Summary
Mikrogelstenger med komplementære reaktive grupper produseres via mikrofluidikk med evne til å knytte seg sammen i vandig løsning. De anisometriske mikrogelene syltetøy og sammenkobling til stabile konstruksjoner med større porer sammenlignet med sfæriske baserte systemer. Mikrogeler modifisert med GRGDS-PC danner makroporøse 3D-konstruksjoner som kan brukes til cellekultur.
Abstract
Et tokomponentsystem av funksjonaliserte mikrogeler fra mikrofluidikk muliggjør rask sammenkobling til 3D-makroporøse konstruksjoner i vandige løsninger uten ytterligere tilsetningsstoffer. Kontinuerlig fotoinitiert gelering på brikken muliggjør variasjon av mikrogel-sideforholdet, som bestemmer byggeblokkegenskapene for de oppnådde konstruksjonene. Glycidylmetakrylat (GMA) eller 2-aminoetylmetakrylatmonomerer (AMA) kopolymeriseres i mikrogelnettverket basert på polyetylenglykol (PEG) stjernepolymerer for å oppnå enten epoksy- eller aminfunksjonalitet. En fokuserende oljestrøm føres inn i den mikrofluidiske utløpsstrukturen for å sikre kontinuerlig oppsamling av de funksjonaliserte mikrogelstengene. Basert på en nylig publikasjon resulterer mikrogelstangbaserte konstruksjoner i større porer på flere hundre mikrometer og fører samtidig til generell høyere stillasstabilitet sammenlignet med en sfærisk basert modell. På denne måten er det mulig å produsere konstruksjoner med høyere volum med mer fritt volum samtidig som mengden materiale som kreves reduseres. De sammenkoblede makroporøse stillasene kan hentes og transporteres uten skade eller oppløsning. Amin- og epoksygrupper som ikke er involvert i sammenkobling, forblir aktive og kan brukes uavhengig for ettermodifisering. Denne protokollen beskriver en optimalisert metode for fremstilling av mikrogelstenger for å danne makroporøse sammenkoblede stillaser som kan brukes til påfølgende celleforsøk.
Introduction
For å studere kompleks kooperativ celleoppførsel i 3D-konstruksjoner, må stillasplattformer vise konsistent ytelse i reproduserbarhet, ha egnet geometri for cellemigrasjon, og samtidig tillate viss fleksibilitet når det gjelder parameterendring for å undersøke deres innflytelse på levende vev1. I de senere år har konseptet makroporøse glødede partikler (MAP), først beskrevet av Segura et al., utviklet seg til en effektiv og allsidig plattform for 3D-stillasproduksjon2. Den skreddersydde sammensetningen av mikrogelene, som er byggesteinene i det endelige 3D-stillaset, forhåndsdefinerer egenskaper som stivheten i konstruksjonen, den selektive kjemiske reaktiviteten til gelnettverket og den endelige porestørrelsen på stillaset 2,3,4,5,6. Celleklebende peptider som signaler for stillascelleinteraksjoner er innlemmet i polymernettverket til mikrogelene for å tillate cellefeste og kan varieres for å undersøke deres spesifikke effekter på celler i kultur. 3D-stillasene stabiliseres ved sammenkobling av glødede injiserbare mikrogeler på grunn av kovalente eller supramolekylære bindinger, noe som resulterer i robuste og definerte konstruksjoner for cellekultur 2,3,5,7,8.
Mikrofluidikk har etablert seg som en av de mest nøyaktige og tilpasningsdyktige metodene for fremstilling av definerte granulære hydrogeler9. Muligheten for å produsere større mengder av de nødvendige byggesteinene i en kontinuerlig prosess samtidig som deres kjemiske, mekaniske og fysiske monodispersitet opprettholdes, bidrar vesentlig til egnetheten til denne prosessen. Videre kan størrelsen og formen på de produserte mikrogelene manipuleres ved hjelp av forskjellige metoder som batchemulsjoner, mikrofluidikk, litografi, elektrodynamisk sprøyting eller mekanisk fragmentering, som bestemmer geometrien til byggesteinene og dermed 3D-strukturen til det endelige stillaset 1,10.
