Summary
מוטות מיקרוג'ל עם קבוצות תגובתיות משלימות מיוצרים באמצעות מיקרופלואידיקה עם היכולת להתחבר בתמיסה מימית. המיקרוג'לים האניזומטריים נתקעים ומתחברים למבנים יציבים עם נקבוביות גדולות יותר בהשוואה למערכות מבוססות כדוריות. מיקרו-ג'לים שעברו שינוי עם GRGDS-PC יוצרים מבנים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים שיכולים לשמש לתרבית תאים.
Abstract
מערכת דו-רכיבית של מיקרוג'לים פונקציונליים ממיקרופלואידיקה מאפשרת קישור מהיר למבנים מקרו-נקבוביים תלת-ממדיים בתמיסות מימיות ללא תוספים נוספים. ג'לציה רציפה על השבב מאפשרת וריאציה של יחס הגובה-רוחב של המיקרוג'ל, הקובע את תכונות אבני הבניין עבור המבנים המתקבלים. מונומרים של גליצידיל מתקרילט (GMA) או 2-אמינואתיל מתקרילט (AMA) עוברים קופולימריזציה לרשת המיקרו-ג'ל על בסיס פולימרים של פוליאתילן גליקול (PEG) כדי להשיג פונקציונליות של אפוקסי או אמין. זרימת שמן ממוקדת מוחדרת למבנה השקע המיקרופלואידי כדי להבטיח איסוף רציף של מוטות המיקרוג'ל הפונקציונליים. בהתבסס על פרסום שפורסם לאחרונה, מבנים מבוססי מוטות מיקרוג'ל גורמים לנקבוביות גדולות יותר של כמה מאות מיקרומטרים, ובמקביל מובילים ליציבות פיגומים גבוהה יותר באופן כללי בהשוואה למודל מבוסס כדוריות. בדרך זו, ניתן לייצר מבנים בנפח גבוה יותר עם נפח חופשי יותר תוך הפחתת כמות החומר הנדרשת. הפיגומים המקרו-נקבוביים המחוברים זה לזה ניתנים לאיסוף ולהובלה ללא נזק או התפוררות. קבוצות אמין ואפוקסי שאינן מעורבות בקישור הדדי נשארות פעילות וניתן להשתמש בהן באופן עצמאי לאחר השינוי. פרוטוקול זה מתאר שיטה אופטימלית לייצור מוטות מיקרוג'ל ליצירת פיגומים מקרו-נקבוביים מקושרים שיכולים לשמש לניסויים הבאים בתאים.
Introduction
כדי לחקור התנהגות מורכבת של תאים שיתופיים במבנים תלת-ממדיים, פלטפורמות פיגומים צריכות להראות ביצועים עקביים ביכולת השחזור, להיות בעלות גיאומטריה מתאימה לנדידת תאים, ובמקביל לאפשר גמישות מסוימת במונחים של שינוי פרמטרים כדי לחקור את השפעתם על הרקמה החיה1. בשנים האחרונות, הרעיון של חלקיקים מקרו-נקבוביים (MAP), שתואר לראשונה על ידי Segura et al., התפתח לפלטפורמה יעילה ורב-תכליתית לייצור פיגומים תלת-ממדיים2. ההרכב המותאם של המיקרו-ג'לים, שהם אבני הבניין של הפיגום התלת-ממדי הסופי, מגדיר מראש תכונות כגון קשיחות המבנה, התגובתיות הכימית הסלקטיבית של רשת הג'ל וגודל הנקבוביות הסופי של הפיגום 2,3,4,5,6. פפטידים דביקים של תאים כרמזים לאינטראקציות פיגומים-תאים משולבים ברשת הפולימרים של המיקרו-ג'לים כדי לאפשר חיבור של תאים, וניתן לגוון אותם כדי לחקור את ההשפעות הספציפיות שלהם על תאים בתרבית. הפיגומים התלת-ממדיים מיוצבים על ידי קישור של המיקרו-ג'לים הניתנים להזרקה בחישול עקב קשרים קוולנטיים או סופראמולקולריים, וכתוצאה מכך מבנים חזקים ומוגדרים עבור תרבית תאים 2,3,5,7,8.
