Summary
पूरक प्रतिक्रियाशील समूहों के साथ माइक्रोगेल रॉड का उत्पादन जलीय घोल में इंटरलिंक करने की क्षमता के साथ माइक्रोफ्लुइडिक्स के माध्यम से किया जाता है। एनीसोमेट्रिक माइक्रोगेल गोलाकार-आधारित प्रणालियों की तुलना में बड़े छिद्रों के साथ स्थिर संरचनाओं में जाम और इंटरलिंक करते हैं। जीआरजीडीएस-पीसी के साथ संशोधित माइक्रोगेल मैक्रोपोरस 3 डी संरचनाएं बनाते हैं जिनका उपयोग सेल संस्कृति के लिए किया जा सकता है।
Abstract
माइक्रोफ्लुइडिक्स से कार्यात्मक माइक्रोगेल की एक दो-घटक प्रणाली आगे के एडिटिव्स के बिना जलीय घोल में 3 डी मैक्रोपोरस संरचनाओं में तेजी से इंटरलिंकिंग की अनुमति देती है। निरंतर फोटोइनेटेड ऑन-चिप गेलेशन माइक्रोजेल पहलू अनुपात की भिन्नता को सक्षम बनाता है, जो प्राप्त संरचनाओं के लिए बिल्डिंग ब्लॉक गुणों को निर्धारित करता है। ग्लाइसिडिल मेथैक्रिलेट (जीएमए) या 2-एमिनोइथाइल मेथैक्रिलेट (एएमए) मोनोमर्स को पॉलीइथाइलीन ग्लाइकोल (पीईजी) स्टार-पॉलिमर के आधार पर माइक्रोगेल नेटवर्क में कॉपोलीमरकिया जाता है ताकि या तो एपॉक्सी या अमाइन कार्यक्षमता प्राप्त की जा सके। कार्यात्मक माइक्रोजेल रॉड के निरंतर संग्रह को सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक आउटलेट संरचना में एक फोकसिंग तेल प्रवाह पेश किया जाता है। हाल के प्रकाशन के आधार पर, माइक्रोगेल रॉड-आधारित संरचनाओं के परिणामस्वरूप कई सौ माइक्रोमीटर के बड़े छिद्र होते हैं और साथ ही, गोलाकार-आधारित मॉडल की तुलना में समग्र उच्च पाड़ स्थिरता होती है। इस तरह, आवश्यक सामग्री की मात्रा को कम करते हुए अधिक मुक्त मात्रा के साथ उच्च मात्रा वाले निर्माणों का उत्पादन करना संभव है। इंटरलिंक्ड मैक्रोपोरस स्काफोल्ड्स को बिना किसी क्षति या विघटन के उठाया और ले जाया जा सकता है। अमीन और एपॉक्सी समूह इंटरलिंकिंग में शामिल नहीं हैं और संशोधन के बाद स्वतंत्र रूप से उपयोग किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल मैक्रोपोरस इंटरलिंक्ड स्काफोल्ड्स बनाने के लिए माइक्रोगेल रॉड के निर्माण के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन करता है जिसका उपयोग बाद के सेल प्रयोगों के लिए किया जा सकता है।
Introduction
3 डी संरचनाओं में जटिल सहकारी सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए, पाड़ प्लेटफार्मों को प्रजनन क्षमता में लगातार प्रदर्शन दिखाने की आवश्यकता होती है, सेल माइग्रेशन के लिए उपयुक्त ज्यामिति होती है, और साथ ही, जीवित ऊतकपर उनके प्रभाव की जांच करने के लिए पैरामीटर परिवर्तन के संदर्भ में कुछ लचीलेपन की अनुमति होती है। हाल के वर्षों में, मैक्रोपोरस एनाल्ड कणों (एमएपी) की अवधारणा, जिसे पहली बार सेगुरा एट अल द्वारा वर्णित किया गया था, 3 डी पाड़ उत्पादन2 के लिए एक कुशल और बहुमुखी मंच में विकसित हुआ। माइक्रोगेल की अनुरूप संरचना, जो अंतिम 3 डी पाड़ के निर्माण खंड हैं, निर्माण की कठोरता, जेल नेटवर्क की चयनात्मक रासायनिक प्रतिक्रिया, और पाड़ 2,3,4,5,6 के अंतिम छिद्र आकार जैसे गुणों को पूर्वनिर्धारित करती है। पाड़-सेल इंटरैक्शन के संकेतों के रूप में सेल चिपकने वाला पेप्टाइड्स को सेल अटैचमेंट की अनुमति देने के लिए माइक्रोगेल के बहुलक नेटवर्क में शामिल किया जाता है और संस्कृति में कोशिकाओं पर उनके विशिष्ट प्रभावों की जांच करने के लिए विविध हो सकता है। सहसंयोजक या आणविक बंधों के कारण 3 डी मचानों को नष्ट किए गए इंजेक्शन योग्य माइक्रोगेल को आपस में जोड़कर स्थिर किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप सेल कल्चर 2,3,5,7,8 के लिए मजबूत और परिभाषित निर्माण होते हैं।
