Summary
Microgelstænger med komplementære reaktive grupper produceres via mikrofluidik med evnen til at forbinde i vandig opløsning. De anisometriske mikrogeler sætter sig fast og forbinder sig til stabile konstruktioner med større porer sammenlignet med sfæriske baserede systemer. Mikrogeler modificeret med GRGDS-PC danner makroporøse 3D-konstruktioner, der kan bruges til cellekultur.
Abstract
Et to-komponent system af funktionaliserede mikrogeler fra mikrofluidik muliggør hurtig sammenkobling i 3D-makroporøse konstruktioner i vandige opløsninger uden yderligere additiver. Kontinuerlig fotoinitieret on-chip gelering muliggør variation af mikrogelformatforholdet, som bestemmer byggestensegenskaberne for de opnåede konstruktioner. Glycidylmethacrylat (GMA) eller 2-aminoethylmethacrylat (AMA) monomerer copolymeriseres ind i mikrogelnetværket baseret på polyethylenglycol (PEG) stjernepolymerer for at opnå enten epoxy- eller aminfunktionalitet. En fokuserende oliestrøm indføres i den mikrofluidiske udløbsstruktur for at sikre kontinuerlig opsamling af de funktionaliserede mikrogelstænger. Baseret på en nylig publikation resulterer mikrogelstangbaserede konstruktioner i større porer på flere hundrede mikrometer og fører samtidig til generelt højere stilladsstabilitet sammenlignet med en sfærisk baseret model. På denne måde er det muligt at producere konstruktioner med højere volumen med mere frit volumen, samtidig med at mængden af materiale, der kræves, reduceres. De indbyrdes forbundne makroporøse stilladser kan afhentes og transporteres uden skader eller opløsning. Amin- og epoxygrupper, der ikke er involveret i sammenkobling, forbliver aktive og kan anvendes uafhængigt til postmodifikation. Denne protokol beskriver en optimeret metode til fremstilling af mikrogelstænger til dannelse af makroporøse indbyrdes forbundne stilladser, der kan bruges til efterfølgende celleforsøg.
Introduction
For at studere kompleks kooperativ celleadfærd i 3D-konstruktioner skal stilladsplatforme vise ensartet ydeevne i reproducerbarhed, have passende geometri til cellemigration og samtidig tillade en vis fleksibilitet med hensyn til parameterændring for at undersøge deres indflydelse på det levende væv1. I de senere år har begrebet makroporøse udglødede partikler (MAP), først beskrevet af Segura et al., udviklet sig til en effektiv og alsidig platform til 3D-stilladsproduktion2. Den skræddersyede sammensætning af mikrogelerne, som er byggestenene i det endelige 3D-stillads, foruddefinerer egenskaber såsom konstruktionens stivhed, gelnetværkets selektive kemiske reaktivitet og stilladsets endelige porestørrelse 2,3,4,5,6. Celleklæbende peptider som tegn på stilladscelleinteraktioner inkorporeres i mikrogelernes polymernetværk for at muliggøre cellebinding og kan varieres for at undersøge deres specifikke virkninger på celler i kultur. 3D-stilladserne stabiliseres ved sammenkobling af de udglødede injicerbare mikrogeler på grund af kovalente eller supramolekylære bindinger, hvilket resulterer i robuste og definerede konstruktioner til cellekultur 2,3,5,7,8.
Microfluidics har etableret sig som en af de mest nøjagtige og tilpasningsdygtige metoder til fremstilling af definerede granulære hydrogeler9. Muligheden for at producere større mængder af de krævede byggesten i en kontinuerlig proces, samtidig med at deres kemiske, mekaniske og fysiske monodispersitet opretholdes, bidrager væsentligt til denne proces' egnethed. Desuden kan størrelsen og formen af de producerede mikrogeler manipuleres ved forskellige metoder såsom batchemulsioner, mikrofluidik, litografi, elektrodynamisk sprøjtning eller mekanisk fragmentering, som bestemmer byggestenenes geometri og dermed 3D-strukturen på det endelige stillads 1,10.
