Summary
Microgelstaven met complementaire reactieve groepen worden geproduceerd via microfluïdica met het vermogen om in waterige oplossing met elkaar te verbinden. De anisometrische microgels binden en verbinden zich tot stabiele constructies met grotere poriën in vergelijking met op bolvormige systemen gebaseerde systemen. Microgels gemodificeerd met GRGDS-PC vormen macroporeuze 3D-constructies die kunnen worden gebruikt voor celkweek.
Abstract
Een tweecomponentensysteem van gefunctionaliseerde microgels uit microfluïdica maakt snelle koppeling in 3D-macroporeuze constructies in waterige oplossingen mogelijk zonder verdere additieven. Continue gefoto-geïnitieerde on-chip gelation maakt variatie van de microgel-beeldverhouding mogelijk, die de eigenschappen van de bouwsteen voor de verkregen constructies bepaalt. Glycidylmethacrylaat (GMA) of 2-aminoethylmethacrylaat (AMA) monomeren worden gecopolymeriseerd in het microgelnetwerk op basis van polyethyleenglycol (PEG) sterpolymeren om epoxy- of aminefunctionaliteit te bereiken. Een focusoliestroom wordt in de microfluïdische uitlaatstructuur geïntroduceerd om een continue verzameling van de gefunctionaliseerde microgelstaven te garanderen. Op basis van een recente publicatie resulteren op microgelstaaf gebaseerde constructies in grotere poriën van enkele honderden micrometers en tegelijkertijd tot een algehele hogere stabiliteit van de steiger in vergelijking met een bolvormig model. Op deze manier is het mogelijk om constructies met een hoger volume te produceren met een vrijer volume en tegelijkertijd de benodigde hoeveelheid materiaal te verminderen. De onderling verbonden macroporeuze steigers kunnen worden opgepakt en vervoerd zonder schade of desintegratie. Amine- en epoxygroepen die niet betrokken zijn bij het onderling verbinden blijven actief en kunnen onafhankelijk worden gebruikt voor post-modificatie. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode voor de fabricage van microgelstaven om macroporeuze onderling verbonden steigers te vormen die kunnen worden gebruikt voor volgende celexperimenten.
Introduction
Om complex gedrag van coöperatieve cellen in 3D-constructies te bestuderen, moeten steigerplatforms consistente prestaties in reproduceerbaarheid vertonen, een geschikte geometrie hebben voor celmigratie en tegelijkertijd een zekere flexibiliteit bieden in termen van parameterverandering om hun invloed op het levende weefsel te onderzoeken1. In de afgelopen jaren heeft het concept van macroporeuze gegloeide deeltjes (MAP), voor het eerst beschreven door Segura et al., zich ontwikkeld tot een efficiënt en veelzijdig platform voor 3D-steigerproductie2. De op maat gemaakte samenstelling van de microgels, die de bouwstenen zijn van de uiteindelijke 3D-steiger, definieert eigenschappen zoals de stijfheid van het construct, de selectieve chemische reactiviteit van het gelnetwerk en de uiteindelijke poriegrootte van de steiger 2,3,4,5,6. Cellijmpeptiden als aanwijzingen voor scaffold-celinteracties worden opgenomen in het polymeernetwerk van de microgels om celaanhechting mogelijk te maken en kunnen worden gevarieerd om hun specifieke effecten op cellen in cultuur te onderzoeken. De 3D-steigers worden gestabiliseerd door de gegloeide injecteerbare microgels onderling te koppelen als gevolg van covalente of supramoleculaire bindingen, wat resulteert in robuuste en gedefinieerde constructies voor celkweek 2,3,5,7,8.
