Summary
يتم إنتاج قضبان Microgel مع مجموعات تفاعلية تكميلية عبر الموائع الدقيقة مع القدرة على الترابط في محلول مائي. تتكدس الهلاميات الدقيقة متباينة القياس وتترابط في تركيبات مستقرة ذات مسام أكبر مقارنة بالأنظمة الكروية. Microgels المعدلة مع GRGDS-PC شكل هياكل 3D كبيرة يسهل اختراقها التي يمكن استخدامها لزراعة الخلايا.
Abstract
يسمح نظام مكون من عنصرين من الهلاميات الدقيقة الوظيفية من الموائع الدقيقة بالربط السريع في التركيبات الكبيرة 3D في المحاليل المائية دون مزيد من الإضافات. يتيح الهلام المستمر على الرقاقة التي يتم تشغيلها ضوئيا تغيير نسبة العرض إلى الارتفاع microgel ، والتي تحدد خصائص لبنة البناء للتركيبات التي تم الحصول عليها. يتم بلمرة مونومرات جليسيديل ميثاكريلات (GMA) أو مونومرات 2-أمينو إيثيل ميثاكريلات (AMA) في شبكة ميكروجيل تعتمد على بوليمرات نجوم البولي إيثيلين جلايكول (PEG) لتحقيق وظائف الإيبوكسي أو الأمين. يتم إدخال تدفق زيت مركز في هيكل مخرج الموائع الدقيقة لضمان التجميع المستمر لقضبان الميكروجيل الوظيفية. استنادا إلى منشور حديث ، تؤدي التركيبات القائمة على قضيب microgel إلى مسام أكبر تبلغ عدة مئات من الميكرومترات ، وفي الوقت نفسه ، تؤدي إلى استقرار سقالة أعلى بشكل عام مقارنة بالنموذج الكروي. بهذه الطريقة ، من الممكن إنتاج تركيبات ذات حجم أكبر مع حجم أكبر مع تقليل كمية المواد المطلوبة. يمكن التقاط السقالات الكبيرة المترابطة ونقلها دون تلف أو تفكك. تظل مجموعات الأمين والإيبوكسي غير المشاركة في الربط البيني نشطة ويمكن استخدامها بشكل مستقل للتعديل اللاحق. يصف هذا البروتوكول طريقة محسنة لتصنيع قضبان microgel لتشكيل سقالات مترابطة كبيرة يسهل اختراقها والتي يمكن استخدامها في تجارب الخلايا اللاحقة.
Introduction
لدراسة سلوك الخلية التعاونية المعقدة في بنيات 3D ، تحتاج منصات السقالة إلى إظهار أداء ثابت في قابلية التكاثر ، ولديها هندسة مناسبة لهجرة الخلايا ، وفي الوقت نفسه ، تسمح ببعض المرونة من حيث تغيير المعلمات للتحقيق في تأثيرها على الأنسجة الحية1. في السنوات الأخيرة ، تطور مفهوم الجسيمات الملدنة الكبيرة التي يسهل اختراقها (MAP) ، والتي وصفها Segura et al. لأول مرة ، إلى منصة فعالة ومتعددة الاستخدامات لإنتاج سقالة ثلاثية الأبعاد2. يحدد التركيب المخصص للكبسولات الهلامية الدقيقة ، والتي تعد اللبنات الأساسية للسقالة ثلاثية الأبعاد النهائية ، خصائص مثل صلابة البناء ، والتفاعل الكيميائي الانتقائي لشبكة الهلام ، وحجم المسام النهائي للسقالة2،3،4،5،6. يتم دمج الببتيدات اللاصقة الخلوية كإشارات لتفاعلات خلايا السقالة في شبكة البوليمر الخاصة بالكبسولات الهلامية الدقيقة للسماح بارتباط الخلية ويمكن تنوعها للتحقيق في آثارها المحددة على الخلايا في الثقافة. يتم تثبيت السقالات ثلاثية الأبعاد عن طريق ربط الهلاميات الدقيقة القابلة للحقن الملدنة بسبب الروابط التساهمية أو فوق الجزيئية ، مما ينتج عنه تركيبات قوية ومحددة لزراعة الخلايا2،3،5،7،8.
