Las varillas de microgel con grupos reactivos complementarios se producen a través de microfluídica con la capacidad de interconectarse en solución acuosa. Los microgeles anisómetros se atascan y se entrelazan en construcciones estables con poros más grandes en comparación con los sistemas de base esférica. Los microgeles modificados con GRGDS-PC forman construcciones 3D macroporosas que se pueden utilizar para el cultivo celular.
Un sistema de dos componentes de microgeles funcionalizados de microfluídica permite una rápida interconexión en construcciones macroporosas 3D en soluciones acuosas sin aditivos adicionales. La gelificación continua fotoiniciada en chip permite la variación de la relación de aspecto del microgel, que determina las propiedades del bloque de construcción para las construcciones obtenidas. Los monómeros de metacrilato de glicidil (GMA) o metacrilato de 2-aminoetilo (AMA) se copolimerizan en la red de microgel basada en polímeros estrella de polietilenglicol (PEG) para lograr la funcionalidad epoxi o amina. Se introduce un flujo de aceite de enfoque en la estructura de salida microfluídica para garantizar la recolección continua de las varillas de microgel funcionalizadas. Según una publicación reciente, las construcciones basadas en varillas de microgel dan como resultado poros más grandes de varios cientos de micrómetros y, al mismo tiempo, conducen a una mayor estabilidad general del andamio en comparación con un modelo de base esférica. De esta manera, es posible producir construcciones de mayor volumen con más volumen libre al tiempo que se reduce la cantidad de material requerido. Los andamios macroporosos interconectados se pueden recoger y transportar sin daños ni desintegración. Los grupos amina y epoxi que no participan en la interconexión permanecen activos y pueden usarse de forma independiente para la modificación posterior. Este protocolo describe un método optimizado para la fabricación de varillas de microgel para formar andamios macroporosos interconectados que se pueden utilizar para experimentos celulares posteriores.
Para estudiar el comportamiento celular cooperativo complejo en construcciones 3D, las plataformas de andamios deben mostrar un rendimiento consistente en reproducibilidad, tener una geometría adecuada para la migración celular y, al mismo tiempo, permitir cierta flexibilidad en términos de alteración de parámetros para investigar su influencia en el tejido vivo1. En los últimos años, el concepto de partículas recocidas macroporosas (MAP), descrito por primera vez por Segura et al., se convirtió en una plataforma eficiente y versátil para la producción de andamios 3D2. La composición personalizada de los microgeles, que son los bloques de construcción del andamio 3D final, predefine propiedades como la rigidez de la construcción, la reactividad química selectiva de la red de gel y el tamaño de poro final del andamio 2,3,4,5,6. Los péptidos adhesivos celulares como señales para las interacciones andamio-célula se incorporan a la red polimérica de los microgeles para permitir la unión celular y se pueden variar para investigar sus efectos específicos en las células en cultivo. Los andamios 3D se estabilizan mediante la interconexión de los microgeles inyectables recocidos debido a enlaces covalentes o supramoleculares, lo que resulta en construcciones robustas y definidas para el cultivo celular 2,3,5,7,8.
La microfluídica se ha establecido como uno de los métodos más precisos y adaptables para la preparación de hidrogeles granulares definidos9. La posibilidad de producir mayores cantidades de los bloques de construcción requeridos en un proceso continuo mientras se mantiene su monodispersidad química, mecánica y física contribuye sustancialmente a la idoneidad de este proceso. Además, el tamaño y la forma de los microgeles producidos pueden manipularse mediante diversos métodos, como emulsiones discontinuas, microfluídica, litografía, pulverización electrodinámica o fragmentación mecánica, que determinan la geometría de los bloques de construcción y, por lo tanto, la estructura 3D del andamio final 1,10.
Recientemente, el concepto de andamios 3D macroporosos compuestos por varillas de microgel funcionalizadas que se entrelazan rápidamente en soluciones acuosas sin aditivos adicionales ha sido reportado11. La anisotropía de las varillas de microgel resultó en mayores porosidades y distribuciones de poros con mayores tamaños de poro en comparación con el empleo de microgeles esféricos en este estudio11. De esta manera, menos material crea poros más grandes con una variedad de geometrías de poros diferentes, manteniendo la estabilidad del andamio 3D. El sistema consiste en dos tipos de barras de microgel con grupos funcionales complementarios de amina primaria y epoxi que se consumen dentro de la reacción de interconexión cuando entran en contacto entre sí. Los grupos funcionales que no participan en el proceso de interconexión permanecen activos y pueden utilizarse para la post-modificación selectiva con péptidos adhesivos celulares u otros factores bioactivos. Las células de fibroblastos se adhieren, se propagan y proliferan cuando se cultivan dentro de los andamios 3D, creciendo primero en la superficie del microgel y llenando la mayoría de los macroporos después de 5 días. Un estudio preliminar de cocultivo de fibroblastos humanos y células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVECs) mostró resultados prometedores para la formación de estructuras similares a vasos dentro de los andamios 3D interconectados11.
Uno de los pasos críticos en este protocolo es la calidad del metacrilato de 2-aminoetilo (AMA) utilizado como comonómero para la funcionalización de aminas primarias. El AMA debe ser un polvo de grano fino y preferiblemente incoloro entregado en un recipiente de vidrio marrón hermético al gas. Se debe evitar el uso de material verdoso y grumoso, ya que perjudica significativamente la reacción de gelificación y afecta negativamente la reproducibilidad de los resultados. En caso de mala gelificación y varillas de …
The authors have nothing to disclose.
Expresamos nuestra gratitud a los coautores de nuestro trabajo anterior en el que se basa esta metodología, Céline Bastard, Luis P. B. Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born y Tamás Haraszti. Agradecemos la financiación de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dentro del proyecto B5 y C3 SFB 985 “Microgeles funcionales y sistemas de microgeles”. Reconocemos la financiación del Comité de Competencia del Senado de Leibniz (SAW) bajo el Professorinnenprogramm (SAW-2017-PB62: BioMat). Reconocemos sinceramente la financiación de la Comisión Europea (EUSMI, 731019). Este trabajo se realizó en parte en el Centro de Tecnología de Polímeros Químicos (CPT), que recibió el apoyo de la UE y el estado federal de Renania del Norte-Westfalia (subvención EFRE 30 00 883 02).
ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |