Summary
Микрогелевые стержни с комплементарными реакционноспособными группами получают с помощью микрофлюидики со способностью соединяться в водном растворе. Анизометрические микрогели заклинивают и соединяются в стабильные конструкции с большими порами по сравнению со сферическими системами. Микрогели, модифицированные с помощью GRGDS-PC, образуют макропористые 3D-конструкции, которые могут быть использованы для клеточной культуры.
Abstract
Двухкомпонентная система функционализированных микрогелей из микрофлюидики позволяет быстро соединяться в 3D макропористые конструкции в водных растворах без дополнительных добавок. Непрерывное фотоиницированное гелеобразование на кристалле позволяет изменять соотношение сторон микрогеля, что определяет свойства строительных блоков для полученных конструкций. Мономеры глицидилметакрилата (GMA) или 2-аминоэтилметакрилата (AMA) сополимеризуются в микрогелевую сеть на основе звездополимеров полиэтиленгликоля (PEG) для достижения эпоксидной или аминной функциональности. Фокусирующий поток масла вводится в микрофлюидную выходную структуру для обеспечения непрерывного сбора функционализированных микрогелевых стержней. Основываясь на недавней публикации, конструкции на основе микрогелевых стержней приводят к увеличению пор в несколько сотен микрометров и, в то же время, приводят к общей более высокой стабильности каркаса по сравнению со сферической моделью. Таким образом, можно производить конструкции большего объема с большим свободным объемом при одновременном уменьшении количества необходимого материала. Взаимосвязанные макропористые каркасы могут быть подобраны и транспортированы без повреждения или распада. Аминная и эпоксидная группы, не участвующие во взаимосвязи, остаются активными и могут использоваться независимо для постмодификации. Этот протокол описывает оптимизированный метод изготовления микрогелевых стержней для формирования макропористых взаимосвязанных каркасов, которые могут быть использованы для последующих клеточных экспериментов.
Introduction
Для изучения сложного кооперативного поведения клеток в 3D-конструкциях платформы каркасов должны демонстрировать последовательную производительность в воспроизводимости, иметь подходящую геометрию для миграции клеток и, в то же время, обеспечивать определенную гибкость с точки зрения изменения параметров для исследования их влияния на живую ткань1. В последние годы концепция макропористых отожженных частиц (MAP), впервые описанная Segura et al., превратилась в эффективную и универсальную платформу для производства 3D-лесов2. Индивидуальный состав микрогелей, которые являются строительными блоками конечного 3D-каркаса, предопределяет такие свойства, как жесткость конструкции, селективная химическая реакционная способность гелевой сети и конечный размер пор каркаса 2,3,4,5,6. Клеточные адгезивные пептиды в качестве сигналов для взаимодействия каркаса и клетки включены в полимерную сеть микрогелей, чтобы обеспечить прикрепление клеток, и могут быть изменены для исследования их специфического воздействия на клетки в культуре. 3D-каркасы стабилизируются путем соединения отожженных инъекционных микрогелей за счет ковалентных или супрамолекулярных связей, в результате чего образуются прочные и определенные конструкции для клеточной культуры 2,3,5,7,8.
Микрофлюидика зарекомендовала себя как один из наиболее точных и адаптируемых методов получения определенных гранулированных гидрогелей9. Возможность производства большего количества необходимых строительных блоков в непрерывном процессе при сохранении их химической, механической и физической монодисперсности существенно способствует пригодности этого процесса. Кроме того, размером и формой полученных микрогелей можно манипулировать различными методами, такими как периодические эмульсии, микрофлюидика, литография, электродинамическое напыление или механическая фрагментация, которые определяют геометрию строительных блоков и, таким образом, 3D-структуру конечного каркаса 1,10.