أثبتت Microfluidics نفسها كواحدة من أكثر الطرق دقة وقابلية للتكيف لإعداد الهلاميات المائية الحبيبية المحددة9. إن إمكانية إنتاج كميات أكبر من اللبنات الأساسية المطلوبة في عملية مستمرة مع الحفاظ على تشتتها الأحادي الكيميائي والميكانيكي والمادي يساهم بشكل كبير في ملاءمة هذه العملية. علاوة على ذلك ، يمكن التلاعب بحجم وشكل الهلاميات الدقيقة المنتجة بطرق مختلفة مثل مستحلبات الدفعات ، أو الموائع الدقيقة ، أو الطباعة الحجرية ، أو الرش الكهروديناميكي ، أو التجزئة الميكانيكية ، والتي تحدد هندسة اللبنات الأساسية ، وبالتالي ، الهيكل ثلاثي الأبعاد للسقالة النهائية1،10.
في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن مفهوم السقالات 3D التي يسهل اختراقها والتي تتكون من قضبان microgel وظيفية تتشابك بسرعة في المحاليل المائية دون مزيد من الإضافات11. أدى تباين الخواص لقضبان الميكروجيل إلى مسامية أعلى وتوزيعات مسام بأحجام مسام أكبر مقارنة باستخدام الهلاميات الدقيقة الكروية في هذه الدراسة11. بهذه الطريقة ، تخلق المواد الأقل مسام أكبر مع مجموعة متنوعة من أشكال هندسة المسام المختلفة مع الحفاظ على استقرار سقالة 3D. يتكون النظام من نوعين من قضبان microgel مع مجموعات وظيفية أمينية وإيبوكسي أولية تكميلية يتم استهلاكها داخل تفاعل الترابط عند ملامستها لبعضها البعض. تظل المجموعات الوظيفية التي لا تشارك في عملية الربط نشطة ويمكن استخدامها للتعديل الانتقائي اللاحق مع الببتيدات اللاصقة للخلية أو غيرها من العوامل النشطة بيولوجيا. تلتصق الخلايا الليفية وتنتشر وتتكاثر عند زراعتها داخل سقالات 3D ، وتنمو أولا على سطح الهلام الدقيق وتملأ معظم المسام الكبيرة بعد 5 أيام. أظهرت دراسة أولية للاستزراع المشترك للخلايا الليفية البشرية والخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) نتائج واعدة لتشكيل هياكل تشبه الأوعية داخل السقالات 3D المترابطة11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. المواد المطلوبة والاستعدادات للموائع الدقيقة
- لإجراء الموائع الدقيقة الموصوفة ، استخدم محاقن زجاجية سعة 1 مل و 5 مل ومضخات حقنة. تتم ملاحظة تكوين القطيرات على الرقاقة عبر مجهر مقلوب مزود بكاميرا عالية السرعة.
- قم بإنشاء تصميم رقاقة الموائع الدقيقة (الشكل 1 ب) باستخدام برنامج تصميم بمساعدة الكمبيوتر وإنتاج قالب رئيسي كما ورد بالفعل12.
- تحقيق الأشعة فوق البنفسجية الخاضعة للرقابة باستخدام الأشعة فوق البنفسجية LED ذاتية البناء (λ = 365 نانومتر ، قطر البقعة ~ 4.7 مم) مما يوفر الإشعاع عند 957 ميجاوات / سم2 من خلال غطاء زجاجي بسمك 0.13 مم.
ملاحظة: ضع في اعتبارك إمكانية توليد الحرارة المحلية بواسطة UV-LED أثناء التشعيع. إذا كانت هذه هي الحالة ، فتأكد من التبريد الكافي عن طريق تدفق الهواء الخارجي.
2. إنتاج جهاز الموائع الدقيقة
ملاحظة: يعتمد إنتاج جهاز الموائع الدقيقة على منشور سابق13.
- تحضير 20 غرام من خليط 10: 1 (بالكتلة) من بوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) وعامل المعالجة. تخلط بقوة لمدة 3 دقائق.
- مزيج 60 ملغ من النفط الأحمر O في 2.0 غرام من التولوين. أضف 50 ميكرولتر من الزيت الأحمر O في محلول التولوين إلى خليط PDMS. امزج حتى يكون هناك توزيع متجانس للألوان لتقليل تشتت الضوء غير المرغوب فيه والحفاظ على تركيز حجم البقعة أثناء الهلام على الرقاقة.
- قم بإزالة الفقاعات عن طريق وضع الخليط في مجفف مجهز بمضخة تفريغ.
- صب خليط PDMS في القالب الرئيسي على ارتفاع 5-5.5 مم وإزالة الغازات مرة أخرى.
- اسمح ل PDMS بالمعالجة لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة لتجنب تدهور صبغة ديازو.
