Summary
Microgelstavar med komplementära reaktiva grupper produceras via mikrofluidik med förmågan att sammanlänka i vattenlösning. De anisometriska mikrogelerna fastnar och kopplas samman till stabila konstruktioner med större porer jämfört med sfäriska baserade system. Mikrogeler modifierade med GRGDS-PC bildar makroporösa 3D-konstruktioner som kan användas för cellodling.
Abstract
Ett tvåkomponentsystem av funktionaliserade mikrogeler från mikrofluidik möjliggör snabb sammankoppling till 3D-makroporösa konstruktioner i vattenhaltiga lösningar utan ytterligare tillsatser. Kontinuerlig fotoinitierad on-chip-gelering möjliggör variation av mikrogel-bildförhållandet, vilket bestämmer byggstensegenskaperna för de erhållna konstruktionerna. Glycidylmetakrylat (GMA) eller 2-aminoetylmetakrylat (AMA) monomerer sampolymeriseras i mikrogelnätverket baserat på polyetylenglykol (PEG) stjärnpolymerer för att uppnå antingen epoxi- eller aminfunktionalitet. Ett fokuserande oljeflöde införs i den mikrofluidiska utloppsstrukturen för att säkerställa kontinuerlig insamling av de funktionaliserade mikrogelstavarna. Baserat på en ny publikation resulterar mikrogelstångsbaserade konstruktioner i större porer på flera hundra mikrometer och leder samtidigt till totalt sett högre ställningsstabilitet jämfört med en sfäriskt baserad modell. På detta sätt är det möjligt att producera konstruktioner med högre volym med mer fri volym samtidigt som mängden material som krävs minskas. De sammanlänkade makroporösa ställningarna kan plockas upp och transporteras utan skador eller sönderfall. Amin- och epoxigrupper som inte är involverade i sammankoppling förblir aktiva och kan användas oberoende för postmodifiering. Detta protokoll beskriver en optimerad metod för tillverkning av mikrogelstavar för att bilda makroporösa sammankopplade byggnadsställningar som kan användas för efterföljande cellexperiment.
Introduction
För att studera komplext kooperativt cellbeteende i 3D-konstruktioner måste ställningsplattformar visa konsekvent prestanda i reproducerbarhet, ha lämplig geometri för cellmigration och samtidigt tillåta viss flexibilitet när det gäller parameterförändring för att undersöka deras inflytande på den levande vävnaden1. Under de senaste åren har begreppet makroporösa glödgade partiklar (MAP), som först beskrivits av Segura et al., utvecklats till en effektiv och mångsidig plattform för 3D-ställningsproduktion2. Den skräddarsydda sammansättningen av mikrogelerna, som är byggstenarna i den slutliga 3D-ställningen, fördefinierar egenskaper såsom konstruktionens styvhet, gelnätverkets selektiva kemiska reaktivitet och ställningens slutliga porstorlek 2,3,4,5,6. Cellhäftande peptider som ledtrådar för byggnadsställning-cellinteraktioner införlivas i mikrogelernas polymernätverk för att möjliggöra cellbindning och kan varieras för att undersöka deras specifika effekter på celler i odling. 3D-ställningarna stabiliseras genom sammankoppling av de glödgade injicerbara mikrogelerna på grund av kovalenta eller supramolekylära bindningar, vilket resulterar i robusta och definierade konstruktioner för cellodling 2,3,5,7,8.
Mikrofluidik har etablerat sig som en av de mest exakta och anpassningsbara metoderna för framställning av definierade granulära hydrogeler9. Möjligheten att producera större mängder av de erforderliga byggstenarna i en kontinuerlig process samtidigt som deras kemiska, mekaniska och fysiska monodispersitet bibehålls bidrar väsentligt till lämpligheten av denna process. Vidare kan storleken och formen på de producerade mikrogelerna manipuleras med olika metoder såsom batchemulsioner, mikrofluidik, litografi, elektrodynamisk sprutning eller mekanisk fragmentering, som bestämmer byggstenarnas geometri och därmed 3D-strukturen hos den slutliga ställningen 1,10.
