Summary
Protokollen presenterer en musemodell av vaginal kolonisering med anaerob dyrkede humane vaginale bakterier. Vi fokuserer på Gardnerella vaginalis, mens vi inkluderer forslag til Prevotella bivia og Fusobacterium nucleatum. Denne protokollen kan også brukes som en veiledning for vaginale inokulasjoner og levedyktig gjenoppretting av andre anaerob dyrket bakterier.
Abstract
Pattedyrskjeden kan koloniseres av mange bakterielle taxa. Det menneskelige vaginale mikrobiomet domineres ofte av Lactobacillus-arter , men en av fire kvinner opplever bakteriell vaginose, hvor et lavt nivå av laktobaciller ledsages av en overvekst av forskjellige anaerobe bakterier. Denne tilstanden har vært forbundet med mange helsekomplikasjoner, inkludert risiko for reproduktiv og seksuell helse. Mens det er økende bevis som viser den komplekse naturen til mikrobielle interaksjoner i menneskelig vaginal helse, er de individuelle rollene til disse forskjellige anaerobe bakteriene ikke fullt ut forstått. Dette kompliseres av mangelen på tilstrekkelige modeller for å studere anaerobt dyrkede vaginale bakterier. Musemodeller tillater oss å undersøke biologien og virulensen til disse organismene in vivo. Andre musemodeller av vaginal bakteriell inokulasjon er tidligere beskrevet. Her beskriver vi metoder for inokulering av anaerob dyrkede bakterier og deres levedyktige utvinning i konvensjonelt hevede C57Bl / 6-mus. En ny, mindre stressende prosedyremetode for vaginal inokulering og vasking er også beskrevet. Inokulering og levedyktig utvinning av Gardnerella er skissert i detalj, og strategier for ytterligere anaerober som Prevotella bivia og Fusobacterium nucleatum diskuteres.
Introduction
Hos pattedyr er skjeden hjemsted for et konsortium av bakteriearter. Det menneskelige vaginale mikrobiomet er unikt blant pattedyr i sin overflod av medlemmer av slekten Lactobacillus og tilsvarende lav vaginal pH (3,8-4,5)1,2,3,4. Forstyrrelse av denne Lactobacillus-dominansen er forbundet med en rekke negative helseutfall.
Ved bakteriell vaginose (BV) er det færre laktobaciller og en økt overflod av forskjellige anaerobe bakterier, som Gardnerella vaginalis og Prevotella bivia 5,6. Kvinner med BV har økt risiko for seksuelt overførbare infeksjoner 7,8,9, infertilitet 10, graviditetstap 11, for tidlig fødsel 12,13,14, intrauterin infeksjoner 15, livmorhalsinfeksjoner 16 og kreft 16,17,18 . BV er også forbundet med en høyere sannsynlighet for vaginal kolonisering av potensielt patogene bakterier, som Fusobacterium nucleatum 1,19,20, et vanlig isolat fra fostervannsinfeksjoner 21.
På grunn av betydningen av anaerobe bakterier i menneskers vaginale helse, er det behov for dyremodeller som kan brukes til å undersøke biologien og patogenesen til disse organismene. Her beskriver vi metoder for vaginal inokulering og levedyktig gjenoppretting av Gardnerella vaginalis hos østrogeniserte mus og foreslår ytterligere strategier for Prevotella bivia og Fusobacterium nucleatum. Andre modeller av murine vaginal kolonisering har tidligere blitt beskrevet, men disse har fokusert på inokulering og gjenoppretting av fakultative anaerobe bakterier som gruppe B Streptococcus22 og Neisseria gonorrhoeae23 som ble dyrket aerobt. Inokulering og gjenoppretting av obligatoriske anaerober kan oppnås med passende eksperimentelle strategier. Vi diskuterer tilnærminger for levedyktig utvinning av flere bakterielle taxa og foreslår empirisk evaluering av betingelser for levedyktigheten til flere arter / stammer av interesse.
Den klassiske metoden for å estimere kolonisering av levende bakterier er utvinning av kolonidannende enheter (CFUer). I konvensjonelt hevede mus med sin egen endogene mikrobiota krever dette utvinning på agarmedier som selekterer mot medlemmer av den endogene vaginale mikrobiotaen, samtidig som den inokulerte bakteriestammen kan vokse. Her bruker vi et streptomycinresistent isolat av G. vaginalis24 som selektivt kan gjenvinnes på et streptomycinholdig agarmedium. For å sikre at mediet er tilstrekkelig selektivt og omvendt at streptomycinresistente bakterier ikke er tilstede i det endogene mikrobiomet, bør vaginale skyllinger samlet like før inokulering belegges på selektiv (streptomycinholdig) agar.
Den beste metoden for inokulumpreparasjon kan variere mellom arter og bakteriestammer. Før forsøk på mus starter, bør det utføres forarbeid for å bestemme foretrukne forhold for kulturmediet, vekstendepunktet og tilberedning av inokulum, samt følsomheten for oksygen og levedyktighet i PBS. Når det gjelder mer oksygenfølsomme bakterier, kan alternative preparater av inokulum vurderes (f.eks. i et anaerob dyrkningsmedium med en egnet kjøretøykontrollgruppe)25,26.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent og utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer og Guide for the Care and Use of Laboratory Animals ved University of California San Diego (UCSD, protokollnummer: S20057, 2020-og fremover) og før det ved Washington University, St. Louis (protokoll 20110149, frem til 2020).