माइक्रोफ्लुइडिक्स ने खुद को परिभाषित दानेदार हाइड्रोगेल 9 की तैयारी के लिए सबसे सटीक और अनुकूलनीय तरीकों में से एक के रूप में स्थापितकिया है। उनके रासायनिक, यांत्रिक और भौतिक मोनोफैलिटैरिटी को बनाए रखते हुए एक निरंतर प्रक्रिया में आवश्यक बिल्डिंग ब्लॉकों की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने की संभावना इस प्रक्रिया की उपयुक्तता में काफी योगदान देती है। इसके अलावा, उत्पादित माइक्रोगेल के आकार और आकार को विभिन्न तरीकों जैसे बैच इमल्शन, माइक्रोफ्लुइडिक्स, लिथोग्राफी, इलेक्ट्रोडायनामिक छिड़काव, या यांत्रिक विखंडन द्वारा हेरफेर किया जा सकता है, जो बिल्डिंग ब्लॉक की ज्यामिति निर्धारित करते हैं और इस प्रकार, अंतिम पाड़ 1,10 की 3 डी संरचना।
हाल ही में, कार्यात्मक माइक्रोजेल रॉड से बने मैक्रोपोरस 3 डी स्काफोल्ड्स की अवधारणा जो आगे के एडिटिव्स के बिना जलीय घोल में तेजी से इंटरलिंक होतीहै। माइक्रोगेल रॉड के अनिसोट्रॉपी के परिणामस्वरूप इस अध्ययन में गोलाकार माइक्रोगेल को नियोजित करने की तुलना में बड़े छिद्र आकारके साथ उच्च छिद्र और छिद्र वितरण हुआ। इस तरह, कम सामग्री 3 डी पाड़ की स्थिरता को बनाए रखते हुए विभिन्न छिद्र ज्यामिति की एक किस्म के साथ बड़े छिद्र बनाती है। प्रणाली में पूरक प्राथमिक अमाइन और एपॉक्सी कार्यात्मक समूहों के साथ दो प्रकार के माइक्रोजेल रॉड होते हैं जो एक दूसरे के संपर्क में आने पर इंटरलिंकिंग प्रतिक्रिया के भीतर उपभोग किए जाते हैं। कार्यात्मक समूह जो इंटरलिंकिंग प्रक्रिया में भाग नहीं लेते हैं, सक्रिय रहते हैं और सेल चिपकने वाले पेप्टाइड्स या अन्य बायोएक्टिव कारकों के साथ चयनात्मक पोस्ट-संशोधन के लिए उपयोग किया जा सकता है। फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाएं 3 डी मचानों के अंदर सुसंस्कृत होने पर संलग्न, फैलती हैं और प्रसार करती हैं, पहले माइक्रोजेल सतह पर बढ़ती हैं और 5 दिनों के बाद अधिकांश मैक्रोस्पोर्स को भरती हैं। मानव फाइब्रोब्लास्ट्स और मानव नाभि शिरा एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीईसी) के एक प्रारंभिक सह-संस्कृति अध्ययन ने इंटरलिंक्ड 3 डी स्काफोल्ड्स11 के भीतर पोत जैसी संरचनाओं के गठन के लिए आशाजनक परिणाम दिखाए।
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Protocol
1. माइक्रोफ्लुइडिक्स के लिए आवश्यक सामग्री और तैयारी
- वर्णित माइक्रोफ्लुइडिक प्रक्रिया के लिए, 1 एमएल और 5 एमएल ग्लास सिरिंज और सिरिंज पंप का उपयोग करें। ऑन-चिप ड्रॉपलेट गठन एक उच्च गति कैमरे से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखा जाता है।
- कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक चिप डिज़ाइन (चित्रा 1 बी) बनाएं और पहले से ही रिपोर्ट किए गएमास्टर टेम्पलेट का उत्पादन करें।
- स्व-निर्मित यूवी-एलईडी (3 = 365 एनएम, स्पॉट व्यास ~ 4.7 मिमी) का उपयोग करके नियंत्रित यूवी-विकिरण प्राप्त करें जो 0.13 मिमी मोटी कवर ग्लास के माध्यम से 957 एमडब्ल्यू / सेमी2 पर विकिरण प्रदान करता है।
नोट: विकिरण के दौरान यूवी-एलईडी द्वारा संभावित स्थानीय गर्मी उत्पादन को ध्यान में रखें। यदि ऐसा है, तो बाहरी वायु प्रवाह द्वारा पर्याप्त शीतलन सुनिश्चित करें।
2. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस उत्पादन
नोट: माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस उत्पादन पिछले प्रकाशन13 पर आधारित है।
- पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) और इलाज एजेंट के 10: 1 (द्रव्यमान द्वारा) मिश्रण का 20 ग्राम तैयार करें। 3 मिनट के लिए जोर से मिलाएं।
- 2.0 ग्राम टोल्यूनि में 60 मिलीग्राम तेल लाल ओ मिलाएं। पीडीएमएस मिश्रण में टोल्यूनि घोल में 50 μL तेल लाल ओ जोड़ें। अवांछित प्रकाश प्रकीर्णन को कम करने के लिए सजातीय रंग वितरण होने तक मिश्रण करें और ऑन-चिप गेलेशन के दौरान स्पॉट आकार को केंद्रित रखें।