Microfluïdica heeft zich gevestigd als een van de meest nauwkeurige en aanpasbare methoden voor de bereiding van gedefinieerde granulaire hydrogels9. De mogelijkheid om grotere hoeveelheden van de vereiste bouwstenen in een continu proces te produceren met behoud van hun chemische, mechanische en fysische monodispersiteit draagt aanzienlijk bij aan de geschiktheid van dit proces. Bovendien kunnen de grootte en vorm van de geproduceerde microgels worden gemanipuleerd door verschillende methoden zoals batch-emulsies, microfluïdica, lithografie, elektrodynamisch spuiten of mechanische fragmentatie, die de geometrie van de bouwstenen bepalen en dus de 3D-structuur van de uiteindelijke steiger 1,10.
Onlangs is het concept van macroporeuze 3D-steigers die zijn samengesteld uit gefunctionaliseerde microgelstaven die snel met elkaar verbonden zijn in waterige oplossingen zonder verdere additieven gemeld11. De anisotropie van microgelstaven resulteerde in hogere porositeiten en porieverdelingen met grotere poriegroottes in vergelijking met het gebruik van bolvormige microgels in deze studie11. Op deze manier creëert minder materiaal grotere poriën met een verscheidenheid aan verschillende poriegeometrieën met behoud van de stabiliteit van de 3D-steiger. Het systeem bestaat uit twee soorten microgelstaven met complementaire primaire amine- en epoxyfunctiegroepen die binnen de onderling verbonden reactie worden verbruikt wanneer ze met elkaar in contact komen. De functionele groepen die niet deelnemen aan het interlinkingproces blijven actief en kunnen worden gebruikt voor selectieve postmodificatie met cellijmpeptiden of andere bioactieve factoren. Fibroblastcellen hechten, verspreiden en vermenigvuldigen zich wanneer ze in de 3D-steigers worden gekweekt, eerst op het microgeloppervlak groeien en de meeste macroporiën na 5 dagen vullen. Een voorlopige co-kweekstudie van menselijke fibroblasten en menselijke navelstreng endotheelcellen (HUVECs) toonde veelbelovende resultaten voor de vorming van vaatachtige structuren binnen de onderling verbonden 3D-steigers11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Benodigd materiaal en preparaten voor microfluïdica
- Gebruik voor de beschreven microfluïdische procedure 1 ml en 5 ml glazen spuiten en spuitpompen. On-chip druppelvorming wordt waargenomen via een omgekeerde microscoop uitgerust met een hogesnelheidscamera.
- Maak het microfluïdische chipontwerp (figuur 1B) met behulp van computerondersteunde ontwerpsoftware en produceer een hoofdsjabloon zoals al gemeld12.
- Bereik gecontroleerde UV-bestraling met behulp van een zelfgeconstrueerde UV-LED (λ = 365 nm, spotdiameter ~ 4,7 mm) die bestralingssterkte biedt bij 957 mW / cm2 door een 0,13 mm dik dekglas.
LET OP: Houd rekening met mogelijke lokale warmteontwikkeling door de UV-LED tijdens de bestraling. Als dit het geval is, zorg dan voor voldoende koeling door externe luchtstroom.
2. Productie van microfluïdische apparaten
OPMERKING: De productie van microfluïdische apparaten is gebaseerd op een eerdere publicatie13.
- Bereid 20 g van een mengsel van polydimethylsiloxaan (PDMS) van 10:1 (in massa) en uithardingsmiddel. Meng krachtig gedurende 3 min.
- Meng 60 mg Olie Rood O in 2,0 g tolueen. Voeg 50 μL Olie Rood O in tolueenoplossing toe aan het PDMS-mengsel. Meng tot er een homogene kleurverdeling is om ongewenste lichtverstrooiing te verminderen en de spotgrootte gefocust te houden tijdens de gelatatie op de chip.
- Verwijder de belletjes door het mengsel in een exsiccator te plaatsen die is uitgerust met een vacuümpomp.
- Giet het PDMS-mengsel in de hoofdsjabloon tot een hoogte van 5-5,5 mm en ontgas opnieuw.