MERK: Protokollen nedenfor bruker konvensjonelt hevet kvinnelig C57Bl / mus, alder 6-11 uker på tidspunktet for inokulering. Vær oppmerksom på leverandørinformasjon og spesifikke aldersgrupper som tidligere er brukt i det relevante siterte arbeidet.
1. Tilberedning og administrering av β-østradiol 17-valerat
MERK: β-østradiol 17-valerat er et kreftfremkallende og et reproduktivt toksin som kan absorberes gjennom huden27,28. Bruk riktig PPE under håndtering av pulver og flytende oppløsning. Det er også et akvatisk toksin29; Kast den ordentlig i en passende forseglet og merket beholder.
- Filtrer steriliser opptil 50 ml sesamolje gjennom et 0,22 μm filter ved hjelp av et 50 ml konisk rørvakuumfiltersystem. Kun åpent i et biosikkerhetsskap for å opprettholde steriliteten.
- Beregn volumet av β-østradiolvaleratoppløsning som trengs for forsøket: 200 μL per mus pluss 2-3 ml ekstra for å ta hensyn til prøvetap under sprøytefylling (f.eks. krever et 10-museeksperiment totalt 4 ml). Beregn mengden β-østradiolvalerat som trengs for å lage en 5 mg / ml løsning og vei den direkte i et 14 ml rundbunnet rør.
- Sett lokk på 14 ml røret tett og virvel for å bryte opp klumper i pulveret (dette vil tillate β-østradiolvaleratet å oppløses raskere). Tilsett sterilfiltrert sesamolje til 14 ml røret slik at den endelige konsentrasjonen av β-østradiolvalerat er 5 mg / ml.
- Plasser det tette 14 ml røret på en rotator ved 37 °C i 30-40 minutter, til det faste pulveret er helt oppløst. Bekreft visuelt homogeniteten av løsningen før injeksjon i musene. Inkubasjon ved 37 °C reduserer viskositeten til sesamoljen, noe som gjør den lettere å injisere.
- Trekk opp β-østradiolvaleratoppløsning i en 1 ml sprøyte (uten nål). For å gjøre dette uten å introdusere bobler, må du først trekke opp litt av løsningen, og deretter utvise forsiktig mens du holder sprøytens spiss i sesamoljen. Trekk opp løsningen igjen sakte, litt forbi 100 μL-merket.
- Legg en 25 G x 5/8 kanyle på sprøyten. Deretter klargjør du nålen ved sakte å fjerne sesamoljeoppløsningen til den begynner å komme ut av nålespissen. Fjern oppløsningen til sprøyten er ved 100 μL-merket. Klargjør en sprøyte per mus.
- Administrer β-østradiol 17-valerat ved intraperitoneal injeksjon ved 48 timer eller 72 timer før inokulering. Injiser hver mus med 100 mikrol av 5 mg/ml β-østradiolvaleratoppløsningen (0,5 mg β-østradiolvalerat/mus), som tidligere beskrevet22,30. Oppbevar resten av oppløsningen ved 4 °C i 72 timer til neste injeksjon.
- Administrer β-østradiolvaleratoppløsningen igjen på dagen for inokulering, umiddelbart før vaginal inokulering av musene. Fjern oppløsningen fra 4 °C og legg den på en rotator ved 37 °C i 30 minutter før injeksjon slik at sesamoljen varmes opp og blir mindre tyktflytende. Fortsett med injeksjonene som beskrevet i trinn 1.7.
2. Fremstilling av inokulum
MERK: Denne delen inneholder de generelle trinnene for fremstilling av inokula fra anaerob dyrket streptomycinresistent Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR 24,25,31,32. Alle trinnene i denne delen skal gjøres i et anaerob kammer.
- Syklus eventuelle reagenser, inkludert tilberedt NYC III buljong, agar og PBS, inn i et anaerob kammer for å balansere minst 24 timer før bruk.
MERK: Her ble det brukt et vinylanaerob kammer med 5% hydrogengassblanding. Den indre oksygenkonsentrasjonen hviler vanligvis ved 0 ppm, selv om det kan være forbigående økninger på lavt nivå (10-25 ppm) når du sykler materialer inn i kammeret. - To dager før vaginal inokulasjon, strek ut Gardnerella fra en frossen glyserolbestand på en NYC III agarplate i det anaerobe kammeret. Bruk en liten beholder (for eksempel en tom pipettespissboks) fylt med tørris for å holde glyserollageret frosset under transport inn og ut av kammeret.
- 1 dag før vaginal inokulering, bruk 5-10 individuelle Gardnerella-kolonier fra platen for å inokulere 10 ml NYC III-buljong. La væskekulturen vokse over natten i 16 timer ved 37 °C. Inkluder en andre 1 ml alikot av kulturmediet som ikke inokuleres, og inkuber den sammen med den inokulerte kulturen for å bekrefte at mediet er uforurenset.
- Forbered inokulumet fra flytende kultur som beskrevet nedenfor. Utfør inokulumpreparasjonen i det anaerobe kammeret så mye som mulig.