Microfluidics ביססה את עצמה כאחת השיטות המדויקות והניתנות להתאמה להכנת הידרוג'לים גרעיניים מוגדרים9. האפשרות לייצר כמויות גדולות יותר של אבני הבניין הנדרשות בתהליך מתמשך תוך שמירה על חד-פעמיותן הכימית, המכנית והפיזיקלית, תורמת רבות להתאמתו של תהליך זה. יתר על כן, ניתן לתפעל את הגודל והצורה של המיקרו-ג'לים המיוצרים בשיטות שונות כגון תחליבי אצווה, מיקרופלואידיקה, ליתוגרפיה, ריסוס אלקטרודינמי או פיצול מכני, הקובעים את הגיאומטריה של אבני הבניין, ולפיכך, את המבנה התלת-ממדי של הפיגום הסופי 1,10.
לאחרונהדווח על הרעיון של פיגומים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים המורכבים ממוטות מיקרוג'ל פונקציונליים המתחברים במהירות בתמיסות מימיות ללא תוספים נוספים. האניזוטרופיה של מוטות מיקרוג'ל הביאה לנקבוביות גבוהות יותר ולהתפלגות נקבוביות עם גודל נקבוביות גדול יותר בהשוואה לשימוש במיקרו-ג'לים כדוריים במחקר זה11. באופן זה, פחות חומר יוצר נקבוביות גדולות יותר עם מגוון גיאומטריות נקבוביות שונות תוך שמירה על יציבות הפיגום התלת-ממדי. המערכת מורכבת משני סוגים של מוטות מיקרוג'ל עם קבוצות פונקציונליות משלימות של אמין ראשוני ואפוקסי הנצרכים בתוך התגובה ההדדית כאשר באים במגע זה עם זה. הקבוצות הפונקציונליות שאינן משתתפות בתהליך הקישור נשארות פעילות וניתן להשתמש בהן לבחירה לאחר שינוי עם פפטידים דביקים של תאים או גורמים ביו-אקטיביים אחרים. תאי פיברובלסטים מתחברים, מתפשטים ומתרבים כאשר הם מתרבים בתוך הפיגומים התלת-ממדיים, גדלים לראשונה על פני המיקרוג'ל וממלאים את רוב המקרופורים לאחר 5 ימים. מחקר ראשוני בתרבית משותפת של פיברובלסטים אנושיים ותאי אנדותל של ורידים בטבור אנושי (HUVECs) הראה תוצאות מבטיחות להיווצרות מבנים דמויי כלי דם בתוך הפיגומים התלת-ממדייםהמקושרים 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. חומר נדרש והכנות למיקרופלואידיקה
- עבור ההליך microfluidic המתואר, להשתמש 1 מ"ל ו 5 מ"ל מזרקי זכוכית משאבות מזרק. היווצרות טיפות על השבב נצפתה באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמה במהירות גבוהה.
- צור את תכנון השבב המיקרופלואידי (איור 1B) באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב והפק תבנית אב כפי שכבר דווח12.
- השג קרינת UV מבוקרת באמצעות UV-LED שנבנה בעצמו (λ = 365 ננומטר, קוטר ספוט ~ 4.7 מ"מ) המספק הקרנה במהירות של 957 mW / cm2 דרך זכוכית כיסוי בעובי 0.13 מ"מ.
הערה: קח בחשבון ייצור חום מקומי אפשרי על ידי ה- UV-LED במהלך הקרנה. אם זה המקרה, ודא קירור מספיק על ידי זרימת אוויר חיצונית.
2. ייצור מכשירים מיקרופלואידיים
הערה: ייצור המכשירים המיקרופלואידיים מבוסס על פרסוםקודם 13.
- הכינו 20 גרם של תערובת 10:1 (לפי מסה) של פולידימתילסילוקסן (PDMS) וחומר ריפוי. מערבבים במרץ במשך 3 דקות.
- יש לערבב 60 מ"ג של שמן אדום O ב-2.0 גרם טולואן. הוסיפו 50 מיקרו-ליטר של שמן O אדום בתמיסת טולואן לתערובת PDMS. מערבבים עד שתהיה התפלגות צבעים הומוגנית כדי להקטין את פיזור האור הלא רצוי ולשמור על גודל הכתם ממוקד במהלך הג'לציה על השבב.
- מוציאים את הבועות על ידי הכנסת התערובת למייבש המצויד במשאבת ואקום.
- יצקו את תערובת ה-PDMS לתבנית הראשית לגובה של 5-5.5 מ"מ והורידו שוב את הגז.
- אפשרו ל-PDMS להירפא במשך 18 שעות בטמפרטורת החדר כדי למנוע פגיעה בצבע דיאזו.