Недавно сообщалось о концепции макропористых 3D-каркасов, состоящих из функционализированных микрогелевых стержней, которые быстро соединяются в водных растворах без дальнейших добавок11. Анизотропия микрогелевых стержней привела к более высокой пористости и распределению пор с большими размерами пор по сравнению с использованием сферических микрогелей в этом исследовании11. Таким образом, меньшее количество материала создает более крупные поры с различными геометриями пор, сохраняя при этом стабильность 3D-каркаса. Система состоит из двух типов микрогелевых стержней с комплементарными первичными аминовыми и эпоксидными функциональными группами, которые потребляются в рамках взаимосвязанной реакции при контакте друг с другом. Функциональные группы, которые не участвуют в процессе взаимосвязи, остаются активными и могут быть использованы для селективной постмодификации с клеточными адгезивными пептидами или другими биологически активными факторами. Клетки фибробластов прикрепляются, распространяются и размножаются при культивировании внутри 3D-каркасов, сначала вырастая на поверхности микрогеля и заполняя большую часть макропор через 5 дней. Предварительное кокультурное исследование фибробластов человека и эндотелиальных клеток пупочных вен человека (HUVECs) показало многообещающие результаты для формирования сосудоподобных структур во взаимосвязанных 3D-каркасах11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Необходимый материал и препараты для микрофлюидики
- Для описанной микрофлюидной процедуры используют стеклянные шприцы 1 мл и 5 мл и шприцевые насосы. Образование капель на чипе наблюдается с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного высокоскоростной камерой.
- Создайте микрофлюидную конструкцию чипа (рисунок 1B) с помощью программного обеспечения для автоматизированного проектирования и создайте главный шаблон, как уже сообщалось12.
- Достигайте контролируемого УФ-облучения с помощью собственного УФ-светодиода (λ = 365 нм, диаметр пятна ~ 4,7 мм), обеспечивающего излучение при 957 мВт/см2 через покровное стекло толщиной 0,13 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывайте возможную локальную выработку тепла УФ-светодиодом во время облучения. В этом случае обеспечьте достаточное охлаждение внешним воздушным потоком.
2. Производство микрофлюидных устройств
ПРИМЕЧАНИЕ: Производство микрофлюидных устройств основано на предыдущей публикации13.
- Готовят 20 г смеси полидиметилсилоксана (PDMS) и отверждающего агента 10:1 (по массе). Энергично перемешать в течение 3 мин.
- Смешайте 60 мг масла Red O с 2,0 г толуола. Добавьте 50 мкл масла Red O в растворе толуола в смесь PDMS. Перемешивайте до однородного распределения цвета, чтобы уменьшить нежелательное рассеяние света и сохранить размер пятна сфокусированным во время гелеобразования на чипе.
- Удалите пузырьки, поместив смесь в осушитель, оснащенный вакуумным насосом.
- Отлить смесь PDMS в мастер-шаблон на высоту 5-5,5 мм и снова дегазировать.
- Дайте PDMS отверждаться в течение 18 ч при комнатной температуре, чтобы избежать деградации диазокрасителя.
- Вырежьте структуру PDMS и продувите входные и выходные отверстия в конструкции с помощью инструмента для отбора проб линейного керна (внутренний диаметр 0,77 мм, наружный диаметр 1,07 мм).
- Промыть PDMS и покрыть стекло изопропанолом и деионизированной водой несколько раз в 5 раз и, впоследствии, удалить жидкость через поток напорного воздуха или азота после каждого этапа промывки.
- Обработайте сухое стекло и PDMS вместе в плазменной печи при 0,2 мбар, с потоком кислорода 20 мл / мин в течение 60 с при 100 Вт, и соедините непосредственно, чтобы связать стекло и PDMS вместе, чтобы сформировать микрофлюидное устройство.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте изгиба структуры PDMS во время процесса связывания, чтобы свести к минимуму деформацию структуры канала. - Чтобы сделать каналы микрофлюидного чипа гидрофобными, поместите устройство вместе с 50 мкл трихлор-(1H,1 H,2 H,2 H-перфторктил)-силана в осушитель под вакуумом на ночь (закройте соединение с насосом после снижения давления паров). Промыть внешнюю часть прибора гидрофторэфиром.
ВНИМАНИЕ: Выполните эти шаги в вытяжной вытяжке и избегайте любого контакта с перфторсиланом. Используйте стеклянный вакуумный осушитель, герметичный смазкой. Тщательно очистите осушитель перед использованием в других целях.