- Bestem kulturens optiske tetthet (OD) ved å tilsette 200 μL kultur til 800 μL ferske medier i en 1,5 ml kyvette (1:5 fortynning). Bruk et spektrofotometer til å måle tettheten (OD) til den fortynnede kulturen ved en bølgelengde på 600 nm (bruk en separat kyvette med ferske medier alene som blank). Multipliser OD-lesingen med 5 for å få den faktiske OD600 av 16 timers kulturen.
- Beregn volumet av inokulum som trengs for eksperimentet. For eksempel, for å infisere 15 mus med et inokulum på 20 μL per mus, er det nødvendig med 15 x 20 μL = 300 μL inokulum. Forbered omtrent 25% mer inokulum enn nødvendig, så for 15 mus, lag 300 μL + (0,25 x 300 μL) = 375 μL inokulum.
- Ved å bruke OD 600 bestemt i trinn 2.4.1., beregne volumet av 16 h-kulturen som må spinnes ned og resuspenderes for å få en OD600 = 5,0 inokulum i volumet beregnet i trinn 2.4.2. For eksempel, hvis OD600 av kulturen er 1,5, og inokulumvolumet som trengs er 375 μL, er volumet av kultur som skal spunnet ned (375 μL x 5) / 1,5 = 1250 μL.
- Pipett volumet av kultur beregnet i trinn 2.4.3. inn i et sterilt mikrosentrifugerør. Pellet bakteriene ved å sentrifugere ved 16 000 x g i 1-3 min.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten i anaerob PBS ved volumet beregnet i trinn 2.4.2. Inokulumet vil nå være på en beregnet OD600 på 5,0. Hvis det er aktuelt, må du også forberede et rør med PBS for å tjene som kjøretøykontroll for mus i den uinfiserte kontrollgruppen.
- Før inokulumrøret fjernes fra det anaerobe kammeret, utarbeides en seriell fortynningsserie fra 1:10 til 1:10 x 106 i PBS. Spotplate 5 replikerer hver fortynning på en agarplate ved hjelp av en flerkanalspipper for å bestemme inokulumets CFU. Dette er CFU før inokulering.
3. Vaginal pre-lavage og inokulering med Gardnerella
- Forbered vaginal skylling/vaskerør i det anaerobe kammeret (dette kan gjøres samtidig med inokulumpreparasjon i trinn 2.4.). Pipette 70 mikrosentrifugerør steril, anaerob PBS i 1,5 ml mikrosentrifugerør merket med musetall. Forbered ett vaskerør per mus. Lukk rørene tett og sykle dem ut av det anaerobe kammeret.
- Utfør en vaginal skylling på hver mus med 50 μL anaerob PBS fra de enkelte rørene tilberedt i trinn 3.1. Disse vaginale skyllene er vaskene før inokulering og kan brukes til nedstrøms målinger og analyser.
- Etter administrering av den andre β-østradiolvaleratinjeksjonen (trinn 1.8), plasser hver mus på toppen av et bur eller en ren, hard overflate som den kan gripe med forpotene. Ta forsiktig tak i den midtre delen av halen og løft slik at bakparten er litt forhøyet og skjedeåpningen blir eksponert.
- Bruk en pipette og p-200 filterspiss til å trekke opp 50 mikrol PBS fra vaskerøret som tilsvarer riktig mus. Sett pipettespissen forsiktig inn i vaginallumen ~2-3 mm, og pipetter volumet på 50 μL forsiktig inn og ut, 3x-4x.
- Overfør det oppsamlede vaskematerialet (~50 μL) tilbake til det samme vaskerøret det kom fra, og pipetter opp og ned i vaskerøret som fortsatt inneholder de resterende 20 μl PBS. Hvis det er for mye slim og spissen blir tilstoppet, bruk en ren p-200-spiss for å samle det gjenværende materialet og legg det i samme vaskerør.
- Administrer vaginalt 20 μl av den konsentrerte bakterielle suspensjonen eller kjøretøykontrollen inn i vagina på hver mus. Inokuler hver mus umiddelbart etter vaginal skylling for den musen (dvs. utfør skylling og inokulering i rekkefølge for hver mus før du går videre til neste). For å forenkle denne prosessen, bruk to p200-pipetter - en satt til 50 μL for lavages og den andre til 20 μL for inokulasjoner.
- Begrens musen som beskrevet i trinn 3.2.1. Bruk en p-200-spiss, pipette 20 μL bakteriell suspensjon i skjeden. For co-inokulasjonseksperimenter med to forskjellige bakteriearter / stammer, bruk 10 μL av hver bakteriell suspensjon og unngå å blande de to stammene før inokulering.
MERK: Det totale inokulasjonsvolumet bør ikke overstige 20 μL for å unngå spillover ut av skjeden. - Fortsett å holde opp bakenden av hver mus i 10-20 s for å forhindre at det administrerte volumet umiddelbart samler seg ved vaginal introitus. Plasser deretter musen i et nytt bur / beholder eller med burkamerater som allerede er inokulert.
- Gjenta trinn 3.2. og trinn 3.3. for hver mus. Plasser aldri mus tilbake i et bur med dyr som ennå ikke er inokulert. Dette forhindrer utilsiktet eksponering av mus for streptomycinresistente bakterier før inokulering.
