Summary
Las varillas de microgel con grupos reactivos complementarios se producen a través de microfluídica con la capacidad de interconectarse en solución acuosa. Los microgeles anisómetros se atascan y se entrelazan en construcciones estables con poros más grandes en comparación con los sistemas de base esférica. Los microgeles modificados con GRGDS-PC forman construcciones 3D macroporosas que se pueden utilizar para el cultivo celular.
Abstract
Un sistema de dos componentes de microgeles funcionalizados de microfluídica permite una rápida interconexión en construcciones macroporosas 3D en soluciones acuosas sin aditivos adicionales. La gelificación continua fotoiniciada en chip permite la variación de la relación de aspecto del microgel, que determina las propiedades del bloque de construcción para las construcciones obtenidas. Los monómeros de metacrilato de glicidil (GMA) o metacrilato de 2-aminoetilo (AMA) se copolimerizan en la red de microgel basada en polímeros estrella de polietilenglicol (PEG) para lograr la funcionalidad epoxi o amina. Se introduce un flujo de aceite de enfoque en la estructura de salida microfluídica para garantizar la recolección continua de las varillas de microgel funcionalizadas. Según una publicación reciente, las construcciones basadas en varillas de microgel dan como resultado poros más grandes de varios cientos de micrómetros y, al mismo tiempo, conducen a una mayor estabilidad general del andamio en comparación con un modelo de base esférica. De esta manera, es posible producir construcciones de mayor volumen con más volumen libre al tiempo que se reduce la cantidad de material requerido. Los andamios macroporosos interconectados se pueden recoger y transportar sin daños ni desintegración. Los grupos amina y epoxi que no participan en la interconexión permanecen activos y pueden usarse de forma independiente para la modificación posterior. Este protocolo describe un método optimizado para la fabricación de varillas de microgel para formar andamios macroporosos interconectados que se pueden utilizar para experimentos celulares posteriores.
Introduction
Para estudiar el comportamiento celular cooperativo complejo en construcciones 3D, las plataformas de andamios deben mostrar un rendimiento consistente en reproducibilidad, tener una geometría adecuada para la migración celular y, al mismo tiempo, permitir cierta flexibilidad en términos de alteración de parámetros para investigar su influencia en el tejido vivo1. En los últimos años, el concepto de partículas recocidas macroporosas (MAP), descrito por primera vez por Segura et al., se convirtió en una plataforma eficiente y versátil para la producción de andamios 3D2. La composición personalizada de los microgeles, que son los bloques de construcción del andamio 3D final, predefine propiedades como la rigidez de la construcción, la reactividad química selectiva de la red de gel y el tamaño de poro final del andamio 2,3,4,5,6. Los péptidos adhesivos celulares como señales para las interacciones andamio-célula se incorporan a la red polimérica de los microgeles para permitir la unión celular y se pueden variar para investigar sus efectos específicos en las células en cultivo. Los andamios 3D se estabilizan mediante la interconexión de los microgeles inyectables recocidos debido a enlaces covalentes o supramoleculares, lo que resulta en construcciones robustas y definidas para el cultivo celular 2,3,5,7,8.
La microfluídica se ha establecido como uno de los métodos más precisos y adaptables para la preparación de hidrogeles granulares definidos9. La posibilidad de producir mayores cantidades de los bloques de construcción requeridos en un proceso continuo mientras se mantiene su monodispersidad química, mecánica y física contribuye sustancialmente a la idoneidad de este proceso. Además, el tamaño y la forma de los microgeles producidos pueden manipularse mediante diversos métodos, como emulsiones discontinuas, microfluídica, litografía, pulverización electrodinámica o fragmentación mecánica, que determinan la geometría de los bloques de construcción y, por lo tanto, la estructura 3D del andamio final 1,10.