3. Приготовление раствора для микрофлюидики
- Для непрерывной масляной фазы смешайте парафиновое масло и гексадекан (1:1 об/об) и добавьте 8% (мас./мас.) неионного поверхностно-активного вещества. Наполните один стеклянный шприц 1 мл (первое масло, рисунок 1) и один стеклянный шприц объемом 5 мл (второе масло, рисунок 1).
- Подготовьте растворы преполимеров для дисперсной фазы во флаконах из коричневого стекла для предотвращения разложения фотоинициатора и непреднамеренного гелеобразования.
- Раствор аминного компонента преполимера, содержащий GRGDS-PC
- Для раствора 300 мкл взвесьте 33,3 мг звездо-полиэтиленгликоль-акрилата (sPEG-AC) и 3,03 мг фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфината лития (LAP).
- Растворить 18,74 мг 2-аминоэтилметакрилата гидрохлорида (АМА) в 1,5 мл деионизированной воды и пропустить раствор через шприцевой фильтр (размер пор 0,20 мкм).
ПРИМЕЧАНИЕ: АМА является гигроскопичной и должна быть выброшена, как только твердое вещество образует комочки в контейнере для хранения. - Приготовьте стерильные 36 мМ аликвоты GRGDS-PC в воде и держите при температуре −20 °C до использования.
- Используйте 291,7 мкл раствора АМА для растворения sPEG-AC и LAP и добавьте 8,3 мкл раствора GRGDS-PC. Возьмите раствор стеклянным шприцем объемом 1 мл и защитите от света с помощью алюминиевой фольги.
- Раствор преполимера эпоксидных компонентов
- Для приготовления раствора 300 мкл взвесьте 33,3 мг звездчатого полиэтиленгликоля-акрилата (sPEG-AC), 3,03 мг LAP и растворите в 300 мкл деионизированной воды. Добавьте 2,4 мг глицидилметакрилата (GMA).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сильное встряхивание ускоряет растворение ГМА. Возьмите раствор стеклянным шприцем объемом 1 мл и защитите от света с помощью алюминиевой фольги.
- Для приготовления раствора 300 мкл взвесьте 33,3 мг звездчатого полиэтиленгликоля-акрилата (sPEG-AC), 3,03 мг LAP и растворите в 300 мкл деионизированной воды. Добавьте 2,4 мг глицидилметакрилата (GMA).
- Раствор аминного компонента преполимера, содержащий GRGDS-PC
4. Производство и очистка аминных и эпоксидных функционализированных микрогелевых стержней
Рисунок 1: Расположение микрофлюидного узла гелеобразования на кристалле. (A) Вид спереди и угловой вид расположения компонентов во время микрофлюидики. (B) Микрофлюидная конструкция чипа, используемая для гелеобразования микрогелевых стержней. (1) Полиэтиленовая трубка к первому входному отверстию масла. (2) Светонепроницаемая полиэтиленовая трубка на входе дисперсной фазы. (3) Полиэтиленовая трубка ко второму входному отверстию масла. (4) Полиэтиленовая трубка от выхода до контейнера для сбора продукта. (5) УФ-лампа и место облучения на прямом канале 80 мкм вблизи выходного отверстия. (6) Объективная/наблюдательная позиция микроскопа. (7) Цветной компонент PDMS микрофлюидного устройства. (8) Закройте стекло, прикрепленное к PDMS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Вставьте иглы в полиэтиленовые трубки и удалите газ из шприца и трубки.
- Вставьте полиэтиленовую трубку в розетку для сбора продукта.
- Поместите все стеклянные шприцы в шприцевые насосы и вставьте каждый конец трубки в соответствующее входное отверстие (рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите трубку преполимера от света с помощью алюминиевой фольги или черной трубки, чтобы избежать непреднамеренного гелеобразования. - Наведите микроскоп на поперечное сечение масло-вода.