- Begrens musen som beskrevet i trinn 3.2.1. Bruk en p-200-spiss, pipette 20 μL bakteriell suspensjon i skjeden. For co-inokulasjonseksperimenter med to forskjellige bakteriearter / stammer, bruk 10 μL av hver bakteriell suspensjon og unngå å blande de to stammene før inokulering.
- Etter at alle musene har blitt inokulert, sykle inokulumrøret tilbake i det anaerobe kammeret. Forbered og plate en annen seriefortynning som beskrevet i trinn 2.5. Dette er post-inokulasjon CFU. Sammenlign CFUene fra postinokulasjons- og preinokulasjonsplatene for å avgjøre om levedyktigheten til inokulumet ble redusert mens den var utenfor det anaerobe kammeret under inokuleringen av dyrene.
- Plate vaginale skyller samlet i trinn 3.2. på selektiv agar (i dette tilfellet 1 mg/ml streptomycin). Inkuber platene i 1-2 dager i et anaerob kammer ved 37 °C og undersøk for vekst.
MERK: Vekst indikerer at endogene medlemmer av mikrobiomet er resistente mot seleksjonsmarkøren og kan derfor skjule CFU-oppregning av målorganismen.
4. Innsamling av vaginale skyller for å bestemme levedyktig Gardnerella-kolonisering
- Samle vaginale vasker på utvalgte tidspunkter for å analysere vaginal kolonisering. Samle inn som beskrevet i trinn 3.2.
- Umiddelbart etter oppsamling, sykle vaginale skyllene inn i et anaerob kammer. Bruk 10 μL av hver skylling til å utføre seriefortynning og plettering på selektiv agar som beskrevet i trinn 2.5. Bruk CFU-tellingene som et mål på vaginal kolonisering av Gardnerella (eller en annen anaerobe av interesse).
5. Ofring, disseksjon og vevshomogenisering
- Forbered et 5 ml rør for hvert organ som samles fra hver mus (for eksempel hvis skjeden, livmorhalsen og livmoren blir samlet, forberede tre rør per mus). Fyll hvert rør med steril anaerob 1x PBS (eller andre homogeniseringsmedier) i det anaerobe kammeret. Bruk 1 ml PBS for rør som brukes til å samle vaginaer og cervices og 750 μL for rør som brukes til å samle livmorhorn.
- Når PBS er tilsatt, veier du hvert enkelt rør (dette er pre-samlingsvekten og vil bli brukt til å bestemme totalvekten av hvert høstet vev). Hvis en vekt ikke er tilgjengelig i det anaerobe kammeret, må du sette lokket på rørene tett og sykle dem ut av kammeret som skal veies, og deretter sykle dem inn igjen.
MERK: Rørforberedelse og vektoppsamling kan gjøres 1 dag før ofring, men rør bør oppbevares i det anaerobe kammeret med lokkene tett forseglet for å forhindre fordampning. - Forbered et sett med vaginale skyllerør som beskrevet i trinn 3.1. å samle den endelige skyllingen ved offer. Forbered også et 50 ml beger med avionisert (DI) vann og et andre 50 ml beger med 70% -90% etanol til bruk for skylling og sterilisering av standard ståldisseksjonsinstrumenter under ofringen.
- Syklus ut de PBS-fylte organoppsamlingsrørene fra det anaerobe kammeret. Hold rørene tett lukket til vevet er klart til å bli tilsatt.
- Ofre hver mus ved hjelp av IACUC-godkjente metoder. Utfør den endelige skyllingen som beskrevet i trinn 3.2.2. og 3.2.3. enten umiddelbart før ofringen eller umiddelbart etterpå.
- Begynn disseksjon og vevssamling. Spray ned magen og baksiden av hver mus med 70% etanol. Steriliser saksen i et beger av etanol, la dem tørke, og gjør deretter en enkelt vertikal kutt opp musens bukhule.
- Bruk steril tang for å trekke tilbake huden og forsiktig skyve tarmene ut av kroppshulen og til siden av det åpne feltet, noe som vil utsette reproduksjonskanalen.
MERK: Vær forsiktig så du ikke punkterer eller pierce tarmene, da de kan ha streptomycinresistente bakterier som kan forvirre de eksperimentelle resultatene. - For å samle maksimalt vaginalt vev, bryte skambenet under nekropen. Bruk steril saks, klipp midten av skambenet (kjønnssymfysen) mens du er forsiktig så du ikke skjærer inn i skjeden. Bruk to sett med steril tang, ta tak i hver side av bekkenet og trekk bekkenet åpent sideveis, og utsett den nedre delen av skjeden under.
- Bruk tang for å forsiktig gripe livmorhalsen (en hardere struktur sammenlignet med det omkringliggende vevet). Trekk forsiktig opp på livmorhalsen for å avsløre tykktarmen, skjult bak og nært forbundet med skjeden.
- Bruk liten saks for å frigjøre skjeden fra det eksterne bindevevet. Forsiktig skille skjeden fra tykktarmen og unngå punktering av tarmkanalen. Når den er helt utgitt, flankerer du skjeden ved introitus med saks og klipp for å frigjøre fra musekroppen.
- Oppretthold et forsiktig grep om livmorhalsen mens du trekker litt opp for å gjøre livmorhornene mer synlige. Med den andre hånden, kutt rett under eggstokkene på høyre og venstre side for å frigjøre livmorhornene. Fjern den nå frakoblede reproduksjonskanalen fra kroppshulen og legg den i en steril petriskål.