Nyligen har begreppet makroporösa 3D-ställningar bestående av funktionaliserade mikrogelstavar som snabbt kopplas samman i vattenlösningar utan ytterligare tillsatser rapporterats11. Anisotropin hos mikrogelstavar resulterade i högre porositeter och porfördelningar med större porstorlekar jämfört med att använda sfäriska mikrogeler i denna studie11. På så sätt skapar mindre material större porer med en mängd olika porgeometrier samtidigt som stabiliteten i 3D-ställningen bibehålls. Systemet består av två typer av mikrogelstavar med komplementära primära amin- och epoxifunktionella grupper som konsumeras inom den sammanlänkande reaktionen när de kommer i kontakt med varandra. De funktionella grupperna som inte deltar i sammankopplingsprocessen förblir aktiva och kan användas för selektiv eftermodifiering med cellhäftande peptider eller andra bioaktiva faktorer. Fibroblastceller fäster, sprider sig och sprider sig när de odlas inuti 3D-ställningarna, växer först på mikrogelytan och fyller de flesta makroporerna efter 5 dagar. En preliminär samodlingsstudie av humana fibroblaster och humana navelvenendotelceller (HUVEC) visade lovande resultat för bildandet av kärlliknande strukturer inom de sammanlänkade 3D-ställningarna11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nödvändigt material och preparat för mikrofluidik
- För det beskrivna mikrofluidiska förfarandet, använd 1 ml och 5 ml glassprutor och sprutpumpar. Droppbildning på chip observeras via ett inverterat mikroskop utrustat med en höghastighetskamera.
- Skapa den mikrofluidiska chipdesignen (figur 1B) med hjälp av en datorstödd designprogramvara och producera en huvudmall som redan rapporterats12.
- Uppnå kontrollerad UV-bestrålning med en självkonstruerad UV-LED (λ = 365 nm, punktdiameter ~ 4,7 mm) som ger bestrålning vid 957 mW / cm2 genom ett 0,13 mm tjockt täckglas.
OBS: Ta hänsyn till eventuell lokal värmeproduktion av UV-LED under bestrålning. Om så är fallet, se till att det finns tillräckligt med kylning genom externt luftflöde.
2. Produktion av mikrofluidiska enheter
OBS: Produktionen av mikrofluidiska enheter baseras på en tidigare publikation13.
- Bered 20 g av en 10:1 (i massa) blandning av polydimetylsiloxan (PDMS) och härdningsmedel. Blanda kraftigt i 3 min.
- Blanda 60 mg olja röd O i 2,0 g toluen. Tillsätt 50 μl olja röd O i toluenlösning till PDMS-blandningen. Blanda tills det finns homogen färgfördelning för att minska oönskad ljusspridning och hålla spotstorleken fokuserad under gelering på chipet.
- Ta bort bubblorna genom att placera blandningen i en exsickator utrustad med en vakuumpump.
- Gjut PDMS-blandningen i huvudmallen till en höjd av 5-5,5 mm och avgasa igen.
- Låt PDMS härda i 18 timmar vid rumstemperatur för att undvika nedbrytning av diazofärgämne.
- Skär ut PDMS-strukturen och stansa inlopps- och utloppshål i strukturen med hjälp av ett provtagningsverktyg för linjekärna (0,77 mm innerdiameter, 1,07 mm ytterdiameter).
- Tvätta PDMS och täck glaset med isopropanol och avjoniserat vatten upprepade gånger 5x och avlägsna därefter vätskan via tryckluft eller kväveflöde efter varje tvättsteg.
- Behandla det torra glaset och PDMS tillsammans i en plasmaugn vid 0,2 mbar, med ett syreflöde på 20 ml / min i 60 s vid 100 W, och anslut direkt för att binda glaset och PDMS tillsammans för att bilda den mikrofluidiska enheten.
OBS: Undvik att böja PDMS-strukturen under bindningsprocessen för att minimera deformation av kanalstrukturen. - För att göra kanalerna i det mikrofluidiska chipet hydrofoba, placera enheten tillsammans med 50 μL triklor-(1 H,1 H,2H,2 H-perfluoroktyl)-silan i en exsickator under vakuum över natten (stäng anslutningen till pumpen efter att ångtrycket har minskat). Skölj utsidan av enheten med fluoreter.