- قم بقطع هيكل PDMS وثقب فتحات المدخل والمخرج في الهيكل باستخدام أداة أخذ العينات الأساسية للخط (القطر الداخلي 0.77 مم ، القطر الخارجي 1.07 مم).
- اغسل PDMS وقم بتغطية الزجاج بالإيزوبروبانول والماء منزوع الأيونات بشكل متكرر 5x ، وبعد ذلك ، قم بإزالة السائل عن طريق الهواء المضغوط أو تدفق النيتروجين بعد كل خطوة غسيل.
- عالج الزجاج الجاف و PDMS معا في فرن بلازما عند 0.2 ملي بار ، مع تدفق أكسجين 20 مل / دقيقة لمدة 60 ثانية عند 100 واط ، وقم بتوصيله مباشرة لربط الزجاج و PDMS معا لتشكيل جهاز الموائع الدقيقة.
ملاحظة: تجنب ثني بنية PDMS أثناء عملية الربط لتقليل تشوه بنية القناة. - لجعل قنوات رقاقة الموائع الدقيقة كارهة للماء ، ضع الجهاز مع 50 ميكرولتر من ثلاثي كلورو- (1 H ، 1 H ، 2 H ، 2 H-perfluoroctyl) - silane في مجفف تحت فراغ طوال الليل (أغلق الاتصال بالمضخة بعد تقليل ضغط البخار). شطف الجزء الخارجي من الجهاز مع هيدروفلوروإيثر.
تنبيه: نفذ هذه الخطوات في غطاء الدخان وتجنب أي اتصال مع سيلان بيرفلورو. استخدم مجفف فراغ زجاجي مختوم بالشحم. نظف المجفف جيدا قبل استخدامه لأغراض أخرى.
3. إعداد الحل للموائع الدقيقة
- بالنسبة لمرحلة الزيت المستمرة ، امزج زيت البارافين وهيكساديكان (1: 1 فولت / فولت) وأضف 8٪ (وزن / وزن) من خافض للتوتر السطحي غير الأيوني. املأ حقنة زجاجية واحدة سعة 1 مل (الزيت الأول ، الشكل 1) وحقنة زجاجية واحدة سعة 5 مل (الزيت الثاني ، الشكل 1).
- تحضير محاليل ما قبل البوليمر لمرحلة التشتت في قوارير زجاجية بنية لمنع تحلل البادئ الضوئي والهلام غير المقصود.
- محلول أمين مكون من البوليمر المسبق يحتوي على GRGDS-PC
- للحصول على محلول 300 ميكرولتر ، قم بوزن 33.3 مجم من نجمة البولي إيثيلين جلايكول أكريلات (sPEG-AC) و 3.03 مجم من ليثيوم فينيل -2،4،6-ثلاثي ميثيل بنزويل فوسفينات (LAP).
- قم بإذابة 18.74 مجم من 2-أمينو إيثيل ميثاكريلات هيدروكلوريد (AMA) في 1.5 مل من الماء منزوع الأيونات ومرر المحلول من خلال مرشح حقنة (حجم المسام 0.20 ميكرومتر).
ملاحظة: AMA استرطابي ويجب التخلص منه بمجرد أن تتشكل المواد الصلبة في حاوية التخزين. - تحضير القسمة المعقمة 36 mM GRGDS-PC في الماء والاحتفاظ بها عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- استخدم 291.7 ميكرولتر من محلول AMA لإذابة sPEG-AC و LAP ، وأضف 8.3 ميكرولتر من محلول GRGDS-PC. تناول المحلول باستخدام حقنة زجاجية سعة 1 مل وحمايته من الضوء باستخدام ورق الألمنيوم.
- محلول إيبوكسي مكون بريبوليمر
- بالنسبة لمحلول 300 ميكرولتر ، قم بوزن 33.3 مجم من نجمي البولي إيثيلين جلايكول أكريليت (sPEG-AC) ، و 3.03 مجم من LAP وتذوب في 300 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. أضف 2.4 ملغ من جليسيديل ميثاكريلات (GMA).
ملاحظة: الاهتزاز القوي يسرع من ذوبان GMA. تناول المحلول باستخدام حقنة زجاجية سعة 1 مل وحمايته من الضوء باستخدام ورق الألمنيوم.
- بالنسبة لمحلول 300 ميكرولتر ، قم بوزن 33.3 مجم من نجمي البولي إيثيلين جلايكول أكريليت (sPEG-AC) ، و 3.03 مجم من LAP وتذوب في 300 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. أضف 2.4 ملغ من جليسيديل ميثاكريلات (GMA).
- محلول أمين مكون من البوليمر المسبق يحتوي على GRGDS-PC
4. إنتاج وتنقية قضبان ميكروجيل أمينية وإيبوكسي
الشكل 1: ترتيب مجموعة الهلام على الرقاقة الموائع الدقيقة. (أ) منظر أمامي ومنظر زاوي لترتيب المكونات أثناء الموائع الدقيقة. (ب) تصميم رقاقة الموائع الدقيقة المستخدمة في الهلام على الرقاقة لقضبان الميكروجيل. (1) أنبوب PE إلى مدخل الزيت الأول. (2) أنبوب PE المحمي بالضوء إلى مدخل مرحلة التفريق. (3) أنبوب PE إلى مدخل الزيت الثاني. (4) أنبوب PE من المخرج إلى حاوية تجميع المنتجات. (5) مصباح الأشعة فوق البنفسجية وموقع التشعيع على قناة 80 ميكرومتر المستقيمة بالقرب من المخرج. (6) هدف المجهر / موقف الرصد. (7) مكون PDMS الملون لجهاز الموائع الدقيقة. (8) غطاء الزجاج المستعبدين إلى PDMS. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
- أدخل الإبر في أنابيب PE وأزل الغاز من المحقنة والأنبوب.
- أدخل أنبوب PE في المخرج لجمع المنتج.
- ضع جميع المحاقن الزجاجية في مضخات المحاقن وأدخل كل طرف أنبوب في المدخل المقابل (الشكل 1).
ملاحظة: احم أنبوب البوليمر المسبق من الضوء عبر رقائق الألومنيوم أو أنبوب أسود لتجنب الهلام غير المقصود. - ركز المجهر على المقطع العرضي للزيت والماء.
- ابدأ أول مضخة حقنة زيت (معدل التدفق = 100-200 ميكرولتر / ساعة) لملء القناة بالزيت أولا لمنع ترطيب القناة بمرحلة التفريق.
- قم بتقليل معدل تدفق الزيت الأول إلى 30 ميكرولتر / ساعة وابدأ تشغيل مضخة حقنة البوليمر المسبق (معدل التدفق = 100-200 ميكرولتر / ساعة) حتى يمكن ملاحظة المرحلة المائية المشتتة عند المقطع العرضي.
- اضبط معدل تدفق البوليمر المسبق على 30 ميكرولتر / ساعة وركز المجهر على المخرج.
- ابدأ تشغيل مضخة حقنة الزيت الثانية (معدل تدفق 300 ميكرولتر / ساعة) وانتظر حتى يستقر نظام التدفق.
- ضع أنبوب المخرج في حاوية تجميع.
ملاحظة: ضع نهاية الأنبوب في الجزء العلوي من الحاوية لتجنب زيادة الضغط بسبب تراكم المنتج بمرور الوقت. - اضبط نظام التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية بحيث يكون الإشعاع في حدود 900-1000 ميجاوات / سم 2 (الإشعاع المستخدم = 957 ميجاوات / سم2) وتكون بقعة التشعيع في جزء القناة المستقيمة قبل المخرج (الشكل 1 ب).
ملاحظة: تأكد من عدم التشعيع بالقرب من المقطع العرضي للزيت والماء لتجنب انسداد القناة. لمزيد من الحماية ، قم بتغطية هياكل القناة قبل بقعة التشعيع في الجزء العلوي من الوحدة. - قبل تشعيع الأشعة فوق البنفسجية ، اضبط معدلات تدفق البوليمر المسبق والزيت الأول لتحقيق نسبة العرض إلى الارتفاع المطلوبة في النطاق من 3.0 إلى 4.5 ، واضبط وقت التشعيع للمرحلة المشتتة على ~ 2.3 ثانية ، اعتمادا على حجم بقعة التشعيع.
- ابدأ تشعيع الأشعة فوق البنفسجية ، وإذا لزم الأمر ، اضبط معدلات التدفق مرة أخرى وفقا للقسم الفرعي السابق.
ملاحظة: راقب الإنتاج في البداية وراقب سلوك التدفق المستقر في المخرج وتوحيد قضبان الميكروجيل. يمكن تعديل تدفق الزيت الثاني لتحسين نقل المنتج داخل المخرج. - قم بتغيير حاوية التجميع ولاحظ وقت بدء مجموعة المنتجات ومعدلات التدفق.
ملاحظة: حماية المنتج من الغبار. توقف عن التجميع قبل أن ينفد أي محلول من المحقنة. - لإنهاء المجموعة ، قم بإزالة حاوية المجموعة ، مع ملاحظة الوقت. وقف التشعيع وجميع مضخات المحاقن.