- मिश्रण को वैक्यूम पंप से लैस डेसिकेटर में रखकर बुलबुले को हटा दें।
- पीडीएमएस मिश्रण को मास्टर टेम्पलेट में 5-5.5 मिमी की ऊंचाई पर डालें और फिर से डेगैस करें।
- डायज़ो डाई क्षरण से बचने के लिए पीडीएमएस को कमरे के तापमान पर 18 घंटे तक ठीक करने की अनुमति दें।
- एक लाइन कोर सैंपलिंग टूल (0.77 मिमी आंतरिक व्यास, 1.07 मिमी बाहरी व्यास) का उपयोग करके संरचना में पीडीएमएस संरचना और पंच इनलेट और आउटलेट छेद काटें।
- पीडीएमएस को धोएं और ग्लास को आइसोप्रोपेनॉल और विआयनीकृत पानी के साथ बार-बार 5 गुना कवर करें और बाद में, प्रत्येक धोने के चरण के बाद दबाव वाली हवा या नाइट्रोजन प्रवाह के माध्यम से तरल को हटा दें।
- सूखे ग्लास और पीडीएमएस को 0.2 एमबार पर प्लाज्मा ओवन में एक साथ इलाज करें, जिसमें 100 डब्ल्यू पर 60 सेकंड के लिए 20 एमएल / मिनट का ऑक्सीजन प्रवाह हो, और माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस बनाने के लिए ग्लास और पीडीएमएस को एक साथ बांधने के लिए सीधे कनेक्ट करें।
नोट: चैनल संरचना विरूपण को कम करने के लिए बाध्यकारी प्रक्रिया के दौरान पीडीएमएस संरचना को झुकाने से बचें। - माइक्रोफ्लुइडिक चिप हाइड्रोफोबिक के चैनलों को प्रस्तुत करने के लिए, डिवाइस को रात भर वैक्यूम के तहत एक डेसिकेटर में ट्राइक्लोरो-(1 एच, 1एच, 2 एच, 2एच-परफ्लोरोक्टिल) -सिलेन के 50 μL के साथ एक साथ रखें (वाष्प दबाव को कम करने के बाद पंप से कनेक्शन बंद करें)। हाइड्रोफ्लोरोएथर के साथ डिवाइस के बाहर कुल्ला करें।
सावधानी: इन चरणों को एक फ्यूम हुड में करें और परफ्लोरो सिलेन के साथ किसी भी संपर्क से बचें। ग्रीस के साथ सील किए गए ग्लास वैक्यूम डेसिकेटर का उपयोग करें। अन्य उद्देश्यों के लिए उपयोग करने से पहले डेसिकेटर को अच्छी तरह से साफ करें।
3. माइक्रोफ्लुइडिक्स के लिए समाधान तैयार करना
- निरंतर तेल चरण के लिए, पैराफिन तेल और हेक्साडेकेन (1: 1 v / v) मिलाएं और एक गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट का 8% (w / w) जोड़ें। एक 1 एमएल (पहला तेल, चित्रा 1) और एक 5 एमएल (दूसरा तेल, चित्रा 1) ग्लास सिरिंज भरें।
- फोटोइनिटेटर अपघटन और अनपेक्षित गेलेशन को रोकने के लिए भूरे रंग की कांच की शीशियों में फैलाव चरण के लिए प्रीपॉलीमर समाधान तैयार करें।
- जीआरजीडीएस-पीसी युक्त अमाइन घटक प्रीपोलीमर समाधान
- 300 μL समाधान के लिए, स्टार-पॉलीथीन ग्लाइकोल-एक्रिलेट (एसपीईजी-एसी) के 33.3 मिलीग्राम और लिथियम फिनाइल -2,4,6-ट्राइमिथाइलबेंजोइलफॉस्फिनेट (एलएपी) के 3.03 मिलीग्राम का वजन करें।
- 1.5 एमएल विआयनीकृत पानी में 18.74 मिलीग्राम 2-एमिनोइथाइल मेथैक्रिलेट हाइड्रोक्लोराइड (एएमए) को घोलें और एक सिरिंज फिल्टर (0.20 μm छिद्र आकार) के माध्यम से समाधान पारित करें।
नोट: एएमए हाइग्रोस्कोपिक है और जैसे ही ठोस भंडारण कंटेनर में गांठ बनाता है, इसे छोड़ दिया जाना चाहिए। - पानी में बाँझ 36 mM GRGDS-PC एलिकोट तैयार करें और उपयोग होने तक -20 °C पर रखें।
- एसपीईजी-एसी और एलएपी को भंग करने के लिए एएमए समाधान के 291.7 μL का उपयोग करें, और GRGDS-PC समाधान के 8.3 μL जोड़ें। 1 एमएल ग्लास सिरिंज के साथ समाधान लें और एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करके प्रकाश से बचाएं।
- एपॉक्सी घटक प्रीपॉलीमर समाधान
- 300 μL घोल के लिए, 33.3 मिलीग्राम स्टार-पॉलीथीन ग्लाइकोल-एक्रिलेट (एसपीईजी-एसी), 3.03 मिलीग्राम एलएपी का वजन करें और 300 μL विआयनीकृत पानी में घुल जाएं। 2.4 मिलीग्राम ग्लाइसिडिल मेथैक्रिलेट (जीएमए) जोड़ें।
नोट: जोरदार झटके जीएमए को भंग करने में तेजी लाते हैं। 1 एमएल ग्लास सिरिंज के साथ समाधान लें और एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करके प्रकाश से बचाएं।