- Запустите первый масляный шприцевой насос (расход = 100-200 мкл/ч), чтобы сначала заполнить канал маслом, чтобы предотвратить смачивание канала дисперсной фазой.
- Уменьшите первый расход масла до 30 мкл/ч и запустите шприцевый насос преполимера (расход = 100-200 мкл/ч) до тех пор, пока дисперсная водная фаза не будет наблюдаться на поперечном сечении.
- Установите скорость потока преполимера на 30 мкл/ч и сфокусируйте микроскоп на выходе.
- Запустите второй масляный шприцевой насос (расход 300 мкл/ч) и подождите, пока режим потока стабилизируется.
- Поместите выпускную трубку в контейнер для сбора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите конец трубки в верхнюю часть контейнера, чтобы избежать повышения давления из-за накопления продукта с течением времени. - Установите систему УФ-облучения таким образом, чтобы интенсивность излучения находилась в диапазоне 900-1000 мВт/см2 (используемое излучение = 957 мВт/см2), а пятно облучения находилось в прямой канальной части перед выходом (рисунок 1В).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы не облучаете вблизи поперечного сечения масла и воды, чтобы избежать засорения канала. Для дополнительной защиты накройте канальные конструкции перед местом облучения в верхней части блока. - Перед УФ-облучением отрегулируйте скорость потока преполимера и первого масла для достижения желаемого соотношения сторон в диапазоне от 3,0 до 4,5, и установите время облучения дисперсной фазы на ~2,3 с, в зависимости от размера точки облучения.
- Начните УФ-облучение и при необходимости снова отрегулируйте скорость потока в соответствии с предыдущим подразделом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за производством в начале и следите за стабильным поведением потока на выходе и однородностью микрогелевых стержней. Второй поток масла может быть отрегулирован для оптимизации транспортировки продукта в пределах выхода. - Измените контейнер сбора и запишите время начала сбора продукта и скорость потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите продукт от пыли. Прекратите собирать до того, как какой-либо шприц закончится раствором. - Чтобы завершить сбор, удалите контейнер коллекции, отметив время. Остановите облучение и все шприцевые насосы.
- Затем промыть продукт по 5 раз н-гексаном, изопропанолом и деионизированной водой. Удалить надосадочный наполнитель после стержневого осаждения.
ПРИМЕЧАНИЕ: После каждого добавления раствора тщательно диспергируйте продукт и подождите 10 мин перед заменой растворителя, учитывая молекулярную диффузию. Постепенно заменяйте изопропанол водой, чтобы стержни не всплывали на поверхность жидкости. Несколько дополнительных этапов промывки водой уменьшают оставшиеся следы изопропанола.
5. Формирование макропористых лесов
- Определите количество микрогелевых стержней на объем дисперсии для эпоксидных и аминно-функционализированных образцов.
- Отрегулируйте количество эпоксидных и аминных функционализированных образцов путем разбавления или концентрации до аналогичного значения между 1000-5000 стержней на 100 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте центрифугу при ~2000 х г в течение 5-10 с, чтобы ускорить осаждение микрогелевых стержней. Если количество стержней на объем дисперсии низкое, взаимосвязь стержней может привести к меньшим кластерам стержней вместо одной стабильной конструкции. Если количество стержней на объем дисперсии велико, качество смешивания двух компонентов будет нарушено. - Перенесите дисперсию первого компонента (~1 200 стержней) в конический прозрачный флакон объемом 1,5 мл или 2 мл.
- Добавьте второй компонент контролируемым образом в непрерывной работе (пипетка 100 мкл). После добавления перемешайте содержимое непосредственно с помощью пипетки, чтобы взять жидкость и добавить ее снова. Взаимосвязанная структура образуется в течение нескольких секунд во время смешивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вместо одной когерентной структуры образуется несколько кластеров, перепроверьте количество микрогелевых стержней на объем или обеспечьте более контролируемое смешивание двух компонентов.