- اغسل المنتج بعد ذلك 5 مرات لكل منهما ب n-hexane و isopropanol والماء منزوع الأيونات. قم بإزالة المادة الطافية بعد ترسيب القضيب.
ملاحظة: بعد كل إضافة محلول ، قم بتفريق المنتج بعناية وانتظر 10 دقائق قبل استبدال المذيب ، مع مراعاة الانتشار الجزيئي. استبدل الأيزوبروبانول تدريجيا بالماء لمنع القضبان من الطفو على سطح السائل. خطوات غسيل إضافية متعددة بالماء تقلل من آثار الأيزوبروبانول المتبقية.
5. تشكيل سقالة كبيرة يسهل اختراقها
- حدد عدد قضبان الميكروجيل لكل حجم تشتت للعينات الوظيفية الإيبوكسي والأمين.
- اضبط عدد العينات الوظيفية للإيبوكسي والأمين عن طريق التخفيف أو التركيز إلى قيمة مماثلة بين 1000-5000 قضيب / 100 ميكرولتر.
ملاحظة: استخدم جهاز طرد مركزي عند ~ 2000 × جم لمدة 5-10 ثوان لتسريع ترسيب قضبان الميكروجيل. إذا كان عدد القضبان لكل حجم تشتت منخفضا ، فقد يؤدي ربط القضبان إلى مجموعات قضبان أصغر بدلا من بنية واحدة مستقرة. إذا كان عدد القضبان لكل حجم تشتت مرتفعا ، اختراق جودة خلط المكونين. - انقل تشتت المكون الأول (~ 1200 قضيب) إلى قنينة شفافة مخروطية 1.5 مل أو 2 مل.
- أضف المكون الثاني بطريقة خاضعة للرقابة في عملية مستمرة (ماصة 100 ميكرولتر). بعد الإضافة ، امزج المحتويات مباشرة باستخدام الماصة لامتصاص السائل وإضافته مرة أخرى. يتشكل الهيكل المترابط في غضون ثوان أثناء الخلط.
ملاحظة: إذا تشكلت مجموعات متعددة بدلا من بنية واحدة متماسكة ، فأعد فحص عدد قضبان الهلام الدقيق لكل وحدة تخزين أو وفر خلطا أكثر تحكما للمكونين.
6. خلية لاصقة بعد التعديل
- احسب العدد النظري لمجموعات الإيبوكسي في الهيكل المترابط بناء على معدل تدفق طور البوليمر المشتت ، وعدد الهلاميات الدقيقة التي تم جمعها خلال فترة زمنية محددة ، وعامل التخفيف لتشتت الهلام الدقيق المستخدم في تكوين السقالة.
ملاحظة: قرب العدد النظري لمجموعات الايبوكسي لكل سقالة بالمعادلة التالية.
nth: الكمية النظرية للمادة
cGMA: تركيز GMA في محلول ما قبل البوليمر
س: معدل تدفق محلول البوليمر المسبق - أضف محلول GRGDS-PC إلى الهيكل المترابط لتعديل جميع مجموعات الإيبوكسي المتبقية مع الببتيد اللاصق للخلية الذي يحمل أمينا حرا وثيول (n [مجموعات الإيبوكسي النظرية] / n [GRGDS-PC] = 1). اتركيه في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
- قم بإزالة الجزيئات غير المتفاعلة عن طريق غسلها بالماء منزوع الأيونات وإزالة المادة الطافية.
7. التعقيم والنقل إلى وسائط زراعة الخلايا
- قلل منسوب الماء لمجرد غمر السقالة المترابطة.
- افتح القارورة وقم بالإشعاع بضوء الأشعة فوق البنفسجية λ = 250-300 نانومتر. أغلق القارورة وانقل القارورة إلى مقعد نظيف. اغسل 1x بالماء المعقم.
- استبدل الماء الموجود في القارورة بوسائط زراعة الخلايا واتركه للتوازن لمدة 5 دقائق. كرر هذا مع وسائط زراعة الخلايا الطازجة 2x.