- Bruk en barberhøvel til å skille livmorhornene, livmorhalsen og skjeden. Plasser hvert vev i sitt respektive merkede oppsamlingsrør. Hvis cytokiner skal samles, legg rørene på is etter tilsetning av vev.
- Vei hver tube igjen etter at vevet er tilsatt. Dette er vekten etter samlingen. Trekk vekten før oppsamlingen fra vekten etter oppsamlingen for å få den totale vekten av vevet.
- Bruk en håndholdt homogenisator for å homogenisere organene i oppsamlingsrørene. For Gardnerella JCP8151B, utfør dette trinnet i biosikkerhetsskapet (aerobt) eller det anaerobe kammeret.
- Forbered flere sett med rør for vask og aseptisk behandling av den håndholdte homogenisatoren mellom prøver. Sørg for at hvert sett har tre 50 ml koniske rør: ett fylt med DI-vann, ett med 70 % etanol og det tredje med 1x PBS. Forbered et separat sett med vaskerør for hver musebehandlingsgruppe.
- For å rengjøre homogenisatoren, senk bladene ned i væsken i hvert vaskerør og vri instrumentet til maks hastighet. Hold homogenisatoren i hvert av de tre rørene i ca. 3 s. Vaskeordren er DI-vann (for å fjerne fysisk rusk), deretter etanol (for å rense), og til slutt 1x PBS (for å nøytralisere). Rist sonden på et papirhåndkle eller engangsbenkpute for å fjerne overflødig væske mellom hver skylling.
- Etter første skylling, homogeniser vevet ved å senke homogeniseringssonden til bunnen av oppsamlingsrøret, fange vevet under. Slå på homogenisatoren for å male vevet, og flytt sonden forsiktig opp og ned ca. 5x mens den forblir nedsenket. Homogeniser hvert organ i ca 15-30 s.
- Etter å ha slått av og fjernet homogenisatoren fra røret, må du visuelt inspisere innholdet for å sikre fullstendig vevsforstyrrelse. Dette er spesielt viktig for livmorhalsen og skjeden, som noen ganger ikke klarer å bli fanget av sonden.
MERK: Det er greit hvis noe overflødig fett på livmorhornene ikke homogeniseres helt. - Gjenta trinn 5.14.1.-5.14.4., vask og steriliser sonden mellom hver prøve. Bytt til et nytt sett med vaskerør for hver eksperimentelle gruppe.
- Flytt rørene med homogeniserte prøver inn i det anaerobe kammeret. For å bestemme bakteriebelastningen til hvert vev, utfør kort, mild vortexing av prøven som skal blandes, fjern deretter 100 μL vevshomogenat for seriell fortynning og plating på selektiv agar for CFU-bestemmelse (den første fortynningen er 1 x 100). Hvis en nedre deteksjonsgrense er nødvendig, utfør spredningsplettering av 200-250 μL ufortynnet homogenat.
Representative Results
En skjematisk fremstilling av et eksempeleksperiment viser noen av måtene man kan utføre den beskrevne protokollen på (figur 1).
Noen dyr vil bære endogene mikrober i deres vaginale mikrobiomer som vil vokse på ikke-selektive medier. Metodene beskrevet her er avhengige av streptomycinresistente isolater av de studerte bakteriestammene, sammen med selektive medier som inneholder streptomycin, for å selektere mot endogene bakterier (figur 2A, B). Det er mulig for streptomycinresistens å utvikle seg spontant, så kontroll av mus før infeksjon (dag 0 vasker) kan bidra til å fastslå om dette kan være et problem.
Gjenoppretting av levedyktige bakterier fra vaginale vasker oppnås ved seriell fortynning og plating på agar media. En standard petriskål kan holde opptil en 6 x 6 matrise med 5 μL flekker, noe som tillater oppregning av bakterietitere fra seks replikapunkter over seks størrelsesordener for hver prøve hvis du bruker 10 ganger serielle fortynninger (figur 3A). Denne metoden kan brukes til å oppregne titere av bakterier som spenner fra Gardnerella til Prevotella og Fusobacterium (figur 3B-D).
Sammen tillater disse metodene en å teste hypoteser og gjøre tolkninger om bakteriell kolonisering / infeksjon av den kvinnelige reproduktive kanalen. For eksempel viste en sammenligning av Gardnerella-titere i vaginale vasker og vaginale vevshomogenater samsvar mellom disse metodene (figur 4A). På samme måte, i en vaginal koinokulasjonsmodell, var titere av Prevotella i livmorvev signifikant høyere (ca. 20 ganger) under Gardnerella-koinfeksjon sammenlignet med Prevotella monoinfeksjon (figur 4B). Endelig kan villtype versus mutante bakteriestammer sammenlignes i disse modellene for å fastslå rollene som spesifikke gener og deres produkter spiller i prosessene for kolonisering / infeksjon av reproduktive kanaler. For eksempel førte en mutert stamme av Fusobacterium som manglet evnen til å transportere og konsumere karbohydratsialinsyre til lavere nivåer av kolonisering med 3 dager etter inokulering (figur 4C).