Nylig har begrepet makroporøse 3D-stillas sammensatt av funksjonaliserte mikrogelstenger som raskt knytter seg sammen i vandige løsninger uten ytterligere tilsetningsstoffer, blitt rapportert11. Anisotropien til mikrogelstenger resulterte i høyere porøsiteter og porefordelinger med større porestørrelser sammenlignet med bruk av sfæriske mikrogeler i denne studien11. På denne måten skaper mindre materiale større porer med en rekke forskjellige poregeometrier, samtidig som stabiliteten til 3D-stillaset opprettholdes. Systemet består av to typer mikrogelstenger med komplementære primære amin- og epoksyfunksjonelle grupper som forbrukes innenfor den sammenbindende reaksjonen når de kommer i kontakt med hverandre. De funksjonelle gruppene som ikke deltar i sammenkoblingsprosessen forblir aktive og kan brukes til selektiv ettermodifisering med celleklebende peptider eller andre bioaktive faktorer. Fibroblastceller fester, sprer seg og sprer seg når de dyrkes inne i 3D-stillasene, vokser først på mikrogeloverflaten og fyller de fleste makroporene etter 5 dager. En foreløpig samkulturstudie av humane fibroblaster og humane navlestrengendotelceller (HUVECs) viste lovende resultater for dannelsen av fartøylignende strukturer innenfor de sammenkoblede 3D-stillasene11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nødvendig materiale og preparater for mikrofluidikk
- For den beskrevne mikrofluidiske prosedyren, bruk 1 ml og 5 ml glasssprøyter og sprøytepumper. Dråpedannelse på brikken observeres via et omvendt mikroskop utstyrt med et høyhastighetskamera.
- Lag mikrofluidisk chipdesign (figur 1B) ved hjelp av en datamaskinstøttet designprogramvare og produser en hovedmal som allerede rapportert12.
- Oppnå kontrollert UV-bestråling ved hjelp av en selvkonstruert UV-LED (λ = 365 nm, punktdiameter ~ 4,7 mm) som gir bestråling ved 957 mW / cm2 gjennom et 0,13 mm tykt dekselglass.
MERK: Ta hensyn til mulig lokal varmeutvikling fra UV-LED under bestråling. Hvis dette er tilfelle, sørg for tilstrekkelig kjøling ved ekstern luftstrøm.
2. Produksjon av mikrofluidiske enheter
MERK: Produksjonen av mikrofluidiske enheter er basert på en tidligere publikasjon13.
- Forbered 20 g av en 10: 1 (etter masse) blanding av polydimetylsiloksan (PDMS) og herdemiddel. Bland kraftig i 3 min.
- Bland 60 mg olje rød O i 2,0 g toluen. Tilsett 50 μL oljerød O i toluenoppløsning til PDMS-blandingen. Bland til det er homogen fargefordeling for å redusere uønsket lysspredning og hold flekkstørrelsen fokusert under gelering på brikken.
- Fjern boblene ved å plassere blandingen i en tørkemaskin utstyrt med en vakuumpumpe.
- Kast PDMS-blandingen i hovedmalen til en høyde på 5-5,5 mm og degas igjen.
- La PDMS herde i 18 timer ved romtemperatur for å unngå nedbrytning av diazofargestoff.
- Klipp ut PDMS-strukturen og stans innløps- og utløpshull i strukturen ved hjelp av et linjekjerneprøvetakingsverktøy (0,77 mm indre diameter, 1,07 mm ytre diameter).
- Vask PDMS og dekk glasset med isopropanol og avionisert vann gjentatte ganger 5x, og fjern deretter væsken via trykkluft eller nitrogenstrøm etter hvert vasketrinn.
- Behandle det tørre glasset og PDMS sammen i en plasmaovn på 0,2 mbar, med en oksygenstrøm på 20 ml / min i 60 s ved 100 W, og koble direkte for å binde glasset og PDMS sammen for å danne mikrofluidisk enhet.
MERK: Unngå å bøye PDMS-strukturen under bindingsprosessen for å minimere deformasjon av kanalstrukturen. - For å gjøre kanalene til mikrofluidikkbrikken hydrofobe, plasser enheten sammen med 50 μL triklor- (1 H,1 H,2 H,2 H-perfluoroctyl)-silan i en tørkemaskin under vakuum over natten (lukk tilkoblingen til pumpen etter å ha redusert damptrykket). Skyll utsiden av enheten med hydrofluoreter.