For nylig er begrebet makroporøse 3D-stilladser sammensat af funktionaliserede mikrogelstænger, der hurtigt forbinder i vandige opløsninger uden yderligere additiver, blevet rapporteret11. Anisotropien af mikrogelstænger resulterede i højere porøsiteter og porefordelinger med større porestørrelser sammenlignet med anvendelse af sfæriske mikrogeler i denne undersøgelse11. På denne måde skaber mindre materiale større porer med en række forskellige poregeometrier, samtidig med at stabiliteten af 3D-stilladset opretholdes. Systemet består af to typer mikrogelstænger med komplementære primære amin- og epoxyfunktionelle grupper, der indtages inden for den sammenkoblede reaktion, når de kommer i kontakt med hinanden. De funktionelle grupper, der ikke deltager i sammenkoblingsprocessen, forbliver aktive og kan bruges til selektiv postmodifikation med celleklæbende peptider eller andre bioaktive faktorer. Fibroblastceller fastgør, spredes og formerer sig, når de dyrkes inde i 3D-stilladserne, vokser først på mikrogeloverfladen og fylder de fleste makroporer efter 5 dage. En foreløbig samkulturundersøgelse af humane fibroblaster og endotelceller fra menneskelige navleårer (HUVEC'er) viste lovende resultater for dannelsen af karlignende strukturer i de indbyrdes forbundne 3D-stilladser11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Påkrævet materiale og præparater til mikrofluidik
- Til den beskrevne mikrofluidiske procedure anvendes 1 ml og 5 ml glassprøjter og sprøjtepumper. On-chip dråbedannelse observeres via et omvendt mikroskop udstyret med et højhastighedskamera.
- Opret det mikrofluidiske chipdesign (figur 1B) ved hjælp af en computerstøttet designsoftware, og fremstil en masterskabelon som allerede rapporteret12.
- Opnå kontrolleret UV-bestråling ved hjælp af en selvkonstrueret UV-LED (λ = 365 nm, spotdiameter ~4,7 mm), der giver bestråling ved 957 mW/cm2 gennem et 0,13 mm tykt dækglas.
BEMÆRK: Tag højde for mulig lokal varmeproduktion med UV-LED under bestråling. Hvis dette er tilfældet, skal du sikre tilstrækkelig afkøling ved hjælp af ekstern luftstrøm.
2. Produktion af mikrofluidisk udstyr
BEMÆRK: Produktionen af mikrofluidiske enheder er baseret på en tidligere publikation13.
- Der fremstilles 20 g af en 10:1 (masse) blanding af polydimethylsiloxan (PDMS) og hærdningsmiddel. Bland kraftigt i 3 min.
- Bland 60 mg Oil Red O i 2,0 g toluen. Der tilsættes 50 μL Oil Red O i toluenopløsning til PDMS-blandingen. Bland, indtil der er homogen farvefordeling for at mindske uønsket lysspredning og holde spotstørrelsen fokuseret under on-chip gelering.
- Fjern boblerne ved at placere blandingen i en tørremiddel udstyret med en vakuumpumpe.
- Kast PDMS-blandingen ind i masterskabelonen til en højde på 5-5,5 mm og afgass igen.
- Lad PDMS hærde i 18 timer ved stuetemperatur for at undgå nedbrydning af diazofarvestof.
- Skær PDMS-strukturen ud, og stanseindløbs- og udløbshuller i strukturen ved hjælp af et linjekerneprøvetagningsværktøj (0,77 mm indvendig diameter, 1,07 mm ydre diameter).
- Vask PDMS og dæk glas med isopropanol og deioniseret vand gentagne gange 5x, og fjern derefter væsken via trykluft eller nitrogenstrøm efter hvert vasketrin.
- Behandl tørt glas og PDMS sammen i en plasmaovn ved 0,2 mbar med en iltstrøm på 20 ml/min i 60 s ved 100 W, og tilslut direkte for at binde glasset og PDMS sammen for at danne den mikrofluidiske enhed.
BEMÆRK: Undgå at bøje PDMS-strukturen under bindingsprocessen for at minimere deformation af kanalstrukturen. - For at gøre kanalerne i den mikrofluidiske chip hydrofobe anbringes anordningen sammen med 50 μL trichlor-(1 H,1 H,2 H,2 H-perfluoroctyl)-silan i en tørremiddel under vakuum natten over (luk forbindelsen til pumpen efter nedsættelse af damptrykket). Skyl ydersiden af enheden med hydrofluoroether.