Recientemente, el concepto de andamios 3D macroporosos compuestos por varillas de microgel funcionalizadas que se entrelazan rápidamente en soluciones acuosas sin aditivos adicionales ha sido reportado11. La anisotropía de las varillas de microgel resultó en mayores porosidades y distribuciones de poros con mayores tamaños de poro en comparación con el empleo de microgeles esféricos en este estudio11. De esta manera, menos material crea poros más grandes con una variedad de geometrías de poros diferentes, manteniendo la estabilidad del andamio 3D. El sistema consiste en dos tipos de barras de microgel con grupos funcionales complementarios de amina primaria y epoxi que se consumen dentro de la reacción de interconexión cuando entran en contacto entre sí. Los grupos funcionales que no participan en el proceso de interconexión permanecen activos y pueden utilizarse para la post-modificación selectiva con péptidos adhesivos celulares u otros factores bioactivos. Las células de fibroblastos se adhieren, se propagan y proliferan cuando se cultivan dentro de los andamios 3D, creciendo primero en la superficie del microgel y llenando la mayoría de los macroporos después de 5 días. Un estudio preliminar de cocultivo de fibroblastos humanos y células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVECs) mostró resultados prometedores para la formación de estructuras similares a vasos dentro de los andamios 3D interconectados11.
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Protocol
1. Material y preparaciones necesarias para microfluídica
- Para el procedimiento microfluídico descrito, use jeringas de vidrio y bombas de jeringa de 1 ml y 5 ml. La formación de gotitas en chip se observa a través de un microscopio invertido equipado con una cámara de alta velocidad.
- Cree el diseño del chip microfluídico (Figura 1B) utilizando un software de diseño asistido por computadora y produzca una plantilla maestra como ya se informó12.
- Logre una irradiación UV controlada utilizando un LED UV autoconstruido (λ = 365 nm, diámetro de punto ~ 4.7 mm) que proporciona irradiancia a 957 mW / cm2 a través de un vidrio de cubierta de 0.13 mm de espesor.
NOTA: Tenga en cuenta la posible generación de calor local por el UV-LED durante la irradiación. Si este es el caso, asegúrese de una refrigeración suficiente por flujo de aire externo.
2. Producción de dispositivos microfluídicos
NOTA: La producción de dispositivos microfluídicos se basa en una publicación anterior13.
- Prepare 20 g de una mezcla 10:1 (en masa) de polidimetilsiloxano (PDMS) y agente de curado. Mezclar vigorosamente durante 3 min.
- Mezclar 60 mg de Oil Red O en 2,0 g de tolueno. Añadir 50 μL de aceite rojo O en solución de tolueno a la mezcla de PDMS. Mezcle hasta que haya una distribución de color homogénea para disminuir la dispersión de luz no deseada y mantener el tamaño del punto enfocado durante la gelificación en chip.
- Retire las burbujas colocando la mezcla en un desecador equipado con una bomba de vacío.
- Coloque la mezcla PDMS en la plantilla maestra a una altura de 5-5,5 mm y desgasifique de nuevo.
- Deje que el PDMS se cure durante 18 h a temperatura ambiente para evitar la degradación del colorante diazo.
- Corte la estructura PDMS y perfore los orificios de entrada y salida en la estructura utilizando una herramienta de muestreo de núcleo de línea (0,77 mm de diámetro interior, 1,07 mm de diámetro exterior).
- Lave el PDMS y cubra el vidrio con isopropanol y agua desionizada repetidamente 5 veces y, posteriormente, retire el líquido a través del flujo de aire o nitrógeno a presión después de cada paso de lavado.
- Tratar el vidrio seco y el PDMS juntos en un horno de plasma a 0,2 mbar, con un flujo de oxígeno de 20 ml / min durante 60 s a 100 W, y conectar directamente para unir el vidrio y PDMS para formar el dispositivo microfluídico.
NOTA: Evite doblar la estructura PDMS durante el proceso de unión para minimizar la deformación de la estructura del canal. - Para hacer que los canales del chip microfluídico sean hidrófobos, coloque el dispositivo junto con 50 μL de tricloro-(1 H,1 H,2 H,2 H-perfluoroctil)-silano en un desecador al vacío durante la noche (cierre la conexión a la bomba después de disminuir la presión de vapor). Enjuague el exterior del dispositivo con hidrofluoroéter.