FORSIKTIG: Utfør disse trinnene i en avtrekkshette og unngå kontakt med perfluorilanen. Bruk en glassvakuumtørker forseglet med fett. Rengjør tørkeren grundig før bruk til andre formål.
3. Oppløsning forberedelse for mikrofluidikk
- For den kontinuerlige oljefasen, bland parafinolje og heksadekan (1: 1 v / v) og tilsett 8% (w / w) av et ikke-ionisk overflateaktivt middel. Fyll en 1 ml (første olje, figur 1) og en 5 ml (andre olje, figur 1) glasssprøyte.
- Forbered prepolymerløsningene for dispergeringsfasen i brune glassflasker for å forhindre fotoinitiatornedbrytning og utilsiktet gelering.
- Prepolymerløsning for aminkomponent som inneholder GRGDS-PC
- For en 300 μL-løsning veier du ut 33,3 mg stjernepolyetylenglykol-akrylat (sPEG-AC) og 3,03 mg litiumfenyl-2,4,6-trimetylbenzoylfosfinat (LAP).
- Løs opp 18,74 mg 2-aminoetylmetakrylathydroklorid (AMA) i 1,5 ml avionisert vann og pass oppløsningen gjennom et sprøytefilter (0,20 μm porestørrelse).
MERK: AMA er hygroskopisk og bør kastes så snart de faste formene klumper seg i oppbevaringsbeholderen. - Forbered sterile 36 mM GRGDS-PC aliquots i vann og hold ved -20 ° C til bruk.
- Bruk 291,7 μL av AMA-løsningen for å oppløse sPEG-AC og LAP, og tilsett 8,3 μL av GRGDS-PC-løsningen. Ta opp løsningen med en 1 ml glasssprøyte og beskytt mot lys ved hjelp av aluminiumsfolie.
- Epoksykomponent prepolymer løsning
- For en 300 μL-løsning veier du 33,3 mg stjernepolyetylenglykol-akrylat (sPEG-AC), 3,03 mg LAP og oppløses i 300 μL avionisert vann. Tilsett 2,4 mg glycidylmetakrylat (GMA).
MERK: Kraftig risting akseler GMA-oppløsning. Ta opp løsningen med en 1 ml glasssprøyte og beskytt mot lys ved hjelp av aluminiumsfolie.
- For en 300 μL-løsning veier du 33,3 mg stjernepolyetylenglykol-akrylat (sPEG-AC), 3,03 mg LAP og oppløses i 300 μL avionisert vann. Tilsett 2,4 mg glycidylmetakrylat (GMA).
- Prepolymerløsning for aminkomponent som inneholder GRGDS-PC
4. Produksjon og rensing av amin- og epoksyfunksjonaliserte mikrogelstenger
Figur 1: Arrangement av den mikrofluidiske geleringsenheten på brikken . (A) Sett forfra og vinklet visning av komponentarrangementet under mikrofluidikk. (B) Mikrofluidisk chipdesign som brukes til gelering av mikrogelstenger på brikken. (1) PE-rør til det første oljeinntaket. (2) Lysbeskyttet PE-rør til dispergeringsfaseinnløpet. (3) PE-rør til det andre oljeinntaket. (4) PE-rør fra utløpet til produktoppsamlingsbeholderen. (5) UV-lampe og bestrålingsplassering på den rette 80 μm-kanalen nær utløpet. (6) Mikroskop mål / observasjonsposisjon. (7) Farget PDMS-komponent i mikrofluidisk enhet. (8) Dekkglass bundet til PDMS. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Sett nålene inn i PE-rørene og fjern gassen fra sprøyten og røret.
- Sett inn et PE-rør i stikkontakten for produktoppsamling.
- Plasser alle glasssprøytene i sprøytepumpene og stikk hver slangeende inn i det tilsvarende innløpet (figur 1).
NOTAT: Beskytt prepolymerslangen mot lys via aluminiumsfolie eller et svart rør for å unngå utilsiktet gelering. - Fokuser mikroskopet på olje-vann-tverrsnittet.
