Summary
Le barre di microgel con gruppi reattivi complementari sono prodotte tramite microfluidica con la capacità di interlegarsi in soluzione acquosa. I microgel anisometrici si inceppano e si interconnettono in costrutti stabili con pori più grandi rispetto ai sistemi basati su sferiche. Microgel modificati con GRGDS-PC formano costrutti 3D macroporosi che possono essere utilizzati per la coltura cellulare.
Abstract
Un sistema bicomponente di microgel funzionalizzati dalla microfluidica consente una rapida interconnessione in costrutti macroporosi 3D in soluzioni acquose senza ulteriori additivi. La gelificazione continua su chip fotoavviata consente la variazione del rapporto di aspetto del microgel, che determina le proprietà del blocco di costruzione per i costrutti ottenuti. I monomeri di glicidil metacrilato (GMA) o 2-amminoetilmetacrilato (AMA) vengono copolimerizzati nella rete di microgel basata su polimeri stellari di glicole polietilenico (PEG) per ottenere funzionalità epossidica o amminica. Un flusso di olio di focalizzazione viene introdotto nella struttura di uscita microfluidica per garantire la raccolta continua delle barre di microgel funzionalizzate. Sulla base di una recente pubblicazione, i costrutti basati su aste di microgel producono pori più grandi di diverse centinaia di micrometri e, allo stesso tempo, portano a una maggiore stabilità complessiva dell'impalcatura rispetto a un modello basato su sferica. In questo modo, è possibile produrre costrutti di volume più elevato con più volume libero, riducendo al contempo la quantità di materiale richiesto. Gli scaffold macroporosi interconnessi possono essere prelevati e trasportati senza danni o disintegrazioni. I gruppi amminici ed epossidici non coinvolti nell'interconnessione rimangono attivi e possono essere utilizzati indipendentemente per la post-modifica. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per la fabbricazione di barre di microgel per formare scaffold macroporosi interconnessi che possono essere utilizzati per successivi esperimenti cellulari.
Introduction
Per studiare il comportamento complesso delle cellule cooperative nei costrutti 3D, le piattaforme di scaffold devono mostrare prestazioni coerenti in termini di riproducibilità, avere una geometria adatta per la migrazione cellulare e, allo stesso tempo, consentire una certa flessibilità in termini di alterazione dei parametri per indagare la loro influenza sul tessuto vivente1. Negli ultimi anni, il concetto di particelle ricotto macroporose (MAP), descritto per la prima volta da Segura et al., si è sviluppato in una piattaforma efficiente e versatile per la produzione di scaffold 3D2. La composizione su misura dei microgel, che sono gli elementi costitutivi dello scaffold 3D finale, predefinisce proprietà come la rigidità del costrutto, la reattività chimica selettiva della rete di gel e la dimensione finale dei pori dello scaffold 2,3,4,5,6. I peptidi adesivi cellulari come spunti per le interazioni scaffold-cellula sono incorporati nella rete polimerica dei microgel per consentire l'attaccamento cellulare e possono essere variati per studiare i loro effetti specifici sulle cellule in coltura. Gli scaffold 3D sono stabilizzati dall'interconnessione dei microgel iniettabili ricotti a causa di legami covalenti o supramolecolari, risultando in costrutti robusti e definiti per la coltura cellulare 2,3,5,7,8.
La microfluidica si è affermata come uno dei metodi più accurati e adattabili per la preparazione di idrogel granulari definiti9. La possibilità di produrre maggiori quantità degli elementi costitutivi necessari in un processo continuo mantenendo la loro monodispersità chimica, meccanica e fisica contribuisce in modo sostanziale all'idoneità di questo processo. Inoltre, le dimensioni e la forma dei microgel prodotti possono essere manipolate con vari metodi come emulsioni batch, microfluidica, litografia, spruzzatura elettrodinamica o frammentazione meccanica, che determinano la geometria dei blocchi di costruzione e, quindi, la struttura 3D dell'impalcatura finale 1,10.