- 300 μL घोल के लिए, 33.3 मिलीग्राम स्टार-पॉलीथीन ग्लाइकोल-एक्रिलेट (एसपीईजी-एसी), 3.03 मिलीग्राम एलएपी का वजन करें और 300 μL विआयनीकृत पानी में घुल जाएं। 2.4 मिलीग्राम ग्लाइसिडिल मेथैक्रिलेट (जीएमए) जोड़ें।
- जीआरजीडीएस-पीसी युक्त अमाइन घटक प्रीपोलीमर समाधान
4. अमाइन और एपॉक्सी कार्यात्मक माइक्रोगेल रॉड का उत्पादन और शुद्धिकरण
चित्र 1: माइक्रोफ्लुइडिक ऑन-चिप गेलेशन असेंबली की व्यवस्था। (ए) माइक्रोफ्लुइडिक्स के दौरान घटक व्यवस्था का फ्रंट व्यू और एंगल्ड व्यू। (बी) माइक्रोफ्लूइडिक चिप डिजाइन का उपयोग माइक्रोजेल रॉड के ऑन-चिप गेलेशन के लिए किया जाता है। (1) पहले तेल इनलेट के लिए पीई ट्यूब। (2) तितर-बितर चरण इनलेट के लिए प्रकाश-संरक्षित पीई ट्यूब। (3) दूसरे तेल इनलेट के लिए पीई ट्यूब। (4) आउटलेट से उत्पाद संग्रह कंटेनर तक पीई ट्यूब। (5) आउटलेट के पास सीधे 80 μm चैनल पर यूवी लैंप और विकिरण स्थान। (6) माइक्रोस्कोप उद्देश्य / अवलोकन स्थिति। (7) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का रंगीन पीडीएमएस घटक। (8) पीडीएमएस से बंधे ग्लास को कवर करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- सुइयों को पीई ट्यूबों में डालें और सिरिंज और ट्यूब से गैस को हटा दें।
- उत्पाद संग्रह के लिए आउटलेट में एक पीई ट्यूब डालें।
- सिरिंज पंप में सभी ग्लास सिरिंज रखें और प्रत्येक ट्यूबिंग छोर को संबंधित इनलेट में डालें (चित्रा 1)।
नोट: अनजाने में गेलेशन से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी या काली ट्यूब के माध्यम से प्रीपॉलीमर टयूबिंग को प्रकाश से बचाएं। - तेल-पानी क्रॉस-सेक्शन पर माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें।
- फैलाव चरण द्वारा चैनल गीला होने से रोकने के लिए चैनल को पहले तेल से भरने के लिए पहला तेल सिरिंज पंप (प्रवाह दर = 100-200 μL / h) शुरू करें।
- पहली तेल प्रवाह दर को 30 μL / h तक कम करें और प्रीपॉलिमर सिरिंज पंप (प्रवाह दर = 100-200 μL / h) शुरू करें जब तक कि क्रॉस-सेक्शन पर छितरी हुई जलीय अवस्था नहीं देखी जा सकती है।
- प्रीपॉलीमर प्रवाह दर को 30 μL / h पर सेट करें और आउटलेट पर माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें।
- दूसरा तेल सिरिंज पंप (300 μL / h की प्रवाह दर) शुरू करें और प्रवाह शासन स्थिर होने तक प्रतीक्षा करें।
- आउटलेट ट्यूब को एक संग्रह कंटेनर में रखें।
नोट: समय के साथ उत्पाद के संचय के कारण दबाव वृद्धि से बचने के लिए कंटेनर के ऊपरी भाग में ट्यूब के अंत को रखें। - यूवी विकिरण प्रणाली को इस तरह सेट करें कि विकिरण 900-1000 mW / cm2 (प्रयुक्त विकिरण = 957 mW / cm2) की सीमा में है और विकिरण स्थान आउटलेट से पहले सीधे चैनल भाग में है (चित्रा 1 बी)।
नोट: चैनल को बंद करने से बचने के लिए तेल-पानी क्रॉस-सेक्शन के पास विकिरणित न करना सुनिश्चित करें। अतिरिक्त सुरक्षा के लिए, इकाई के शीर्ष पर विकिरण स्पॉट से पहले चैनल संरचनाओं को कवर करें। - यूवी विकिरण से पहले, 3.0 से 4.5 की सीमा में वांछित पहलू अनुपात प्राप्त करने के लिए प्रीपॉलीमर और पहले तेल की प्रवाह दरों को समायोजित करें, और विकिरण स्पॉट के आकार के आधार पर बिखरे हुए चरण के विकिरण समय को ~ 2.3 एस पर सेट करें।
- यूवी विकिरण शुरू करें और यदि आवश्यक हो, तो पिछले उपखंड के अनुसार प्रवाह दरों को फिर से समायोजित करें।
नोट: शुरुआत में उत्पादन का निरीक्षण करें और आउटलेट में स्थिर प्रवाह व्यवहार और माइक्रोगेल रॉड की एकरूपता के लिए निगरानी करें। आउटलेट के भीतर उत्पाद परिवहन को अनुकूलित करने के लिए दूसरे तेल प्रवाह को समायोजित किया जा सकता है। - संग्रह कंटेनर परिवर्तित करें और उत्पाद संग्रह प्रारंभ समय और प्रवाह दरों को नोट करें.