6. Клеточный клей после модификации
- Рассчитать теоретическое число эпоксидных групп во взаимосвязанной структуре на основе расхода дисперсной полимерной фазы, количества микрогелей, собранных в течение определенного времени, и коэффициента разбавления дисперсии микрогеля, используемой для формирования каркаса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аппроксимируйте теоретическое число эпоксидных групп на каркас по следующему уравнению.
nth: Теоретическое количество вещества
cGMA: концентрация ГМА в растворе преполимера
Q: Расход раствора преполимера - Добавить раствор GRGDS-PC во взаимосвязанную структуру для изменения всех оставшихся эпоксидных групп клеточным адгезивным пептидом, содержащим свободный амин и тиол (n[теоретические эпоксидные группы]/n[GRGDS-PC] = 1). Оставить при комнатной температуре на ночь.
- Удалите непрореагировавшие молекулы, промыв деионизированной водой и удалив супернатант.
7. Стерилизация и перенос в клеточные питательные среды
- Уменьшите уровень воды, чтобы просто погрузить взаимосвязанные леса.
- Открыть флакон и облучить ультрафиолетовым светом λ = 250-300 нм. Закройте флакон и переложите флакон на чистую скамейку. Промыть 1x стерильной водой.
- Замените воду во флаконе средой для культивирования клеток и обеспечьте уравновешивание в течение 5 минут. Повторите это со свежими клеточными культуральными средами 2x.
- Переложите макропористый каркас в пластину колодца клеточной культуры для эксперимента путем заливки или с помощью шпателя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 2: Макропористая сшитая структура каркаса. (A) 3D-проекция 500 мкм конфокальной микроскопии Z-стека взаимосвязанного макропористого каркаса. Шкала представляет собой 500 мкм. (B) Взаимосвязанный каркас, состоящий из ~ 10 000 микрогелевых стержней на покровном стекле, взятом непосредственно из воды. Шкала представляет 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Этот протокол приводит к стабильной 3D-макропористой конструкции, состоящей из взаимосвязанных аминов и эпоксидных функционализированных микрогелевых стержней (рисунок 2A). Конструкция должна демонстрировать компактную геометрию, если используется описанный тип перемешивания, который формируется в течение 2 с или 3 с (рисунок 2В).
Стабильность взаимосвязанной конструкции зависит от микрогелевых стержневых строительных блоков, из которых она состоит. Аминофункциональные микрогелевые стержни демонстрируют среднюю жесткость 2,0 ± 0,2 кДа, определяемую наноиндентированием (рисунок 3А). Если стержни слишком мягкие, взаимосвязанная макропористая структура может быть не достигнута из-за деформации строительных блоков. Для обнаружения активных функциональных групп изотиоцианат флуоресцеина (FITC) может быть использован для визуализации первичных аминогрупп, а изомер амина флуоресцеина I может быть использован для маркировки эпоксидных групп (рисунок 3B, C). Стержни аминного микрогеля имеют размеры со средней длиной 553 мкм ± 29 мкм и средней шириной 193 мкм ± 7 мкм в деионизированной воде, что приводит к соотношению сторон ~3,0 и уменьшению объема (коллапсу) на ~73% от их размера в клеточной культуральной среде11.
Рисунок 3: Свойства микрогеля. (A) Эффективный модуль Юнга аминных и эпоксидных микрогелевых стержней вместе с аминными и эпоксидными микрогелевыми сферами, измеренными наноиндентированием. Данные отображаются в виде прямоугольного графика, простирающегося от 25-го до 75-го процентиля, причем усы достигают от 5% до 95% квантилей. Линии внутри квадратов представляют медианы, пустые квадраты указывают на средние, а черные квадраты представляют выбросы (n = 40; p-значения рассчитываются с использованием односторонней ANOVA с поправкой Бонферрони, **p < 0,01, ****p < 0,0001). (B) Вверху: Конфокальное микроскопическое изображение стержня аминного микрогеля, функционализированного FITC, и эпоксидного микрогелевого стержня, функционализированного изомером флуоресцеина амина I. Внизу: Соответствующие яркие изображения поля. Все шкалы представляют 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Как описано в соответствующей публикации, сфероподобные микрогели, полученные одним и тем же методом, приводят к образованию нескольких взаимосвязанных кластеров, а не к одному стабильному макропористому каркасу11. Более высокое соотношение сторон микрогелевых стержней обеспечивает лучшую общую стабильность за счет более эффективного соединения структуры в 3D (рисунок 4).