- Laat de PDMS 18 uur bij kamertemperatuur uitharden om diazokleurstofafbraak te voorkomen.
- Knip de PDMS-structuur uit en pons inlaat- en uitlaatgaten in de structuur met behulp van een lijnkernbemonsteringstool (0,77 mm binnendiameter, 1,07 mm buitendiameter).
- Was het PDMS en bedek glas met isopropanol en gedeïoniseerd water herhaaldelijk 5x en verwijder vervolgens de vloeistof via lucht onder druk of stikstofstroom na elke wasstap.
- Behandel het droge glas en PDMS samen in een plasmaoven op 0,2 mbar, met een zuurstofstroom van 20 ml / min gedurende 60 s bij 100 W, en sluit rechtstreeks aan om het glas en PDMS samen te binden om het microfluïdische apparaat te vormen.
OPMERKING: Vermijd het buigen van de PDMS-structuur tijdens het bindingsproces om vervorming van de kanaalstructuur te minimaliseren. - Om de kanalen van de microfluïdische chip hydrofoob te maken, plaatst u het apparaat samen met 50 μL trichloor-(1H,1 H,2 H,2 H-perfluoroctyl)-silaan 's nachts in een exsiccator onder vacuüm (sluit de verbinding met de pomp na het verlagen van de dampdruk). Spoel de buitenkant van het apparaat af met fluorkoolwaterstof.
LET OP: Voer deze stappen uit in een zuurkast en vermijd elk contact met het perfluorale silaan. Gebruik een glazen vacuümdesiccator afgedicht met vet. Reinig de exsiccator grondig voordat u deze voor andere doeleinden gebruikt.
3. Oplossingsvoorbereiding voor microfluïdica
- Meng voor de continue oliefase paraffineolie en hexadecaan (1:1 v/v) en voeg 8% (g/g) van een niet-ionische oppervlakteactieve stof toe. Vul één glazen spuit van 1 ml (eerste olie, figuur 1) en één glazen spuit van 5 ml (tweede olie, figuur 1).
- Bereid de prepolymeeroplossingen voor de dispersiefase in injectieflacons van bruin glas om foto-initiatorafbraak en onbedoelde gelatatie te voorkomen.
- Prepolymeeroplossing voor aminecomponenten die GRGDS-PC bevat
- Weeg voor een oplossing van 300 μL 33,3 mg ster-polyethyleenglycolacrylaat (sPEG-AC) en 3,03 mg lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP) af.
- Los 18,74 mg 2-aminoethylmethacrylaathydrochloride (AMA) op in 1,5 ml gedeïoniseerd water en laat de oplossing door een spuitfilter (poriegrootte van 0,20 μm) lopen.
OPMERKING: AMA is hygroscopisch en moet worden weggegooid zodra de vaste stof klontjes in de opslagcontainer vormt. - Bereid steriele 36 mM GRGDS-PC aliquots in water en bewaar bij −20 °C tot gebruik.
- Gebruik 291,7 μL van de AMA-oplossing om sPEG-AC en LAP op te lossen en voeg 8,3 μL van de GRGDS-PC-oplossing toe. Neem de oplossing op met een glazen spuit van 1 ml en bescherm tegen licht met aluminiumfolie.
- Epoxy component prepolymeer oplossing
- Weeg voor een oplossing van 300 μL 33,3 mg ster-polyethyleenglycol-acrylaat (sPEG-AC), 3,03 mg LAP en los op in 300 μL gedeïoniseerd water. Voeg 2,4 mg glycidylmethacrylaat (GMA) toe.
OPMERKING: Krachtig schudden versnelt het oplossen van GMA. Neem de oplossing op met een glazen spuit van 1 ml en bescherm tegen licht met aluminiumfolie.
- Weeg voor een oplossing van 300 μL 33,3 mg ster-polyethyleenglycol-acrylaat (sPEG-AC), 3,03 mg LAP en los op in 300 μL gedeïoniseerd water. Voeg 2,4 mg glycidylmethacrylaat (GMA) toe.