नोट: उत्पाद को धूल से बचाएं। इससे पहले कि कोई सिरिंज घोल कम हो, इकट्ठा करना बंद कर दें। - संग्रह समाप्त करने के लिए, समय नोट करते हुए संग्रह कंटेनर निकालें. विकिरण और सभी सिरिंज पंप बंद करें।
- उत्पाद को बाद में एन-हेक्सेन, आइसोप्रोपेनॉल और विआयनीकृत पानी के साथ 5 गुना धोएं। रॉड अवसादन के बाद सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
नोट: प्रत्येक समाधान जोड़ने के बाद, उत्पाद को सावधानी से फैलाएं और आणविक प्रसार पर विचार करते हुए विलायक को बदलने से पहले 10 मिनट प्रतीक्षा करें। तरल की सतह पर रॉड को तैरने से रोकने के लिए आइसोप्रोपेनोल को धीरे-धीरे पानी से बदलें। पानी के साथ कई अतिरिक्त धोने के कदम शेष आइसोप्रोपेनॉल निशान को कम करते हैं।
5. मैक्रोपोरस पाड़ गठन
- एपॉक्सी और अमाइन कार्यात्मक नमूनों के लिए प्रति फैलाव मात्रा में माइक्रोगेल रॉड की संख्या निर्धारित करें।
- एपॉक्सी और अमाइन कार्यात्मक नमूनों की संख्या को कमजोर पड़ने या एकाग्रता द्वारा 1,000-5,000 छड़ / 100 μL के बीच समान मूल्य पर समायोजित करें।
नोट: माइक्रोगेल रॉड के अवसादन को गति देने के लिए 5-10 सेकंड के लिए ~ 2,000 x g पर एक सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करें। यदि प्रति फैलाव मात्रा में छड़ों की संख्या कम है, तो रॉड-इंटरलिंकिंग के परिणामस्वरूप एक स्थिर निर्माण के बजाय छोटे रॉड क्लस्टर हो सकते हैं। यदि प्रति फैलाव मात्रा में छड़ों की संख्या अधिक है, तो दो घटकों की मिश्रण गुणवत्ता से समझौता किया जाएगा। - पहले घटक (~ 1,200 छड़) फैलाव को शंक्वाकार 1.5 एमएल या 2 एमएल पारदर्शी शीशी में स्थानांतरित करें।
- एक निरंतर ऑपरेशन में नियंत्रित तरीके से दूसरा घटक जोड़ें (100 μL पिपेट)। इसके अलावा, तरल लेने के लिए पिपेट का उपयोग करके सामग्री को सीधे मिलाएं और इसे फिर से जोड़ें। मिश्रण के दौरान सेकंड के भीतर परस्पर जुड़ी संरचना बन जाती है।
नोट: यदि एक सुसंगत संरचना के बजाय कई क्लस्टर बनते हैं, तो प्रति मात्रा माइक्रोगेल रॉड की संख्या को फिर से जांचें या दो घटकों का अधिक नियंत्रित मिश्रण प्रदान करें।
6. सेल चिपकने वाला पोस्ट-संशोधन
- बिखरे हुए बहुलक चरण की प्रवाह दर, एक विशिष्ट समय के दौरान एकत्र किए गए माइक्रोगेल की संख्या और मचान गठन के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोगेल फैलाव के कमजोर पड़ने के कारक के आधार पर इंटरलिंक संरचना में एपॉक्सी समूहों की सैद्धांतिक संख्या की गणना करें।
नोट: निम्नलिखित समीकरण द्वारा प्रति मचान एपॉक्सी समूहों की सैद्धांतिक संख्या का अनुमान लगाएं।
nth: पदार्थ की सैद्धांतिक मात्रा
सीजीएमए: प्रीपॉलीमर समाधान में जीएमए एकाग्रता
प्रश्न: प्रीपॉलीमर समाधान की प्रवाह दर - एक मुक्त अमाइन और थिओल (एन[सैद्धांतिक एपॉक्सी समूहों]/एन [जीआरजीडीएस-पीसी] = 1) वाले सेल चिपकने वाले पेप्टाइड के साथ सभी शेष एपॉक्सी समूहों को संशोधित करने के लिए इंटरलिंक्ड संरचना में जीआरजीडीएस-पीसी समाधान जोड़ें। रात भर कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
- विआयनीकृत पानी से धोकर और सतह पर तैरने वाले को हटाकर अपरिवर्तित अणुओं को हटा दें।
7. सेल संस्कृति मीडिया में नसबंदी और स्थानांतरण
- आपस में जुड़े मचान को डुबोने के लिए पानी के स्तर को कम करें।
- शीशी खोलें और 250-300 एनएम के यूवी प्रकाश के साथ विकिरणित करें। शीशी को बंद करें और शीशी को एक साफ बेंच पर स्थानांतरित करें। बाँझ पानी से 1x धो लें।
- शीशी में पानी को सेल कल्चर मीडिया के साथ बदलें और 5 मिनट के लिए संतुलन की अनुमति दें। इसे ताजा सेल संस्कृति मीडिया 2x के साथ दोहराएं।
- स्पैटुला डालकर या उपयोग करके प्रयोग के लिए मैक्रोपोरस पाड़ को सेल कल्चर वेल प्लेट में स्थानांतरित करें।