Figur 1: Skjematisk fremstilling av et eksempeleksperiment33. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vekst av endogene murine vaginale mikrober på selektiv versus ikke-selektiv agar. Vaginal skylling fra fem kvinnelige C57Bl / 6 mus (1-5) ble stripet på to forskjellige NYC III agarplater og inkubert anaerobt. (A) Platen til venstre inneholder ingen antibiotika og tillater vekst av endogene anaerobe bakterier fra murine vaginalkanalen. (B) Platen til høyre inneholder 1 mg/ml streptomycin og selekterer mot vekst av endogene bakterier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Gjenoppretting av levedyktige G. vaginalis, P. bivia og F. nucleatum CFU fra vaginale vasker. (A) CFUer av G. vaginalis JCP8151B-SmR inokulum, replikabelagt som en fortynningsserie på NYC III-agar. (VG Nett) Gjenoppretting av levedyktig (B) G. vaginalis24, (C) P. bivia25 og (D) F. nucleatum26 fra vaginale skyller av monoinfiserte dyr. For hver graf (B-D) kombineres dataene fra to uavhengige eksperimenter, med 10-15 mus per eksperiment24,25,26. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Videre analyse av anaerob bakteriell kolonisering i en murine vaginal inokulasjonsmodell . (A) G. vaginalis-titere i vaginale vasker korrelerer med G. vaginalis-titere gjenfunnet fra vaginalvevshomogenater ved 24 timer og 72 timer etter inokulasjon (kombinasjon av to uavhengige eksperimenter, n = 10 hver. Signifikans bestemmes av Spearmans rangkorrelasjonstest)24. (B) Co-infeksjon med G. vaginalis fører til økt P. bivia titere i livmorhornvev sammenlignet med P. bivia monoinfiserte dyr ved 48 timer etter inokulering (kombinasjon av to uavhengige eksperimenter, hver med 6-10 mus per gruppe . Signifikans bestemt av Mann-Whitney U-test, **p = 0,0017)25. (C) F. nucleatum mutant med forstyrret sialinsyretransportør (Ω SiaT) har redusert titere i vaginale skyllinger av monoinfiserte mus sammenlignet med F. nucleatum wild-type ved 72 timer etter inokulering (kombinasjon av to uavhengige eksperimenter, hver med 10 mus per gruppe . Signifikans bestemt av Mann-Whitney U-test, **p < 0,01)26. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Eksempler på metoder som brukes for ulike vaginale bakterier dyrket under anaerobe forhold. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Den viktigste måten modellen beskrevet her skiller seg fra tidligere publiserte vaginale inokulasjonsmodeller, er bruken av anaerob dyrkede bakterier, som krever spesielle hensyn for fremstilling av levedyktig inokulum og gjenoppretting av bakterier fra musene. Spesifikke trinn i protokollen ovenfor kan variere noe avhengig av arten/stammen av bakterier som brukes, som foreslått i tilleggsfil 1. I tillegg beskriver dette manuskriptet en ny prosedyremetode for administrering av bakterier og vaginale vasker som krever mindre erfaring fra etterforskerens side og mindre tilbakeholdenhet for musene. Hvis eksperimentøren ikke er komfortabel med formen for tilbakeholdenhet beskrevet i trinn 3.2. og trinn 3.3., kan musene i stedet scruffed som tidligere beskrevet34 med eller uten anestesi i henhold til eksperimentell design og institusjonelle IACUC-retningslinjer.
En viktig advarsel for bruk av anaerob dyrkede bakterier i murine modeller er at visse trinn (for eksempel noen som involverer levende dyr) må gjøres utenfor det anaerobe kammeret. Derfor er de mest kritiske trinnene i denne protokollen de der bakteriene av interesse vil bli utsatt for et aerobt miljø, for eksempel under inokulering av musene. Bruken av enhver ny anaerobe i denne modellen vil kreve en foreløpig undersøkelse av dens evne til å opprettholde levedyktighet ved eksponering for oksygen (for eksempel sammenligning av CFU før og etter inokulering som beskrevet i trinn 2.5. og trinn 3.4.). Avhengig av graden av oksygen og PBS-følsomhet for organismen, bør forskjellige metoder for inokulumpreparasjon vurderes (tilleggsfil 1, trinn 2.4.5.). For inokulasjoner ved bruk av G. vaginalis JCP8151B har vi funnet ut at et enkelt rør av inokulum kan fremstilles i PBS og brukes til å infisere alle musene. Hvis en annen anaerob bakterie brukes som er mer følsom for oksygen, kan inokulumet i stedet fremstilles i separate rør for hver mus, slik at gjentatt åpning / lukking av røret ikke er nødvendig. På samme måte, hvis bakterieartene av interesse er mer kresne / mindre i stand til å overleve i PBS enn G. vaginalis, kan inokulering i stedet forberedes i kulturmedier. Hvis mediet som brukes inneholder reduksjonsmidler, slik som CDC-anaerobemediet som brukes til å dyrke Prevotella bivia (tilleggsfil 1, trinn 2.1. og trinn 2.2.), vil bakteriene også ha økt beskyttelse mot oksygeneksponering.
Alternative metoder for homogenisering kan også vurderes, for eksempel perleslag22,35, som gjøres med rørhetten lukket og kan derfor introdusere mindre oksygen enn den håndholdte homogenisatoren. I tillegg kan mer oksygenfølsomme organismer kreve lengre likevektstid for media. En oksygenindikator som resazurin kan brukes til å kontrollere at anaerobe forhold er nådd (trinn 2.1.). Alternative metoder som anaerobe krukker kan påvirke resultatene og bør undersøkes for bakteriell levedyktighet før bruk.