- חותכים את מבנה ה-PDMS ומנקבים חורי כניסה ויציאה לתוך המבנה באמצעות כלי דגימת ליבת קו (קוטר פנימי של 0.77 מ"מ, קוטר חיצוני של 1.07 מ"מ).
- יש לשטוף את ה-PDMS ולכסות את הזכוכית באיזופרופנול ובמים שעברו דה-יוניזציה שוב ושוב פי 5, ולאחר מכן להסיר את הנוזל באמצעות אוויר לחוץ או זרימת חנקן לאחר כל שלב כביסה.
- טפלו בזכוכית היבשה וב-PDMS יחד בתנור פלזמה בטמפרטורה של 0.2 mbar, עם זרימת חמצן של 20 מ"ל/דקה למשך 60 שניות ב-100 W, והתחברו ישירות כדי לקשור את הזכוכית וה-PDMS יחד כדי ליצור את ההתקן המיקרופלואידי.
הערה: הימנע מכיפוף מבנה PDMS במהלך תהליך הכריכה כדי למזער את העיוות במבנה הערוץ. - כדי להפוך את התעלות של השבב המיקרופלואידי להידרופובי, הנח את המכשיר יחד עם 50 μL של טריכלורו-(1 H,1 H,2 H,2 H-perfluoroctyl)-silane בתוך ייבוש תחת ואקום למשך הלילה (סגור את החיבור למשאבה לאחר הפחתת לחץ האדים). שטפו את החלק החיצוני של המכשיר עם הידרופלואורואטר.
אזהרה: בצעו את השלבים הבאים במכסה אדים והימנעו מכל מגע עם פרפלואורו סילאן. השתמשו במייבש ואקום מזכוכית אטום בגריז. יש לנקות את חומר הייבוש ביסודיות לפני השימוש למטרות אחרות.
3. הכנת פתרון עבור microfluidics
- לשלב השמן הרציף, יש לערבב שמן פרפין והקסדקן (1:1 v/v) ולהוסיף 8% (w/w) של חומר פעילי שטח לא יוניים. מלאו מזרק זכוכית אחד של 1 מ"ל (שמן ראשון, איור 1) ו-5 מ"ל (שמן שני, איור 1).
- הכינו את תמיסות הקדם-פולימר לשלב הפיזור בבקבוקוני זכוכית חומים למניעת פירוק פוטו-אינפורמציה וג'לציה לא מכוונת.
- תמיסת פרפולימר של רכיב אמין המכילה GRGDS-PC
- לתמיסה של 300 μL, שקלו 33.3 מ"ג של כוכב-פוליאתילן גליקול-אקרילט (sPEG-AC) ו-3.03 מ"ג של ליתיום פניל-2,4,6-טרימתילבנזואיל-פוספינאט (LAP).
- יש להמיס 18.74 מ"ג של 2-אמינואתיל מתקרילט הידרוכלוריד (AMA) ב-1.5 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה ולהעביר את התמיסה דרך מסנן מזרק (גודל נקבוביות 0.20 מיקרומטר).
הערה: AMA הוא היגרוסקופי ויש להשליך אותו ברגע שהמוצק יוצר גושים במיכל האחסון. - מכינים אליקוטים סטריליים של 36 mM GRGDS-PC במים ושומרים על טמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- השתמש ב-291.7 μL מתמיסת AMA כדי להמיס sPEG-AC ו-LAP, והוסף 8.3 μL מתמיסת GRGDS-PC. קח את הפתרון עם מזרק זכוכית 1 מ"ל ולהגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
- תמיסת פרפולימר של רכיב אפוקסי
- לתמיסת 300 μL, יש לשקול 33.3 מ"ג של כוכב-פוליאתילן גליקול-אקרילט (sPEG-AC), 3.03 מ"ג של LAP ולהתמוסס ב-300 μL של מים שעברו דה-יוניזציה. יש להוסיף 2.4 מ"ג של גליצידיל מתקרילט (GMA).
הערה: רעידות נמרצות מאיצות את התמוססות ה-GMA. קח את הפתרון עם מזרק זכוכית 1 מ"ל ולהגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
- לתמיסת 300 μL, יש לשקול 33.3 מ"ג של כוכב-פוליאתילן גליקול-אקרילט (sPEG-AC), 3.03 מ"ג של LAP ולהתמוסס ב-300 μL של מים שעברו דה-יוניזציה. יש להוסיף 2.4 מ"ג של גליצידיל מתקרילט (GMA).