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Representative Results
चित्र 2: मैक्रोपोरस क्रॉसलिंक्ड पाड़ संरचना। (ए) इंटरलिंक्ड मैक्रोपोरस पाड़ के 500 μm कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी Z-स्टैक का 3D प्रक्षेपण। स्केल बार 500 μm का प्रतिनिधित्व करता है। (B) इंटरलिंक्ड पाड़ जो सीधे पानी से बाहर निकाले गए कवर ग्लास पर ~ 10,000 माइक्रोजेल रॉड से बना होता है। स्केल पट्टी 5 मिमी का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप एक स्थिर 3 डी मैक्रोपोरस निर्माण होता है जो इंटरलिंक्ड अमाइन और एपॉक्सी फंक्शनलाइज्ड माइक्रोगेल रॉड (चित्रा 2 ए) से बना होता है। यदि वर्णित प्रकार के मिश्रण का उपयोग किया जाता है, तो निर्माण को एक कॉम्पैक्ट ज्यामिति प्रदर्शित करनी चाहिए, जो 2 एस या 3 एस (चित्रा 2 बी) के भीतर बनती है।
इंटरलिंक्ड निर्माण स्थिरता माइक्रोगेल रॉड बिल्डिंग ब्लॉकों पर निर्भर करती है जिसमें से यह बना है। अमाइन कार्यात्मक माइक्रोगेल रॉड 2.0 ± 0.2 केडीए की औसत कठोरता प्रदर्शित करते हैं, जो नैनोइंडेंटेशन (चित्रा 3 ए) द्वारा निर्धारित किया जाता है। यदि छड़ें बहुत नरम हैं, तो बिल्डिंग ब्लॉकों के विरूपण के कारण इंटरलिंक्ड मैक्रोपोरस संरचना प्राप्त नहीं की जा सकती है। सक्रिय कार्यात्मक समूहों का पता लगाने के लिए, प्राथमिक अमीनो समूहों की कल्पना करने के लिए फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) का उपयोग किया जा सकता है, और फ्लोरेसिन अमाइन आइसोमर आई को एपॉक्सी समूहों (चित्रा 3 बी, सी) को लेबल करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। अमाइन माइक्रोजेल रॉड में 553 μm ± 29 μm की औसत लंबाई और विआयनीकृत पानी में 193 μm ± 7 μm की औसत चौड़ाई के साथ आयाम होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप ~ 3.0 का पहलू अनुपात होता है और सेल कल्चर मीडिया11 में उनके आकार के ~ 73% तक मात्रा (पतन) में कमी आती है।
चित्र 3: माइक्रोजेल गुण। (ए) प्रभावी यंग के एमाइन और एपॉक्सी माइक्रोगेल रॉड के मापांक के साथ-साथ एमाइन और एपॉक्सी माइक्रोगेल गोले नैनोइंडेंटेशन द्वारा मापा जाता है। डेटा को 25 वें से 75 वें प्रतिशत तक फैले बॉक्स प्लॉट के रूप में प्रदर्शित किया गया है, जिसमें मूंछें 5% से 95% तक पहुंचती हैं। बक्से के अंदर की रेखाएं माध्यिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं, खाली वर्ग साधनों को इंगित करते हैं, और काले वर्ग आउटलायर्स का प्रतिनिधित्व करते हैं (एन = 40; पी-मानों की गणना बोनफेरोनी सुधार के साथ एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके की जाती है, ** पी < 0.01, ****पी < 0.0001)। (बी) शीर्ष: एफआईटीसी के साथ कार्यात्मक एक अमाइन माइक्रोगेल रॉड की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवि और फ्लोरेसिन अमाइन आइसोमर के साथ कार्यात्मक एक एपॉक्सी माइक्रोगेल रॉड। सभी स्केल पट्टियाँ 100 μm का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
जैसा कि संबंधित प्रकाशन में वर्णित है, एक ही विधि के माध्यम से उत्पादित गोले जैसे माइक्रोगेल एक स्थिर मैक्रोपोरस पाड़11 के बजाय कई परस्पर जुड़े समूहों को जन्म देते हैं। माइक्रोगेल रॉड का उच्च पहलू अनुपात 3 डी में अधिक कुशल संरचना ब्रिजिंग के कारण बेहतर समग्र स्थिरता की अनुमति देता है (चित्रा 4)।
चित्र 4: संरचना निर्माण पर पहलू अनुपात का प्रभाव। (A) माइक्रोगेल रॉड से बने एक परस्पर जुड़े निर्माण की उज्ज्वल क्षेत्र छवि। (बी) गोले जैसे माइक्रोगेल से बने परस्पर जुड़े समूहों की उज्ज्वल क्षेत्र छवि। स्केल पट्टियाँ 500 μm का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