FORSIGTIG: Udfør disse trin i en røghætte og undgå enhver kontakt med perfluorsilanen. Brug en glasvakuum tørremiddel forseglet med fedt. Rengør tørreren grundigt, inden den bruges til andre formål.
3. Opløsningsforberedelse til mikrofluidik
- Til den kontinuerlige oliefase blandes paraffinolie og hexadecan (1: 1 v / v) og tilsættes 8% (w / w) af et ikke-ionisk overfladeaktivt stof. Fyld en 1 ml (første olie, figur 1) og en 5 ml (anden olie, figur 1) glassprøjte.
- Forbered præpolymeropløsningerne til dispergeringsfasen i hætteglas med brunt glas for at forhindre nedbrydning af fotoinitiator og utilsigtet gelering.
- Aminkomponent præpolymeropløsning indeholdende GRGDS-PC
- For en 300 μL opløsning vejes 33,3 mg stjernepolyethylenglycol-acrylat (sPEG-AC) og 3,03 mg lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP).
- 18,74 mg 2-aminoethylmethacrylathydrochlorid (AMA) opløses i 1,5 ml deioniseret vand og opløsningen ledes gennem et sprøjtefilter (0,20 μm porestørrelse).
BEMÆRK: AMA er hygroskopisk og skal kasseres, så snart det faste danner klumper i opbevaringsbeholderen. - Tilbered sterile 36 mM GRGDS-PC aliquoter i vand og opbevares ved -20 °C indtil brug.
- Brug 291,7 μL af AMA-løsningen til at opløse sPEG-AC og LAP, og tilføj 8,3 μL af GRGDS-PC-opløsningen. Tag opløsningen op med en 1 ml glassprøjte og beskyt mod lys ved hjælp af aluminiumsfolie.
- Epoxykomponent præpolymeropløsning
- For en 300 μL opløsning vejes 33,3 mg stjernepolyethylenglycol-acrylat (sPEG-AC), 3,03 mg LAP og opløses i 300 μL deioniseret vand. Tilsæt 2,4 mg glycidylmethacrylat (GMA).
BEMÆRK: Kraftig rystelse fremskynder GMA-opløsning. Tag opløsningen op med en 1 ml glassprøjte og beskyt mod lys ved hjælp af aluminiumsfolie.
- For en 300 μL opløsning vejes 33,3 mg stjernepolyethylenglycol-acrylat (sPEG-AC), 3,03 mg LAP og opløses i 300 μL deioniseret vand. Tilsæt 2,4 mg glycidylmethacrylat (GMA).
- Aminkomponent præpolymeropløsning indeholdende GRGDS-PC
4. Fremstilling og rensning af amin- og epoxyfunktionaliserede mikrogelstænger
Figur 1: Arrangement af den mikrofluidiske on-chip geleringsenhed . (A) Set forfra og vinklet billede af komponentarrangementet under mikrofluidik. (B) Mikrofluidisk chipdesign, der anvendes til on-chip gelering af mikrogelstænger. (1) PE-rør til det første olieindløb. (2) Lysbeskyttet PE-rør til dispersfaseindløbet. (3) PE-rør til det andet olieindløb. (4) PE-rør fra stikkontakten til produktindsamlingsbeholderen. (5) UV-lampe og bestrålingsplacering på den lige 80 μm kanal nær udløbet. (6) Mikroskop mål/observationsposition. (7) Farvet PDMS-komponent i den mikrofluidiske enhed. (8) Dækglas bundet til PDMS. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Indsæt nålene i PE-rørene, og fjern gassen fra sprøjten og røret.
- Indsæt et PE-rør i stikkontakten til produktindsamling.
- Anbring alle glassprøjterne i sprøjtepumperne, og indsæt hver slangeende i det tilsvarende indløb (figur 1).
BEMÆRK: Beskyt præpolymerrøret mod lys via aluminiumsfolie eller et sort rør for at undgå utilsigtet gelering. - Fokuser mikroskopet på olie-vand-tværsnittet.
- Start den første oliesprøjtepumpe (strømningshastighed = 100-200 μL/t) for at fylde kanalen med olie først for at forhindre kanalbefugtning i dispergeringsfasen.
