Resuspenque as células no volume restante do PBS e transfira o conteúdo para um deslizamento de cobertura rotulado (24 mm x 60 mm).
    6. Aplique 75 μL de montagem diretamente na amostra e remova quaisquer bolhas com uma ponta de pipeta. Deixe as tampas curarem durante a noite (18-24 h) no RT no escuro.
  5. Montagem de enteróides apical-out manchados (dia 2)
    1. Depois de curar durante a noite, aplique uma camada fina (~15 μL) de glicerol nas tampas. Monte a tampa no deslizamento de vidro e pressione suavemente no lugar. Toque para remover quaisquer bolhas entre o deslizamento e o slide.
    2. Deixe que a mancha de cobertura seja definida em RT no escuro por um mínimo de 2h, antes de fotografar a ampliação de 20x com um microscópio confocal. Para visualização microscópica de enteróides utilizando vários métodos de aquisição confocal, consulte Lallemant et al.37.
  6. Quantificação imunofluorescente
    NOTA: Este método determina a fluorescência total corrigida removendo o sinal de fundo usando o software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
    1. Abra as imagens confocal no ImageJ e delineie a área desejada com a ferramenta região de interesse (ROI).
    2. Defina parâmetros definidos pelo usuário navegando para analisar > definir medidas. Selecione Área > Densidade Integrada > Valor Cinza Médio na guia Configurações.
    3. Navegue até analisar > Medida. Uma janela pop-up aparecerá contendo as medidas. Copie e cole essas medidas em uma planilha.
    4. Para subtrair o sinal de fundo, selecione uma pequena área não fluorescente da imagem. Navegue até Analisar > Medida para aquela região. Uma janela pop-up aparecerá contendo as medidas. Copie e cole a saída em uma planilha.
    5. Multiplique a área da célula selecionada pela fluorescência média das leituras de fundo e subtraia a soma da densidade integrada para calcular a fluorescência celular total corrigida (CTCF). Repita as etapas acima para todas as imagens de interesse, mantendo registros em uma planilha ou pacote de software estatístico (ver Tabela de Materiais).

3. Viabilidade celular NEC-in-a-dish

  1. Tratamentos enteróides
    1. Estabeleça o modelo NEC-in-a-dish apical-out por 24 h, como no Passo 1.
    2. Degelo da viabilidade celular ensaio reagente durante a noite a 4 °C. No dia do ensaio, leve o reagente para RT 30 min antes de usar. Inverta o reagente para misturar.
    3. Antes de realizar o ensaio, remova 100 μL de mídia de cada poço, deixando os 400 μL restantes. Adicione 400 μL de reagente de ensaio de viabilidade celular a cada poço.
    4. Misture vigorosamente bem o conteúdo em um agitador de placas em RT por 5 min a 200 rpm para induzir a lise celular. Após o tremor, incubar a placa na RT por mais 25 minutos.
    5. Após 25 min de incubação, misture o conteúdo de um poço através de pipetagem e transfira 200 μL dos 800 μL para um único poço de uma placa de 96 poços, opacos, poliestireno, de fundo claro. Repita para os 600 μL restantes, criando quatro réplicas técnicas por poço. Transfira o conteúdo restante de cada poço da placa de 24 poços para uma placa de 96 poços desta maneira.
    6. Utilizando um leitor de placas capaz de luminescência, registos de integração de 0,25 ms e compare os valores relativos entre os tratamentos. Alternativamente, compare a luminescência do tratamento com um padrão de triptofato de adenosina (ATP).