- Prepolymeeroplossing voor aminecomponenten die GRGDS-PC bevat
4. Productie en zuivering van gefunctionaliseerde microgelstaven van amine en epoxy
Figuur 1: Opstelling van de microfluïdische on-chip gelation assembly. (A) Vooraanzicht en schuin zicht van de componentopstelling tijdens microfluïdica. (B) Microfluïdisch chipontwerp dat wordt gebruikt voor on-chip gelation van microgelstaven. (1) PE-buis naar de eerste olie-inlaat. (2) Lichtbeschermde PE-buis naar de inlaat van de disperse fase. (3) PE-buis naar de tweede olie-inlaat. (4) PE-buis van de uitlaat naar de productverzamelingscontainer. (5) UV-lamp en bestralingslocatie op het rechte kanaal van 80 μm in de buurt van de uitlaat. (6) Microscoop objectief/observatiepositie. (7) Gekleurde PDMS-component van het microfluïdische apparaat. (8) Afdekglas dat aan het PDMS is verlijmd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Steek de naalden in de PE-buizen en verwijder het gas uit de spuit en de buis.
- Steek een PE-buis in de uitlaat voor productverzameling.
- Plaats alle glazen spuiten in de spuitpompen en steek elk uiteinde van de slang in de overeenkomstige inlaat (figuur 1).
OPMERKING: Bescherm de prepolymeerbuis tegen licht via aluminiumfolie of een zwarte buis om onbedoelde gelatatie te voorkomen. - Richt de microscoop op de olie-waterdoorsnede.
- Start de eerste oliespuitpomp (debiet = 100-200 μL/h) om het kanaal eerst met olie te vullen om bevochtiging van het kanaal door de dispersiefase te voorkomen.
- Verlaag het eerste oliedebiet tot 30 μL/h en start de pomp van de prepolymeerspuit (debiet = 100-200 μL/h) totdat de gedispergeerde waterige fase bij de doorsnede kan worden waargenomen.
- Stel het prepolymeerdebiet in op 30 μL/h en richt de microscoop op de uitlaat.
- Start de tweede oliespuitpomp (debiet van 300 μL/h) en wacht tot het stroomregime stabiel is.
- Plaats de uitlaatbuis in een opvangbak.
OPMERKING: Plaats het uiteinde van de buis in het bovenste deel van de container om een drukverhoging als gevolg van de accumulatie van het product in de loop van de tijd te voorkomen. - Stel het UV-bestralingssysteem zo in dat de instralingssterkte in het bereik van 900-1000 mW/cm2 ligt (gebruikte bestralingssterkte = 957 mW/cm2) en de bestralingsplek zich in het rechte kanaalgedeelte vóór de uitlaat bevindt (figuur 1B).
OPMERKING: Zorg ervoor dat u niet in de buurt van de olie-waterdoorsnede bestraalt om te voorkomen dat het kanaal verstopt raakt. Voor extra bescherming, bedek de kanaalstructuren voorafgaand aan de bestralingsplek op de bovenkant van de eenheid. - Pas vóór UV-bestraling de stroomsnelheden van het prepolymeer en de eerste olie aan om de gewenste beeldverhouding in het bereik van 3,0 tot 4,5 te bereiken en stel de bestralingstijd van de gedispergeerde fase in op ~ 2,3 s, afhankelijk van de grootte van de bestralingsplek.
- Start uv-bestraling en pas indien nodig de stroomsnelheden opnieuw aan volgens de vorige subsectie.
OPMERKING: Observeer de productie aan het begin en controleer op stabiel stromingsgedrag in de uitlaat en de uniformiteit van de microgelstaven. De tweede oliestroom kan worden aangepast om het producttransport binnen de uitlaat te optimaliseren. - Wijzig de verzamelcontainer en noteer de begintijd en stroomsnelheden van de productverzameling.