- תמיסת פרפולימר של רכיב אמין המכילה GRGDS-PC
4. ייצור וטיהור של מוטות מיקרוג'ל פונקציונליים של אמין ואפוקסי
איור 1: סידור מכלול הג'לציה המיקרופלואידי על השבב . (A) מבט קדמי ומבט זוויתי על סידור הרכיבים במהלך מיקרופלואידיקה. (B) תכנון שבבים מיקרופלואידיים המשמשים לג'לציה על השבב של מוטות מיקרוג'ל. (1) צינור PE לכניסת השמן הראשונה. (2) צינור PE מוגן אור לכניסת שלב הפיזור. (3) צינור PE לכניסת השמן השנייה. (4) צינור PE מהשקע למיכל איסוף המוצרים. (5) מנורת UV ומיקום הקרנה בתעלה ישרה של 80 מיקרומטר ליד השקע. (6) עמדת מטרה/תצפית במיקרוסקופ. (7) רכיב PDMS צבעוני של ההתקן המיקרופלואידי. (8) כיסוי זכוכית המודבקת ל-PDMS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
- הכנס את המחטים לצינורות PE והסר את הגז מהמזרק ומהצינור.
- הכנס צינור PE לשקע לאיסוף מוצרים.
- הניחו את כל מזרקי הזכוכית במשאבות המזרקים והכניסו כל קצה צינור לכניסה המתאימה (איור 1).
הערה: הגן על צינורות הקדם-פולימר מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום או צינור שחור כדי למנוע ג'לציה לא מכוונת. - מקד את המיקרוסקופ בחתך השמן-מים.
- הפעל את משאבת מזרק השמן הראשונה (קצב זרימה = 100-200 μL / h) כדי למלא את הערוץ בשמן תחילה כדי למנוע הרטבת ערוץ על ידי שלב הפיזור.
- הפחיתו את קצב זרימת השמן הראשון ל-30 μL/h והפעילו את משאבת המזרק הפרה-פולימרית (קצב זרימה = 100-200 μL/h) עד שניתן יהיה לראות את השלב המיימי המפוזר בחתך.
- הגדר את קצב הזרימה הפרה-פולימרית ל-30 μL/h ומקד את המיקרוסקופ בשקע.
- הפעל את משאבת מזרק השמן השנייה (קצב זרימה של 300 μL/h) והמתן עד שמשטר הזרימה יהיה יציב.
- מניחים את צינור היציאה במיכל איסוף.
הערה: הנח את קצה הצינור בחלק העליון של המיכל כדי למנוע עלייה בלחץ עקב הצטברות המוצר לאורך זמן. - הגדר את מערכת קרינת ה-UV כך שהקרינה תהיה בטווח של 900-1000 mW/cm 2 (קרינה משומשת = 957 mW/cm2) ונקודת ההקרנה נמצאת בחלק הערוץ הישר לפני היציאה (איור 1B).
הערה: הקפידו לא להקרין ליד חתך השמן-מים כדי למנוע סתימת התעלה. להגנה נוספת, כסו את מבני התעלה לפני נקודת ההקרנה בחלק העליון של היחידה. - לפני קרינת UV, התאם את קצבי הזרימה של הפרה-פולימר והשמן הראשון כדי להשיג את יחס הגובה-רוחב הרצוי בטווח של 3.0 עד 4.5, והגדר את זמן ההקרנה של הפאזה המפוזרת ל~2.3 שניות, בהתאם לגודל נקודת ההקרנה.
- התחל קרינת UV, ובמידת הצורך, התאם את קצבי הזרימה שוב בהתאם לסעיף המשנה הקודם.
הערה: שים לב לייצור בהתחלה ועקוב אחר התנהגות זרימה יציבה בשקע ואחידות מוטות המיקרוג'ל. ניתן להתאים את זרימת השמן השנייה כדי לייעל את הובלת המוצרים בתוך השקע. - שנה את מיכל האיסוף וציין את זמן ההתחלה וקצב הזרימה של איסוף המוצרים.
הערה: יש להגן על המוצר מפני אבק. הפסק לאסוף לפני שכל מזרק מתרוקן מהתמיסה. - כדי לסיים את האיסוף, הסר את הגורם המכיל של האיסוף, תוך ציון הזמן. עצור הקרנה ואת כל משאבות המזרק.