VARNING: Utför dessa steg i en dragskåp och undvik kontakt med perfluorsilanen. Använd en glasvakuum exsickator förseglad med fett. Rengör exsickatorn noggrant innan den används för andra ändamål.
3. Lösningsberedning för mikrofluidik
- För den kontinuerliga oljefasen, blanda paraffinolja och hexadekan (1:1 v/v) och tillsätt 8 viktprocent av ett icke-joniskt ytaktivt medel. Fyll en 1 ml (första oljan, figur 1) och en 5 ml (andra oljan, figur 1) glasspruta.
- Förbered prepolymerlösningarna för dispergeringsfasen i bruna glasflaskor för att förhindra nedbrytning av fotoinitiator och oavsiktlig gelering.
- Aminkomponent prepolymerlösning innehållande GRGDS-PC
- För en 300 μl lösning, väg upp 33,3 mg stjärnpolyetylenglykolakrylat (sPEG-AC) och 3,03 mg litiumfenyl-2,4,6-trimetylbensoylfosfinat (LAP).
- Lös upp 18,74 mg 2-aminoetylmetakrylathydroklorid (AMA) i 1,5 ml avjoniserat vatten och för lösningen genom ett sprutfilter (0,20 μm porstorlek).
OBS: AMA är hygroskopisk och bör kasseras så snart det fasta ämnet bildar klumpar i förvaringsbehållaren. - Bered sterila 36 mM GRGDS-PC alikvoter i vatten och håll vid −20 °C tills de används.
- Använd 291,7 μL av AMA-lösningen för att lösa upp sPEG-AC och LAP och tillsätt 8,3 μL av GRGDS-PC-lösningen. Ta upp lösningen med en 1 ml glasspruta och skydda mot ljus med aluminiumfolie.
- Epoxikomponent prepolymerlösning
- För en 300 μl lösning, väg 33,3 mg stjärnpolyetylenglykol-akrylat (sPEG-AC), 3,03 mg LAP och lös upp i 300 μL avjoniserat vatten. Tillsätt 2,4 mg glycidylmetakrylat (GMA).
OBS: Kraftig skakning påskyndar GMA-upplösning. Ta upp lösningen med en 1 ml glasspruta och skydda mot ljus med aluminiumfolie.
- För en 300 μl lösning, väg 33,3 mg stjärnpolyetylenglykol-akrylat (sPEG-AC), 3,03 mg LAP och lös upp i 300 μL avjoniserat vatten. Tillsätt 2,4 mg glycidylmetakrylat (GMA).
- Aminkomponent prepolymerlösning innehållande GRGDS-PC
4. Produktion och rening av amin- och epoxifunktionaliserade mikrogelstavar
Figur 1: Arrangemang av den mikrofluidiska geleringsenheten på chipet . (A) Framifrån och vinklad vy av komponentarrangemanget under mikrofluidik. (B) Mikrofluidisk chipdesign som används för gelering av mikrogelstavar på chip. (1) PE-rör till det första oljeinloppet. (2) Ljusskyddat PE-rör till dispergeringsfasinloppet. (3) PE-rör till det andra oljeinloppet. (4) PE-rör från utloppet till produktuppsamlingsbehållaren. (5) UV-lampa och bestrålningsplats på den raka 80 μm-kanalen nära utloppet. (6) Mikroskopets mål/observationsposition. (7) Färgad PDMS-komponent i mikrofluidikanordningen. (8) Täck glas bundet till PDMS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Sätt in nålarna i PE-rören och ta bort gasen från sprutan och röret.
- Sätt i ett PE-rör i utloppet för produktinsamling.
- Placera alla glassprutor i sprutpumparna och för in varje slangände i motsvarande inlopp (figur 1).
OBS: Skydda prepolymerslangen från ljus via aluminiumfolie eller ett svart rör för att undvika oavsiktlig gelering. - Fokusera mikroskopet på olje-vattentvärsnittet.
- Starta den första oljesprutpumpen (flödeshastighet = 100-200 μL/h) för att fylla kanalen med olja först för att förhindra kanalvätning genom dispergeringsfasen.