Recentemente, è stato riportato il concetto di scaffold 3D macroporosi composti da barre di microgel funzionalizzate che si interlegano rapidamente in soluzioni acquose senza ulteriori additivi11. L'anisotropia dei bastoncelli di microgel ha portato a porosità e distribuzioni dei pori più elevate con dimensioni dei pori maggiori rispetto all'impiego di microgel sferici in questo studio11. In questo modo, meno materiale crea pori più grandi con una varietà di geometrie di pori diverse, mantenendo la stabilità dello scaffold 3D. Il sistema è costituito da due tipi di barre di microgel con ammina primaria complementare e gruppi funzionali epossidici che vengono consumati all'interno della reazione di interconnessione quando entrano in contatto tra loro. I gruppi funzionali che non partecipano al processo di interconnessione rimangono attivi e possono essere utilizzati per la post-modifica selettiva con peptidi adesivi cellulari o altri fattori bioattivi. Le cellule dei fibroblasti si attaccano, si diffondono e proliferano quando vengono coltivate all'interno degli scaffold 3D, crescendo prima sulla superficie del microgel e riempiendo la maggior parte dei macropori dopo 5 giorni. Uno studio preliminare di co-coltura di fibroblasti umani e cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) ha mostrato risultati promettenti per la formazione di strutture simili a vasi all'interno degli scaffold 3D interconnessi11.
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Protocol
1. Materiale richiesto e preparati per la microfluidica
- Per la procedura microfluidica descritta, utilizzare siringhe di vetro da 1 mL e 5 mL e pompe a siringa. La formazione di goccioline su chip viene osservata tramite un microscopio invertito dotato di una telecamera ad alta velocità.
- Creare il progetto del chip microfluidico (Figura 1B) utilizzando un software di progettazione assistita da computer e produrre un modello master come già riportato12.
- Ottenere un'irradiazione UV controllata utilizzando un LED UV autocostruito (λ = 365 nm, diametro spot ~ 4,7 mm) che fornisce irradianza a 957 mW / cm2 attraverso un vetro di copertura spesso 0,13 mm.
NOTA: Tenere conto della possibile generazione di calore locale da parte dell'UV-LED durante l'irraggiamento. In tal caso, assicurarsi di un raffreddamento sufficiente mediante flusso d'aria esterno.
2. Produzione di dispositivi microfluidici
NOTA: La produzione di dispositivi microfluidici si basa su una precedente pubblicazione13.
- Preparare 20 g di una miscela 10:1 (in massa) di polidimetilsilossano (PDMS) e agente indurente. Mescolare energicamente per 3 min.
- Mescolare 60 mg di olio rosso O in 2,0 g di toluene. Aggiungere 50 μL di olio rosso O in soluzione di toluene alla miscela PDMS. Mescolare fino a ottenere una distribuzione omogenea del colore per ridurre la diffusione indesiderata della luce e mantenere la dimensione dello spot focalizzata durante la gelificazione su chip.
- Rimuovere le bolle mettendo la miscela in un essiccatore dotato di una pompa per vuoto.
- Gettate la miscela PDMS nella dima principale ad un'altezza di 5-5,5 mm e degasate nuovamente.
- Lasciare polimerizzare il PDMS per 18 ore a temperatura ambiente per evitare la degradazione del colorante diazo.
- Ritagliare la struttura PDMS e perforare i fori di ingresso e uscita nella struttura utilizzando uno strumento di campionamento del nucleo di linea (diametro interno 0,77 mm, diametro esterno 1,07 mm).
- Lavare ripetutamente il PDMS e coprire il vetro con isopropanolo e acqua deionizzata 5 volte e, successivamente, rimuovere il liquido tramite aria in pressione o flusso di azoto dopo ogni fase di lavaggio.
- Trattare il vetro secco e il PDMS insieme in un forno al plasma a 0,2 mbar, con un flusso di ossigeno di 20 ml / min per 60 s a 100 W, e collegare direttamente per legare insieme il vetro e il PDMS per formare il dispositivo microfluidico.
NOTA: evitare di piegare la struttura PDMS durante il processo di associazione per ridurre al minimo la deformazione della struttura del canale. - Per rendere idrofobici i canali del chip microfluidico, posizionare il dispositivo insieme a 50 μL di tricloro-(1H,1 H,2 H,2 H-perfluoroctil)-silano in un essiccatore sotto vuoto durante la notte (chiudere il collegamento alla pompa dopo aver diminuito la pressione del vapore). Risciacquare l'esterno del dispositivo con idrofluoroetere.