- Start den første oljesprøytepumpen (strømningshastighet = 100-200 μL / t) for å fylle kanalen med olje først for å forhindre kanalfukting ved dispergeringsfasen.
- Reduser den første oljestrømningshastigheten til 30 μL / h og start prepolymersprøytepumpen (strømningshastighet = 100-200 μL / h) til den dispergerte vandige fasen kan observeres ved tverrsnittet.
- Sett prepolymerstrømningshastigheten til 30 μL / h og fokuser mikroskopet på utløpet.
- Start den andre oljesprøytepumpen (strømningshastighet på 300 μL / t) og vent til strømningsregimet er stabilt.
- Plasser utløpsrøret i en oppsamlingsbeholder.
NOTAT: Plasser enden av røret i den øvre delen av beholderen for å unngå trykkøkning på grunn av akkumulering av produktet over tid. - Still UV-bestrålingssystemet slik at bestrålingen ligger i området 900-1000 mW/cm 2 (brukt bestråling = 957 mW/cm2) og bestrålingspunktet er i den rette kanaldelen før utløpet (figur 1B).
MERK: Pass på at du ikke bestråler nær olje-vann-tverrsnittet for å unngå å tette kanalen. For ytterligere beskyttelse, dekk kanalstrukturene før bestrålingspunktet på toppen av enheten. - Før UV-bestråling, juster strømningshastighetene til forpolymeren og den første oljen for å oppnå ønsket sideforhold i området 3,0 til 4,5, og sett bestrålingstiden for den dispergerte fasen til ~ 2,3 s, avhengig av størrelsen på bestrålingspunktet.
- Start UV-bestråling og juster om nødvendig strømningshastighetene igjen i henhold til forrige underavsnitt.
MERK: Vær oppmerksom på produksjonen i begynnelsen og overvåk for stabil strømningsoppførsel i utløpet og ensartetheten til mikrogelstengene. Den andre oljestrømmen kan justeres for å optimalisere produkttransporten i utløpet. - Endre oppsamlingsbeholderen, og noter starttidspunktet for produktsamlingen og flythastigheten.
MERK: Beskytt produktet mot støv. Slutt å samle deg før sprøyten har lite oppløsning. - For å avslutte samlingen, fjern samlingsbeholderen og noter tiden. Stopp bestråling og alle sprøytepumpene.
- Vask produktet deretter 5x hver med n-heksan, isopropanol og avionisert vann. Fjern supernatanten etter stangsedimentering.
MERK: Etter hver tilsetning av oppløsningen, disperger du produktet forsiktig og venter 10 minutter før du bytter ut oppløsningsvæsken, med tanke på molekylær diffusjon. Bytt isopropanol gradvis med vann for å forhindre at stengene flyter til overflaten av væsken. Flere ekstra vasketrinn med vann reduserer de resterende isopropanolsporene.
5. Makroporøs stillasdannelse
- Bestem antall mikrogelstenger per dispersjonsvolum for epoksy- og aminfunksjonaliserte prøver.
- Juster antall epoksy- og aminfunksjonaliserte prøver ved fortynning eller konsentrasjon til en tilsvarende verdi mellom 1,000-5,000 stenger / 100 μL.
MERK: Bruk en sentrifuge ved ~ 2,000 x g for 5-10 s for å øke sedimenteringen av mikrogelstengene. Hvis antall stenger per dispersjonsvolum er lavt, kan stangkobling resultere i mindre stangklynger i stedet for en stabil konstruksjon. Hvis antall stenger per dispersjonsvolum er høyt, vil blandingskvaliteten til de to komponentene bli kompromittert. - Overfør den første komponenten (~1 200 stenger) dispersjon til et konisk 1,5 ml eller 2 ml gjennomsiktig hetteglass.
- Tilsett den andre komponenten på en kontrollert måte i kontinuerlig drift (100 μL pipette). Etter tilsetning blander du innholdet direkte ved hjelp av pipetten for å ta opp væske og tilsett det igjen. Den sammenkoblede strukturen dannes i løpet av sekunder under blanding.
MERK: Hvis flere klynger dannes i stedet for en sammenhengende struktur, må du kontrollere antall mikrogelstenger per volum eller gi mer kontrollert blanding av de to komponentene.