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Representative Results

O uso de enteróides para modelar inflamação intestinal, mesmo dentro do contexto de enterocolite necrosante, agora é comum. No entanto, a maioria dos métodos atualmente utilizados ou não tem acesso à superfície apical dos enteróides, negando a relevância fisiológica dos compostos destinados a eventual uso como terapêutica oral, ou são tecnicamente difíceis e demorados, como acontece com as monocamadas derivadas de enteróides. Para aumentar a utilidade dos modelos enteroid in vitro atuais da NEC, invertemos a polaridade dos enteróides, e, em combinação com 24 h de hipóxia e LPS ou TNF-α, geramos um modelo nec-in-a-prato apical-out. A coloração imunofluorescente confirmou a localização apical-out dos núcleos (azul) em direção ao lúmen e a detecção de villin32 (marcador vermelho, apical) na borda externa do epitélio (Figura 1A). A exposição a 200 μg/mL LPS, 50 ng/mL TNF-α, ou por si só a hipóxia não induziu alterações de 200 μg/mLLPS, localização de villin ou intensidade fluorescente em comparação com o controle (Figura 1A-D; Figura 2). O tratamento com LPS ou TNF-α, em combinação com a hipóxia, interrompeu a arquitetura epitelial e causou uma perda significativa da junção de adeptos e expressão de proteína de borda de escova, indicada pela perda de e-cadherin e mancha de villina (Figura 1E-F; Figura 2). Essas reduções na borda da escova de enterócito e adere expressões proteicas de junção provavelmente indicam uma redução na integridade da barreira epitelial e são uma característica comum tanto da NEC cirúrgica humana quanto da modelagem in vitro da doença23.

Para determinar o impacto dos componentes NEC-in-a-dish na viabilidade de enteróides apical-out 3D, a viabilidade celular foi avaliada usando um ensaio de viabilidade celular projetado para culturas 3D, centrado na quantificação atp após a lise celular. Os enteróides foram tratados com LPS (200 μg/mL) ou TNF-α (50 ng/mL) por 24 h sob condições normóxiclicas ou hipoxilicas. LPS ou TNF-α sozinhos não afetaram significativamente a viabilidade celular em comparação com o controle (Figura 3A). No entanto, reduções significativas na viabilidade ocorreram quando os enteróides apical-out foram tratados com 200 μg/mL LPS ou 50 ng/mL TNF-α em combinação com hipóxia (****p < 0,0001) em comparação apenas com a hipóxia (Figura 3B). Esses experimentos demonstram a versatilidade e a relevância fisiológica de utilizar enteróides apical-out em um modelo NEC-em-um-prato econômico e simples.

Figure 1
Figura 1: Confirmação de fenótipo apical-out e efeitos morfológicos de lipopolisacarídeo (LPS), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e hipóxia. Coloração imunohistoquímica representativa de enteróides apical-out 3D para borda de escova de enterócito e adere proteínas de junção após 24 h. (A) Controle, (B) hipóxia, (C) LPS (200 μg/mL), (D) TNF-α (50 ng/mL), (E) LPS (200 μg/mL) + hipóxia, (F) TNF-α (50 ng/mL) + hipoxia. Barra de escala = 50 μm para cada imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Quantificação da intensidade de coloração para a borda da escova e adere proteínas de junção após lipopolysacarídeos de 24 h (LPS), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e tratamentos de hipóxia. (A) níveis de Villin (vermelho) comparados entre os tratamentos; a = p < 0,0001 em comparação com o controle; b = p < 0,05 em relação ao controle; c = p < 0,0001 em comparação com a hipóxia; d = p < 0,05 em comparação com a hipóxia; e = p < 0,001 em comparação com TNF-α; f = p < 0,01 em comparação com LPS + hipóxia; g = p < 0,0001 em comparação com LPS; e (B) níveis de e-cadherina (verde) em comparação entre os tratamentos; a = p < 0,0001 em comparação com o controle; b = p < 0,0001 em comparação com a hipóxia; c = p < 0,01 em relação ao LPS; d = p < 0,01 em relação ao TNF-α; e = p < 0,05 em comparação com LPS + hipóxia. A significância foi avaliada por meio da análise unidirecional de variância (ANOVA) com o teste de Tukey para análise pós-hoc, apresentado como erro padrão ± médio (SEM) (n ≥ 7/grupo). O controle representa a normoxia com PBS como controle do veículo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Efeito de lipopolisacarídeo (LPS), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e hipóxia na viabilidade celular apical-out. A viabilidade de enteróides apical-out 3D tratados com LPS (200 μg/mL) ou TNF-α (50 ng/mL) por 24 h sob (A) condições hipóxicas ou (B) foram medidas via luminescência. A significância estatística foi calculada utilizando-se a análise unidirecional de variância (ANOVA) com o teste de Tukey para análise pós-hoc. Os enteróides tratados com LPS (200 μg/mL) e TNF-α (50 ng/mL), em combinação com hipóxia, foram significativamente menos viáveis em comparação apenas com a hipóxia, visto aqui com um aumento da luminescência. LPS (200 μg/mL) ou TNF-α (50 ng/mL), sob condições normóxidas, não diferem do controle. Os dados são apresentados como erro padrão ± médio da média (SEM), n = 8/grupo, ****p < 0,0001. O controle representa a normoxia com PBS como controle do veículo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Morfologia de enteróides tridimensionais. (A) Enquanto os enteróides basolaterais são dominados pelo aparecimento de um lúmen central grande e aberto, com ou sem brotação, (B) enteróides apical-out são caracterizados por uma aparência densa e celular. Barra de escala = 100 μm para cada imagem. Clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