ATTENZIONE: Eseguire questi passaggi in una cappa aspirante ed evitare qualsiasi contatto con il perfluorosilano. Utilizzare un essiccatore sottovuoto per vetro sigillato con grasso. Pulire accuratamente l'essiccatore prima di utilizzarlo per altri scopi.
3. Preparazione della soluzione per la microfluidica
- Per la fase oleosa continua, mescolare olio di paraffina ed esadecano (1:1 v/v) e aggiungere l'8% (p/p) di un tensioattivo non ionico. Riempire una siringa di vetro da 1 mL (primo olio, Figura 1) e una da 5 mL (secondo olio, Figura 1).
- Preparare le soluzioni di prepolimeri per la fase dispersa in flaconcini di vetro marrone per prevenire la decomposizione del fotoiniziatore e la gelificazione involontaria.
- Soluzione di prepolimero componente amminico contenente GRGDS-PC
- Per una soluzione da 300 μL, pesare 33,3 mg di glicole-polietilenglico-acrilato stellato (sPEG-AC) e 3,03 mg di litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP).
- Sciogliere 18,74 mg di 2-amminoetilmetacrilato cloridrato (AMA) in 1,5 ml di acqua deionizzata e far passare la soluzione attraverso un filtro a siringa (dimensione dei pori 0,20 μm).
NOTA: AMA è igroscopica e deve essere eliminata non appena i grumi delle forme solide si accumulano nel contenitore di stoccaggio. - Preparare aliquote sterili di 36 mM GRGDS-PC in acqua e conservare a -20 °C fino all'uso.
- Utilizzare 291,7 μL della soluzione AMA per dissolvere sPEG-AC e LAP e aggiungere 8,3 μL della soluzione GRGDS-PC. Assumere la soluzione con una siringa di vetro da 1 mL e proteggere dalla luce utilizzando un foglio di alluminio.
- Soluzione di prepolimero componente epossidico
- Per una soluzione da 300 μL, pesare 33,3 mg di glicole-polietilenglico-acrilato stellato (sPEG-AC), 3,03 mg di LAP e sciogliere in 300 μL di acqua deionizzata. Aggiungere 2,4 mg di glicidil metacrilato (GMA).
NOTA: Lo scuotimento vigoroso accelera la dissoluzione di GMA. Assumere la soluzione con una siringa di vetro da 1 mL e proteggere dalla luce utilizzando un foglio di alluminio.
- Per una soluzione da 300 μL, pesare 33,3 mg di glicole-polietilenglico-acrilato stellato (sPEG-AC), 3,03 mg di LAP e sciogliere in 300 μL di acqua deionizzata. Aggiungere 2,4 mg di glicidil metacrilato (GMA).
- Soluzione di prepolimero componente amminico contenente GRGDS-PC
4. Produzione e purificazione di barre di microgel funzionalizzato amminico ed epossidico
Figura 1: Disposizione del gruppo di gelificazione microfluidica su chip. (A) Vista frontale e vista angolata della disposizione dei componenti durante la microfluidica. (B) Progettazione di chip microfluidici utilizzati per la gelificazione su chip di barre di microgel. (1) Tubo in PE alla prima presa d'olio. (2) Tubo in PE protetto dalla luce all'ingresso della fase dispersa. (3) Tubo in PE al secondo ingresso dell'olio. (4) Tubo in PE dall'uscita al contenitore di raccolta del prodotto. (5) Lampada UV e posizione di irradiazione sul canale rettilineo da 80 μm vicino all'uscita. (6) Obiettivo del microscopio/posizione di osservazione. (7) Componente PDMS colorato del dispositivo microfluidico. (8) Vetro di copertura incollato al PDMS. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
- Inserire gli aghi nei tubi PE e rimuovere il gas dalla siringa e dal tubo.
- Inserire un tubo PE nella presa per la raccolta del prodotto.
- Collocare tutte le siringhe di vetro nelle pompe a siringa e inserire ciascuna estremità del tubo nell'ingresso corrispondente (Figura 1).