- Den første oliestrømningshastighed reduceres til 30 μL/h, og forpolymersprøjtepumpen startes (strømningshastighed = 100-200 μL/h), indtil den dispergerede vandige fase kan observeres ved tværsnittet.
- Indstil præpolymerstrømningshastigheden til 30 μL/h og fokuser mikroskopet på udløbet.
- Start den anden oliesprøjtepumpe (strømningshastighed på 300 μL/t), og vent, indtil strømningsregimet er stabilt.
- Anbring udløbsrøret i en opsamlingsbeholder.
BEMÆRK: Placer enden af røret i den øverste del af beholderen for at undgå en trykstigning på grund af akkumulering af produktet over tid. - UV-bestrålingssystemet indstilles således, at bestrålingen ligger i området 900-1000 mW/cm 2 (brugt bestråling = 957 mW/cm2), og bestrålingsstedet er i den lige kanaldel før udløbet (figur 1B).
BEMÆRK: Sørg for ikke at bestråle nær olie-vand-tværsnittet for at undgå tilstopning af kanalen. For yderligere beskyttelse skal du dække kanalstrukturerne før bestrålingsstedet på toppen af enheden. - Før UV-bestråling justeres strømningshastighederne for præpolymeren og den første olie for at opnå det ønskede billedformat i området 3,0 til 4,5, og bestrålingstiden for den dispergerede fase indstilles til ~ 2,3 s afhængigt af bestrålingsstedets størrelse.
- Start UV-bestråling, og juster om nødvendigt strømningshastighederne igen i henhold til det foregående underafsnit.
BEMÆRK: Overhold produktionen i begyndelsen og overvåg for stabil strømningsadfærd i udløbet og ensartetheden af mikrogelstængerne. Den anden oliestrøm kan justeres for at optimere produkttransporten i stikkontakten. - Skift kollektionsbeholderen, og noter starttidspunktet for produktsamlingen og flowhastighederne.
BEMÆRK: Beskyt produktet mod støv. Stop med at samle op, før sprøjten løber tør for opløsning. - For at afslutte indsamlingen skal du fjerne indsamlingsbeholderen og notere tiden. Stop bestrålingen og alle sprøjtepumperne.
- Vask produktet efterfølgende 5x hver med n-hexan, isopropanol og deioniseret vand. Fjern supernatanten efter stangsedimentering.
BEMÆRK: Efter hver tilsætning af opløsning spredes produktet omhyggeligt og venter 10 minutter, før opløsningsmidlet udskiftes, under hensyntagen til molekylær diffusion. Udskift isopropanol gradvist med vand for at forhindre stængerne i at flyde til væskens overflade. Flere yderligere vasketrin med vand reducerer de resterende isopropanolspor.
5. Makroporøs stilladsdannelse
- Antallet af mikrogelstænger pr. dispersionsvolumen for epoxy- og aminfunktionaliserede prøver bestemmes.
- Antallet af epoxy- og aminfunktionaliserede prøver ved fortynding eller koncentration justeres til en tilsvarende værdi mellem 1.000-5.000 stænger/100 μL.
BEMÆRK: Brug en centrifuge ved ~ 2.000 x g i 5-10 s for at fremskynde sedimenteringen af mikrogelstængerne. Hvis antallet af stænger pr. dispersionsvolumen er lavt, kan stangkobling resultere i mindre stangklynger i stedet for en stabil konstruktion. Hvis antallet af stænger pr. dispersionsvolumen er højt, vil blandingskvaliteten af de to komponenter blive kompromitteret. - Overfør den første komponent (~ 1.200 stænger) dispersion til et konisk 1,5 ml eller 2 ml gennemsigtigt hætteglas.
- Den anden komponent tilsættes på en kontrolleret måde i kontinuerlig drift (100 μL pipette). Efter tilsætning blandes indholdet direkte ved hjælp af pipetten for at optage væske og tilsættes det igen. Den indbyrdes forbundne struktur dannes inden for få sekunder under blanding.
BEMÆRK: Hvis der dannes flere klynger i stedet for en sammenhængende struktur, skal du kontrollere antallet af mikrogelstænger pr. volumen eller give mere kontrolleret blanding af de to komponenter.