- انقل السقالة الكبيرة التي يسهل اختراقها إلى صفيحة بئر زراعة الخلايا للتجربة عن طريق سكب أو استخدام ملعقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 2: هيكل سقالة متشابكة كبيرة المسام . (أ) إسقاط 3D لمجهر متحد البؤر 500 ميكرومتر Z-stack من السقالة الكبيرة المسامية المترابطة. يمثل شريط المقياس 500 ميكرومتر. (ب) سقالة مترابطة تتكون من ~ 10000 قضيب ميكروجيل على غطاء زجاجي مأخوذ مباشرة من الماء. يمثل شريط المقياس 5 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
ينتج عن هذا البروتوكول بنية 3D كبيرة قابلة للاختراق مستقرة تتكون من قضبان ميكروجيل مترابطة من الأمين والإيبوكسي (الشكل 2 أ). يجب أن يظهر البناء هندسة مضغوطة إذا تم استخدام نوع الخلط الموصوف ، والذي يتكون في غضون 2 ثانية أو 3 ثوان (الشكل 2 ب).
يعتمد استقرار البناء المترابط على اللبنات الأساسية لقضيب microgel التي يتكون منها. تظهر قضبان microgel الوظيفية الأمين صلابة متوسطة تبلغ 2.0 ± 0.2 كيلو دالتون ، تحددها المسافة البادئة النانوية (الشكل 3 أ). إذا كانت القضبان ناعمة جدا ، فقد لا يتحقق الهيكل الكبير المترابط بسبب تشوه كتل البناء. للكشف عن المجموعات الوظيفية النشطة ، يمكن استخدام إيزوثيوسيانات الفلوريسئين (FITC) لتصور المجموعات الأمينية الأولية ، ويمكن استخدام أيزومر أمين الفلوريسئين الأول لتسمية مجموعات الإيبوكسي (الشكل 3B ، C). قضبان ميكروجيل الأمين لها أبعاد بمتوسط طول 553 ميكرومتر ± 29 ميكرومتر ومتوسط عرض 193 ميكرومتر ± 7 ميكرومتر في الماء منزوع الأيونات ، مما يؤدي إلى نسبة عرض إلى ارتفاع ~ 3.0 وانخفاض في الحجم (الانهيار) بنسبة ~ 73٪ من حجمها في وسائط زراعة الخلايا11.
الشكل 3: خواص الميكروجيل. (أ) معامل يونغ الفعال لقضبان ميكروجيل أمين وإيبوكسي جنبا إلى جنب مع كرات ميكروجيل أمينية وإيبوكسي مقاسة بالمسافة البادئة النانوية. يتم عرض البيانات كمخطط صندوقي يمتد من النسبة المئوية 25 إلى 75 ، مع وصول الشعيرات من 5٪ إلى 95٪ كميات. تمثل الخطوط الموجودة داخل المربعات المتوسطات ، وتشير المربعات الفارغة إلى الوسائل ، وتمثل المربعات السوداء القيم المتطرفة (n = 40 ؛ يتم حساب قيم p باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع تصحيح Bonferroni ، ** p < 0.01 ، ****p < 0.0001). (B) أعلى: صورة مجهرية متحدة البؤر لقضيب ميكروجيل أمين يعمل باستخدام FITC وقضيب ميكروجيل إيبوكسي يعمل مع أيزومر أمين الفلوريسئين I. أسفل: صور المجال الساطع المقابلة. تمثل جميع قضبان المقياس 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
كما هو موضح في المنشور ذي الصلة ، تؤدي الهلاميات الدقيقة الشبيهة بالكرة التي يتم إنتاجها بنفس الطريقة إلى مجموعات متعددة مترابطة بدلا من سقالة واحدة مستقرة كبيرة يسهل اختراقها11. تسمح نسبة العرض إلى الارتفاع الأعلى لقضبان microgel باستقرار عام أفضل بسبب جسر الهيكل الأكثر كفاءة في 3D (الشكل 4).
الشكل 4: تأثير نسبة العرض إلى الارتفاع على تكوين الهيكل . (أ) صورة مجال ساطع لبنية مترابطة تتكون من قضبان ميكروجيل. (ب) صورة ميدانية ساطعة لمجموعات مترابطة تتكون من هلاميات دقيقة تشبه الكرة. تمثل قضبان المقياس 500 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
القيم المتوسطة للمسام الكبيرة في السقالات المكونة من قضبان ميكروجيل هي 100 ميكرومتر ، مع 90٪ من أحجام المسام تتراوح من 30 ميكرومتر إلى أكثر من 150 ميكرومتر11. ينتج عن الهلاميات الدقيقة الشبيهة بالكرة مجموعات ذات أحجام مسامية تتراوح بين ~ 10 ميكرومتر إلى 55 ميكرومتر ، بقيمة متوسطة حوالي 22 ميكرومتر11. وهذا يتفق مع الأرقام المبلغ عنها من قبل دراسات أخرى تعد MAPs على أساس microgels كروية2،4،14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول في جودة 2-aminoethyl methacrylate (AMA) المستخدم ككومومر لوظيفة الأمين الأولية. يجب أن يكون AMA عبارة عن مسحوق دقيق الحبيبات ويفضل أن يكون عديم اللون يتم تسليمه في حاوية زجاجية بنية محكمة الغلق. يجب على المرء تجنب استخدام المواد الخضراء والمتكتلة ، لأنها تضعف بشكل كبير تفاعل الهلام وتؤثر سلبا على استنساخ النتائج. في حالة ضعف الهلام وقضبان microgel غير المستقرة ، يمكن للمرء أن يفكر في تغيير المورد.