NOTA: Proteggere il tubo di prepolimero dalla luce tramite un foglio di alluminio o un tubo nero per evitare gelificazioni involontarie. - Focalizzare il microscopio sulla sezione trasversale olio-acqua.
- Avviare la prima pompa della siringa dell'olio (portata = 100-200 μL/h) per riempire prima il canale con olio per evitare la bagnatura del canale da parte della fase di dispersione.
- Diminuire la prima portata dell'olio a 30 μL/h e avviare la pompa della siringa prepolimerica (portata = 100-200 μL/h) fino a quando non è possibile osservare la fase acquosa dispersa nella sezione trasversale.
- Impostare la portata del prepolimero su 30 μL/h e focalizzare il microscopio sull'uscita.
- Avviare la seconda pompa a siringa dell'olio (portata di 300 μL/h) e attendere che il regime di flusso sia stabile.
- Posizionare il tubo di uscita in un contenitore di raccolta.
NOTA: Posizionare l'estremità del tubo nella parte superiore del contenitore per evitare un aumento di pressione dovuto all'accumulo del prodotto nel tempo. - Impostare il sistema di irradiazione UV in modo tale che l'irraggiamento sia compreso tra 900 e 1000 mW/cm 2 (irradianza utilizzata = 957 mW/cm2) e che lo spot di irradiazione si trovi nella parte del canale diritto prima dell'uscita (figura 1B).
NOTA: assicurarsi di non irradiare vicino alla sezione trasversale olio-acqua per evitare di intasare il canale. Per una protezione aggiuntiva, coprire le strutture del canale prima del punto di irradiazione sulla parte superiore dell'unità. - Prima dell'irradiazione UV, regolare le portate del prepolimero e del primo olio per ottenere le proporzioni desiderate nell'intervallo da 3,0 a 4,5 e impostare il tempo di irradiazione della fase dispersa a ~ 2,3 s, a seconda delle dimensioni dello spot di irradiazione.
- Avviare l'irradiazione UV e, se necessario, regolare nuovamente le portate secondo la sottosezione precedente.
NOTA: Osservare la produzione all'inizio e monitorare il comportamento stabile del flusso in uscita e l'uniformità delle barre di microgel. Il secondo flusso dell'olio può essere regolato per ottimizzare il trasporto del prodotto all'interno dell'uscita. - Modificare il contenitore di raccolta e annotare l'ora di inizio della raccolta del prodotto e le portate.
NOTA: Proteggere il prodotto dalla polvere. Interrompere la raccolta prima che qualsiasi siringa esaurisca la soluzione. - Per terminare la raccolta, rimuovere il contenitore di raccolta, annotando l'ora. Fermare l'irradiazione e tutte le pompe a siringa.
- Lavare il prodotto successivamente 5 volte ciascuno con n-esano, isopropanolo e acqua deionizzata. Rimuovere il surnatante dopo la sedimentazione dell'asta.
NOTA: Dopo ogni aggiunta di soluzione, disperdere accuratamente il prodotto e attendere 10 minuti prima di sostituire il solvente, considerando la diffusione molecolare. Sostituire gradualmente l'isopropanolo con acqua per evitare che le aste galleggiano sulla superficie del liquido. Più passaggi di lavaggio aggiuntivi con acqua riducono le tracce rimanenti di isopropanolo.
5. Formazione di impalcature macroporose
- Determinare il numero di barre di microgel per volume di dispersione per i campioni epossidici e amminizzati funzionalizzati.
- Regolare il numero di campioni epossidici e amminizzati funzionalizzati mediante diluizione o concentrazione a un valore simile tra 1.000-5.000 barre/100 μL.
NOTA: Utilizzare una centrifuga a ~2.000 x g per 5-10 s per accelerare la sedimentazione delle barre di microgel. Se il numero di barre per volume di dispersione è basso, l'interconnessione delle aste può risultare in cluster di barre più piccoli invece di un costrutto stabile. Se il numero di barre per volume di dispersione è elevato, la qualità di miscelazione dei due componenti sarà compromessa. - Trasferire la dispersione del primo componente (~1.200 barrette) in un flaconcino conico trasparente da 1,5 ml o 2 ml.