Oksygenfølsomheten og fastidiousness av den eksperimentelle organismen kan også spille en rolle i vellykket utvinning av levedyktige bakterier fra musen under lavages / homogenisering (Supplementary File 1, trinn 3.2. og trinn 5.1.). For svært følsomme organismer kan tiden mellom skyllingen blir tatt og belagt føre til tap av levedyktighet og forårsake et kunstig lavt estimat av bakteriell vaginal kolonisering. For å redusere denne effekten kan oppsamlede lavages umiddelbart fortynnes til friske anaerobe kulturmedier (med reduksjonsmiddel). På samme måte kan organhomogenisering gjøres i friske kulturmedier i stedet for PBS for å øke bakteriell levedyktighet, og kan også gjøres i det anaerobe kammeret selv for å minimere oksygeneksponering.
Avhengig av formålet med et gitt eksperiment, må eksperimentøren være oppmerksom på kontrollgrupper. For å teste hypoteser vil baseline-målinger av uinfiserte kontrollmus som er mock-behandlet med kjøretøy alene, bidra til å fastslå om det er induksjon av kjemokiner / cytokiner eller andre spesifikke utfall av infeksjon. Kontrollkjøretøyet som brukes må være det samme som kjøretøyet som brukes til inokulering, så hvis bakteriene inokuleres i kulturmedier, må ikke-inokulerte kulturmedier brukes som kontroll (tilleggsfil 1, trinn 2.4.5.).
Metodene beskrevet i denne protokollen kan også brukes på fakultative bakterier som er i stand til å vokse anaerobt, men som tradisjonelt studeres ved hjelp av aerobe kulturforhold (som Escherichia coli eller gruppe B streptokokker). Dette kan være spesielt relevant for infeksjoner av disse organismene i kroppsområder som antas å inneholde lave nivåer av oksygen, som livmorhalsen. Det kan være at en fakultativ organisme mer vellykket infiserer steder med mindre oksygen når inokulumet fremstilles anaerobt sammenlignet med aerobt. I et slikt eksperiment kan gjenoppretting av levedyktige bakterier for CFU-oppregning ikke kreve anaerobe forhold.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi anerkjenner Lynne Foster for teknisk assistanse under utviklingen av disse modellene. Vi setter pris på oppstartsmidler fra Institutt for molekylær mikrobiologi og Senter for kvinnelig infeksjonssykdomsforskning (til AL), og March of Dimes (Basil O'Connor-prisen til AL) som bidro til å støtte eksperimenter i tidlig fase. National Institute of Allergy and Infectious Diseases (R01 AI114635) støttet også utviklingen av disse modellene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol 17-valerate | Sigma | E1631 | estrogenization of mice |
| 0.22 µm, 50 mL Steriflip vacuum filter | Fisher | SCGP00525 | sterile filtering sesame oil |
| 14 mL tube | Falcon | 352059 | estrogenization of mice |
| 190-proof ethanol | Koptec | V1105M | dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media |
| 1x PBS | Fisher | MT21040CM | vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization |
| 25 G × 5/8 -in needle | BD | 305122 | estrogenization of mice |
| 5 mL tube | Falcon | 352063 | Tissue collection and homogenization |
| Anaerobic chamber | Coy | 7200000 | Growth of anaerobic bacteria |
| Bacto agar | Fisher | DF0140074 | G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates |
| Bacto peptone | Fisher | DF0118170 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Columbia broth | Fisher | DF0944170 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Defibrinated sheep blood | Hemostat | DSB500 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | mouse/tissue dissection |
| Glucose | Sigma | G7528 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Handheld homogenizer | ISC Bio | 3305500 | Tissue homogenization |
| Hemin | Sigma | 51280 | CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Horse serum | Hemostat | SHS500 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen) | Matheson | Gas for anaerobic chamber | |
| Isofluorane | VetOne | 502017 | mouse anaethesia at sacrifice |
| L-cysteine | Sigma | C1276 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| L-glutamate | Sigma | G1626 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Milli-Q Water Purifier | Millipore | IQ-7000 | for making media and homogenization |
| NaCl | Sigma | S3014 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| NaOH tablets | Sigma | S5881 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Nitrogen gas | Airgas | Gas for anaerobic chamber | |
| p-200 filter tips | ISC Bio | P-1237-200 | vaginal lavages and bacterial inoculations |
| pancreatic digest of casein | Sigma | 70169 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Proteose peptone #3 | Fisher | DF-122-17-4 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | mouse/tissue dissection |
| Sesame oil | Fisher | ICN15662191 | estrogenization of mice |
| Single edge surgical carbon steel razor blades | VWR | 55411-050 | tissue dissection |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Spectrophotometer | BioChrom | 80-3000-45 | measuring bacterial OD600 |
| Streptomycin | Gibco | 11860038 | add to agar media to make selective plates |
| Tuberculin slip tip 1ml syringe | BD | 309659 | estrogenization of mice |
| Vitaim K3 | Sigma | M5625 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Vitamin K1 | Sigma | 95271 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Yeast extract | Fisher | DF0127-17-9 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
References
- Hillier, S. L., Krohn, M. A., Rabe, L. K., Klebanoff, S. J., Eschenbach, D. A. The normal vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant women. Clinical Infectious Diseases. 16, Suppl 4 273-281 (1993).