माइक्रोजेल छड़ों से बने मचानों में मैक्रोपोर्स का औसत मान 100 μm है, जिसमें 90% छिद्र आकार 30 μm से 150 μm11 से अधिक है। गोले जैसे माइक्रोगेल के परिणामस्वरूप ~ 10 μm से 55 μm के बीच छिद्र आकार वाले समूह होते हैं, जिनका औसत मान लगभग 22 μm11 होता है। यह गोलाकार माइक्रोगेल 2,4,14 के आधार पर एमएपी तैयार करने वाले अन्य अध्ययनों द्वारा रिपोर्ट की गई संख्याओं के अनुरूप है।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में से एक प्राथमिक अमाइन कार्यात्मककरण के लिए कोमोनोमर के रूप में उपयोग किए जाने वाले 2-एमिनोइथाइल मेथैक्रिलेट (एएमए) की गुणवत्ता है। एएमए एक बारीक-बारीक और अधिमानतः रंगहीन पाउडर होना चाहिए जो गैस-तंग भूरे रंग के ग्लास कंटेनर में वितरित किया जाता है। किसी को हरे और गांठदार सामग्री का उपयोग करने से बचना चाहिए, क्योंकि यह गेलेशन प्रतिक्रिया को काफी कम करता है और परिणामों की प्रजनन क्षमता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है। खराब गेलेशन और अस्थिर माइक्रोजेल रॉड के मामले में, आपूर्तिकर्ता को बदलने पर विचार किया जा सकता है।
यदि अमाइन और एपॉक्सी माइक्रोगेल रॉड के मिश्रण से एक स्थिर संरचना के बजाय कई इंटरलिंक क्लस्टर होते हैं, तो प्रत्येक स्टॉक फैलाव में छड़ों की संख्या की जांच करें और इसे दोनों नमूनों के लिए 1,000-5,000 रॉड / 100 μL की सीमा में समान मूल्य पर सेट करें। यदि माइक्रोजेल के आयाम यहां उल्लिखित मूल्यों से काफी भिन्न होते हैं, तो माइक्रोगेल रॉड की संख्या को वॉल्यूम अंश में समायोजित करें। यदि जैल छोटे हैं तो प्रति मात्रा संख्या बढ़ाएं और विपरीत मामले में संख्या कम करें।
वर्णित विधि ने मिश्रण प्रक्रिया को अनुकूलित करने पर ध्यान केंद्रित नहीं किया ताकि दो पूरक कार्यात्मक मिश्रण घटकों की अधिक नियंत्रित असेंबली हो सके। चूंकि इंटरलिंकिंग कुछ सेकंड के भीतर होती है, इसलिए फैलाव की कुल मात्रा एक इंटरलिंक्ड निर्माण बनाने के लिए और उपयोग किए गए माइक्रोगेल के वॉल्यूम अंशों को एक के बाद एक दो घटकों को पाइप करके स्थिर मैक्रोपोरस संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जाता है। भविष्य में, माइक्रोजेल रॉड फैलाव के प्रवाह और मिश्रण गुणों का विश्लेषण करना और मचानों की संरचना गठन में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्राप्त करना फायदेमंद होगा। दो इंटरलिंकिंग माइक्रोजेल घटकों का अधिक नियंत्रित मिश्रण इन मैक्रोपोरस मचानों के स्वचालित और उच्च-थ्रूपुट गठन को सक्षम कर सकता है और वृद्धिशील निर्माण विकास की अनुमति दे सकता है।
चूंकि इंटरलिंकिंग बहुत तेजी से आगे बढ़ती है, इसलिए मिश्रण के दौरान मचान के छिद्र बनते हैं। यदि रासायनिक रूप से इंटरलिंकिंग से पहले माइक्रोगेल रॉड को पहले पूरी तरह से तलछट किया गया था, तो जैमिंग अनुपात के लिए बहुत अधिक स्टैकिंग की उम्मीद की जाएगी। इसलिए, इंटरलिंकिंग कैनेटीक्स का एमएपी गठन और परिणामस्वरूप छिद्र और छिद्र आकार पर बड़ा प्रभाव पड़ने की संभावना है। माइक्रोजेल तैयारी के दौरान जेल नेटवर्क में संशोधन या समावेश के बाद सेल-चिपकने वाला कार्यात्मककरण ने दिखाया है कि एल 9 2 9 और मानव फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाएं पहले माइक्रोगेल रॉड की सतह पर संलग्न और फैलती हैं और बाद में, संस्कृति11 में 5-7 दिनों के बाद अधिकांश मैक्रोस्पोर्स को भर देती हैं। मुख्य रूप से 30 μm से 150 μm से ऊपर तक के छिद्र आकार और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की गई परस्पर छिद्र संरचना के कारण, बीज वाली कोशिकाएं आसानी से इंटरलिंक्ड पाड़11 में प्रवेश कर सकती हैं। अब तक, इन माइक्रोगेल रॉड-आधारित मचानों का उपयोग सह-संस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट और एचयूवीईसी कोशिकाओं को विकसित करने के लिए किया गया है। फाइब्रोब्लास्ट सेल कल्चर के 14 दिनों के बाद बीजित एचयूवीईसी ने अगले 16दिनों के भीतर पहली लम्बी पोत जैसी संरचनाओं का गठन किया। सह-संस्कृतियों में अन्य सेल प्रकारों का अध्ययन भविष्य में संबोधित किया जाना बाकी है। पाड़ निर्माण के दौरान कोशिकाओं को सीधे सिस्टम में जोड़ने की अनुमति देने के लिए, सेल-संगत बफर या कल्चर मीडिया में फास्ट रॉड इंटरलिंकिंग की आवश्यकता होती है, जो इस प्रणाली को बायोप्रिंटिंग प्लेटफार्मों तक विस्तारित करने में सक्षम बनाएगी।