إذا أدى خلط قضبان ميكروجيل أمين وإيبوكسي إلى مجموعات متعددة مترابطة بدلا من هيكل واحد مستقر ، فتحقق من عدد القضبان في كل تشتت مخزون واضبطه على قيمة مماثلة في نطاق 1000-5000 قضيب / 100 ميكرولتر لكلتا العينتين. إذا كانت أبعاد microgel تختلف اختلافا كبيرا عن القيم المذكورة هنا ، فاضبط عدد قضبان microgel على جزء الحجم. قم بزيادة الرقم لكل وحدة تخزين إذا كانت المواد الهلامية أصغر وتقليل العدد في الحالة المعاكسة.
لم تركز الطريقة الموصوفة على تحسين عملية الخلط للحصول على تجميع أكثر تحكما لمكوني الخلط الوظيفي المتكاملين. نظرا لأن الترابط يحدث في غضون ثوان قليلة ، يتم ضبط الحجم الكلي للتشتت لتشكيل بنية واحدة مترابطة وكسور حجم الكبسولات الهلامية الدقيقة المستخدمة للحصول على هياكل كبيرة مستقرة يسهل اختراقها ببساطة عن طريق سحب المكونين واحدا تلو الآخر. في المستقبل ، سيكون من المفيد تحليل خصائص التدفق والخلط لمشتتات قضبان microgel واكتساب نظرة ثاقبة إضافية في تكوين هيكل السقالات. يمكن أن يؤدي الخلط الأكثر تحكما بين مكونين من الهلام الدقيق إلى تمكين التكوين الآلي وعالي الإنتاجية لهذه السقالات الكبيرة التي يسهل اختراقها والسماح بنمو البناء التدريجي.
نظرا لأن الترابط يستمر بسرعة كبيرة ، يتم إنشاء مسام السقالة أثناء الخلط. إذا تم ترسيب قضبان microgel لأول مرة بالكامل قبل التشابك الكيميائي ، فمن المتوقع أن تكون نسبة التكديس إلى التشويش أعلى بكثير. لذلك ، من المحتمل أن يكون للحركية المترابطة تأثير كبير على تكوين MAP والمسامية الناتجة وأحجام المسام. أظهرت وظيفة اللصق الخلوي عن طريق التعديل اللاحق أو الدمج في شبكة الهلام أثناء تحضير الهلام الدقيق أن L929 والخلايا الليفية البشرية تلتصق وتنتشر على سطح قضبان الميكروجيل أولا ، وبعد ذلك تملأ معظم المسام الكبيرة بعد 5-7 أيام في الثقافة11. نظرا لأحجام المسام التي تتراوح في الغالب من 30 ميكرومتر إلى أكثر من 150 ميكرومتر وهيكل المسام المترابط ، الذي يؤكده الفحص المجهري متحد البؤر ، يمكن للخلايا المصنفة أن تدخل بسهولة السقالةالمترابطة 11. حتى الآن ، تم استخدام هذه السقالات القائمة على قضيب microgel لزراعة الخلايا الليفية وخلايا HUVEC في الثقافة المشتركة. شكلت HUVECs المصنفة بعد 14 يوما من زراعة الخلايا الليفية أول هياكل تشبه الأوعية الممدودة خلال ال 16 يوما التالية11. لا يزال يتعين معالجة دراسة أنواع الخلايا الأخرى في الثقافات المشتركة في المستقبل. للسماح بإضافة الخلايا مباشرة إلى النظام أثناء تكوين السقالة ، يلزم ربط قضيب سريع في مخازن مؤقتة متوافقة مع الخلايا أو وسائط مستنبتة ، مما سيمكن من توسيع هذا النظام ليشمل منصات الطباعة الحيوية.