- לאחר מכן יש לשטוף את המוצר 5x כל אחד עם n-הקסאן, איזופרופנול ומים שעברו דה-יוניזציה. יש להסיר את הסופר-נטנט לאחר שקיעת המוט.
הערה: לאחר כל תוספת תמיסה, פזרו את המוצר בזהירות והמתינו 10 דקות לפני החלפת הממס, בהתחשב בדיפוזיה מולקולרית. החלף את האיזופרופנול בהדרגה במים כדי למנוע מהמוטות לצוף אל פני השטח של הנוזל. מספר שלבי שטיפה נוספים עם מים מפחיתים את עקבות האיזופרופנול הנותרים.
5. היווצרות פיגומים מקרו-נקבוביים
- קבע את מספר מוטות המיקרוג'ל לכל נפח פיזור עבור דגימות תפקודי אפוקסי ואמין.
- התאם את מספר הדגימות הפונקציונליות של אפוקסי ואמין לפי דילול או ריכוז לערך דומה בין 1,000-5,000 מוטות/100 μL.
הערה: השתמש בצנטריפוגה בגודל ~2,000 x g למשך 5-10 שניות כדי להאיץ את שקיעת מוטות המיקרוג'ל. אם מספר המוטות לכל נפח פיזור נמוך, קישור מוטות עשוי לגרום לאשכולות מוטות קטנים יותר במקום מבנה יציב אחד. אם מספר המוטות לכל נפח פיזור גבוה, איכות הערבוב של שני הרכיבים תיפגע. - מעבירים את פיזור הרכיב הראשון (~ 1,200 מוטות) לבקבוקון שקוף חרוטי של 1.5 מ"ל או 2 מ"ל.
- הוסף את הרכיב השני באופן מבוקר בפעולה רציפה (100 μL פיפטה). לאחר התוספת, מערבבים את התוכן ישירות באמצעות פיפטה כדי לקחת נוזל ולהוסיף אותו שוב. המבנה המקושר נוצר תוך שניות במהלך הערבוב.
הערה: אם נוצרים אשכולות מרובים במקום מבנה קוהרנטי אחד, בדוק מחדש את מספר מוטות המיקרוג'ל לכל נפח או ספק ערבוב מבוקר יותר של שני הרכיבים.
6. דבק תאים לאחר שינוי
- חשב את המספר התיאורטי של קבוצות אפוקסי במבנה המקושר בהתבסס על קצב הזרימה של שלב הפולימר המפוזר, מספר המיקרוג'לים שנאספו במהלך זמן מסוים, וגורם הדילול של פיזור המיקרוג'ל המשמש להיווצרות פיגומים.
הערה: הערך את המספר התיאורטי של חבורות אפוקסי לכל פיגום לפי המשוואה הבאה.
n th: כמות תיאורטית של חומר
c GMA: ריכוזGMA בתמיסה פרפולימרית
ש: קצב זרימה של תמיסת פרפולימר - הוסף תמיסת GRGDS-PC למבנה המקושר כדי לשנות את כל קבוצות האפוקסי הנותרות כאשר פפטיד דבק התא נושא אמין ותיול חופשיים (n[קבוצות אפוקסי תיאורטיות]/n[GRGDS-PC] = 1). יש להשאיר בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
- הסר את המולקולות שלא הגיבו על ידי שטיפה במים שעברו דה-יוניזציה והסרת הסופרנטנט.
7. עיקור והעברה למדיה של תרבית תאים
- הפחיתו את מפלס המים כדי פשוט להטביע את הפיגום המחובר.
- פתח את הבקבוקון והקרן עם אור UV של λ = 250-300 ננומטר. סגרו את הבקבוקון והעבירו את הבקבוקון לספסל נקי. יש לשטוף 1x במים סטריליים.
- החליפו את המים בבקבוקון במדיה של תרבית תאים ואפשרו שיווי משקל למשך 5 דקות. חזור על זה עם מדיה תרבית תאים טריים 2x.