- Aggiungere il secondo componente in modo controllato in un funzionamento continuo (pipetta da 100 μL). Dopo l'aggiunta, mescolare il contenuto direttamente utilizzando la pipetta per assorbire il liquido e aggiungerlo di nuovo. La struttura interconnessa si forma in pochi secondi durante la miscelazione.
NOTA: Se si formano più cluster invece di una struttura coerente, ricontrollare il numero di barre di microgel per volume o fornire una miscelazione più controllata dei due componenti.
6. Post-modifica dell'adesivo cellulare
- Calcolare il numero teorico di gruppi epossidici nella struttura interconnessa in base alla portata della fase polimerica dispersa, al numero di microgel raccolti durante un tempo specifico e al fattore di diluizione della dispersione di microgel utilizzata per la formazione dello scaffold.
NOTA: approssimare il numero teorico di gruppi epossidici per impalcatura con la seguente equazione.
nesimo: Quantità teorica di sostanza
c GMA: concentrazione diGMA in soluzione di prepolimero
D: Portata della soluzione di prepolimeri - Aggiungere la soluzione GRGDS-PC alla struttura interconnessa per modificare tutti i restanti gruppi epossidici con il peptide adesivo cellulare contenente un'ammina libera e un tiolo (n [gruppi epossidici teorici] / n [GRGDS-PC] = 1). Lasciare a temperatura ambiente durante la notte.
- Rimuovere le molecole non reagite lavando con acqua deionizzata e rimuovendo il surnatante.
7. Sterilizzazione e trasferimento in terreni di coltura cellulare
- Ridurre il livello dell'acqua per immergere semplicemente l'impalcatura interconnessa.
- Aprire il flaconcino e irradiare con luce UV di λ = 250-300 nm. Chiudere il flaconcino e trasferirlo su un banco pulito. Lavare 1x con acqua sterile.
- Sostituire l'acqua nel flaconcino con terreni di coltura cellulare e consentire l'equilibrio per 5 minuti. Ripetere questa operazione con terreni di coltura cellulare freschi 2x.
- Trasferire l'impalcatura macroporosa in una piastra di coltura cellulare per l'esperimento versando o usando una spatola.
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Representative Results
Figura 2: Struttura dello scaffold reticolato macroporoso. (A) Proiezione 3D di una microscopia confocale da 500 μm Z-stack dello scaffold macroporoso interconnesso. La barra di scala rappresenta 500 μm. (B) Impalcatura interconnessa composta da ~ 10.000 barre di microgel su un vetro di copertura prelevato direttamente dall'acqua. La barra della scala rappresenta 5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Questo protocollo si traduce in un costrutto macroporoso 3D stabile composto da ammine interconnesse e barre di microgel funzionalizzato epossidico (Figura 2A). Il costrutto dovrebbe mostrare una geometria compatta se viene utilizzato il tipo descritto di miscelazione, che si forma entro 2 s o 3 s (Figura 2B).
La stabilità del costrutto interconnesso dipende dai blocchi costitutivi dell'asta di microgel di cui è composta. Le barre di microgel funzionalizzate con ammina mostrano una rigidità media di 2,0 ± 0,2 kDa, determinata dalla nanoindentazione (Figura 3A). Se le aste sono troppo morbide, la struttura macroporosa interconnessa potrebbe non essere raggiunta a causa della deformazione dei blocchi di costruzione. Per rilevare gruppi funzionali attivi, l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) può essere utilizzato per visualizzare i gruppi amminici primari e l'isomero I della fluoresceina ammina può essere impiegato per marcare i gruppi epossidici (Figura 3B,C). Le barre di microgel amminico hanno dimensioni con una lunghezza media di 553 μm ± 29 μm e una larghezza media di 193 μm ± 7 μm in acqua deionizzata, con un rapporto di aspetto di ~ 3,0 e una riduzione del volume (collasso) di ~ 73% delle loro dimensioni in terreni di coltura cellulare11.