O desenvolvimento recente de modelos enteróides derivados de criptes epiteliais intestinais permite um tecido in vitro mais fisiologicamente relevante no qual estudar a patogênese de enterocolite necrosante. Apesar de incluir todos os principais tipos de células diferenciadas do epitélio intestinal, os enteróides 3D ainda estão sujeitos a várias limitações significativas. Os enteróides convencionais de saída basolateral são suspensos em cúpulas de hidrogel 3D ECM, a composição e a densidade das quais podem limitar a difusão normal dentro do ambiente de cultura tecidual39. É importante ressaltar que esses enteróides fornecem acesso limitado à superfície apical das células, que é a superfície que, in vivo, interagiria com bactérias luminais e antígenos, como enterócito tlr4-vinculação de LPS.

Embora a fisiopatologia da NEC permaneça incerta, o aumento da expressão e ativação do apical TLR4 no epitélio intestinal pré-meio-dia é pensado para desempenhar um papel proeminente40. A jusante da ativação do TLR4, aumento da permeabilidade intestinal, redução da reparação epitelial e translocação bacteriana resultam em uma barreira intestinal disfuncional, levando à necrose do intestino2. Acredita-se que este ciclo inflamatório no intestino distal de bebês prematuros tenha origem no lúmen intestinal, iniciando na superfície apical dos enterócitos. Assim, modelos utilizando enteróides 3D basolateral-out em estudos mecanicistas envolvendo translocação bacteriana do epitélio intestinal não recapitulam em patogênese vivo como é atualmente entendido e são susceptíveis de produzir informações suboptimais.

Aqui, descrevemos o estabelecimento de um modelo NEC-em-um-prato apical-out, permitindo fácil acesso à superfície apical das células enteróides e, presumivelmente, resultando em um modelo mais fisiologicamente relevante em comparação com enteróides basolaterais convencionais. A reversão da polaridade nesses enteróides permite que potenciais terapêuticas administradas oralmente sejam simplesmente adicionadas à mídia e tomadas naturalmente por enterócitos, como ocorreria in vivo. Essa abordagem não requer técnicas caras e tecnicamente desafiadoras, como a microinjeção, e é mais amigável com recursos do que o estabelecimento de monocamadas 2D ou modelos gut-on-a-chip.

Nossos resultados representativos indicam que os enteróides apical-out submetidos a LPS ou TNF-α, em combinação com a hipóxia, sofrem viabilidade reduzida, arquitetura epitelial interrompida e uma redução na expressão proteica de junção aderente em comparação com o controle, ou comparado apenas ao tratamento de hipóxia ou mediador inflamatório, imitando as características conhecidas da NEC in vivo. A interrupção das junções de aderentes, crítica à função da barreira epitelial intestinal41, foi relatada na NEC42,43. A ruptura arquitetônica de junção apertada, que também é importante na NEC44, provavelmente também ocorreu, embora essas mudanças sejam avaliadas em estudos futuros. Em um tecido fisiologicamente traduzível, este modelo de duplo impacto permite o estudo de respostas intestinais pré-cardíacas a fatores inerentes à NEC, ao mesmo tempo em que fornece uma plataforma através da qual alvos terapêuticos potencialmente novos podem ser identificados. Estudos futuros podem estender a aplicação de enteróides apical-out além da NEC para estudos focados em infecções parasitárias, bacterianas ou virais31,32, interações hospedeiro-microbioma45, e função absortiva gastrointestinal46, mas dentro do contexto fisiológico do bebê prematuro.