- מעבירים את הפיגום המקרו-נקבובי לצלחת באר של תרבית תאים לצורך הניסוי על ידי מזיגה או שימוש במרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2: מבנה פיגומים מקרו-נקבוביים מוצלבים . (A) הקרנה תלת-ממדית של ערימת Z של מיקרוסקופיה קונפוקלית בגודל 500 מיקרומטר של הפיגום המקרו-נקבובי המקושר. סרגל האבנית מייצג 500 מיקרומטר. (B) פיגום מקושר המורכב מ~10,000 מוטות מיקרו-ג'ל על כיסוי שנלקחה ישירות מהמים. סרגל קנה המידה מייצג 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
פרוטוקול זה יוצר מבנה מקרו-נקבובי תלת-ממדי יציב המורכב ממוטות מיקרו-ג'ל מתפקדים של אמין ואפוקסי (איור 2A). המבנה אמור להציג גיאומטריה קומפקטית אם משתמשים בסוג הערבוב המתואר, שנוצר תוך 2 שניות או 3 שניות (איור 2B).
יציבות המבנה המקושר תלויה באבני הבניין של מוט המיקרוג'ל שממנו הוא מורכב. מוטות המיקרוג'ל הפונקציונליים של אמין מפגינים קשיחות ממוצעת של 2.0 ± 0.2 kDa, הנקבעת על-ידי ננו-אינדנטנציה (איור 3A). אם המוטות רכים מדי, ייתכן שהמבנה המקרו-נקבובי המקושר לא יושג עקב עיוות של אבני הבניין. כדי לזהות קבוצות פונקציונליות פעילות, ניתן להשתמש באיזותיוציאנט פלואורסצין (FITC) כדי להמחיש קבוצות אמינו ראשוניות, וניתן להשתמש באיזומר אמין פלואורסצין I כדי לסמן קבוצות אפוקסי (איור 3B,C). למוטות מיקרוג'ל אמין יש ממדים באורך ממוצע של 553 מיקרומטר ± 29 מיקרומטר ורוחב ממוצע של 193 מיקרומטר ± 7 מיקרומטר במים שעברו דה-יוניזציה, וכתוצאה מכך יחס גובה-רוחב של ~3.0 והפחתה בנפח (קריסה) ב~73% מגודלם במדיה של תרבית תאים11.
איור 3: תכונות מיקרוג'ל. (A) מודולוס יעיל של יאנג של מוטות מיקרוג'ל אמין ואפוקסי יחד עם כדורי מיקרוג'ל אמין ואפוקסי הנמדדים על ידי ננו-אינדנטנציה. הנתונים מוצגים כמגרש קופסה המשתרע מהאחוזון ה-25 עד ה-75, כאשר השפם מגיע מ-5% ל-95% קוונטילים. הקווים בתוך התיבות מייצגים את החציונים, הריבועים הריקים מציינים את האמצעים, והריבועים השחורים מייצגים חריגים (n = 40; ערכי p מחושבים באמצעות ANOVA חד-כיווני עם תיקון Bonferroni, **p < 0.01, ****p < 0.0001). (B) למעלה: תמונת מיקרוסקופיה קונפוקלית של מוט מיקרוג'ל אמין המתפקד עם FITC ומוט מיקרוג'ל אפוקסי המתפקד עם איזומר אמין פלואורסצין I. למטה: תמונות שדה בהיר תואמות. כל סרגלי קנה המידה מייצגים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
כפי שתואר בפרסום הקשור, מיקרו-ג'לים דמויי כדור המיוצרים באותה שיטה מובילים לאשכולות מקושרים מרובים במקום פיגום מקרו-נקבובי יציבאחד 11. יחס הגובה-רוחב הגבוה יותר של מוטות המיקרוג'ל מאפשר יציבות כללית טובה יותר הודות לגישור מבנה יעיל יותר בתלת-ממד (איור 4).
איור 4: השפעת יחס הגובה-רוחב על היווצרות המבנה . (A) תמונת שדה בהירה של מבנה מקושר המורכב ממוטות מיקרוג'ל. (B) תמונת שדה בהירה של צבירים מקושרים המורכבים ממיקרו-ג'לים דמויי כדור. סרגלי קנה מידה מייצגים 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
הערכים הממוצעים של המאקרו-נקבוביות בפיגומים המורכבים ממוטות מיקרוג'ל הם 100 מיקרומטר, כאשר 90% מגודל הנקבוביות נע בין 30 מיקרומטר ליותר מ-150 מיקרומטר11. מיקרו-ג'לים דמויי כדור יוצרים צבירים עם גודל נקבוביות בין ~10 מיקרומטר ל-55 מיקרומטר, עם ערך ממוצע סביב 22 מיקרומטר11. זה עולה בקנה אחד עם המספרים המדווחים על ידי מחקרים אחרים המכינים MAPs המבוססים על מיקרוג'לים כדוריים 2,4,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אחד השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הוא האיכות של 2-אמינואתיל מתקרילט (AMA) המשמש כקומונומר לתפקוד אמין ראשוני. ה-AMA צריכה להיות אבקה עדינה ועדיף חסרת צבע המועברת במיכל זכוכית חום אטום לגז. יש להימנע משימוש בחומר ירקרק וגבשושי, שכן הוא פוגע באופן משמעותי בתגובת הג'לציה ומשפיע לרעה על יכולת השחזור של התוצאות. במקרה של ג'לציה לקויה ומוטות מיקרוג'ל לא יציבים, ניתן לשקול לשנות את הספק.