PRECAUCIÓN: Realice estos pasos en una campana extractora y evite cualquier contacto con el perfluorosilano. Use un desecador al vacío de vidrio sellado con grasa. Limpie bien el desecador antes de usarlo para otros fines.
3. Preparación de la solución para microfluídica
- Para la fase continua de aceite, mezclar aceite de parafina y hexadecano (1:1 v/v) y añadir 8% (p/p) de un tensioactivo no iónico. Llene una jeringa de vidrio de 1 ml (primer aceite, figura 1) y una jeringa de vidrio de 5 ml (segundo aceite, figura 1).
- Preparar las soluciones de prepolímero para la fase dispersa en viales de vidrio marrón para evitar la descomposición del fotoiniciador y la gelificación involuntaria.
- Solución de prepolímero de componentes de amina que contiene GRGDS-PC
- Para una solución de 300 μL, pesar 33,3 mg de estrella-polietilenglicol-acrilato (sPEG-AC) y 3,03 mg de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilofinato de litio (LAP).
- Disuelva 18,74 mg de clorhidrato de metacrilato de 2-aminoetilo (AMA) en 1,5 ml de agua desionizada y pase la solución a través de un filtro de jeringa (tamaño de poro de 0,20 μm).
NOTA: AMA es higroscópico y debe desecharse tan pronto como el sólido forme grumos en el recipiente de almacenamiento. - Preparar alícuotas estériles de 36 mM GRGDS-PC en agua y conservar a -20 °C hasta su uso.
- Use 291.7 μL de la solución AMA para disolver sPEG-AC y LAP, y agregue 8.3 μL de la solución GRGDS-PC. Tome la solución con una jeringa de vidrio de 1 ml y protéjala de la luz con papel de aluminio.
- Solución de prepolímero de componentes epoxi
- Para una solución de 300 μL, pesar 33,3 mg de estrella-polietilenglicol-acrilato (sPEG-AC), 3,03 mg de LAP y disolver en 300 μL de agua desionizada. Añadir 2,4 mg de metacrilato de glicidil (GMA).
NOTA: La agitación vigorosa acelera la disolución de GMA. Tome la solución con una jeringa de vidrio de 1 ml y protéjala de la luz con papel de aluminio.
- Para una solución de 300 μL, pesar 33,3 mg de estrella-polietilenglicol-acrilato (sPEG-AC), 3,03 mg de LAP y disolver en 300 μL de agua desionizada. Añadir 2,4 mg de metacrilato de glicidil (GMA).
- Solución de prepolímero de componentes de amina que contiene GRGDS-PC
4. Producción y purificación de varillas de microgel funcionalizadas con amina y epoxi
Figura 1: Disposición del conjunto de gelificación microfluídica en chip . (A) Vista frontal y vista en ángulo de la disposición de los componentes durante la microfluídica. (B) Diseño de chip microfluídico utilizado para la gelificación en chip de varillas de microgel. (1) Tubo de PE a la primera entrada de aceite. (2) Tubo de PE protegido contra la luz a la entrada de fase dispersa. (3) Tubo de PE a la segunda entrada de aceite. (4) Tubo de PE desde la salida hasta el contenedor de recogida del producto. (5) Lámpara UV y ubicación de irradiación en el canal recto de 80 μm cerca de la salida. (6) Objetivo/posición de observación del microscopio. (7) Componente PDMS coloreado del dispositivo microfluídico. (8) Cubrir el vidrio unido al PDMS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Inserte las agujas en los tubos de PE y retire el gas de la jeringa y del tubo.
- Inserte un tubo de PE en la salida para la recogida del producto.
- Coloque todas las jeringas de vidrio en las bombas de jeringa e inserte cada extremo del tubo en la entrada correspondiente (Figura 1).
