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Summary

Le barre di microgel con gruppi reattivi complementari sono prodotte tramite microfluidica con la capacità di interlegarsi in soluzione acquosa. I microgel anisometrici si inceppano e si interconnettono in costrutti stabili con pori più grandi rispetto ai sistemi basati su sferiche. Microgel modificati con GRGDS-PC formano costrutti 3D macroporosi che possono essere utilizzati per la coltura cellulare.

Abstract

Un sistema bicomponente di microgel funzionalizzati dalla microfluidica consente una rapida interconnessione in costrutti macroporosi 3D in soluzioni acquose senza ulteriori additivi. La gelificazione continua su chip fotoavviata consente la variazione del rapporto di aspetto del microgel, che determina le proprietà del blocco di costruzione per i costrutti ottenuti. I monomeri di glicidil metacrilato (GMA) o 2-amminoetilmetacrilato (AMA) vengono copolimerizzati nella rete di microgel basata su polimeri stellari di glicole polietilenico (PEG) per ottenere funzionalità epossidica o amminica. Un flusso di olio di focalizzazione viene introdotto nella struttura di uscita microfluidica per garantire la raccolta continua delle barre di microgel funzionalizzate. Sulla base di una recente pubblicazione, i costrutti basati su aste di microgel producono pori più grandi di diverse centinaia di micrometri e, allo stesso tempo, portano a una maggiore stabilità complessiva dell’impalcatura rispetto a un modello basato su sferica. In questo modo, è possibile produrre costrutti di volume più elevato con più volume libero, riducendo al contempo la quantità di materiale richiesto. Gli scaffold macroporosi interconnessi possono essere prelevati e trasportati senza danni o disintegrazioni. I gruppi amminici ed epossidici non coinvolti nell’interconnessione rimangono attivi e possono essere utilizzati indipendentemente per la post-modifica. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per la fabbricazione di barre di microgel per formare scaffold macroporosi interconnessi che possono essere utilizzati per successivi esperimenti cellulari.

Introduction

Per studiare il comportamento complesso delle cellule cooperative nei costrutti 3D, le piattaforme di scaffold devono mostrare prestazioni coerenti in termini di riproducibilità, avere una geometria adatta per la migrazione cellulare e, allo stesso tempo, consentire una certa flessibilità in termini di alterazione dei parametri per indagare la loro influenza sul tessuto vivente¹. Negli ultimi anni, il concetto di particelle ricotto macroporose (MAP), descritto per la prima volta da Segura et al., si è sviluppato in una piattaforma efficiente e versatile per la produzione di scaffold 3D². La composizione su misura dei microgel, che sono gli elementi costitutivi dello scaffold 3D finale, predefinisce proprietà come la rigidità del costrutto, la reattività chimica selettiva della rete di gel e la dimensione finale dei pori dello scaffold 2,3,4,5,6. I peptidi adesivi cellulari come spunti per le interazioni scaffold-cellula sono incorporati nella rete polimerica dei microgel per consentire l’attaccamento cellulare e possono essere variati per studiare i loro effetti specifici sulle cellule in coltura. Gli scaffold 3D sono stabilizzati dall’interconnessione dei microgel iniettabili ricotti a causa di legami covalenti o supramolecolari, risultando in costrutti robusti e definiti per la coltura cellulare 2,3,5,7,8.

La microfluidica si è affermata come uno dei metodi più accurati e adattabili per la preparazione di idrogel granulari definiti⁹. La possibilità di produrre maggiori quantità degli elementi costitutivi necessari in un processo continuo mantenendo la loro monodispersità chimica, meccanica e fisica contribuisce in modo sostanziale all’idoneità di questo processo. Inoltre, le dimensioni e la forma dei microgel prodotti possono essere manipolate con vari metodi come emulsioni batch, microfluidica, litografia, spruzzatura elettrodinamica o frammentazione meccanica, che determinano la geometria dei blocchi di costruzione e, quindi, la struttura 3D dell’impalcatura finale ^1,10.