6. Cellelim etter modifisering
- Beregn det teoretiske antall epoksygrupper i den sammenkoblede strukturen basert på strømningshastigheten til den dispergerte polymerfasen, antall mikrogeler oppsamlet i løpet av en bestemt tid, og fortynningsfaktoren for mikrogeldispersjonen som brukes til stillasdannelse.
MERK: Tilnærmet det teoretiske antallet epoksygrupper per stillas med følgende ligning.
nth: Teoretisk mengde stoff
c GMA:GMA-konsentrasjon i prepolymeroppløsning
Spørsmål: Strømningshastighet for prepolymerløsning - Legg til GRGDS-PC-løsning i den sammenkoblede strukturen for å modifisere alle gjenværende epoksygrupper med cellelimpeptidet som bærer et fritt amin og tiol (n[teoretiske epoksygrupper]/n[GRGDS-PC] = 1). La stå i romtemperatur over natten.
- Fjern de uomsatte molekylene ved å vaske med avionisert vann og fjerne supernatanten.
7. Sterilisering og overføring til cellekulturmedier
- Reduser vannstanden for å bare senke det sammenkoblede stillaset.
- Åpne hetteglasset og bestråle med UV-lys på λ = 250-300 nm. Lukk hetteglasset og overfør hetteglasset til en ren benk. Vask 1x med sterilt vann.
- Bytt ut vannet i hetteglasset med cellekulturmedier og la det bli likevekt i 5 minutter. Gjenta dette med friske cellekulturmedier 2x.
- Overfør det makroporøse stillaset til en cellekulturbrønnplate for eksperimentet ved å helle eller bruke en slikkepott.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2: Makroporøs tverrbundet stillasstruktur . (A) 3D-projeksjon av en 500 μm konfokal mikroskopi Z-stack av det sammenkoblede makroporøse stillaset. Skalastang representerer 500 μm. (B) Sammenkoblet stillas sammensatt av ~ 10.000 mikrogelstenger på et dekkglass tatt direkte ut av vann. Skalalinjen representerer 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Denne protokollen resulterer i en stabil 3D makroporøs konstruksjon sammensatt av sammenkoblede amin- og epoksyfunksjonaliserte mikrogelstenger (figur 2A). Konstruksjonen skal utvise en kompakt geometri hvis den beskrevne blandingstypen brukes, som dannes innen 2 s eller 3 s (figur 2B).
Den sammenkoblede konstruksjonsstabiliteten avhenger av mikrogelstangens byggesteiner som den er sammensatt av. De aminfunksjonaliserte mikrogelstengene utviser en gjennomsnittlig stivhet på 2,0 ± 0,2 kDa, bestemt ved nanoindentasjon (figur 3A). Hvis stengene er for myke, kan den sammenhengende makroporøse strukturen ikke oppnås på grunn av deformasjon av byggesteinene. For å oppdage aktive funksjonelle grupper kan fluoresceinisotiocyanat (FITC) brukes til å visualisere primære aminogrupper, og fluoresceinaminisomer I kan brukes til å merke epoksygrupper (figur 3B, C). Aminmikrogelstengene har dimensjoner med en gjennomsnittlig lengde på 553 μm ± 29 μm og en gjennomsnittlig bredde på 193 μm ± 7 μm i avionisert vann, noe som resulterer i et sideforhold på ~ 3,0 og en reduksjon i volum (kollaps) med ~ 73% av størrelsen i cellekulturmedier11.
Figur 3: Mikrogel egenskaper . (A) Effektiv Youngs modul av amin- og epoksymikrogelstenger sammen med amin- og epoksymikrogelkuler målt ved nanoindentasjon. Data vises som et boksplott som strekker seg fra 25. til 75. persentil, med værhårene som når fra 5% til 95% kvantiler. Linjene inne i boksene representerer medianene, de tomme rutene angir midlene, og de svarte firkantene representerer uteliggere (n = 40; p-verdier beregnes ved hjelp av enveis ANOVA med Bonferroni-korreksjon, **p < 0,01, ****p < 0,0001). (B) Øverst: Konfokal mikroskopibilde av en aminmikrogelstang funksjonalisert med FITC og en epoksymikrogelstang funksjonalisert med fluoresceinaminisomer I. Bunn: Tilsvarende lyse feltbilder. Alle skalastolper representerer 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Som beskrevet i den relaterte publikasjonen, fører sfærelignende mikrogeler produsert via samme metode til flere sammenkoblede klynger i stedet for ett stabilt makroporøst stillas11. Det høyere sideforholdet til mikrogelstengene gir bedre total stabilitet på grunn av mer effektiv strukturbrobygging i 3D (figur 4).
