Summary
Tamamlayıcı reaktif gruplara sahip mikrojel çubuklar, sulu çözeltide birbirine bağlanma kabiliyetine sahip mikroakışkanlar yoluyla üretilir. Anizometrik mikrojeller, küresel tabanlı sistemlere kıyasla daha büyük gözeneklere sahip kararlı yapılara sıkışır ve birbirine bağlanır. GRGDS-PC ile modifiye edilmiş mikrojeller, hücre kültürü için kullanılabilecek makrogözenekli 3D yapılar oluşturur.
Abstract
Mikroakışkanlardan gelen iki bileşenli işlevselleştirilmiş mikrojel sistemi, başka katkı maddeleri olmadan sulu çözeltilerde 3D makrogözenekli yapılara hızlı bir şekilde bağlanmayı sağlar. Sürekli foto-başlatılan çip üstü jelasyon, elde edilen yapılar için yapı taşı özelliklerini belirleyen mikrojel en boy oranının varyasyonunu sağlar. Glisidil metakrilat (GMA) veya 2-aminoetil metakrilat (AMA) monomerleri, epoksi veya amin işlevselliği elde etmek için polietilen glikol (PEG) yıldız polimerlerine dayanan mikrojel ağına kopolimerize edilir. İşlevselleştirilmiş mikrojel çubukların sürekli toplanmasını sağlamak için mikroakışkan çıkış yapısına bir odaklama yağı akışı getirilir. Yakın tarihli bir yayına dayanarak, mikrojel çubuk bazlı yapılar birkaç yüz mikrometrelik daha büyük gözeneklerle sonuçlanır ve aynı zamanda küresel tabanlı bir modele kıyasla genel olarak daha yüksek iskele stabilitesine yol açar. Bu sayede ihtiyaç duyulan malzeme miktarını azaltırken daha fazla serbest hacimli daha yüksek hacimli yapılar üretmek mümkündür. Birbirine bağlı makrogözenekli iskeleler hasar görmeden veya parçalanmadan toplanabilir ve taşınabilir. Birbirine bağlanmada yer almayan amin ve epoksi grupları aktif kalır ve modifikasyon sonrası için bağımsız olarak kullanılabilir. Bu protokol, sonraki hücre deneyleri için kullanılabilecek makrogözenekli birbirine bağlı iskeleler oluşturmak için mikrojel çubukların üretimi için optimize edilmiş bir yöntemi açıklamaktadır.
Introduction
3D yapılarda karmaşık işbirlikçi hücre davranışını incelemek için, iskele platformlarının tekrarlanabilirlikte tutarlı performans göstermesi, hücre göçü için uygun geometriye sahip olması ve aynı zamanda canlı doku üzerindeki etkilerini araştırmak için parametre değişikliği açısından belirli bir esnekliğe izin vermesi gerekir1. Son yıllarda, ilk olarak Segura ve ark. tarafından tanımlanan makrogözenekli tavlanmış parçacıklar (MAP) kavramı, 3D iskele üretimi için verimli ve çok yönlü bir platform haline geldi2. Son 3D iskelenin yapı taşları olan mikrojellerin özel bileşimi, yapının sertliği, jel ağının seçici kimyasal reaktivitesi ve iskelenin son gözenek boyutu 2,3,4,5,6 gibi özellikleri önceden tanımlar. İskele-hücre etkileşimleri için ipuçları olarak hücre yapışkan peptitleri, hücre bağlanmasına izin vermek için mikrojellerin polimer ağına dahil edilir ve kültürdeki hücreler üzerindeki spesifik etkilerini araştırmak için değiştirilebilir. 3D iskeleler, kovalent veya supramoleküler bağlar nedeniyle tavlanmış enjekte edilebilir mikrojellerin birbirine bağlanmasıyla stabilize edilir ve hücre kültürü 2,3,5,7,8 için sağlam ve tanımlanmış yapılar elde edilir.
Mikroakışkanlar, tanımlanmış granüler hidrojellerin hazırlanması için en doğru ve uyarlanabilir yöntemlerden biri olarak kendini kanıtlamıştır9. Kimyasal, mekanik ve fiziksel monodispersitelerini korurken sürekli bir süreçte gerekli yapı taşlarının daha büyük miktarlarda üretilmesi olasılığı, bu işlemin uygunluğuna önemli ölçüde katkıda bulunur. Ayrıca, üretilen mikrojellerin boyutu ve şekli, yapı taşlarının geometrisini ve dolayısıyla son iskele1,10'un 3D yapısını belirleyen toplu emülsiyonlar, mikroakışkanlar, litografi, elektrodinamik püskürtme veya mekanik parçalanma gibi çeşitli yöntemlerle manipüle edilebilir.
Son zamanlarda, başka katkı maddesi olmadan sulu çözeltilerde hızla birbirine bağlanan işlevselleştirilmiş mikrojel çubuklardan oluşan makrogözenekli 3D iskeleler kavramı bildirilmiştir11. Mikrojel çubukların anizotropisi, bu çalışmada küresel mikrojellerin kullanılmasına kıyasla daha yüksek gözeneklilikler ve daha büyük gözenek boyutlarına sahip gözenek dağılımları ile sonuçlanmıştır11. Bu şekilde, daha az malzeme, 3D iskelenin stabilitesini korurken çeşitli gözenek geometrilerine sahip daha büyük gözenekler oluşturur. Sistem, birbiriyle temas ettiğinde birbirine bağlanma reaksiyonu içinde tüketilen tamamlayıcı primer amin ve epoksi fonksiyonel gruplarına sahip iki tip mikrojel çubuktan oluşur. Birbirine bağlanma sürecine katılmayan fonksiyonel gruplar aktif kalır ve hücre yapışkan peptitleri veya diğer biyoaktif faktörlerle seçici post-modifikasyon için kullanılabilir. Fibroblast hücreleri, 3D iskelelerin içinde kültürlendiğinde bağlanır, yayılır ve çoğalır, ilk önce mikrojel yüzeyinde büyür ve 5 gün sonra makrogözeneklerin çoğunu doldurur. İnsan fibroblastları ve insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC'ler) ön ko-kültür çalışması, birbirine bağlı 3D iskelelerde damar benzeri yapıların oluşumu için umut verici sonuçlar göstermiştir11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikroakışkanlar için gerekli malzeme ve preparatlar
- Tarif edilen mikroakışkan prosedür için, 1 mL ve 5 mL cam şırıngalar ve şırınga pompaları kullanın. Çip üzerinde damlacık oluşumu, yüksek hızlı bir kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop aracılığıyla gözlemlenir.
- Bilgisayar destekli bir tasarım yazılımı kullanarak mikroakışkan çip tasarımını (Şekil 1B) oluşturun ve daha önce bildirildiği gibi bir ana şablon üretin12.
- 0,13 mm kalınlığında bir kapak camı aracılığıyla 957 mW/cm2'de ışıma sağlayan, kendi kendine oluşturulmuş bir UV-LED (λ = 365 nm, nokta çapı ~4,7 mm) kullanarak kontrollü UV ışınlaması elde edin.
NOT: Işınlama sırasında UV-LED ile olası yerel ısı üretimini dikkate alın. Bu durumda, harici hava akımı ile yeterli soğutmayı sağlayın.
2. Mikroakışkan cihaz üretimi
NOT: Mikroakışkan cihaz üretimi önceki bir yayına dayanmaktadır13.
- 20 g 10:1 (kütle ile) polidimetilsiloksan (PDMS) ve kürleme maddesi karışımı hazırlayın. 3 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın.
- 2.0 g tolüen içinde 60 mg Yağ Kırmızı O karıştırın. PDMS karışımına toluen çözeltisine 50 μL Yağ Kırmızı O ekleyin. İstenmeyen ışık saçılımını azaltmak ve çip üzerinde jelasyon sırasında spot boyutunu odaklanmış halde tutmak için homojen renk dağılımı olana kadar karıştırın.
- Karışımı vakum pompası ile donatılmış bir kurutucuya yerleştirerek kabarcıkları çıkarın.
- PDMS karışımını ana şablona 5-5,5 mm yüksekliğe kadar dökün ve tekrar gazdan arındırın.
- Diyazo boya bozulmasını önlemek için PDMS'nin oda sıcaklığında 18 saat kürlenmesine izin verin.
- PDMS yapısını kesin ve bir hat çekirdeği örnekleme aleti (0,77 mm iç çap, 1,07 mm dış çap) kullanarak yapıya giriş ve çıkış delikleri delin.
- PDMS'yi yıkayın ve camı tekrar tekrar izopropanol ve deiyonize suyla 5x örtün ve daha sonra her yıkama adımından sonra sıvıyı basınçlı hava veya azot akışı yoluyla çıkarın.
- Kuru cam ve PDMS'yi 0,2 mbar'da bir plazma fırında, 100 W'ta 60 s boyunca 20 mL/dak oksijen akışıyla birlikte işleyin ve mikroakışkan cihazı oluşturmak üzere camı ve PDMS'yi birbirine bağlamak için doğrudan bağlayın.
NOT: Kanal yapısı deformasyonunu en aza indirmek için bağlama işlemi sırasında PDMS yapısını bükmekten kaçının. - Mikroakışkan çipin kanallarını hidrofobik hale getirmek için, cihazı 50 μL trikloro-(1 H, 1 H, 2 H, 2 H-perfloroktil)-silan ile birlikte gece boyunca vakum altında bir kurutucuya yerleştirin (buhar basıncını düşürdükten sonra pompa bağlantısını kapatın). Cihazın dışını hidrofloroeter ile durulayın.
DİKKAT: Bu adımları bir duman davlumbazında uygulayın ve perfloro silan ile herhangi bir temastan kaçının. Gres ile kapatılmış bir cam vakumlu kurutucu kullanın. Başka amaçlar için kullanmadan önce kurutucuyu iyice temizleyin.
3. Mikroakışkanlar için çözelti hazırlama
- Sürekli yağ fazı için, parafin yağı ve hekzadekan (1: 1 v / v) karıştırın ve% 8 (w / w) iyonik olmayan bir yüzey aktif madde ekleyin. Bir adet 1 mL (birinci yağ, Şekil 1) ve bir adet 5 mL (ikinci yağ, Şekil 1) cam şırıngayı doldurun.
- Fotobaşlatıcı ayrışmasını ve istenmeyen jelleşmeyi önlemek için kahverengi cam şişelerde dağılım fazı için prepolimer çözeltileri hazırlayın.
- GRGDS-PC içeren amin komponent prepolimer çözeltisi
- 300 μL'lik bir çözelti için, 33.3 mg yıldız-polietilen glikol-akrilat (sPEG-AC) ve 3.03 mg lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat (LAP) tartın.
- 18.74 mg 2-aminoetil metakrilat hidroklorürü (AMA) 1.5 mL deiyonize suda çözün ve çözeltiyi bir şırınga filtresinden (0.20 μm gözenek boyutu) geçirin.
NOT: AMA higroskopiktir ve katı formlar saklama kabında topaklanır toplanmaz atılmalıdır. - Steril 36 mM GRGDS-PC alikotları suda hazırlayın ve kullanıma kadar -20 ° C'de tutun.
- sPEG-AC ve LAP'yi çözmek için 291,7 μL AMA çözeltisi kullanın ve GRGDS-PC çözeltisinden 8,3 μL ekleyin. Çözeltiyi 1 mL cam şırınga ile alın ve alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun.
- Epoksi komponent prepolimer çözeltisi
- 300 μL'lik bir çözelti için, 33.3 mg yıldız-polietilen glikol-akrilat (sPEG-AC), 3.03 mg LAP tartın ve 300 μL deiyonize suda çözün. 2.4 mg glisidil metakrilat (GMA) ekleyin.
NOT: Güçlü sarsıntı, GMA'nın çözünmesini hızlandırır. Çözeltiyi 1 mL cam şırınga ile alın ve alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun.
- 300 μL'lik bir çözelti için, 33.3 mg yıldız-polietilen glikol-akrilat (sPEG-AC), 3.03 mg LAP tartın ve 300 μL deiyonize suda çözün. 2.4 mg glisidil metakrilat (GMA) ekleyin.