NOTA: Proteja el tubo de prepolímero de la luz a través de papel de aluminio o un tubo negro para evitar la gelificación involuntaria. - Enfoque el microscopio en la sección transversal aceite-agua.
- Encienda la primera bomba de jeringa de aceite (caudal = 100-200 μL/h) para llenar primero el canal con aceite para evitar la humectación del canal por la fase dispersa.
- Disminuir el primer caudal de aceite a 30 μL/h y poner en marcha la bomba de jeringa de prepolímero (caudal = 100-200 μL/h) hasta que se pueda observar la fase acuosa dispersa en la sección transversal.
- Ajuste el caudal del prepolímero a 30 μL/h y enfoque el microscopio en la salida.
- Arranque la segunda bomba de jeringa de aceite (caudal de 300 μL/h) y espere hasta que el régimen de flujo sea estable.
- Coloque el tubo de salida en un recipiente de recolección.
NOTA: Coloque el extremo del tubo en la parte superior del recipiente para evitar un aumento de presión debido a la acumulación del producto con el paso del tiempo. - Ajuste el sistema de irradiación UV de tal manera que la irradiancia esté en el rango de 900-1000 mW / cm 2 (irradiancia utilizada = 957 mW / cm2) y el punto de irradiación esté en la parte del canal recto antes de la salida (Figura 1B).
NOTA: Asegúrese de no irradiar cerca de la sección transversal aceite-agua para evitar obstruir el canal. Para mayor protección, cubra las estructuras del canal antes del punto de irradiación en la parte superior de la unidad. - Antes de la irradiación UV, ajuste los caudales del prepolímero y del primer aceite para lograr la relación de aspecto deseada en el rango de 3.0 a 4.5, y establezca el tiempo de irradiación de la fase dispersa en ~ 2.3 s, dependiendo del tamaño del punto de irradiación.
- Inicie la irradiación UV y, si es necesario, vuelva a ajustar los caudales de acuerdo con la subsección anterior.
NOTA: Observe la producción al principio y supervise el comportamiento estable del flujo en la salida y la uniformidad de las varillas de microgel. El segundo flujo de aceite se puede ajustar para optimizar el transporte del producto dentro de la salida. - Cambie el contenedor de recolección y anote la hora de inicio de la recolección del producto y las tasas de flujo.
NOTA: Proteja el producto del polvo. Deje de recolectar antes de que cualquier jeringa se quede sin solución. - Para finalizar la recolección, retire el contenedor de recolección y anote la hora. Detenga la irradiación y todas las bombas de jeringa.
- Lave el producto posteriormente 5 veces cada una con n-hexano, isopropanol y agua desionizada. Retire el sobrenadante después de la sedimentación de la varilla.
NOTA: Después de cada adición de solución, dispersar el producto cuidadosamente y esperar 10 minutos antes de reemplazar el solvente, considerando la difusión molecular. Reemplace el isopropanol gradualmente con agua para evitar que las varillas floten hacia la superficie del líquido. Múltiples pasos de lavado adicionales con agua disminuyen las trazas restantes de isopropanol.
5. Formación de andamios macroporosos
- Determinar el número de varillas de microgel por volumen de dispersión para las muestras funcionalizadas con epoxi y amina.
- Ajustar el número de muestras funcionalizadas con epoxi y amina por dilución o concentración a un valor similar entre 1.000-5.000 varillas/100 μL.
NOTA: Utilice una centrífuga a ~2.000 x g durante 5-10 s para acelerar la sedimentación de las barras de microgel. Si el número de varillas por volumen de dispersión es bajo, la interconexión de varillas puede dar lugar a grupos de varillas más pequeños en lugar de una construcción estable. Si el número de varillas por volumen de dispersión es alto, la calidad de mezcla de los dos componentes se verá comprometida. - Transfiera la dispersión del primer componente (~1,200 varillas) a un vial transparente cónico de 1.5 ml o 2 ml.