Figur 4: Påvirkning av sideforholdet på strukturdannelsen . (A) Lyst feltbilde av en sammenkoblet konstruksjon sammensatt av mikrogelstenger. (B) Lyst feltbilde av sammenkoblede klynger sammensatt av sfærelignende mikrogeler. Skalastenger representerer 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Middelverdiene for makroporene i stillasene sammensatt av mikrogelstenger er 100 μm, hvorav 90 % av porestørrelsene varierer fra 30 μm til over 150 μm11. Kulelignende mikrogeler resulterer i klynger med porestørrelser mellom ~ 10 μm til 55 μm, med en middelverdi rundt 22 μm11. Dette er i samsvar med de rapporterte tallene fra andre studier som forbereder MAPs basert på sfæriske mikrogeler 2,4,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et av de kritiske trinnene i denne protokollen er kvaliteten på 2-aminoetylmetakrylatet (AMA) som brukes som komonomer for primær aminfunksjonalisering. AMA skal være et finkornet og helst fargeløst pulver levert i en gasstett brun glassbeholder. Man bør unngå å bruke grønt og klumpete materiale, da det svekker geleringsreaksjonen betydelig og påvirker reproduserbarheten av resultatene negativt. Ved dårlig gelering og ustabile mikrogelstenger kan man vurdere å bytte leverandør.
Hvis blandingen av amin- og epoksymikrogelstenger fører til flere sammenkoblede klynger i stedet for til en stabil struktur, må du kontrollere antall stenger i hver lagerdispersjon og sette den til en lignende verdi i området 1,000-5,000 stenger / 100 μL for begge prøvene. Hvis dimensjonene til mikrogelen avviker vesentlig fra verdiene nevnt her, justerer du antall mikrogelstenger til volumfraksjonen. Øk antallet per volum hvis gelene er mindre og reduser tallet i motsatt tilfelle.
Metoden som ble beskrevet fokuserte ikke på å optimalisere blandeprosessen for å få en mer kontrollert montering av de to komplementære funksjonaliserte blandingskomponentene. Siden sammenkobling skjer i løpet av få sekunder, justeres det totale volumet av dispersjonen for å danne en sammenkoblet konstruksjon og volumfraksjonene av mikrogelene som brukes, for å oppnå stabile makroporøse strukturer ved ganske enkelt å pipettere de to komponentene etter hverandre. I fremtiden vil det være en fordel å analysere strømnings- og blandeegenskapene til mikrogelstangdispersjonene og få ytterligere innsikt i stilalistenes strukturdannelse. En mer kontrollert blanding av de to sammenkoblede mikrogelkomponentene kan muliggjøre automatisert og høy gjennomstrømningsdannelse av disse makroporøse stillasene og muliggjøre inkrementell konstruksjonsvekst.
Siden sammenkobling går veldig raskt, opprettes porene i stillaset under blanding. Hvis mikrogelstengene først ble fullstendig sedimentert før de kjemisk sammenkoblet, ville det forventes et mye høyere stabling til fastkjøringsforhold. Derfor vil interlinkingskinetikken sannsynligvis ha stor effekt på MAP-dannelsen og den resulterende porøsiteten og porestørrelsene. Celleklebende funksjonalisering ved ettermodifisering eller inkorporering i gelnettverket under mikrogelpreparering har vist at L929 og humane fibroblastceller fester seg og sprer seg på mikrogelstengenes overflate først og deretter fyller de fleste makroporene etter 5-7 dager i kultur11. På grunn av porestørrelsene som hovedsakelig varierer fra 30 μm til over 150 μm og den sammenkoblede porestrukturen, bekreftet ved konfokalmikroskopi, kan frøceller lett komme inn i det sammenkoblede stillaset11. Så langt har disse mikrogelstangbaserte stillasene blitt brukt til å dyrke fibroblast- og HUVEC-celler i samkultur. HUVECs sådd etter 14 dager med fibroblastcellekultur dannet første langstrakte fartøylignende strukturer innen de følgende 16 dagene11. Studiet av andre celletyper i samkulturer gjenstår å bli adressert i fremtiden. For at celler skal kunne legges direkte til systemet under stillasdannelse, er det nødvendig med rask stangkobling i cellekompatible buffere eller kulturmedier, noe som vil gjøre det mulig å utvide dette systemet til bioprintingsplattformer.