- GRGDS-PC içeren amin komponent prepolimer çözeltisi
4. Amin ve epoksi işlevselleştirilmiş mikrojel çubukların üretimi ve saflaştırılması
Şekil 1: Mikroakışkan çip üstü jelasyon tertibatının düzenlenmesi . (A) Mikroakışkanlar sırasında bileşen düzenlemesinin önden görünümü ve açılı görünümü. (B) Mikrojel çubukların çip üzerinde jelleştirilmesi için kullanılan mikroakışkan çip tasarımı. (1) İlk yağ girişine PE tüpü. (2) Dispers faz girişine ışık korumalı PE tüpü. (3) İkinci yağ girişine PE tüpü. (4) PE tüpü çıkıştan ürün toplama kabına. (5) UV lambası ve çıkışın yakınındaki düz 80 μm kanalda ışınlama konumu. (6) Mikroskop objektif/gözlem pozisyonu. (7) Mikroakışkan cihazın renkli PDMS bileşeni. (8) PDMS'ye bağlı kapak camı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- İğneleri PE tüplerine yerleştirin ve gazı şırıngadan ve tüpten çıkarın.
- Ürün toplama için çıkışa bir PE tüp yerleştirin.
- Tüm cam şırıngaları şırınga pompalarına yerleştirin ve her boru ucunu ilgili girişe yerleştirin (Şekil 1).
NOT: İstenmeyen jelleşmeyi önlemek için prepolimer boruyu alüminyum folyo veya siyah bir tüp aracılığıyla ışıktan koruyun. - Mikroskopu yağ-su kesitine odaklayın.
- Dispers fazında kanalın ıslanmasını önlemek için kanalı önce yağ ile doldurmak için ilk yağ şırınga pompasını (akış hızı = 100-200 μL / s) çalıştırın.
- İlk yağ akış hızını 30 μL/s'ye düşürün ve dağılmış sulu faz enine kesitte gözlemlenene kadar prepolimer şırınga pompasını (akış hızı = 100-200 μL/h) çalıştırın.
- Prepolimer akış hızını 30 μL / s'ye ayarlayın ve mikroskobu çıkışa odaklayın.
- İkinci yağ şırınga pompasını çalıştırın (akış hızı 300 μL / s) ve akış rejimi stabil olana kadar bekleyin.
- Çıkış tüpünü bir toplama kabına yerleştirin.
NOT: Ürünün zamanla birikmesi nedeniyle basınç artışını önlemek için tüpün ucunu kabın üst kısmına yerleştirin. - UV ışınlama sistemini, ışıma 900-1000 mW/cm2 aralığında olacak şekilde ayarlayın (kullanılan ışıma = 957 mW/cm2) ve ışınlama noktası çıkıştan önceki düz kanal kısmında olacak şekilde ayarlayın (Şekil 1B).
NOT: Kanalın tıkanmasını önlemek için yağ-su kesitinin yakınında ışınlama yapmadığınızdan emin olun. Ek koruma için, ünitenin üstündeki ışınlama noktasından önce kanal yapılarını örtün. - UV ışınlamasından önce, istenen en boy oranını 3,0 ila 4,5 aralığında elde etmek için prepolimerin ve ilk yağın akış hızlarını ayarlayın ve ışınlama noktasının boyutuna bağlı olarak dağılmış fazın ışınlama süresini ~ 2,3 s'ye ayarlayın.
- UV ışınlamasını başlatın ve gerekirse akış hızlarını önceki alt bölüme göre tekrar ayarlayın.
NOT: Başlangıçta üretimi gözlemleyin ve çıkıştaki kararlı akış davranışını ve mikrojel çubukların homojenliğini izleyin. İkinci yağ akışı, çıkış içindeki ürün taşınmasını optimize etmek için ayarlanabilir. - Koleksiyon kapsayıcısını değiştirin ve ürün koleksiyonu başlangıç saatini ve akış hızlarını not edin.
NOT: Ürünü tozdan koruyun. Herhangi bir şırınga çözelti azalmadan önce toplamayı bırakın. - Koleksiyonu sonlandırmak için, saati not ederek koleksiyon kapsayıcısını kaldırın. Işınlamayı ve tüm şırınga pompalarını durdurun.
- Ürünü daha sonra her biri 5 kat n-hekzan, izopropanol ve deiyonize su ile yıkayın. Çubuk çökelmesinden sonra süpernatantı çıkarın.
NOT: Her çözelti ilavesinden sonra, ürünü dikkatlice dağıtın ve moleküler difüzyonu göz önünde bulundurarak çözücüyü değiştirmeden önce 10 dakika bekleyin. Çubukların sıvının yüzeyine yüzmesini önlemek için izopropanolü yavaş yavaş suyla değiştirin. Su ile birden fazla ek yıkama adımı, kalan izopropanol izlerini azaltır.
5. Makrogözenekli iskele oluşumu
- Epoksi ve amin işlevselleştirilmiş numuneler için dispersiyon hacmi başına mikrojel çubuk sayısını belirleyin.
- Seyreltme veya konsantrasyon yoluyla epoksi ve amin işlevselleştirilmiş numunelerin sayısını 1.000-5.000 çubuk/100 μL arasında benzer bir değere ayarlayın.
NOT: Mikrojel çubukların çökelmesini hızlandırmak için 5-10 s boyunca ~2.000 x g'de bir santrifüj kullanın. Dağılım hacmi başına çubuk sayısı düşükse, çubuk birbirine bağlanma tek bir kararlı yapı yerine daha küçük çubuk kümelerine neden olabilir. Dağılım hacmi başına çubuk sayısı yüksekse, iki bileşenin karıştırma kalitesi tehlikeye girer. - İlk bileşen (~ 1.200 çubuk) dağılımını konik 1,5 mL veya 2 mL şeffaf bir şişeye aktarın.
- İkinci bileşeni kontrollü bir şekilde sürekli bir çalışmada ekleyin (100 μL pipet). Ekledikten sonra, sıvı almak için içeriği doğrudan pipeti kullanarak karıştırın ve tekrar ekleyin. Birbirine bağlı yapı, karıştırma sırasında saniyeler içinde oluşur.
NOT: Tek bir tutarlı yapı yerine birden fazla küme oluşursa, hacim başına mikrojel çubuk sayısını yeniden kontrol edin veya iki bileşenin daha kontrollü bir şekilde karıştırılmasını sağlayın.
6. Modifikasyon sonrası hücre yapıştırıcısı
- Dağılmış polimer fazının akış hızına, belirli bir süre boyunca toplanan mikrojellerin sayısına ve iskele oluşumu için kullanılan mikrojel dispersiyonunun seyreltme faktörüne bağlı olarak birbirine bağlı yapıdaki epoksi gruplarının teorik sayısını hesaplayın.
NOT: İskele başına epoksi gruplarının teorik sayısını aşağıdaki denklemle yaklaşık olarak belirleyin.
n'inci: Teorik madde miktarı
cGMA: Prepolimer çözeltisindeki GMA konsantrasyonu
S: Prepolimer çözeltisinin akış hızı - Kalan tüm epoksi gruplarını serbest amin ve tiol taşıyan hücre yapışkan peptidi ile değiştirmek için birbirine bağlı yapıya GRGDS-PC çözeltisi ekleyin (n [teorik epoksi grupları] / n [GRGDS-PC] = 1). Gece boyunca oda sıcaklığında bırakın.
- Deiyonize su ile yıkayarak ve süpernatanı çıkararak reaksiyona girmemiş molekülleri çıkarın.
7. Sterilizasyon ve hücre kültürü ortamına transfer
- Birbirine bağlı iskeleyi suya batırmak için su seviyesini azaltın.
- Şişeyi açın ve λ = 250-300 nm UV ışığı ile ışınlayın. Şişeyi kapatın ve şişeyi temiz bir tezgaha aktarın. 1x'i steril suyla yıkayın.
- Şişedeki suyu hücre kültürü ortamı ile değiştirin ve 5 dakika boyunca dengeye izin verin. Bunu taze hücre kültürü ortamı ile 2x tekrarlayın.
- Makrogözenekli iskeleye, bir spatula dökerek veya kullanarak deney için bir hücre kültürü kuyu plakasına aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resim 2: Makrogözenekli çapraz bağlı iskele yapısı. (A) Birbirine bağlı makrogözenekli iskelenin 500 μm konfokal mikroskopi Z-yığınının 3D projeksiyonu. Ölçek çubuğu 500 μm'yi temsil eder. (B) Doğrudan sudan alınan bir kapak camı üzerinde ~ 10.000 mikrojel çubuktan oluşan birbirine bağlı iskele. Ölçek çubuğu 5 mm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu protokol, birbirine bağlı amin ve epoksi işlevselleştirilmiş mikrojel çubuklardan oluşan kararlı bir 3D makrogözenekli yapı ile sonuçlanır (Şekil 2A). Yapı, tarif edilen karıştırma tipi kullanılıyorsa, 2 s veya 3 s içinde oluşan kompakt bir geometri sergilemelidir (Şekil 2B).
Birbirine bağlı yapı stabilitesi, oluştuğu mikrojel çubuk yapı taşlarına bağlıdır. Amin işlevselleştirilmiş mikrojel çubuklar, nanogirinti ile belirlenen ortalama 2.0 ± 0.2 kDa'lık bir sertlik sergiler (Şekil 3A). Çubuklar çok yumuşaksa, yapı taşlarının deformasyonu nedeniyle birbirine bağlı makrogözenekli yapı elde edilemeyebilir. Aktif fonksiyonel grupları tespit etmek için, primer amino gruplarını görselleştirmek için floresein izotiyosiyanat (FITC) kullanılabilir ve epoksi gruplarını etiketlemek için floresein amin izomeri I kullanılabilir (Şekil 3B, C). Amin mikrojel çubuklar, ortalama uzunluğu 553 μm ± 29 μm ve ortalama genişliği 193 μm ± deiyonize suda 7 μm olan boyutlara sahiptir, bu da ~ 3.0'lık bir en boy oranına ve hacimde (çökme) hücre kültürü ortamındaki boyutlarının ~% 73'ü kadar azalmaya (çökme) neden olur11.
Şekil 3: Mikrojel özellikleri. (A) Effective Young'ın amin ve epoksi mikrojel çubuklarının modülü, nanogirinti ile ölçülen amin ve epoksi mikrojel küreleri ile birlikte. Veriler, 25. ila 75. yüzdelik dilim arasında uzanan bir kutu grafiği olarak görüntülenir ve bıyıklar% 5 ila% 95 kantillere ulaşır. Kutuların içindeki çizgiler medyanları, boş kareler ortalamaları ve siyah kareler aykırı değerleri temsil eder (n = 40; p-değerleri, Bonferroni düzeltmeli tek yönlü ANOVA kullanılarak hesaplanır, **p < 0.01, ****p < 0.0001). (B) Üst: FITC ile işlevselleştirilmiş bir amin mikrojel çubuğunun ve floresein amin izomeri I. Altta ile işlevselleştirilmiş bir epoksi mikrojel çubuğun konfokal mikroskopi görüntüsü. Tüm ölçek çubukları 100 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
İlgili yayında açıklandığı gibi, aynı yöntemle üretilen küre benzeri mikrojeller, bir kararlı makrogözenekli iskele11 yerine birbirine bağlı çoklu kümelere yol açmaktadır. Mikrojel çubukların daha yüksek en boy oranı, 3D'de daha verimli yapı köprülemesi nedeniyle daha iyi genel stabilite sağlar (Şekil 4).
Şekil 4: En boy oranının yapı oluşumu üzerindeki etkisi . (A) Mikrojel çubuklardan oluşan birbirine bağlı bir yapının parlak alan görüntüsü. (B) Küre benzeri mikrojellerden oluşan birbirine bağlı kümelerin parlak alan görüntüsü. Ölçek çubukları 500 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Mikrojel çubuklardan oluşan iskelelerdeki makrogözeneklerin ortalama değerleri 100 μm'dir ve gözenek boyutlarının %90'ı 30 μm ile 150 μm11 arasında değişmektedir. Küre benzeri mikrojeller, gözenek boyutları ~ 10 μm ila 55 μm arasında olan ve ortalama değeri 22 μm11 civarında olan kümelerle sonuçlanır. Bu, küresel mikrojellere dayanan MAP'leri hazırlayan diğer çalışmalar tarafından bildirilen sayılarla tutarlıdır 2,4,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokoldeki kritik adımlardan biri, birincil amin fonksiyonelleştirmesi için komonomer olarak kullanılan 2-aminoetil metakrilatın (AMA) kalitesidir. AMA, gaz geçirmez kahverengi bir cam kapta verilen ince taneli ve tercihen renksiz bir toz olmalıdır. Yeşilimsi ve topaklı malzeme kullanmaktan kaçınılmalıdır, çünkü jelasyon reaksiyonunu önemli ölçüde bozar ve sonuçların tekrarlanabilirliğini olumsuz yönde etkiler. Zayıf jelleşme ve kararsız mikrojel çubuklar durumunda, tedarikçiyi değiştirmeyi düşünebilirsiniz.