- Añadir el segundo componente de forma controlada en un funcionamiento continuo (pipeta de 100 μL). Después de la adición, mezclar el contenido directamente con la pipeta para tomar líquido y añadirlo de nuevo. La estructura interconectada se forma en cuestión de segundos durante la mezcla.
NOTA: Si se forman varios grupos en lugar de una estructura coherente, vuelva a comprobar el número de varillas de microgel por volumen o proporcione una mezcla más controlada de los dos componentes.
6. Adhesivo celular post-modificación
- Calcule el número teórico de grupos epoxi en la estructura interconectada en función del caudal de la fase de polímero disperso, el número de microgeles recogidos durante un tiempo específico y el factor de dilución de la dispersión de microgel utilizada para la formación de andamios.
NOTA: Aproxime el número teórico de grupos epoxi por andamio mediante la siguiente ecuación.
nth: Cantidad teórica de sustancia
c GMA: concentración deGMA en solución de prepolímero
P: Caudal de la solución de prepolímero - Agregue la solución GRGDS-PC a la estructura interconectada para modificar todos los grupos epoxi restantes con el péptido adhesivo celular que lleva una amina y tiol libres (n [grupos epoxi teóricos] / n [GRGDS-PC] = 1). Dejar a temperatura ambiente durante la noche.
- Eliminar las moléculas no reaccionadas lavando con agua desionizada y eliminando el sobrenadante.
7. Esterilización y transferencia a medios de cultivo celular
- Reduzca el nivel del agua para sumergir el andamio interconectado.
- Abra el vial e irradie con luz UV de λ = 250-300 nm. Cierre el vial y transfiera el vial a un banco limpio. Lavar 1x con agua estéril.
- Reemplace el agua del vial con medios de cultivo celular y permita el equilibrio durante 5 minutos. Repita esto con medios de cultivo celular frescos 2x.
- Transfiera el andamio macroporoso a una placa de pozo de cultivo celular para el experimento vertiendo o usando una espátula.
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Representative Results
Figura 2: Estructura del andamio reticulado macroporoso. (A) Proyección 3D de una pila Z de microscopía confocal de 500 μm del andamio macroporoso interconectado. La barra de escala representa 500 μm. (B) Andamio interconectado compuesto por ~10,000 varillas de microgel en un vidrio de cubierta tomado directamente del agua. La barra de escala representa 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Este protocolo da como resultado una construcción macroporosa 3D estable compuesta de varillas de microgel funcionalizadas con amina y epoxi interconectadas (Figura 2A). El constructo debe exhibir una geometría compacta si se utiliza el tipo de mezcla descrito, que se forma dentro de 2 s o 3 s (Figura 2B).
La estabilidad de construcción interconectada depende de los bloques de construcción de varilla de microgel de los que se compone. Las varillas de microgel funcionalizadas con amina exhiben una rigidez promedio de 2.0 ± 0.2 kDa, determinada por nanoindentación (Figura 3A). Si las varillas son demasiado blandas, es posible que la estructura macroporosa interconectada no se logre debido a la deformación de los bloques de construcción. Para detectar grupos funcionales activos, se puede usar isotiocianato de fluoresceína (FITC) para visualizar grupos amino primarios, y se puede emplear el isómero de fluoresceína amina I para marcar grupos epoxi (Figura 3B, C). Las varillas de microgel de amina tienen dimensiones con una longitud promedio de 553 μm ± 29 μm y una anchura promedio de 193 μm ± 7 μm en agua desionizada, lo que resulta en una relación de aspecto de ~3.0 y una reducción en el volumen (colapso) en ~73% de su tamaño en medios de cultivo celular11.