6. Celleklæbende eftermodifikation
- Beregn det teoretiske antal epoxygrupper i den sammenkoblede struktur baseret på strømningshastigheden for den dispergerede polymerfase, antallet af mikrogeler opsamlet i løbet af en bestemt tid og fortyndingsfaktoren for mikrogeldispersionen, der anvendes til stilladsdannelse.
BEMÆRK: Tilnærm det teoretiske antal epoxygrupper pr. stillads ved hjælp af følgende ligning.
nth: Teoretisk mængde stof
c GMA: GMA-koncentration i præpolymeropløsning
Q: Strømningshastighed for præpolymeropløsning - Tilsæt GRGDS-PC-opløsning til den sammenkoblede struktur for at modificere alle resterende epoxygrupper med celleklæbepeptidet med en fri amin og thiol (n [teoretiske epoxygrupper] / n [GRGDS-PC] = 1). Forlad ved stuetemperatur natten over.
- Fjern de ikke-reagerede molekyler ved at vaske med deioniseret vand og fjerne supernatanten.
7. Sterilisering og overførsel til cellekulturmedier
- Reducer vandstanden for blot at nedsænke det sammenkoblede stillads.
- Hætteglasset åbnes, og bestråles med UV-lys på λ = 250-300 nm. Luk hætteglasset, og overfør hætteglasset til en ren bænk. Vask 1x med sterilt vand.
- Udskift vandet i hætteglasset med cellekulturmedier, og lad det være muligt at ligevægte i 5 minutter. Gentag dette med friske cellekulturmedier 2x.
- Overfør det makroporøse stillads til en cellekulturbrøndplade til eksperimentet ved at hælde eller bruge en spatel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2: Makroporøs tværbundet stilladsstruktur . (A) 3D-projektion af en 500 μm konfokal mikroskopi Z-stak af det sammenkoblede makroporøse stillads. Skalabjælke repræsenterer 500 μm. (B) Sammenkoblet stillads sammensat af ~ 10.000 mikrogelstænger på et dækglas taget direkte ud af vandet. Skalabjælken repræsenterer 5 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Denne protokol resulterer i en stabil 3D makroporøs konstruktion sammensat af indbyrdes forbundne amin- og epoxyfunktionaliserede mikrogelstænger (figur 2A). Konstruktionen skal udvise en kompakt geometri, hvis den beskrevne blandingstype anvendes, som dannes inden for 2 s eller 3 s (figur 2B).
Den indbyrdes forbundne konstruktionsstabilitet afhænger af mikrogelstangens byggesten, som den er sammensat af. De aminfunktionaliserede mikrogelstænger udviser en gennemsnitlig stivhed på 2,0 ± 0,2 kDa, bestemt ved nanoindentation (figur 3A). Hvis stængerne er for bløde, opnås den sammenkoblede makroporøse struktur muligvis ikke på grund af deformation af byggestenene. For at detektere aktive funktionelle grupper kan fluoresceinisothiocyanat (FITC) bruges til at visualisere primære aminogrupper, og fluoresceinaminosiomer I kan anvendes til at mærke epoxygrupper (figur 3B, C). Aminmikrogelstængerne har dimensioner med en gennemsnitlig længde på 553 μm ± 29 μm og en gennemsnitlig bredde på 193 μm ± 7 μm i deioniseret vand, hvilket resulterer i et billedformat på ~ 3,0 og en reduktion i volumen (sammenbrud) med ~ 73% af deres størrelse i cellekulturmedier11.
Figur 3: Microgel egenskaber . (A) Effektiv Youngs modul af amin- og epoxymikrogelstænger sammen med amin- og epoxymikrogelkugler målt ved nanoindrykning. Data vises som et boksplot, der strækker sig fra den 25. til 75. percentil, hvor knurhårene når fra 5% til 95% kvantilerne. Linjerne inde i boksene repræsenterer medianerne, de tomme firkanter angiver midlerne, og de sorte firkanter repræsenterer outliers (n = 40; p-værdier beregnes ved hjælp af envejs ANOVA med Bonferroni-korrektion, **p < 0,01, ****p < 0,0001). (B) Øverst: Konfokal mikroskopibillede af en aminmikrogelstang funktionaliseret med FITC og en epoxymikrogelstang funktionaliseret med fluoresceinaminosomer I. Nederst: Tilsvarende lyse feltbilleder. Alle skalabjælker repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Som beskrevet i den relaterede publikation fører kuglelignende mikrogeler produceret via samme metode til flere indbyrdes forbundne klynger snarere end et stabilt makroporøst stillads11. Det højere billedformat for mikrogelstængerne giver mulighed for bedre samlet stabilitet på grund af mere effektiv strukturbrobygning i 3D (figur 4).