Рисунок 4: Влияние соотношения сторон на формирование структуры. (А) Яркое полевое изображение взаимосвязанной конструкции, состоящей из микрогелевых стержней. (B) Яркое полевое изображение взаимосвязанных кластеров, состоящих из сферообразных микрогелей. Шкалы представляют 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Средние значения макропор в каркасах, состоящих из микрогелевых стержней, составляют 100 мкм, причем 90% размеров пор колеблется от 30 мкм до более 150 мкм11. Сфероподобные микрогели приводят к кластерам с размерами пор от ~ 10 мкм до 55 мкм, со средним значением около 22 мкм11. Это согласуется с цифрами, сообщенными другими исследованиями, готовящими MAP на основе сферических микрогелей 2,4,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одним из критических шагов в этом протоколе является качество 2-аминоэтилметакрилата (АМА), используемого в качестве сомономера для функционализации первичного амина. АМА должен представлять собой мелкозернистый и предпочтительно бесцветный порошок, поставляемый в газонепроницаемом коричневом стеклянном контейнере. Следует избегать использования зеленоватого и комковатого материала, так как он значительно ухудшает реакцию гелеобразования и негативно влияет на воспроизводимость результатов. В случае плохого гелеобразования и нестабильных микрогелевых стержней можно рассмотреть вопрос о смене поставщика.
Если смешивание аминных и эпоксидных микрогелевых стержней приводит к образованию нескольких взаимосвязанных кластеров, а не к одной стабильной структуре, проверьте количество стержней в каждой дисперсии запаса и установите его на аналогичное значение в диапазоне 1000-5000 стержней / 100 мкл для обоих образцов. Если размеры микрогеля значительно отличаются от значений, упомянутых здесь, отрегулируйте количество микрогелевых стержней к объемной доле. Увеличьте количество на объем, если гели меньше, и уменьшите количество в обратном случае.
Описанный способ не был сосредоточен на оптимизации процесса смешивания, чтобы иметь более контролируемую сборку двух взаимодополняющих функционализированных компонентов смешивания. Поскольку взаимосвязь происходит в течение нескольких секунд, общий объем дисперсии, образующей одну взаимосвязанную конструкцию, и объемные фракции используемых микрогелей корректируются для получения стабильных макропористых структур путем простого пипетирования двух компонентов один за другим. В будущем было бы целесообразно проанализировать свойства потока и смешивания дисперсий микрогелевых стержней и получить дополнительное представление о структуре формирования каркасов. Более контролируемое смешивание двух взаимосвязанных микрогелевых компонентов может обеспечить автоматизированное и высокопроизводительное формирование этих макропористых каркасов и обеспечить постепенный рост конструкции.
Поскольку взаимосвязь протекает очень быстро, поры каркаса создаются во время перемешивания. Если бы микрогелевые стержни были сначала полностью осаждены до химического соединения, можно было бы ожидать гораздо более высокого соотношения укладки и глушения. Таким образом, взаимосвязанная кинетика, вероятно, окажет большое влияние на образование MAP и результирующую пористость и размеры пор. Клеточно-адгезивная функционализация путем постмодификации или включения в гелевую сеть во время приготовления микрогеля показала, что L929 и клетки фибробластов человека сначала прикрепляются и распространяются по поверхности микрогелевых стержней, а затем заполняют большую часть макропор через 5-7 дней в культуре11. Благодаря размерам пор преимущественно от 30 мкм до более 150 мкм и взаимосвязанной структуре пор, подтвержденной конфокальной микроскопией, засеянные клетки могут легко проникать во взаимосвязанный каркас11. До сих пор эти каркасы на основе микрогелевых стержней использовались для выращивания клеток фибробластов и HUVEC в совместной культуре. HUVECs, посеянные после 14 дней культуры клеток фибробластов, сформировали первые удлиненные сосудоподобные структуры в течение следующих 16 дней11. Изучение других типов клеток в кокультурах еще предстоит решить в будущем. Чтобы ячейки можно было добавлять непосредственно в систему во время формирования каркасов, требуется быстрая взаимосвязь стержней в клеточно-совместимых буферах или питательных средах, что позволит распространить эту систему на платформы биопечати.