Figura 3: Propiedades del microgel. (A) Módulo efectivo de Young de varillas de microgel de amina y epoxi junto con esferas de microgel de amina y epoxi medidas por nanoindentación. Los datos se muestran como un diagrama de caja que se extiende desde el percentil 25 al 75, con los bigotes que alcanzan desde el 5% hasta el 95% de cuantiles. Las líneas dentro de las cajas representan las medianas, los cuadrados vacíos indican las medias y los cuadrados negros representan valores atípicos (n = 40; Los valores de p se calculan utilizando ANOVA unidireccional con corrección de Bonferroni, **p < 0,01, ****p < 0,0001). (B) Arriba: Imagen de microscopía confocal de una varilla de microgel de amina funcionalizada con FITC y una varilla de microgel epoxi funcionalizada con isómero de amina fluoresceína I. Abajo: Imágenes de campo brillante correspondientes. Todas las barras de escala representan 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Como se describe en la publicación relacionada, los microgeles en forma de esfera producidos a través del mismo método conducen a múltiples grupos interconectados en lugar de un andamio macroporoso estable11. La mayor relación de aspecto de las varillas de microgel permite una mejor estabilidad general debido a un puente de estructura más eficiente en 3D (Figura 4).
Figura 4: Influencia de la relación de aspecto en la formación de la estructura . (A) Imagen de campo brillante de una construcción interconectada compuesta de varillas de microgel. (B) Imagen de campo brillante de cúmulos interconectados compuestos de microgeles en forma de esfera. Las barras de escala representan 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los valores medios de los macroporos en los andamios compuestos por varillas de microgel son de 100 μm, con un 90% de los tamaños de poro que van desde 30 μm hasta más de 150 μm11. Los microgeles en forma de esfera dan como resultado grupos con tamaños de poro entre ~ 10 μm a 55 μm, con un valor medio de alrededor de 22 μm11. Esto es consistente con los números reportados por otros estudios que preparan MAPs basados en microgeles esféricos 2,4,14.
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Discussion
Uno de los pasos críticos en este protocolo es la calidad del metacrilato de 2-aminoetilo (AMA) utilizado como comonómero para la funcionalización de aminas primarias. El AMA debe ser un polvo de grano fino y preferiblemente incoloro entregado en un recipiente de vidrio marrón hermético al gas. Se debe evitar el uso de material verdoso y grumoso, ya que perjudica significativamente la reacción de gelificación y afecta negativamente la reproducibilidad de los resultados. En caso de mala gelificación y varillas de microgel inestables, se puede considerar cambiar el proveedor.
Si la mezcla de varillas de microgel de amina y epoxi da lugar a múltiples grupos interconectados en lugar de a una estructura estable, compruebe el número de varillas en cada dispersión de material y configúrelo en un valor similar en el rango de 1.000-5.000 varillas/100 μL para ambas muestras. Si las dimensiones del microgel difieren significativamente de los valores mencionados aquí, ajuste el número de varillas de microgel a la fracción de volumen. Aumente el número por volumen si los geles son más pequeños y disminuya el número en el caso contrario.
El método descrito no se centró en optimizar el proceso de mezcla para tener un ensamblaje más controlado de los dos componentes de mezcla funcionalizados complementarios. Dado que la interconexión se produce en pocos segundos, el volumen total de la dispersión para formar una construcción interconectada y las fracciones de volumen de los microgeles utilizados se ajustan para obtener estructuras macroporosas estables simplemente pipeteando los dos componentes uno tras otro. En el futuro, sería ventajoso analizar las propiedades de flujo y mezcla de las dispersiones de varillas de microgel y obtener información adicional sobre la formación de la estructura de los andamios. Una mezcla más controlada de los dos componentes de microgel interconectados podría permitir la formación automatizada y de alto rendimiento de estos andamios macroporosos y permitir un crecimiento de construcción incremental.