Amin ve epoksi mikrojel çubukların karıştırılması, tek bir kararlı yapı yerine birbirine bağlı birden fazla kümeye yol açarsa, her stok dağılımındaki çubuk sayısını kontrol edin ve her iki numune için 1.000-5.000 çubuk / 100 μL aralığında benzer bir değere ayarlayın. Mikrojelin boyutları burada belirtilen değerlerden önemli ölçüde farklıysa, mikrojel çubuklarının sayısını hacim fraksiyonuna ayarlayın. Jeller daha küçükse hacim başına sayıyı artırın ve karşı durumda sayıyı azaltın.
Açıklanan yöntem, iki tamamlayıcı işlevselleştirilmiş karıştırma bileşeninin daha kontrollü bir montajına sahip olmak için karıştırma prosesini optimize etmeye odaklanmamıştır. Birbirine bağlanma birkaç saniye içinde gerçekleştiğinden birlikte, birbirine bağlı bir yapı oluşturmak için dağılımın toplam hacmi ve kullanılan mikrojellerin hacim fraksiyonları, iki bileşeni birbiri ardına pipetleyerek kararlı makrogözenekli yapılar elde etmek için ayarlanır. Gelecekte, mikrojel çubuk dispersiyonlarının akış ve karıştırma özelliklerini analiz etmek ve iskelelerin yapı oluşumu hakkında ek bilgi edinmek avantajlı olacaktır. Birbirine bağlanan iki mikrojel bileşeninin daha kontrollü bir şekilde karıştırılması, bu makrogözenekli iskelelerin otomatik ve yüksek verimli oluşumunu sağlayabilir ve artımlı yapı büyümesine izin verebilir.
Birbirine bağlama çok hızlı ilerlediğinden, karıştırma sırasında iskelenin gözenekleri oluşturulur. Mikrojel çubuklar kimyasal olarak birbirine bağlanmadan önce ilk önce tamamen çökeltilseydi, çok daha yüksek bir istifleme / sıkışma oranı beklenirdi. Bu nedenle, birbirine bağlanan kinetiğin MAP oluşumu ve bunun sonucunda ortaya çıkan gözeneklilik ve gözenek boyutları üzerinde büyük bir etkisi olması muhtemeldir. Mikrojel hazırlama sırasında modifikasyon sonrası veya jel ağına dahil edilerek hücre yapışkan işlevselleştirme, L929 ve insan fibroblast hücrelerinin önce mikrojel çubukların yüzeyine yapıştığını ve yayıldığını ve daha sonra kültür11'de 5-7 gün sonra makrogözeneklerin çoğunu doldurduğunu göstermiştir. Ağırlıklı olarak 30 μm ila 150 μm arasında değişen gözenek boyutları ve konfokal mikroskopi ile doğrulanan birbirine bağlı gözenek yapısı nedeniyle, tohumlanmış hücreler birbirine bağlı iskele11'e kolayca girebilir. Şimdiye kadar, bu mikrojel çubuk bazlı iskeleler, ko-kültürde fibroblast ve HUVEC hücrelerini büyütmek için kullanılmıştır. 14 günlük fibroblast hücre kültüründen sonra tohumlanan HUVEC'ler, takip eden 16 gün içinde ilk uzatılmış damar benzeri yapıları oluşturdu11. Ko-kültürlerdeki diğer hücre tiplerinin incelenmesi gelecekte ele alınmaya devam etmektedir. İskele oluşumu sırasında hücrelerin doğrudan sisteme eklenmesine izin vermek için, hücre uyumlu tamponlarda veya kültür ortamlarında hızlı çubuk birbirine bağlanması gerekir, bu da bu sistemin biyobaskı platformlarına genişletilmesini sağlar.