OPMERKING: Bescherm het product tegen stof. Stop met verzamelen voordat een spuit bijna leeg is. - Als u de verzameling wilt beëindigen, verwijdert u de verzamelcontainer en noteert u de tijd. Stop de bestraling en alle spuitpompen.
- Was het product vervolgens 5x elk met n-hexaan, isopropanol en gedeïoniseerd water. Verwijder het supernatant na bezinking van de staaf.
OPMERKING: Dispergeer het product na elke toevoeging van de oplossing zorgvuldig en wacht 10 minuten voordat u het oplosmiddel vervangt, rekening houdend met moleculaire diffusie. Vervang de isopropanol geleidelijk door water om te voorkomen dat de staven naar het oppervlak van de vloeistof drijven. Meerdere extra wasstappen met water verminderen de resterende isopropanolsporen.
5. Macroporeuze steigervorming
- Bepaal het aantal microgelstaven per dispersievolume voor de epoxy- en amine-gefunctionaliseerde monsters.
- Pas het aantal gefunctionaliseerde epoxy- en aminemonsters door verdunning of concentratie aan tot een vergelijkbare waarde tussen 1.000-5.000 staafjes/100 μL.
OPMERKING: Gebruik een centrifuge van ~ 2.000 x g gedurende 5-10 s om de sedimentatie van de microgelstaven te versnellen. Als het aantal staven per dispersievolume laag is, kan staaf-interlinking resulteren in kleinere staafclusters in plaats van één stabiele constructie. Als het aantal staven per dispersievolume hoog is, komt de mengkwaliteit van de twee componenten in het gedrang. - Breng de eerste component (~ 1.200 staafjes) dispersie over in een conische transparante injectieflacon van 1,5 ml of 2 ml.
- Voeg de tweede component op een gecontroleerde manier toe in een continue bewerking (100 μL pipet). Meng na toevoeging de inhoud direct met behulp van de pipet om vloeistof op te nemen en voeg deze opnieuw toe. De onderling verbonden structuur vormt zich binnen enkele seconden tijdens het mengen.
OPMERKING: Als er meerdere clusters ontstaan in plaats van één coherente structuur, controleer dan opnieuw het aantal microgelstaven per volume of zorg voor een meer gecontroleerde menging van de twee componenten.
6. Cellijm na modificatie
- Bereken het theoretische aantal epoxygroepen in de onderling verbonden structuur op basis van de stroomsnelheid van de gedispergeerde polymeerfase, het aantal microgels dat gedurende een bepaalde tijd is verzameld en de verdunningsfactor van de microgeldispersie die wordt gebruikt voor de vorming van steigers.
OPMERKING: Benader het theoretische aantal epoxygroepen per steiger met de volgende vergelijking.
nth: Theoretische hoeveelheid stof
cGMA: GMA-concentratie in prepolymeeroplossing
V: Debiet van prepolymeeroplossing - Voeg GRGDS-PC-oplossing toe aan de onderling verbonden structuur om alle resterende epoxygroepen te wijzigen met het cellijmpeptide met een vrije amine en thiol (n [theoretische epoxygroepen]/n[GRGDS-PC] = 1). Laat een nacht op kamertemperatuur staan.
- Verwijder de niet-gereageerde moleculen door te wassen met gedeïoniseerd water en het supernatant te verwijderen.
7. Sterilisatie en overdracht naar celkweekmedia
- Verlaag het waterniveau om de onderling verbonden steiger onder te dompelen.
- Open de injectieflacon en bestraal met UV-licht van λ = 250-300 nm. Sluit de injectieflacon en breng de injectieflacon over op een schone bank. Was 1x met steriel water.
- Vervang het water in de injectieflacon door celkweekmedia en laat gedurende 5 minuten equilibratie toe. Herhaal dit met verse celkweekmedia 2x.