Figura 3: Proprietà del microgel. (A) Modulo di Young efficace di barre di ammina e microgel epossidico insieme a sfere di ammina e microgel epossidico misurate mediante nanoindentazione. I dati visualizzati come un box plot che si estende dal 25 ° al 75 ° percentile, con i baffi che raggiungono dal 5% al 95% quantili. Le linee all'interno delle caselle rappresentano le mediane, i quadrati vuoti indicano i mezzi e i quadrati neri rappresentano i valori anomali (n = 40; I valori p sono calcolati utilizzando ANOVA unidirezionale con correzione Bonferroni, **p < 0,01, ****p < 0,0001). (B) In alto: immagine al microscopio confocale di una barra di microgel amminico funzionalizzata con FITC e di una barra di microgel epossidico funzionalizzata con isomero di ammina fluoresceina I. In basso: immagini in campo luminoso corrispondenti. Tutte le barre della scala rappresentano 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Come descritto nella pubblicazione correlata, microgel simili a sfere prodotti con lo stesso metodo portano a più cluster interconnessi piuttosto che a un'impalcatura macroporosa stabile11. Il rapporto d'aspetto più elevato delle aste di microgel consente una migliore stabilità complessiva grazie a un ponte di struttura più efficiente in 3D (Figura 4).
Figura 4: Influenza del rapporto d'aspetto sulla formazione della struttura . (A) Immagine in campo chiaro di un costrutto interconnesso composto da barre di microgel. (B) Immagine in campo luminoso di ammassi interconnessi composti da microgel simili a sfere. Le barre della scala rappresentano 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
I valori medi dei macropori negli scaffold composti da barre di microgel sono 100 μm, con il 90% delle dimensioni dei pori che vanno da 30 μm a oltre 150 μm11. I microgel simili a sfere producono cluster con dimensioni dei pori comprese tra ~ 10 μm e 55 μm, con un valore medio intorno a 22 μm11. Ciò è coerente con i numeri riportati da altri studi che preparano MAP basate su microgel sferici 2,4,14.
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Discussion
Uno dei passaggi critici in questo protocollo è la qualità del 2-amminoetilmetacrilato (AMA) utilizzato come comonomero per la funzionalizzazione dell'ammina primaria. L'AMA dovrebbe essere una polvere a grana fine e preferibilmente incolore consegnata in un contenitore di vetro marrone a tenuta di gas. Si dovrebbe evitare l'uso di materiale verdastro e grumoso, in quanto compromette significativamente la reazione di gelificazione e influisce negativamente sulla riproducibilità dei risultati. In caso di scarsa gelificazione e barre di microgel instabili, si può considerare di cambiare il fornitore.
Se la miscelazione di barre di ammina e microgel epossidico porta a più cluster interconnessi piuttosto che a una struttura stabile, controllare il numero di barre in ciascuna dispersione di stock e impostarlo su un valore simile nell'intervallo 1.000-5.000 bastoncelli/100 μL per entrambi i campioni. Se le dimensioni del microgel differiscono significativamente dai valori qui menzionati, regolare il numero di barre di microgel alla frazione di volume. Aumentare il numero per volume se i gel sono più piccoli e diminuire il numero nel caso opposto.
Il metodo descritto non si è concentrato sull'ottimizzazione del processo di miscelazione per avere un assemblaggio più controllato dei due componenti di miscelazione funzionalizzati complementari. Poiché l'interlinking avviene entro pochi secondi, il volume totale della dispersione per formare un costrutto interconnesso e le frazioni volumetriche dei microgel utilizzati vengono regolati per ottenere strutture macroporose stabili semplicemente pipettando i due componenti uno dopo l'altro. In futuro, sarebbe vantaggioso analizzare il flusso e le proprietà di miscelazione delle dispersioni delle barre di microgel e ottenere ulteriori informazioni sulla formazione della struttura degli scaffold. Una miscelazione più controllata dei due componenti del microgel interconnesso potrebbe consentire la formazione automatizzata e ad alto rendimento di questi scaffold macroporosi e consentire una crescita incrementale del costrutto.