- Ravel, J., et al.
- Hill, G. B., Eschenbach, D. A., Holmes, K. K.
- van de Wijgert, J. The vaginal microbiome and sexually transmitted infections are interlinked: Consequences for treatment and prevention. PLoS Medicine. 14 (12), 1002478 (2017).
- Srinivasan, S., et al. Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria. PLoS One. 7 (6), 37818 (2012).
- Shipitsyna, E., et al. Composition of the vaginal microbiota in women of reproductive age-sensitive and specific molecular diagnosis of bacterial vaginosis is possible. PLoS One. 8 (4), 60670 (2013).
- Brotman, R. M., et al. Bacterial vaginosis assessed by gram stain and diminished colonization resistance to incident gonococcal, chlamydial, and trichomonal genital infection. The Journal of Infectious Diseases. 202 (12), 1907-1915 (2010).
- Peipert, J. F., et al. Bacterial vaginosis, race, and sexually transmitted infections: does race modify the association. Sexually Transmitted Diseases. 35 (4), 363-367 (2008).
- Wiesenfeld, H. C., Hillier, S. L., Krohn, M. A., Landers, D. V., Sweet, R. L. Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. Clinical Infectious Diseases. 36 (5), 663-668 (2003).
- Spandorfer, S. D., Neuer, A., Giraldo, P. C., Rosenwaks, Z., Witkin, S. S. Relationship of abnormal vaginal flora, proinflammatory cytokines and idiopathic infertility in women undergoing IVF. The Journal of Reproductive Medicine. 46 (9), 806-810 (2001).
- Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: cohort study. BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).
- Holst, E., Goffeng, A. R., Andersch, B. Bacterial vaginosis and vaginal microorganisms in idiopathic premature labor and association with pregnancy outcome. Journal of Clinical Microbiology. 32 (1), 176-186 (1994).
- DiGiulio, D. B., et al. Microbial prevalence, diversity and abundance in amniotic fluid during preterm labor: a molecular and culture-based investigation. PLoS One. 3 (8), 3056 (2008).
- Svare, J. A., Schmidt, H., Hansen, B. B., Lose, G. Bacterial vaginosis in a cohort of Danish pregnant women: Prevalence and relationship with preterm delivery, low birthweight and perinatal infections. British Journal of Obstetrics and Gynaecology. 113 (12), 1419-1425 (2006).
- Ádám, A., et al. Culture- and PCR-based detection of BV associated microbiological profile of the removed IUDs and correlation with the time period of IUD in place and the presence of the symptoms of genital tract infection. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 17 (1), 40 (2018).
- Di Paola, M., et al. Characterization of cervico-vaginal microbiota in women developing persistent high-risk Human Papillomavirus infection. Scientific Reports. 7 (1), 10200 (2017).
- Bullman, S., et al. Analysis of Fusobacterium persistence and antibiotic response in colorectal cancer. Science. 358 (6369), 1443-1448 (2017).
- Brennan, C. A., Garrett, W. S. Gut microbiota, inflammation, and colorectal cancer. Annual Review of Microbiology. 70, 395-411 (2016).
- Hill, G. B. Preterm birth: associations with genital and possibly oral microflora. Annals of Periodontology. 3 (1), 222-232 (1998).
- Hitti, J., et al. Vaginal indicators of amniotic fluid infection in preterm labor. Obstetrics & Gynecology. 97 (2), 211-219 (2001).
- DiGiulio, D. B.
- Patras, K. A., Doran, K. S. A murine model of Group B Streptococcus vaginal colonization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54708 (2016).
- Jerse, A. E., et al. Estradiol-treated female mice as surrogate hosts for Neisseria gonorrhoeae genital tract infections. Frontiers in Microbiology. 2, 107 (2011).
- Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).
- Gilbert, N. M., et al. Gardnerella vaginalis and Prevotella bivia trigger distinct and overlapping phenotypes in a mouse model of bacterial vaginosis. The Journal of Infectious Diseases. 220 (7), 1099-1108 (2019).
- Agarwal, K., et al. Glycan cross-feeding supports mutualism between Fusobacterium and the vaginal microbiota. PLOS Biology. 18 (8), 3000788 (2020).
- Liehr, J. G. Is estradiol a genotoxic mutagenic carcinogen. Endocrine Reviews. 21 (1), 40-54 (2000).
- Yager, J. D., Davidson, N. E.
- Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L.
- Lewis, W. G., Robinson, L. S., Gilbert, N. M., Perry, J. C., Lewis, A. L. Degradation, foraging, and depletion of mucus sialoglycans by the vagina-adapted Actinobacterium Gardnerella vaginalis. Journal of Biological Chemistry. 288 (17), 12067-12079 (2013).
- Robinson, L. S., et al. Genome sequences of 15 Gardnerella vaginalis strains isolated from the vaginas of women with and without bacterial vaginosis. Genome Announcements. 4 (5), 00879 (2016).
- Adapted from "mouse posterior turn" by BioRender.com. BioRender.com. , Available from: https://app.biorender.com/biorender-templates (2022).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
- Verollet, R. A major step towards efficient sample preparation with bead-beating. Biotechniques. 44 (6), 832-833 (2008).