- Sänk det första oljeflödet till 30 μl/h och starta sprutpumpen före polymeren (flödeshastighet = 100–200 μl/h) tills den dispergerade vattenfasen kan observeras vid tvärsnittet.
- Ställ in prepolymerflödeshastigheten på 30 μl / h och fokusera mikroskopet på utloppet.
- Starta den andra oljesprutpumpen (flödeshastighet på 300 μl/h) och vänta tills flödesregimen är stabil.
- Placera utloppsröret i en uppsamlingsbehållare.
OBS: Placera rörets ände i behållarens övre del för att undvika en tryckökning på grund av ackumulering av produkten över tiden. - Ställ in UV-bestrålningssystemet så att bestrålningen ligger i intervallet 900-1000 mW/cm 2 (använd bestrålning = 957 mW/cm2) och bestrålningsfläcken är i den raka kanaldelen före utloppet (figur 1B).
OBS: Se till att inte bestråla nära olje-vattentvärsnittet för att undvika att täppa till kanalen. För ytterligare skydd, täck kanalstrukturerna före bestrålningsplatsen på toppen av enheten. - Före UV-bestrålning, justera flödeshastigheterna för prepolymeren och den första oljan för att uppnå önskat bildförhållande i intervallet 3,0 till 4,5 och ställ in bestrålningstiden för den dispergerade fasen till ~ 2,3 s, beroende på storleken på bestrålningsplatsen.
- Starta UV-bestrålning och justera vid behov flödeshastigheterna igen enligt föregående underavsnitt.
OBS: Observera produktionen i början och övervaka för stabilt flödesbeteende i utloppet och mikrogelstavarnas enhetlighet. Det andra oljeflödet kan justeras för att optimera produkttransporten inom utloppet. - Ändra insamlingsbehållaren och notera produktsamlingens starttid och flödeshastigheter.
OBS: Skydda produkten från damm. Sluta samla innan någon spruta har slut på lösningen. - För att avsluta samlingen, ta bort insamlingsbehållaren och notera tiden. Stoppa bestrålningen och alla sprutpumpar.
- Tvätta produkten därefter 5x vardera med n-hexan, isopropanol och avjoniserat vatten. Ta bort supernatanten efter stavsedimentering.
OBS: Efter varje lösningstillsats, dispergera produkten försiktigt och vänta 10 minuter innan du byter ut lösningsmedlet, med tanke på molekylär diffusion. Byt ut isopropanolen gradvis med vatten för att förhindra att stavarna flyter till vätskans yta. Flera ytterligare tvättsteg med vatten minskar de återstående isopropanolspåren.
5. Makroporös ställningsbildning
- Bestäm antalet mikrogelstavar per dispersionsvolym för epoxi- och aminfunktionaliserade prover.
- Justera antalet funktionaliserade epoxi- och aminprover genom utspädning eller koncentration till ett liknande värde mellan 1 000–5 000 stavar/100 μl.
OBS: Använd en centrifug vid ~ 2,000 x g i 5-10 s för att påskynda sedimenteringen av mikrogelstavarna. Om antalet stavar per dispersionsvolym är lågt kan stångsammankoppling resultera i mindre stavkluster istället för en stabil konstruktion. Om antalet stavar per dispersionsvolym är högt kommer blandningskvaliteten för de två komponenterna att äventyras. - Överför den första komponenten (~ 1 200 stavar) dispersion till en konisk 1,5 ml eller 2 ml transparent injektionsflaska.
- Tillsätt den andra komponenten på ett kontrollerat sätt i en kontinuerlig drift (100 μl pipett). Efter tillsats, blanda innehållet direkt med pipetten för att ta upp vätska och tillsätt det igen. Den sammanlänkade strukturen bildas inom några sekunder under blandning.
OBS: Om flera kluster bildas istället för en sammanhängande struktur, kontrollera antalet mikrogelstavar per volym eller ge mer kontrollerad blandning av de två komponenterna.
6. Cellhäftande eftermodifiering
- Beräkna det teoretiska antalet epoxigrupper i den sammanlänkade strukturen baserat på flödeshastigheten för den dispergerade polymerfasen, antalet mikrogeler uppsamlade under en viss tid och utspädningsfaktorn för mikrogeldispersionen som används för ställningsbildning.