Poiché l'interconnessione procede molto rapidamente, i pori dell'impalcatura vengono creati durante la miscelazione. Se le barre di microgel fossero prima completamente sedimentate prima di collegarsi chimicamente, ci si aspetterebbe un rapporto di impilamento molto più elevato / inceppamento. Pertanto, è probabile che la cinetica di interconnessione abbia un grande effetto sulla formazione di MAP e sulla conseguente porosità e dimensione dei pori. La funzionalizzazione dell'adesivo cellulare mediante post-modifica o incorporazione nella rete di gel durante la preparazione del microgel ha dimostrato che L929 e le cellule dei fibroblasti umani si attaccano e si diffondono prima sulla superficie dei bastoncelli di microgel e, successivamente, riempiono la maggior parte dei macropori dopo 5-7 giorni in coltura11. A causa delle dimensioni dei pori che variano prevalentemente da 30 μm a oltre 150 μm e della struttura dei pori interconnessi, confermata dalla microscopia confocale, le cellule seminate possono facilmente entrare nell'impalcatura interconnessa11. Finora, questi scaffold a base di microgel sono stati utilizzati per coltivare fibroblasti e cellule HUVEC in co-coltura. Gli HUVEC seminati dopo 14 giorni di coltura cellulare di fibroblasti hanno formato le prime strutture allungate simili a vasi entro i successivi 16 giorni11. Lo studio di altri tipi di cellule nelle co-colture deve ancora essere affrontato in futuro. Per consentire alle cellule di essere aggiunte direttamente al sistema durante la formazione dello scaffold, è necessaria una rapida interconnessione delle aste in tamponi o terreni di coltura compatibili con le cellule, che consentirebbe di estendere questo sistema alle piattaforme di bioprinting.
Gli scaffold 3D macroporosi non iniettabili possono anche essere creati con vari metodi alternativi come la colata con solvente, la liofilizzazione, la lisciviazione del particolato schiumogeno a gas, l'elettrofilatura o la stampa 3D 1,15,16. La migrazione e la proliferazione cellulare possono avvenire facilmente senza la necessità di degradare preventivamente lo scaffold, purché la geometria dei pori e la permeabilità richieste siano state raggiunte in tutta la rete. La stampa 3D che utilizza bioink inceppati ed estrudibili da sfere di microgel a base di acido ialuronico modificato con PEG, agarosio e norbornene combina le tecnologie di stampa MAP e 3D, controllando la porosità tra i microgel ricotti e anche la geometria della struttura stampata complessiva17.
Rispetto ai metodi alternativi esistenti, gli scaffold risultanti presentano un'ampia varietà di geometrie macroporose 3D a causa delle proporzioni più elevate dei blocchi di costruzione del microgel e della loro configurazione bicomponente interconnessa11. L'utilizzo di barre di microgel crea più porosità e, quindi, più spazio per le interazioni cellula-cellula rispetto all'assemblaggio di microgel sferici. Questo è fondamentale per la formazione del tessuto biologico in quanto migliora le interazioni cellula-cellula. Allo stesso tempo, meno materiale può essere utilizzato per produrre scaffold macroporosi degli stessi volumi, pur mantenendo la stabilità del costrutto. La riduzione del materiale dell'impalcatura è vantaggiosa in quanto viene fornito più spazio aperto per la formazione dei tessuti e meno materiale deve essere degradato, il che è importante sia per le applicazioni in vitro che in vivo . La biofunzionalizzazione dei microgel può essere estesa ad altri tipi di peptidi e fattori bioattivi. Gli scaffold macroporosi stabili risultanti richiedono meno materiale per creare più porosità. Insieme alla sintonizzazione del sistema, questo metodo offre un elevato potenziale come piattaforma versatile per la coltura cellulare in 3D.
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Disclosures
Gli autori assicurano che non ci sono conflitti di interesse.
Acknowledgments
Esprimiamo la nostra gratitudine ai coautori del nostro precedente lavoro su cui si basa questa metodologia, Céline Bastard, Luis P. B. Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born e Tamás Haraszti. Riconosciamo con gratitudine il finanziamento della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) nell'ambito del progetto B5 e C3 SFB 985 "Microgel funzionali e sistemi di microgel". Riconosciamo il finanziamento del Comitato per la concorrenza del Senato di Leibniz (SAW) nell'ambito del Professorinnenprogramm (SAW-2017-PB62: BioMat). Riconosciamo sinceramente i finanziamenti della Commissione europea (EUSMI, 731019). Questo lavoro è stato svolto in parte presso il Center for Chemical Polymer Technology (CPT), sostenuto dall'UE e dallo Stato federale della Renania settentrionale-Vestfalia (sovvenzione EFRE 30 00 883 02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
References
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