Figur 4: Indflydelse af billedformatet på strukturdannelsen . (A) Lyst feltbillede af en sammenkoblet konstruktion sammensat af mikrogelstænger. (B) Lyst feltbillede af indbyrdes forbundne klynger sammensat af kuglelignende mikrogeler. Vægtstænger repræsenterer 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Middelværdierne for makroporerne i stilladserne bestående af mikrogelstænger er 100 μm, hvor 90% af porestørrelserne spænder fra 30 μm til over 150 μm11. Kuglelignende mikrogeler resulterer i klynger med porestørrelser mellem ~ 10 μm til 55 μm med en middelværdi omkring 22 μm11. Dette er i overensstemmelse med de rapporterede tal fra andre undersøgelser, der forbereder MAPs baseret på sfæriske mikrogeler 2,4,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et af de kritiske trin i denne protokol er kvaliteten af 2-aminoethylmethacrylat (AMA), der anvendes som comonomer til primær aminfunktionalisering. AMA skal være et finkornet og helst farveløst pulver leveret i en gastæt brun glasbeholder. Man bør undgå at bruge grønligt og klumpet materiale, da det væsentligt forringer gelationsreaktionen og påvirker resultaternes reproducerbarhed negativt. I tilfælde af dårlig gelering og ustabile mikrogelstænger kan man overveje at skifte leverandør.
Hvis blandingen af amin- og epoxymikrogelstænger fører til flere indbyrdes forbundne klynger i stedet for til en stabil struktur, kontrolleres antallet af stænger i hver stamdispersion og sættes til en tilsvarende værdi i intervallet 1.000-5.000 stænger/100 μL for begge prøver. Hvis mikrogelens dimensioner afviger væsentligt fra de værdier, der er nævnt her, skal du justere antallet af mikrogelstænger til volumenfraktionen. Forøg antallet pr. volumen, hvis gelerne er mindre, og reducer antallet i modsat fald.
Den beskrevne metode fokuserede ikke på at optimere blandingsprocessen for at få en mere kontrolleret samling af de to komplementære funktionaliserede blandingskomponenter. Da sammenkobling sker inden for få sekunder, justeres det samlede volumen af dispersionen til dannelse af en sammenkoblet konstruktion og volumenfraktionerne af de anvendte mikrogeler for at opnå stabile makroporøse strukturer ved blot at pipettere de to komponenter efter hinanden. I fremtiden vil det være en fordel at analysere mikrogelstangdispersionernes strømnings- og blandingsegenskaber og få yderligere indsigt i stilladsernes strukturdannelse. En mere kontrolleret blanding af de to indbyrdes forbundne mikrogelkomponenter kan muliggøre automatiseret og høj gennemstrømning af disse makroporøse stilladser og muliggøre trinvis konstruktionsvækst.
Da sammenkoblingen foregår meget hurtigt, skabes stilladsets porer under blandingen. Hvis mikrogelstængerne først blev fuldstændigt sedimenteret, før de kemisk blev sammenkoblet, ville der forventes et meget højere stacking til jamming-forhold. Derfor vil den sammenkoblede kinetik sandsynligvis have en stor effekt på MAP-dannelsen og de resulterende porøsitets- og porestørrelser. Celleklæbende funktionalisering ved postmodifikation eller inkorporering i gelnetværket under mikrogelfremstilling har vist, at L929 og humane fibroblastceller først binder og spredes på mikrogelstængernes overflade og derefter fylder de fleste makroporer efter 5-7 dage i kultur11. På grund af porestørrelserne, der overvejende spænder fra 30 μm til over 150 μm og den sammenkoblede porestruktur, bekræftet ved konfokal mikroskopi, kan frøede celler let komme ind i det sammenkoblede stillads11. Indtil videre er disse mikrogelstangbaserede stilladser blevet brugt til at dyrke fibroblast- og HUVEC-celler i samkultur. HUVEC'er sået efter 14 dages fibroblastcellekultur dannede først aflange karlignende strukturer inden for de følgende 16 dage11. Undersøgelsen af andre celletyper i samkulturer skal stadig behandles i fremtiden. For at gøre det muligt at tilføje celler direkte til systemet under stilladsdannelse kræves der hurtig stangforbindelse i cellekompatible buffere eller kulturmedier, hvilket vil gøre det muligt at udvide dette system til bioprintplatforme.