Dado que la interconexión procede muy rápidamente, los poros del andamio se crean durante la mezcla. Si las varillas de microgel se sedimentaran completamente antes de interconectarse químicamente, se esperaría una relación de apilamiento a atasco mucho mayor. Por lo tanto, es probable que la cinética de interconexión tenga un gran efecto en la formación de MAP y la porosidad y el tamaño de los poros resultantes. La funcionalización celular adhesiva por post-modificación o incorporación a la red de gel durante la preparación del microgel ha demostrado que L929 y las células de fibroblastos humanos se adhieren y se extienden primero en la superficie de las barras de microgel y, posteriormente, llenan la mayoría de los macroporos después de 5-7 días en cultivo11. Debido a que los tamaños de los poros oscilan predominantemente entre 30 μm y por encima de 150 μm y a la estructura de poro interconectada, confirmada por microscopía confocal, las células sembradas pueden entrar fácilmente en el andamio interconectado11. Hasta ahora, estos andamios basados en varillas de microgel se han utilizado para cultivar células de fibroblastos y HUVEC en cocultivo. Los HUVEC sembrados después de 14 días de cultivo de células de fibroblastos formaron las primeras estructuras alargadas similares a vasos en los siguientes 16 días11. El estudio de otros tipos de células en cocultivos aún no se ha abordado en el futuro. Para permitir que las células se agreguen directamente al sistema durante la formación de andamios, se requiere una interconexión rápida de varillas en tampones compatibles con células o medios de cultivo, lo que permitiría que este sistema se extienda a plataformas de bioimpresión.
Los andamios 3D macroporosos no inyectables también se pueden crear mediante varios métodos alternativos como la fundición por solvente, la liofilización, la lixiviación de partículas espumantes de gas, el electrohilado o la impresión 3D 1,15,16. La migración y proliferación celular puede ocurrir fácilmente sin la necesidad de degradar el andamio de antemano, siempre y cuando se haya logrado la geometría de poro y la permeabilidad requeridas en toda la red. La impresión 3D utilizando biotintas atascadas y extruibles de esferas de microgel a base de ácido hialurónico modificado con PEG, agarosa y norborneno combina las tecnologías de impresión MAP y 3D, controlando la porosidad entre los microgeles recocidos y también la geometría de la estructura impresa general17.
En comparación con los métodos alternativos existentes, los andamios resultantes exhiben una amplia variedad de geometrías de macroporos 3D debido a la mayor relación de aspecto de los bloques de construcción de microgel y su configuración interconectada de dos componentes11. La utilización de varillas de microgel crea más porosidad y, por lo tanto, más espacio para las interacciones célula-célula en comparación con el ensamblaje de microgeles esféricos. Esto es fundamental para la formación de tejido biológico, ya que mejora las interacciones célula-célula. Al mismo tiempo, se puede usar menos material para producir andamios macroporosos de los mismos volúmenes, manteniendo la estabilidad de la construcción. La reducción del material del andamio es beneficiosa ya que se proporciona más espacio abierto para la formación de tejido y se debe degradar menos material, lo cual es importante tanto para aplicaciones in vitro como in vivo . La biofuncionalización de los microgeles puede extenderse a otros tipos de péptidos y factores bioactivos. Los andamios macroporosos estables resultantes requieren menos material para crear más porosidad. Junto con la capacidad de ajuste del sistema, este método ofrece un alto potencial como plataforma versátil para el cultivo celular en 3D.
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Disclosures
Los autores aseguran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Expresamos nuestra gratitud a los coautores de nuestro trabajo anterior en el que se basa esta metodología, Céline Bastard, Luis P. B. Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born y Tamás Haraszti. Agradecemos la financiación de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dentro del proyecto B5 y C3 SFB 985 "Microgeles funcionales y sistemas de microgeles". Reconocemos la financiación del Comité de Competencia del Senado de Leibniz (SAW) bajo el Professorinnenprogramm (SAW-2017-PB62: BioMat). Reconocemos sinceramente la financiación de la Comisión Europea (EUSMI, 731019). Este trabajo se realizó en parte en el Centro de Tecnología de Polímeros Químicos (CPT), que recibió el apoyo de la UE y el estado federal de Renania del Norte-Westfalia (subvención EFRE 30 00 883 02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
References
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