OBS: Approximera det teoretiska antalet epoxigrupper per ställning med följande ekvation.
nth: Teoretisk mängd ämne
c GMA:GMA-koncentration i prepolymerlösning
Q: Flödeshastighet för prepolymerlösning - Tillsätt GRGDS-PC-lösning till den sammanlänkade strukturen för att modifiera alla återstående epoxigrupper med cellhäftande peptid som bär en fri amin och tiol (n [teoretiska epoxigrupper] / n [GRGDS-PC] = 1). Låt stå vid rumstemperatur över natten.
- Ta bort de oreagerade molekylerna genom att tvätta med avjoniserat vatten och ta bort supernatanten.
7. Sterilisering och överföring till cellodlingsmedier
- Sänk vattennivån så att den bara sänker ner den sammanlänkade ställningen.
- Öppna injektionsflaskan och bestråla med UV-ljus på λ = 250-300 nm. Stäng injektionsflaskan och överför injektionsflaskan till en ren bänk. Tvätta 1x med sterilt vatten.
- Byt ut vattnet i injektionsflaskan mot cellodlingsmedia och tillåt jämvikt i 5 minuter. Upprepa detta med färskt cellodlingsmedium 2x.
- Överför den makroporösa ställningen till en cellodlingsbrunnsplatta för experimentet genom att hälla eller använda en spatel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2: Makroporös tvärbunden ställningsstruktur . (A) 3D-projektion av en 500 μm konfokalmikroskopi Z-stack av den sammanlänkade makroporösa ställningen. Skalstången representerar 500 μm. (B) Sammanlänkad ställning bestående av ~ 10 000 mikrogelstavar på ett täckglas som tas direkt ur vattnet. Skalstången representerar 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Detta protokoll resulterar i en stabil 3D-makroporös konstruktion bestående av sammankopplade amin- och epoxifunktionaliserade mikrogelstavar (figur 2A). Konstruktionen bör uppvisa en kompakt geometri om den beskrivna typen av blandning används, vilken bildas inom 2 s eller 3 s (figur 2B).
Den sammanlänkade konstruktionsstabiliteten beror på de mikrogelstångsbyggstenar som den består av. De aminfunktionaliserade mikrogelstavarna uppvisar en genomsnittlig styvhet på 2,0 ± 0,2 kDa, bestämd av nanoindentation (figur 3A). Om stavarna är för mjuka kan den sammankopplade makroporösa strukturen inte uppnås på grund av deformation av byggstenarna. För att detektera aktiva funktionella grupper kan fluoresceinisotiocyanat (FITC) användas för att visualisera primära aminogrupper, och fluoresceinaminisomer I kan användas för att märka epoxigrupper (figur 3B, C). Aminmikrogelstavarna har dimensioner med en genomsnittlig längd på 553 μm ± 29 μm och en genomsnittlig bredd på 193 μm ± 7 μm i avjoniserat vatten, vilket resulterar i ett bildförhållande på ~ 3,0 och en minskning av volymen (kollaps) med ~ 73% av deras storlek i cellodlingsmedier11.
Figur 3: Microgel-egenskaper . (A) Effektiv Youngs modul av amin- och epoximikrogelstavar tillsammans med amin- och epoximikrogelsfärer mätt genom nanoindentation. Data som visas som ett rutdiagram som sträcker sig från den 25:e till 75:e percentilen, där morrhåren når från kvantilerna 5 % till 95 %. Linjerna inuti rutorna representerar medianerna, de tomma rutorna anger medelvärdet och de svarta rutorna representerar avvikare (n = 40; p-värden beräknas med hjälp av envägs ANOVA med Bonferroni-korrigering, **p < 0,01, ****p < 0,0001). (B) Överst: Konfokalmikroskopibild av en aminmikrogelstav funktionaliserad med FITC och en epoximikrogelstav funktionaliserad med fluoresceinaminisomer I. Botten: Motsvarande ljusa fältbilder. Alla skalstreck representerar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Som beskrivs i den relaterade publikationen leder sfärliknande mikrogeler som produceras via samma metod till flera sammanlänkade kluster snarare än en stabil makroporös byggnadsställning11. Det högre bildförhållandet för mikrogelstavarna möjliggör bättre övergripande stabilitet på grund av effektivare strukturöverbryggning i 3D (figur 4).