गैर-इंजेक्टेबल मैक्रोपोरस 3 डी स्काफोल्ड्स को विलायक कास्टिंग, फ्रीज-सुखाने, गैस फोमिंग पार्टिकुलेट लीचिंग, इलेक्ट्रोस्पिनिंग, या 3 डी प्रिंटिंग 1,15,16 जैसे विभिन्न वैकल्पिक तरीकों से भी बनाया जा सकता है। सेल माइग्रेशन और प्रसार आसानी से मचान को पहले से नीचा दिखाने की आवश्यकता के बिना हो सकता है, जब तक कि पूरे नेटवर्क में आवश्यक छिद्र ज्यामिति और पारगम्यता हासिल की गई हो। पीईजी-, अगारोस-, और नॉरबोर्न-संशोधित हाइलूरोनिक एसिड-आधारित माइक्रोगेल गोले से जाम, एक्सट्रूडेबल बायोइंक का उपयोग करके 3 डी प्रिंटिंग एमएपी और 3 डी प्रिंटिंग प्रौद्योगिकियों को जोड़ती है, जो नष्ट माइक्रोगेल के बीच सरंध्रता को नियंत्रित करती है और समग्र मुद्रित संरचना17 की ज्यामिति भी है।
वैकल्पिक मौजूदा तरीकों की तुलना में, परिणामी मचान माइक्रोजेल बिल्डिंग ब्लॉकों के उच्च पहलू अनुपात और उनके इंटरलिंक्ड दो-घटक कॉन्फ़िगरेशन11 के कारण 3 डी मैक्रोपोर ज्यामिति की एक विस्तृत विविधता प्रदर्शित करते हैं। माइक्रोगेल रॉड का उपयोग अधिक छिद्र पैदा करता है और इस प्रकार, गोलाकार माइक्रोगेल की असेंबली की तुलना में सेल-सेल इंटरैक्शन के लिए अधिक जगह बनाता है। यह जैविक ऊतक गठन के लिए केंद्रीय है क्योंकि यह सेल-सेल इंटरैक्शन को बढ़ाता है। इसी समय, निर्माण की स्थिरता को बनाए रखते हुए, समान मात्रा के मैक्रोपोरस स्काफोल्ड्स का उत्पादन करने के लिए कम सामग्री का उपयोग किया जा सकता है। पाड़ सामग्री की कमी फायदेमंद है क्योंकि ऊतक निर्माण के लिए अधिक खुली जगह प्रदान की जाती है, और कम सामग्री को नीचा दिखाना पड़ता है, जो इन विट्रो और विवो अनुप्रयोगों दोनों के लिए महत्वपूर्ण है। माइक्रोगेल के बायोफंक्शनलाइजेशन को अन्य पेप्टाइड प्रकारों और बायोएक्टिव कारकों तक बढ़ाया जा सकता है। परिणामस्वरूप स्थिर मैक्रोपोरस मचानों को अधिक छिद्र बनाने के लिए कम सामग्री की आवश्यकता होती है। सिस्टम की ट्यूनेबिलिटी के साथ, यह विधि 3 डी में सेल संस्कृति के लिए एक बहुमुखी मंच के रूप में उच्च क्षमता प्रदान करती है।
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Disclosures
लेखक आश्वस्त करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम अपने पिछले काम के सह-लेखकों के प्रति आभार व्यक्त करते हैं, यह पद्धति सेलिन बास्टर्ड, लुइस पीबी गुएरज़ोनी, योंका किटेल, रोस्टिस्लाव विनोकुर, निकोलाई बोर्न और तमस हरास्ज़ती पर आधारित है। हम परियोजना बी 5 और सी 3 एसएफबी 985 "फंक्शनल माइक्रोगेल्स एंड माइक्रोगेल सिस्टम्स" के भीतर ड्यूश फोर्सचुंग्सगेमिनशाफ्ट (डीएफजी) से वित्त पोषण को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं। हम प्रोफेसरइनन प्रोग्राम (एसएडब्ल्यू-2017-पीबी 62: बायोमैट) के तहत लीबनिज़ सीनेट प्रतियोगिता समिति (एसएडब्ल्यू) से वित्त पोषण स्वीकार करते हैं। हम ईमानदारी से यूरोपीय आयोग (EUSMI, 731019) से वित्त पोषण स्वीकार करते हैं। यह काम सेंटर फॉर केमिकल पॉलिमर टेक्नोलॉजी (सीपीटी) में आंशिक रूप से किया गया था, जिसे यूरोपीय संघ और उत्तरी राइन-वेस्टफेलिया के संघीय राज्य (अनुदान ईएफआरई 30 00 883 02) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
References
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