אם הערבוב של מוטות מיקרוג'ל אמין ואפוקסי מוביל לאשכולות מקושרים מרובים ולא למבנה יציב אחד, בדוק את מספר המוטות בכל פיזור מלאי והגדר אותו לערך דומה בטווח של 1,000-5,000 מוטות/100 μL עבור שתי הדגימות. אם מידות המיקרוג'ל שונות באופן משמעותי מהערכים שהוזכרו כאן, התאימו את מספר מוטות המיקרוג'ל לחלק הנפח. הגדל את המספר לכל נפח אם הג'לים קטנים יותר והקטין את המספר במקרה ההפוך.
השיטה המתוארת לא התמקדה באופטימיזציה של תהליך הערבוב כך שיהיה הרכבה מבוקרת יותר של שני רכיבי הערבוב הפונקציונליים המשלימים. מכיוון שקישור מתרחש תוך מספר שניות, הנפח הכולל של הפיזור ליצירת מבנה אחד מקושר ושברי הנפח של המיקרוג'לים המשמשים מותאמים לקבלת מבנים מקרו-נקבוביים יציבים פשוט על ידי ניפוח שני הרכיבים בזה אחר זה. בעתיד, יהיה זה יתרון לנתח את תכונות הזרימה והערבוב של פיזורי מוטות המיקרוג'ל ולקבל תובנה נוספת על היווצרות המבנה של הפיגומים. ערבוב מבוקר יותר של שני רכיבי המיקרוג'ל המקשרים זה לזה עשוי לאפשר היווצרות אוטומטית ותפוקה גבוהה של פיגומים מקרו-נקבוביים אלה ולאפשר צמיחה מצטברת של המבנה.
מכיוון שהקישור מתקדם במהירות רבה, נקבוביות הפיגום נוצרות במהלך הערבוב. אם מוטות המיקרוג'ל היו משקעים תחילה לחלוטין לפני שהם מתחברים כימית, ניתן היה לצפות ליחס ערימה לחסימה גבוה בהרבה. לכן, לקינטיקה המקשרת עשויה להיות השפעה גדולה על היווצרות MAP ועל גודל הנקבוביות והנקבוביות המתקבלות כתוצאה מכך. פונקציונליזציה של דבק תאים על ידי לאחר שינוי או שילוב ברשת הג'ל במהלך הכנת המיקרוג'ל הוכיחה כי L929 ותאי פיברובלסטים אנושיים מתחברים ומתפשטים תחילה על פני השטח של מוטות המיקרוג'ל, ולאחר מכן ממלאים את רוב המקרופורים לאחר 5-7 ימים בתרבית11. בשל גודל הנקבוביות הנע בעיקר בין 30 מיקרומטר ליותר מ-150 מיקרומטר ומבנה הנקבוביות המחוברות, שאושר על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, תאים שנזרעו יכולים להיכנס בקלות לפיגוםהמקושר 11. עד כה, פיגומים אלה המבוססים על מוטות מיקרוג'ל שימשו לגידול פיברובלסטים ותאי HUVEC בתרבית משותפת. HUVECs שנזרעו לאחר 14 יום של תרבית תאים פיברובלסטים יצרו מבנים מוארכים דמויי כלי דם ראשונים בתוך 16 הימיםהבאים 11. המחקר של סוגי תאים אחרים בתרביות משותפות נותר לטפל בעתיד. כדי לאפשר הוספה ישירה של תאים למערכת במהלך היווצרות פיגומים, נדרש קישור מוטות מהיר במאגרים תואמי תאים או במדיית תרבית, מה שיאפשר להרחיב מערכת זו לפלטפורמות הדפסה ביולוגית.