Ikke-injicerbare makroporøse 3D-stilladser kan også oprettes ved forskellige alternative metoder såsom opløsningsmiddelstøbning, frysetørring, gasskummende partikeludvaskning, elektrospinning eller 3D-udskrivning 1,15,16. Cellemigration og spredning kan let forekomme uden behov for at nedbryde stilladset på forhånd, så længe den krævede poregeometri og permeabilitet er opnået i hele netværket. 3D-udskrivning ved hjælp af fastklemte, ekstruderbare bioinks fra PEG-, agarose- og norbornenmodificerede hyaluronsyrebaserede mikrogelkugler kombinerer MAP- og 3D-printteknologierne og styrer porøsiteten mellem de udglødede mikrogeler og også geometrien i den samlede trykte struktur17.
Sammenlignet med alternative eksisterende metoder udviser de resulterende stilladser en lang række 3D-makroporegeometrier på grund af det højere billedformat mellem mikrogelbyggestenene og deres indbyrdes forbundne tokomponentkonfiguration11. Udnyttelsen af mikrogelstænger skaber mere porøsitet og dermed mere plads til celle-celle-interaktioner sammenlignet med samlingen af sfæriske mikrogeler. Dette er centralt for biologisk vævsdannelse, da det forbedrer celle-celleinteraktioner. Samtidig kan mindre materiale bruges til at producere makroporøse stilladser af samme volumen, samtidig med at konstruktionens stabilitet opretholdes. Reduktionen af stilladsmateriale er gavnlig, da der er mere åben plads til vævsdannelse, og mindre materiale skal nedbrydes, hvilket er vigtigt for både in vitro- og in vivo-applikationer . Biofunktionalisering af mikrogelerne kan udvides til andre peptidtyper og bioaktive faktorer. De resulterende stabile makroporøse stilladser kræver mindre materiale for at skabe mere porøsitet. Sammen med systemets tunabilitet giver denne metode et stort potentiale som en alsidig platform for cellekultur i 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne forsikrer, at der ikke er nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi udtrykker vores taknemmelighed over for medforfatterne af vores tidligere arbejde, som denne metode er baseret på, Céline Bastard, Luis P. B. Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born og Tamás Haraszti. Vi anerkender taknemmeligt finansiering fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) inden for projektet B5 og C3 SFB 985 "Functional Microgels and Microgel Systems". Vi anerkender finansiering fra Leibniz Senatets konkurrenceudvalg (SAW) under Professorinnenprogramm (SAW-2017-PB62: BioMat). Vi anerkender oprigtigt finansiering fra Europa-Kommissionen (EUSMI, 731019). Dette arbejde blev delvist udført på Center for Chemical Polymer Technology (CPT), som blev støttet af EU og forbundsstaten Nordrhein-Westfalen (tilskud EFRE 30 00 883 02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Hsu, R. -S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Chen, Z., et al. Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere. Exploration. 1 (3), 20210036 (2021).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Guerzoni, L. P. B., et al. Cell encapsulation in soft, anisometric poly(ethylene) glycol microgels using a novel radical-free microfluidic system. Small. 15 (20), 1900692 (2019).
- Krüger, A. J. D., et al. Compartmentalized jet polymerization as a high-resolution process to continuously produce anisometric microgel rods with adjustable size and stiffness. Advanced Materials. 31 (49), 1903668 (2019).
- Darling, N. J., et al. Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Lutzweiler, G., Ndreu Halili,, Engin Vrana, N. The overview of porous, bioactive scaffolds as instructive biomaterials for tissue regeneration and their clinical translation. Pharmaceutics. 12 (7), 602 (2020).
- Dang, H. P., et al. 3D printed dual macro-, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function. Biofabrication. 11 (3), 035014 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