Figur 4: Bildförhållandets påverkan på strukturbildningen . (A) Ljus fältbild av en sammanlänkad konstruktion bestående av mikrogelstavar. (B) Ljus fältbild av sammanlänkade kluster som består av sfärliknande mikrogeler. Skalstreck representerar 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Medelvärdena för makroporerna i ställningarna som består av mikrogelstavar är 100 μm, med 90% av porstorlekarna från 30 μm till över 150 μm11. Sfärliknande mikrogeler resulterar i kluster med porstorlekar mellan ~ 10 μm och 55 μm, med ett medelvärde runt 22 μm11. Detta överensstämmer med de rapporterade siffrorna från andra studier som förbereder MAPs baserade på sfäriska mikrogeler 2,4,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett av de kritiska stegen i detta protokoll är kvaliteten på 2-aminoetylmetakrylatet (AMA) som används som komonomer för primär aminfunktionalisering. AMA ska vara ett finkornigt och helst färglöst pulver som levereras i en gastät brun glasbehållare. Man bör undvika att använda grönaktigt och klumpigt material, eftersom det väsentligt försämrar geleringsreaktionen och negativt påverkar resultatens reproducerbarhet. Vid dålig gelering och instabila mikrogelstavar kan man överväga att byta leverantör.
Om blandningen av amin- och epoximikrogelstavar leder till flera sammanlänkade kluster snarare än till en stabil struktur, kontrollera antalet stavar i varje stamdispersion och ställ in det till ett liknande värde i intervallet 1 000-5 000 stavar / 100 μL för båda proverna. Om mikrogelens dimensioner skiljer sig avsevärt från de värden som nämns här, justera antalet mikrogelstavar till volymfraktionen. Öka antalet per volym om gelerna är mindre och minska antalet i motsatt fall.
Den beskrivna metoden fokuserade inte på att optimera blandningsprocessen för att få en mer kontrollerad sammansättning av de två komplementära funktionaliserade blandningskomponenterna. Eftersom sammankoppling sker inom några sekunder justeras den totala volymen av dispersionen för att bilda en sammanlänkad konstruktion och volymfraktionerna av de använda mikrogelerna för att erhålla stabila makroporösa strukturer genom att helt enkelt pipettera de två komponenterna efter varandra. I framtiden skulle det vara fördelaktigt att analysera flödes- och blandningsegenskaperna hos mikrogelstångsdispersionerna och få ytterligare insikt i byggnadsställningarnas strukturbildning. En mer kontrollerad blandning av de två sammanlänkande mikrogelkomponenterna skulle kunna möjliggöra automatiserad bildning med hög genomströmning av dessa makroporösa byggnadsställningar och möjliggöra inkrementell konstruktionstillväxt.
Eftersom sammankopplingen fortskrider mycket snabbt skapas ställningens porer under blandning. Om mikrogelstavarna först sedimenterades helt innan de kemiskt sammankopplade, skulle ett mycket högre staplingsförhållande till störningsförhållande förväntas. Därför kommer den sammanlänkande kinetiken sannolikt att ha en stor effekt på MAP-bildning och den resulterande porositeten och porstorlekarna. Cellhäftande funktionalisering genom eftermodifiering eller införlivande i gelnätverket under mikrogelberedning har visat att L929 och humana fibroblastceller fäster och sprids på mikrogelstavarnas yta först och därefter fyller de flesta makroporerna efter 5-7 dagar i odling11. På grund av porstorlekarna som huvudsakligen sträcker sig från 30 μm till över 150 μm och den sammankopplade porstrukturen, bekräftad med konfokalmikroskopi, kan fröade celler lätt komma in i den sammanlänkade ställningen11. Hittills har dessa mikrogelstångsbaserade ställningar använts för att odla fibroblast- och HUVEC-celler i samodling. HUVECs sådda efter 14 dagars fibroblastcellodling bildade de första långsträckta kärlliknande strukturerna inom de följande 16 dagarna11. Studien av andra celltyper i samkulturer återstår att ta itu med i framtiden. För att celler ska kunna tillsättas direkt till systemet under ställningsbildning krävs snabb stångsammankoppling i cellkompatibla buffertar eller odlingsmedier, vilket skulle göra det möjligt att utvidga detta system till bioprintningsplattformar.