Recentemente, è stato riportato il concetto di scaffold 3D macroporosi composti da barre di microgel funzionalizzate che si interlegano rapidamente in soluzioni acquose senza ulteriori additivi¹¹. L’anisotropia dei bastoncelli di microgel ha portato a porosità e distribuzioni dei pori più elevate con dimensioni dei pori maggiori rispetto all’impiego di microgel sferici in questo studio¹¹. In questo modo, meno materiale crea pori più grandi con una varietà di geometrie di pori diverse, mantenendo la stabilità dello scaffold 3D. Il sistema è costituito da due tipi di barre di microgel con ammina primaria complementare e gruppi funzionali epossidici che vengono consumati all’interno della reazione di interconnessione quando entrano in contatto tra loro. I gruppi funzionali che non partecipano al processo di interconnessione rimangono attivi e possono essere utilizzati per la post-modifica selettiva con peptidi adesivi cellulari o altri fattori bioattivi. Le cellule dei fibroblasti si attaccano, si diffondono e proliferano quando vengono coltivate all’interno degli scaffold 3D, crescendo prima sulla superficie del microgel e riempiendo la maggior parte dei macropori dopo 5 giorni. Uno studio preliminare di co-coltura di fibroblasti umani e cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) ha mostrato risultati promettenti per la formazione di strutture simili a vasi all’interno degli scaffold 3D interconnessi¹¹.

Protocol

1. Materiale richiesto e preparati per la microfluidica Per la procedura microfluidica descritta, utilizzare siringhe di vetro da 1 mL e 5 mL e pompe a siringa. La formazione di goccioline su chip viene osservata tramite un microscopio invertito dotato di una telecamera ad alta velocità. Creare il progetto del chip microfluidico (Figura 1B) utilizzando un software di progettazione assistita da computer e produrre un modello master come già riportato<sup…

Representative Results

Figura 2: Struttura dello scaffold reticolato macroporoso. (A) Proiezione 3D di una microscopia confocale da 500 μm Z-stack dello scaffold macroporoso interconnesso. La barra di scala rappresenta 500 μm. (B) Impalcatura interconnessa composta da ~ 10.000 barre di microgel su un vetro di copertura prelevato diretta…

Discussion

Uno dei passaggi critici in questo protocollo è la qualità del 2-amminoetilmetacrilato (AMA) utilizzato come comonomero per la funzionalizzazione dell’ammina primaria. L’AMA dovrebbe essere una polvere a grana fine e preferibilmente incolore consegnata in un contenitore di vetro marrone a tenuta di gas. Si dovrebbe evitare l’uso di materiale verdastro e grumoso, in quanto compromette significativamente la reazione di gelificazione e influisce negativamente sulla riproducibilità dei risultati. In caso di scarsa gelific…

Materials

ABIL EM 90	Evonik	144243-53-8	non-ionic surfactant
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride	TCI Chemicals	A3413	>98.0%(T)(HPLC)
8-Arm PEG-acrylate 20 kDa	Biochempeg Scientific Inc.	A88009-20K	≥ 95 %
AutoCAD 2019	Autodesk		computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs
CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter	CHROMAFILCarl Roth GmbH+Co.KG	XH49.1	pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV)
Cover glass	Marienfeld-Superior		type No. 1
EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm	Electron Microscopy Sciences		0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter
Ethanol absolut	VWR Chemicals
FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera	FLIR Systems
Fluoresceinamine isomer I	Sigma-Aldrich	201626
Fluorescein isothiocyanate	Thermo Fisher Scientific	46424
25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles	BD Microlance 3
Glycidyl methacrylate	Sigma-Aldrich	779342	≥97.0% (GC)
GRGDS-PC	CPC Scientific	FIBN-015A
Hamilton 1000 Series Gastight syringes	Thermo Fisher Scientific	10772361/10500052	PFTE Luer-Lock
Hexane	Sigma-Aldrich	1,04,367
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate	Sigma-Aldrich	900889	≥95 %
Motic AE2000 trinocular microscope	Ted Pella, Inc.	22443-12
Novec 7100	Sigma-Aldrich	SHH0002
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O9755
Paraffin	VWR Chemicals	24679320
Pavone Nanoindenter Platform	Optics11Life
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade	dropletex		ID 0.38 mm OD 1.09 mm
2-Propanol	Sigma-Aldrich	190764	ACS reagent, ≥99.5%
Protein LoBind Tubes	Eppendorf	30108132
Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus
RPMI 1640 medium	Gibco	11530586
SYLGARD 184 silicone elastomer kit	Dow SYLGARD	634165S
Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane	Sigma-Aldrich	448931
UVC LED sterilizing box	UVLED Optical Technology Co., Ltd.	9S SZH8-S2