פיגומים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים שאינם ניתנים להזרקה יכולים להיווצר גם על ידי שיטות חלופיות שונות כמו יציקת ממסים, ייבוש בהקפאה, שטיפת חלקיקים מקציפים בגז, אלקטרוספינינג או הדפסה תלת-ממדית 1,15,16. נדידת תאים והתפשטותם יכולה להתרחש בקלות ללא צורך בפירוק הפיגום מראש, כל עוד הגיאומטריה והחדירות הנדרשות של הנקבוביות הושגו ברחבי הרשת. הדפסה תלת-ממדית תוך שימוש בביו-אינקים דחוסים וניתנים להבלטות מכדורי מיקרו-ג'ל מבוססי חומצה היאלורונית PEG, אגרוז ונורבורן שעברו עיבוד ביולוגי, משלבת את טכנולוגיות MAP והדפסה תלת-ממדית, ושולטת בנקבוביות שבין המיקרוג'לים המחושלים וגם בגיאומטריה של המבנה המודפס הכולל17.
בהשוואה לשיטות קיימות חלופיות, הפיגומים המתקבלים מציגים מגוון רחב של גיאומטריות מקרופורה תלת-ממדיות בשל יחס הגובה-רוחב הגבוה יותר של אבני הבניין של המיקרוג'ל ותצורת שני הרכיבים המשולבים שלהם11. השימוש במוטות מיקרוג'ל יוצר יותר נקבוביות, ולכן יותר מקום לאינטראקציות בין תאים בהשוואה להרכבת מיקרו-ג'לים כדוריים. זה מרכזי להיווצרות רקמות ביולוגיות מכיוון שהוא משפר את האינטראקציות בין התאים לתאים. יחד עם זאת, פחות חומר יכול לשמש לייצור פיגומים מקרו-נקבוביים של אותם נפחים, תוך שמירה על יציבות המבנה. הפחתת חומר הפיגומים מועילה מכיוון שיותר שטח פתוח מסופק להיווצרות רקמות, ויש לפרק פחות חומר, דבר שחשוב הן ליישומי in vitro והן ליישומי in vivo . ניתן להרחיב את הביופונקציונליזציה של המיקרוג'לים לסוגי פפטידים אחרים ולגורמים ביו-אקטיביים. הפיגומים המקרו-נקבוביים היציבים הנוצרים דורשים פחות חומר כדי ליצור יותר נקבוביות. יחד עם יכולת הכוונון של המערכת, שיטה זו מציעה פוטנציאל גבוה כפלטפורמה רב-תכליתית לתרבית תאים בתלת-ממד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מבטיחים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מביעים את תודתנו למחברים השותפים של עבודתנו הקודמת שמתודולוגיה זו מבוססת עליהם, סלין ממזר, לואיס פ. ב. גרזוני, יונקה קיטל, רוסטיסלב וינוקור, ניקולאי בורן ותמאס הרסטי. אנו מודים על מימון מ- Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) במסגרת הפרויקט B5 ו- C3 SFB 985 "מיקרוג'לים פונקציונליים ומערכות מיקרוג'ל". אנו מכירים במימון מוועדת התחרות של הסנאט של לייבניץ (SAW) במסגרת תוכנית Professorinnenprogram (SAW-2017-PB62: BioMat). אנו מכירים בכנות במימון מהנציבות האירופית (EUSMI, 731019). עבודה זו בוצעה בחלקה במרכז לטכנולוגיית פולימרים כימיים (CPT), אשר נתמך על ידי האיחוד האירופי והמדינה הפדרלית של נורדריין-וסטפאליה (מענק EFRE 30 00 883 02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Hsu, R. -S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Chen, Z., et al. Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere. Exploration. 1 (3), 20210036 (2021).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Guerzoni, L. P. B., et al. Cell encapsulation in soft, anisometric poly(ethylene) glycol microgels using a novel radical-free microfluidic system. Small. 15 (20), 1900692 (2019).
- Krüger, A. J. D., et al. Compartmentalized jet polymerization as a high-resolution process to continuously produce anisometric microgel rods with adjustable size and stiffness. Advanced Materials. 31 (49), 1903668 (2019).
- Darling, N. J., et al. Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Lutzweiler, G., Ndreu Halili,, Engin Vrana, N. The overview of porous, bioactive scaffolds as instructive biomaterials for tissue regeneration and their clinical translation. Pharmaceutics. 12 (7), 602 (2020).
- Dang, H. P., et al. 3D printed dual macro-, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function. Biofabrication. 11 (3), 035014 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