يمكن أيضا إنشاء سقالات ثلاثية الأبعاد كبيرة غير قابلة للحقن بطرق بديلة مختلفة مثل صب المذيبات ، أو التجفيف بالتجميد ، أو ترشيح جسيمات رغوة الغاز ، أو الغزل الكهربائي ، أو الطباعة ثلاثية الأبعاد1،15،16. يمكن أن تحدث هجرة الخلايا وتكاثرها بسهولة دون الحاجة إلى تحلل السقالة مسبقا ، طالما تم تحقيق هندسة المسام والنفاذية المطلوبة في جميع أنحاء الشبكة. تجمع الطباعة ثلاثية الأبعاد باستخدام الأحبار الحيوية المحشورة والقابلة للبثق من كرات الميكروجيل المستندة إلى حمض الهيالورونيك المعدلة من PEG و agarose و norbornene بين تقنيات الطباعة MAP و 3D ، والتحكم في المسامية بين الكبسولات الهلامية الدقيقة الملدنة وكذلك هندسة الهيكل المطبوع العام17.
بالمقارنة مع الطرق البديلة الحالية ، تظهر السقالات الناتجة مجموعة واسعة من الأشكال الهندسية 3D macropore بسبب نسبة العرض إلى الارتفاع الأعلى لكتل بناء microgel وتكوينها المترابط المكون من عنصرين11. يؤدي استخدام قضبان microgel إلى مزيد من المسامية ، وبالتالي مساحة أكبر لتفاعلات الخلايا الخلوية مقارنة بتجميع الهلاميات الدقيقة الكروية. هذا أمر أساسي لتشكيل الأنسجة البيولوجية لأنه يعزز التفاعلات بين الخلية والخلية. في الوقت نفسه ، يمكن استخدام مواد أقل لإنتاج سقالات كبيرة يسهل اختراقها من نفس الأحجام ، مع الحفاظ على استقرار البناء. يعد تقليل مادة السقالة مفيدا حيث يتم توفير مساحة مفتوحة أكبر لتكوين الأنسجة ، ويجب تحلل مواد أقل ، وهو أمر مهم لكل من التطبيقات في المختبر وفي الجسم الحي . يمكن تمديد الوظيفة الحيوية للكبسولات الهلامية الدقيقة إلى أنواع الببتيد الأخرى والعوامل النشطة بيولوجيا. تتطلب السقالات الكبيرة التي يسهل اختراقها المستقرة الناتجة مواد أقل لخلق المزيد من المسامية. جنبا إلى جنب مع ضبط النظام ، توفر هذه الطريقة إمكانات عالية كمنصة متعددة الاستخدامات لزراعة الخلايا في 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يؤكد المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نعرب عن امتناننا للمؤلفين المشاركين في عملنا السابق الذي تستند إليه هذه المنهجية ، سيلين باستارد ، لويس بي بي غيرزوني ، يونكا كيتل ، روستيسلاف فينوكور ، نيكولاي بورن ، وتاماس هاراستي. نعترف بامتنان بالتمويل المقدم من Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) ضمن المشروع B5 و C3 SFB 985 "الكبسولات الهلامية الدقيقة الوظيفية وأنظمة الميكروجيل". نحن نقر بالتمويل من لجنة المنافسة في مجلس الشيوخ لايبنتز (SAW) في إطار برنامج البروفيسور (SAW-2017-PB62: BioMat). نحن نعترف بصدق بالتمويل من المفوضية الأوروبية (EUSMI ، 731019). تم تنفيذ هذا العمل جزئيا في مركز تكنولوجيا البوليمر الكيميائي (CPT) ، الذي تم دعمه من قبل الاتحاد الأوروبي وولاية شمال الراين وستفاليا الفيدرالية (منحة EFRE 30 00 883 02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Hsu, R. -S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Chen, Z., et al. Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere. Exploration. 1 (3), 20210036 (2021).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Guerzoni, L. P. B., et al. Cell encapsulation in soft, anisometric poly(ethylene) glycol microgels using a novel radical-free microfluidic system. Small. 15 (20), 1900692 (2019).
- Krüger, A. J. D., et al. Compartmentalized jet polymerization as a high-resolution process to continuously produce anisometric microgel rods with adjustable size and stiffness. Advanced Materials. 31 (49), 1903668 (2019).
- Darling, N. J., et al. Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Lutzweiler, G., Ndreu Halili,, Engin Vrana, N. The overview of porous, bioactive scaffolds as instructive biomaterials for tissue regeneration and their clinical translation. Pharmaceutics. 12 (7), 602 (2020).
- Dang, H. P., et al. 3D printed dual macro-, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function. Biofabrication. 11 (3), 035014 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