Неинъекционные макропористые 3D-каркасы также могут быть созданы различными альтернативными методами, такими как литье растворителем, сублимационная сушка, газовое вспенивание твердых частиц, электроспиннинг или 3D-печать 1,15,16. Миграция и пролиферация клеток могут легко происходить без необходимости предварительно разрушать каркас, если требуемая геометрия пор и проницаемость были достигнуты по всей сети. 3D-печать с использованием заклинивающих, экструдируемых биочернил из микрогелевых сфер на основе ПЭГ-, агарозы и норборнена-модифицированных гиалуроновой кислоты сочетает в себе технологии MAP и 3D-печати, контролируя пористость между отожженными микрогелями, а также геометрию общей печатной структуры17.
По сравнению с альтернативными существующими методами, полученные каркасы демонстрируют широкий спектр 3D-макропорной геометрии из-за более высокого соотношения сторон микрогелевых строительных блоков и их взаимосвязанной двухкомпонентной конфигурации11. Использование микрогелевых стержней создает большую пористость и, таким образом, больше пространства для клеточных взаимодействий по сравнению со сборкой сферических микрогелей. Это имеет решающее значение для формирования биологической ткани, поскольку усиливает взаимодействие клеток с клетками. При этом меньше материала можно использовать для получения макропористых каркасов тех же объемов, сохраняя при этом стабильность конструкции. Уменьшение материала каркаса полезно, так как для формирования тканей предусмотрено больше открытого пространства, и меньше материала должно быть деградировано, что важно как для применений in vitro , так и in vivo . Биофункционализация микрогелей может быть распространена на другие типы пептидов и биологически активные факторы. Полученные стабильные макропористые каркасы требуют меньше материала для создания большей пористости. Вместе с настраиваемостью системы этот метод предлагает высокий потенциал в качестве универсальной платформы для клеточной культуры в 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы уверяют, что конфликта интересов нет.
Acknowledgments
Мы выражаем благодарность соавторам нашей предыдущей работы, на которой основана эта методология, Селин Бастард, Луису. Б. Герцони, Йонке Киттель, Ростиславу Винокуру, Николаю Борну и Тамашу Харашти. Мы с благодарностью отмечаем финансирование со стороны Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) в рамках проекта B5 и C3 SFB 985 «Функциональные микрогели и микрогелевые системы». Мы признаем финансирование со стороны Комитета по конкуренции Сената Лейбница (SAW) в рамках программы Professorinnen (SAW-2017-PB62: BioMat). Мы искренне приветствуем финансирование со стороны Европейской комиссии (EUSMI, 731019). Эта работа была выполнена частично в Центре химических полимерных технологий (CPT), который был поддержан ЕС и федеральной землей Северный Рейн-Вестфалия (грант EFRE 30 00 883 02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Hsu, R. -S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Chen, Z., et al. Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere. Exploration. 1 (3), 20210036 (2021).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Guerzoni, L. P. B., et al. Cell encapsulation in soft, anisometric poly(ethylene) glycol microgels using a novel radical-free microfluidic system. Small. 15 (20), 1900692 (2019).
- Krüger, A. J. D., et al. Compartmentalized jet polymerization as a high-resolution process to continuously produce anisometric microgel rods with adjustable size and stiffness. Advanced Materials. 31 (49), 1903668 (2019).
- Darling, N. J., et al. Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Lutzweiler, G., Ndreu Halili,, Engin Vrana, N. The overview of porous, bioactive scaffolds as instructive biomaterials for tissue regeneration and their clinical translation. Pharmaceutics. 12 (7), 602 (2020).
- Dang, H. P., et al. 3D printed dual macro-, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function. Biofabrication. 11 (3), 035014 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