Este protocolo para nec-in-a-dish apical-out inclui várias etapas críticas que garantem ênfase. A composição e o frescor dos meios de cultura celular são importantes para evitar a variabilidade longitudinal excessiva em experimentos e garantir que os enteróides sejam saudáveis antes do tratamento experimental. Da mesma forma, as soluções de estoque de TNF-α e LPS devem ser aliquos e armazenadas a -80 °C para evitar ciclos excessivos de congelamento/degelo e preservar a atividade ideal. Por fim, deve-se tomar cuidado para garantir que todo o ECM seja solubilizado durante a incubação EDTA/PBS. A remoção incompleta do ECM pode resultar em enteróides que não conseguem reverter a polaridade. Se necessário, o período de incubação pode ser estendido para 1,5 h para garantir a remoção completa da matriz.

Embora este modelo NEC-in-a-dish apical-out seja econômico e simples, o método está sujeito a várias limitações. O NEC-in-a-dish não é tão fisiologicamente relevante quanto os modelos gut-on-a-chip28,29, mas representa uma opção intermediária onde e quando as opções de chip não são acessíveis. Além disso, como cultura de suspensão, os enteróides devem ser coletados, pelotados e resususpendidos para alterações de mídia, adicionando uma etapa de centrifugação a um processo simples. Outra limitação é a longevidade dos enteróides apical-out, pois geralmente são considerados adequados apenas para análises de ponto final. Como os receptores do fator de crescimento basolateral não estão mais em contato constante com fatores de crescimento da mídia, os enteróides apical-out são caracterizados pela redução da proliferação em comparação com os enteróides basolaterais, resultando na relativa incapacidade de passar culturas apical-out31,32. Além disso, não se sabe se a composição exata, incluindo as proporções relativas, dos tipos celulares são representados em enteróides em comparação com o tecido in vivo, mas estudos geralmente sugerem pequenas diferenças31,32. Finalmente, o desenvolvimento de 24 horas deste modelo NEC-em-prato apical-out, embora conveniente, pode ser relativamente breve em comparação com os modelos NEC baseados em fórmula in vivo 47, potencialmente exigindo padronização adicional se períodos mais longos de intervenção forem desejados.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar e não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial dos Institutos Nacionais de Saúde. O HC é apoiado pela concessão P20GM134973 dos Institutos Nacionais de Saúde. A KB é apoiada pela Fundação Hospitalar Infantil (CHF) e pela Fundação Presbiteriana de Saúde (PHF). Agradecemos ao Laboratório de Biologia Molecular e Pesquisa de Citometria da OUHSC pelo uso da Instalação Central, que forneceu imagens confocal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Fisher Scientific 15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Conical tube VWR 89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates Fisher Scientific 07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm Thermo Scientific 102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Scientific A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate Sigma-Aldrich AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer STEMCELL Technologies 36254
E-cadherin antibody (7H12) Novus Biologicals NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Millipore Sigma 1004960700
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5
ImageJ Fiji N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) STEMCELL Technologies 06010
Leica SP8 Confocal Microscope Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography Millipore Sigma L3012-10MG
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich 566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 Corning 21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue Fisher Scientific P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] Abcam ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg Bio-Techne 210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L Fisher Scientific 3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661) Thermo Scientific T3605
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap Thermo Scientific AB0350
Tween-20 Sigma-Aldrich 9005-64-5

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Medicina Edição 184
<em>In vitro </em> Modelo enteróide apical-out de enterocolite necrotizante
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Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H.… More

Burge, K., Wilson, A., Chaaban, H. In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (184), e64003, doi:10.3791/64003 (2022).

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