Enjekte edilemeyen makrogözenekli 3D iskeleler, solvent döküm, dondurarak kurutma, gaz köpüklü partikül liçi yapma, elektro eğirme veya 3D baskı 1,15,16 gibi çeşitli alternatif yöntemlerle de oluşturulabilir. Hücre göçü ve çoğalması, ağ boyunca gerekli gözenek geometrisi ve geçirgenliği sağlandığı sürece, iskelenin önceden bozulmasına gerek kalmadan kolayca gerçekleşebilir. PEG-, agaroz ve norbornen modifiye hyaluronik asit bazlı mikrojel kürelerden sıkışmış, ekstrüde edilebilir biyomürekkepler kullanan 3D baskı, MAP ve 3D baskı teknolojilerini birleştirerek tavlanmış mikrojeller arasındaki gözenekliliği ve ayrıca genel basılı yapının geometrisini kontrol eder17.
Alternatif mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, ortaya çıkan iskeleler, mikrojel yapı taşlarının daha yüksek en boy oranı ve birbirine bağlı iki bileşenli konfigürasyonları11 nedeniyle çok çeşitli 3D makrogözenek geometrileri sergilemektedir. Mikrojel çubukların kullanımı, küresel mikrojellerin montajına kıyasla daha fazla gözeneklilik ve dolayısıyla hücre-hücre etkileşimleri için daha fazla alan yaratır. Bu, hücre-hücre etkileşimlerini arttırdığı için biyolojik doku oluşumu için merkezidir. Aynı zamanda, yapının stabilitesini korurken, aynı hacimlerde makrogözenekli iskeleler üretmek için daha az malzeme kullanılabilir. İskele malzemesinin azaltılması, doku oluşumu için daha fazla açık alan sağlandığından ve daha az malzemenin parçalanması gerektiğinden faydalıdır, bu da hem in vitro hem de in vivo uygulamalar için önemlidir. Mikrojellerin biyofonksiyonelleştirilmesi diğer peptit tiplerine ve biyoaktif faktörlere genişletilebilir. Ortaya çıkan kararlı makrogözenekli iskeleler, daha fazla gözeneklilik oluşturmak için daha az malzeme gerektirir. Sistemin ayarlanabilirliği ile birlikte, bu yöntem 3D'de hücre kültürü için çok yönlü bir platform olarak yüksek potansiyel sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını garanti eder.
Acknowledgments
Bu metodolojinin dayandığı önceki çalışmamızın ortak yazarlarına, Céline Bastard, Luis P. B. Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born ve Tamás Haraszti'ye şükranlarımızı sunuyoruz. Deutsche Forschungsgemeinschaft'ın (DFG) B5 ve C3 SFB 985 "İşlevsel Mikrojeller ve Mikrojel Sistemleri" projesi kapsamında sağladığı fonları minnetle kabul ediyoruz. Leibniz Senatosu Rekabet Komitesi'nin (SAW) Professorinnenprogramm (SAW-2017-PB62: BioMat) kapsamındaki fonlarını kabul ediyoruz. Avrupa Komisyonu'ndan (EUSMI, 731019) gelen fonları içtenlikle kabul ediyoruz. Bu çalışma kısmen AB ve Kuzey Ren-Vestfalya federal eyaleti tarafından desteklenen Kimyasal Polimer Teknolojisi Merkezi'nde (CPT) gerçekleştirildi (hibe EFRE 30 00 883 02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Hsu, R. -S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Chen, Z., et al. Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere. Exploration. 1 (3), 20210036 (2021).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Guerzoni, L. P. B., et al. Cell encapsulation in soft, anisometric poly(ethylene) glycol microgels using a novel radical-free microfluidic system. Small. 15 (20), 1900692 (2019).
- Krüger, A. J. D., et al. Compartmentalized jet polymerization as a high-resolution process to continuously produce anisometric microgel rods with adjustable size and stiffness. Advanced Materials. 31 (49), 1903668 (2019).
- Darling, N. J., et al. Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Lutzweiler, G., Ndreu Halili,, Engin Vrana, N. The overview of porous, bioactive scaffolds as instructive biomaterials for tissue regeneration and their clinical translation. Pharmaceutics. 12 (7), 602 (2020).
- Dang, H. P., et al. 3D printed dual macro-, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function. Biofabrication. 11 (3), 035014 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