- Breng de macroporeuze steiger over in een celkweekputplaat voor het experiment door een spatel te gieten of te gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2: Macroporeuze crosslinked scaffold structuur. (A) 3D projectie van een 500 μm confocale microscopie Z-stack van de onderling verbonden macroporeuze steiger. Schaalbalk vertegenwoordigt 500 μm. (B) Onderling verbonden steiger bestaande uit ~ 10.000 microgelstaven op een afdekglas dat rechtstreeks uit water is gehaald. Schaalbalk staat voor 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Dit protocol resulteert in een stabiele 3D macroporeuze constructie bestaande uit onderling verbonden amine en epoxy gefunctionaliseerde microgelstaven (figuur 2A). Het construct moet een compacte geometrie vertonen als het beschreven type menging wordt gebruikt, dat binnen 2 s of 3 s wordt gevormd (figuur 2B).
De onderling verbonden constructiestabiliteit is afhankelijk van de bouwstenen van de microgelstaaf waaruit het is samengesteld. De amine gefunctionaliseerde microgelstaven vertonen een gemiddelde stijfheid van 2,0 ± 0,2 kDa, bepaald door nano-indentatie (figuur 3A). Als de staven te zacht zijn, kan de onderling verbonden macroporeuze structuur niet worden bereikt als gevolg van vervorming van de bouwstenen. Om actieve functionele groepen te detecteren, kan fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) worden gebruikt om primaire aminogroepen te visualiseren, en fluoresceïne-amine-isomeer I kan worden gebruikt om epoxygroepen te labelen (figuur 3B, C). De amine microgel staafjes hebben afmetingen met een gemiddelde lengte van 553 μm ± 29 μm en een gemiddelde breedte van 193 μm ± 7 μm in gedeïoniseerd water, wat resulteert in een beeldverhouding van ~3,0 en een vermindering van het volume (collaps) met ~73% van hun grootte in celkweekmedia11.
Figuur 3: Microgel eigenschappen. (A) Effectieve Young's modulus van amine en epoxy microgel staafjes samen met amine en epoxy microgel bolletjes gemeten door nano-indentatie. Gegevens weergegeven als een boxplot die zich uitstrekt van het 25e tot het 75e percentiel, waarbij de snorharen reiken van de 5% tot 95% kwantielen. De lijnen in de vakken vertegenwoordigen de medianen, de lege vierkanten geven de gemiddelden aan en de zwarte vierkanten vertegenwoordigen uitschieters (n = 40; p-waarden worden berekend met behulp van eenrichtings-ANOVA met Bonferroni-correctie, **p < 0,01, ****p < 0,0001). (B) Boven: Confocale microscopie afbeelding van een amine microgel staaf gefunctionaliseerd met FITC en een epoxy microgel staaf gefunctionaliseerd met fluoresceïne amine isomeer I. Onder: Overeenkomstige heldere veldbeelden. Alle schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Zoals beschreven in de gerelateerde publicatie, leiden bolachtige microgels geproduceerd via dezelfde methode tot meerdere onderling verbonden clusters in plaats van één stabiele macroporeuze steiger11. De hogere beeldverhouding van de microgelstaven zorgt voor een betere algehele stabiliteit door efficiëntere structuuroverbrugging in 3D (figuur 4).