Ikke-injiserbare makroporøse 3D-stillaser kan også opprettes ved forskjellige alternative metoder som løsemiddelstøping, frysetørking, gassskummende partikkelutvasking, elektrospinning eller 3D-utskrift 1,15,16. Cellemigrasjon og proliferasjon kan lett skje uten behov for å bryte ned stillaset på forhånd, så lenge den nødvendige poregeometrien og permeabiliteten er oppnådd i hele nettverket. 3D-utskrift ved hjelp av fastkjørte, ekstruderbare bioinks fra PEG-, agarose- og norbornenmodifiserte hyaluronsyrebaserte mikrogelkuler kombinerer MAP- og 3D-utskriftsteknologiene, og kontrollerer porøsiteten mellom glødede mikrogeler og også geometrien til den overordnede trykte strukturen17.
Sammenlignet med alternative eksisterende metoder, viser de resulterende stillasene et bredt utvalg av 3D-makroporegeometrier på grunn av det høyere sideforholdet mellom mikrogelbyggesteinene og deres sammenkoblede tokomponentkonfigurasjon11. Utnyttelsen av mikrogelstenger skaper mer porøsitet og dermed mer plass til celle-celle-interaksjoner sammenlignet med montering av sfæriske mikrogeler. Dette er sentralt for biologisk vevsdannelse, da det forbedrer celle-celle-interaksjoner. Samtidig kan mindre materiale brukes til å produsere makroporøse stillaser med samme volumer, samtidig som konstruksjonens stabilitet opprettholdes. Reduksjonen av stillasmateriale er gunstig ettersom det er mer åpen plass for vevsdannelse, og mindre materiale må nedbrytes, noe som er viktig for både in vitro og in vivo applikasjoner. Biofunksjonalisering av mikrogelene kan utvides til andre peptidtyper og bioaktive faktorer. De resulterende stabile makroporøse stillasene krever mindre materiale for å skape mer porøsitet. Sammen med systemets tunabilitet gir denne metoden høyt potensial som en allsidig plattform for cellekultur i 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne forsikrer at det ikke er noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi uttrykker vår takknemlighet til medforfatterne av vårt tidligere arbeid denne metoden er basert på, Céline Bastard, Luis PB Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born og Tamás Haraszti. Vi takker for finansiering fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) innenfor prosjektet B5 og C3 SFB 985 "Functional Microgels and Microgel Systems". Vi anerkjenner finansiering fra Leibniz Senate Competition Committee (SAW) under Professorinnenprogramm (SAW-2017-PB62: BioMat). Vi anerkjenner finansiering fra EU-kommisjonen (EUSMI, 731019). Dette arbeidet ble delvis utført ved Center for Chemical Polymer Technology (CPT), som ble støttet av EU og den føderale delstaten Nordrhein-Westfalen (tilskudd EFRE 30 00 883 02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Hsu, R. -S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Chen, Z., et al. Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere. Exploration. 1 (3), 20210036 (2021).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Guerzoni, L. P. B., et al. Cell encapsulation in soft, anisometric poly(ethylene) glycol microgels using a novel radical-free microfluidic system. Small. 15 (20), 1900692 (2019).
- Krüger, A. J. D., et al. Compartmentalized jet polymerization as a high-resolution process to continuously produce anisometric microgel rods with adjustable size and stiffness. Advanced Materials. 31 (49), 1903668 (2019).
- Darling, N. J., et al. Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Lutzweiler, G., Ndreu Halili,, Engin Vrana, N. The overview of porous, bioactive scaffolds as instructive biomaterials for tissue regeneration and their clinical translation. Pharmaceutics. 12 (7), 602 (2020).
- Dang, H. P., et al. 3D printed dual macro-, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function. Biofabrication. 11 (3), 035014 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