Icke-injicerbara makroporösa 3D-ställningar kan också skapas med olika alternativa metoder som lösningsmedelsgjutning, frystorkning, gasskummande partikelutlakning, elektrospinning eller 3D-utskrift 1,15,16. Cellmigration och proliferation kan lätt ske utan att ställningen behöver brytas ned i förväg, så länge den nödvändiga porgeometrin och permeabiliteten har uppnåtts i hela nätverket. 3D-utskrift med hjälp av fastnat, extruderbara biobläck från PEG-, agaros- och norbornenmodifierade hyaluronsyrabaserade mikrogelsfärer kombinerar MAP- och 3D-utskriftsteknikerna, som styr porositeten mellan de glödgade mikrogelerna och även geometrin för den övergripande tryckta strukturen17.
Jämfört med alternativa befintliga metoder uppvisar de resulterande ställningarna ett brett utbud av 3D-makroporgeometrier på grund av det högre bildförhållandet mellan mikrogelbyggstenarna och deras sammanlänkade tvåkomponentkonfiguration11. Användningen av mikrogelstavar skapar mer porositet och därmed mer utrymme för cell-cellinteraktioner jämfört med montering av sfäriska mikrogeler. Detta är centralt för biologisk vävnadsbildning eftersom det förbättrar cell-cellinteraktioner. Samtidigt kan mindre material användas för att producera makroporösa byggnadsställningar med samma volymer, samtidigt som konstruktionens stabilitet bibehålls. Minskningen av ställningsmaterial är fördelaktigt eftersom mer öppet utrymme tillhandahålls för vävnadsbildning och mindre material måste brytas ned, vilket är viktigt för både in vitro - och in vivo-applikationer . Biofunktionalisering av mikrogelerna kan utvidgas till andra peptidtyper och bioaktiva faktorer. De resulterande stabila makroporösa ställningarna kräver mindre material för att skapa mer porositet. Tillsammans med systemets tunabilitet erbjuder denna metod hög potential som en mångsidig plattform för cellodling i 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna försäkrar att det inte finns några intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi uttrycker vår tacksamhet till medförfattarna till vårt tidigare arbete som denna metod bygger på, Céline Bastard, Luis P. B. Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born och Tamás Haraszti. Vi erkänner tacksamt finansiering från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) inom projektet B5 och C3 SFB 985 "Functional Microgels and Microgel Systems". Vi erkänner finansiering från Leibniz Senate Competition Committee (SAW) under Professorinnenprogrammet (SAW-2017-PB62: BioMat). Vi erkänner uppriktigt finansiering från Europeiska kommissionen (EUSMI, 731019). Detta arbete utfördes delvis vid Center for Chemical Polymer Technology (CPT), som stöddes av EU och förbundsstaten Nordrhein-Westfalen (bidrag EFRE 30 00 883 02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Hsu, R. -S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Chen, Z., et al. Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere. Exploration. 1 (3), 20210036 (2021).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Guerzoni, L. P. B., et al. Cell encapsulation in soft, anisometric poly(ethylene) glycol microgels using a novel radical-free microfluidic system. Small. 15 (20), 1900692 (2019).
- Krüger, A. J. D., et al. Compartmentalized jet polymerization as a high-resolution process to continuously produce anisometric microgel rods with adjustable size and stiffness. Advanced Materials. 31 (49), 1903668 (2019).
- Darling, N. J., et al. Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Lutzweiler, G., Ndreu Halili,, Engin Vrana, N. The overview of porous, bioactive scaffolds as instructive biomaterials for tissue regeneration and their clinical translation. Pharmaceutics. 12 (7), 602 (2020).
- Dang, H. P., et al. 3D printed dual macro-, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function. Biofabrication. 11 (3), 035014 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