Figuur 4: Invloed van de beeldverhouding op de structuurvorming. (A) Helder veldbeeld van een onderling verbonden constructie bestaande uit microgelstaven. (B) Helder veldbeeld van onderling verbonden clusters bestaande uit bolachtige microgels. Schaalbalken vertegenwoordigen 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De gemiddelde waarden van de macroporiën in de steigers bestaande uit microgelstaven zijn 100 μm, waarbij 90% van de poriegroottes varieert van 30 μm tot meer dan 150 μm11. Bolachtige microgels resulteren in clusters met poriegroottes tussen ~10 μm en 55 μm, met een gemiddelde waarde rond 22 μm11. Dit komt overeen met de gerapporteerde cijfers van andere studies die MAPs voorbereiden op basis van bolvormige microgels 2,4,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een van de kritieke stappen in dit protocol is de kwaliteit van het 2-aminoethylmethacrylaat (AMA) dat wordt gebruikt als comonomeer voor primaire aminefunctionalisatie. De AMA moet een fijnkorrelig en bij voorkeur kleurloos poeder zijn dat wordt afgeleverd in een gasdichte bruine glazen container. Men moet het gebruik van groenachtig en klonterig materiaal vermijden, omdat het de gelation-reactie aanzienlijk schaadt en de reproduceerbaarheid van de resultaten negatief beïnvloedt. In het geval van slechte gelatatie en onstabiele microgelstaven, kan men overwegen om van leverancier te veranderen.
Als het mengen van amine- en epoxymicrogelstaven leidt tot meerdere onderling verbonden clusters in plaats van tot één stabiele structuur, controleer dan het aantal staven in elke stockdispersie en stel het in op een vergelijkbare waarde in het bereik van 1.000-5.000 staven / 100 μL voor beide monsters. Als de afmetingen van de microgel aanzienlijk afwijken van de hier vermelde waarden, pas dan het aantal microgelstaven aan de volumefractie aan. Verhoog het aantal per volume als de gels kleiner zijn en verlaag het aantal in het tegenovergestelde geval.
De beschreven methode was niet gericht op het optimaliseren van het mengproces om een meer gecontroleerde assemblage van de twee complementaire gefunctionaliseerde mengcomponenten te hebben. Aangezien interlinking binnen enkele seconden plaatsvindt, worden het totale volume van de dispersie om één onderling verbonden constructie te vormen en de volumefracties van de gebruikte microgels aangepast om stabiele macroporeuze structuren te verkrijgen door simpelweg de twee componenten achter elkaar te pipetteren. In de toekomst zou het voordelig zijn om de stromings- en mengeigenschappen van de microgelstaafdispersies te analyseren en extra inzicht te krijgen in de structuurvorming van de steigers. Een meer gecontroleerde menging van de twee onderling verbonden microgelcomponenten zou geautomatiseerde en high-throughput vorming van deze macroporeuze steigers mogelijk kunnen maken en incrementele constructgroei mogelijk maken.
Omdat het onderling verbinden zeer snel verloopt, ontstaan tijdens het mengen de poriën van de steiger. Als de microgelstaven eerst volledig gesedimd zouden zijn voordat ze chemisch met elkaar verbonden waren, zou een veel hogere stapeling tot jamming ratio worden verwacht. Daarom zal de onderling verbonden kinetiek waarschijnlijk een groot effect hebben op MAP-vorming en de resulterende porositeit en poriegroottes. Cellijm functionalisatie door postmodificatie of opname in het gelnetwerk tijdens microgelbereiding heeft aangetoond dat L929- en menselijke fibroblastcellen zich eerst hechten en verspreiden op het oppervlak van de microgelstaven en vervolgens de meeste macroporiën vullen na 5-7 dagen in cultuur11. Vanwege de poriegroottes die voornamelijk variëren van 30 μm tot meer dan 150 μm en de onderling verbonden poriestructuur, bevestigd door confocale microscopie, kunnen gezaaide cellen gemakkelijk de onderling verbonden steigerbinnendringen 11. Tot nu toe zijn deze op microgelstaven gebaseerde steigers gebruikt om fibroblast- en HUVEC-cellen in co-cultuur te laten groeien. HUVECs gezaaid na 14 dagen fibroblastcelkweek vormden eerst langwerpige vaatachtige structuren binnen de volgende 16 dagen11. De studie van andere celtypen in coculturen moet in de toekomst nog worden aangepakt. Om cellen direct aan het systeem toe te voegen tijdens de vorming van steigers, is snelle staafkoppeling in celcompatibele buffers of kweekmedia vereist, waardoor dit systeem kan worden uitgebreid naar bioprintplatforms.
Niet-injecteerbare macroporeuze 3D-steigers kunnen ook worden gemaakt met verschillende alternatieve methoden zoals solventgieten, vriesdrogen, gasschuimende deeltjesuitloging, elektrospinning of 3D-printen 1,15,16. Celmigratie en proliferatie kunnen gemakkelijk plaatsvinden zonder dat de steiger vooraf hoeft te worden aangetast, zolang de vereiste poriegeometrie en permeabiliteit in het hele netwerk zijn bereikt. 3D-printen met behulp van vastgelopen, extrudeerbare bioinks van PEG-, agarose- en norborneen-gemodificeerde microgelbollen op basis van hyaluronzuur combineert de MAP- en 3D-printtechnologieën en regelt de porositeit tussen de gegloeide microgels en ook de geometrie van de algehele geprinte structuur17.
In vergelijking met alternatieve bestaande methoden vertonen de resulterende steigers een grote verscheidenheid aan 3D-macroporiegeometrieën vanwege de hogere beeldverhouding van de microgel-bouwstenen en hun onderling verbonden tweecomponentenconfiguratie11. Het gebruik van microgelstaven creëert meer porositeit en dus meer ruimte voor cel-celinteracties in vergelijking met de assemblage van bolvormige microgels. Dit is centraal voor biologische weefselvorming omdat het de cel-celinteracties verbetert. Tegelijkertijd kan minder materiaal worden gebruikt om macroporeuze steigers van dezelfde volumes te produceren, terwijl de stabiliteit van het construct behouden blijft. De vermindering van steigermateriaal is gunstig omdat er meer open ruimte is voor weefselvorming en er minder materiaal hoeft te worden afgebroken, wat belangrijk is voor zowel in vitro als in vivo toepassingen. Biofunctionalisatie van de microgels kan worden uitgebreid naar andere peptidetypen en bioactieve factoren. De resulterende stabiele macroporeuze steigers vereisen minder materiaal om meer porositeit te creëren. Samen met de levensvatbaarheid van het systeem biedt deze methode een hoog potentieel als een veelzijdig platform voor celkweek in 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verzekeren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We drukken onze dankbaarheid uit aan de coauteurs van ons eerdere werk waarop deze methodologie is gebaseerd, Céline Bastard, Luis P. B. Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born en Tamás Haraszti. We zijn dankbaar voor de financiering van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) binnen het project B5 en C3 SFB 985 "Functionele microgels en microgelsystemen". We erkennen financiering van de Leibniz Senate Competition Committee (SAW) onder het Professorinnenprogramm (SAW-2017-PB62: BioMat). We erkennen oprecht de financiering van de Europese Commissie (EUSMI, 731019). Dit werk werd gedeeltelijk uitgevoerd in het Center for Chemical Polymer Technology (CPT), dat werd ondersteund door de EU en de deelstaat Noordrijn-Westfalen (subsidie EFRE 30 00 883 02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Hsu, R. -S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Chen, Z., et al. Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere. Exploration. 1 (3), 20210036 (2021).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Guerzoni, L. P. B., et al. Cell encapsulation in soft, anisometric poly(ethylene) glycol microgels using a novel radical-free microfluidic system. Small. 15 (20), 1900692 (2019).
- Krüger, A. J. D., et al. Compartmentalized jet polymerization as a high-resolution process to continuously produce anisometric microgel rods with adjustable size and stiffness. Advanced Materials. 31 (49), 1903668 (2019).
- Darling, N. J., et al. Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Lutzweiler, G., Ndreu Halili,, Engin Vrana, N. The overview of porous, bioactive scaffolds as instructive biomaterials for tissue regeneration and their clinical translation. Pharmaceutics. 12 (7), 602 (2020).
- Dang, H. P., et al. 3D printed dual macro-, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function. Biofabrication. 11 (3), 035014 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
