Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

אסטרטגיה לחקר תאי לימפה מייצרי IL-9 במודל זיהום Nippostrongylus brasiliensis

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64075
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

תאי T ו-ILC2 המבטאים IL-9 מושרים במהלך זיהום ב-N. brasiliensis , אך האפיון שלהם התעלם במידה רבה במעי הנגוע בשל התדירות הנמוכה והקינטיקה הדיפרנציאלית שלהם. פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאים אלה מאיברי מטרה שונים ואישור זהותם באמצעות ציטומטריית זרימה בשלבי זיהום שונים.

Abstract

IL-9 הוא ציטוקין פליוטרופי הקשור לתהליכים שונים, כולל חסינות אנטי-סרטנית, השראת פתולוגיות אלרגיות והתגובה החיסונית נגד זיהומי הלמינת'ס, שם הוא ממלא תפקיד חשוב בגירוש הטפיל. במודל מוריני של זיהום Nippostrongylus brasiliensis, IL-9 מיוצר בעיקר על ידי לימפוציטים מסוג CD4+ T ותאי לימפה מולדים הנמצאים בריאה, במעי הדק ובבלוטות הלימפה המנקזות. בהתחשב בקשיים הטכניים הכרוכים בצביעה תוך-תאית של IL-9, כמו גם המורכבות של בידוד תאים המטופויטיים מהמעי הדק בעת זיהום, יש צורך דחוף בפרוטוקול מקיף אך פשוט לניתוח הביטוי של IL-9 ברקמות לימפואידיות ולא לימפואידיות שונות במודל זה. הפרוטוקול המתואר כאן מתאר את הקינטיקה של IL-9 המיוצרת על ידי תאי T CD4+ ותאי לימפה מולדים בריאה ובמעי הדק, האיברים העיקריים הממוקדים על ידי N. brasiliensis, כמו גם בבלוטות הלימפה mediastinal ו mesenteric, לאורך כל הזיהום. בנוסף, הוא מפרט את מספר הזחלים הדרושים לזיהום, בהתאם לסוג התא והאיבר המעניין. פרוטוקול זה נועד לסייע בסטנדרטיזציה של בדיקות כדי לחסוך זמן ומשאבים על ידי מתן הזדמנות להתמקד בתאים, איברים ושלבי מחלה ספציפיים של עניין במודל זיהום N. brasiliensis.

Introduction

תולעי קרס הן טפילי מעיים המדביקים כ-700 מיליון בני אדם ברחבי העולם, בעיקר באזורים טרופיים במדינות לא מפותחות. זיהומים בעוצמה גבוהה עם Ancylostoma duodenale ו - Necator americanus, טפילי תולעי הקרס הנפוצים ביותר בבני אדם, גורמים לאנמיה ומחסור בחלבון שעלולים לגרום לעיכוב בגדילה ובהתפתחות הנפשית1. N. americanus וטפיל המכרסם Nippostrongylus brasiliensis גורמים לתגובה חיסונית טיפוסית מסוג 2 אצל הפונדקאי שלהם וחולקים קווי דמיון במחזור החיים שלהם. לפיכך, זיהום של עכברים עם N. brasiliensis הוא המודל הנפוץ ביותר עבור זיהומים תולעי קרס אנושיים. שלב 3 (L3) זחלים זיהומיים N. brasiliensis עוברים מהעור לריאה בשעות הראשונות שלאחר ההדבקה. ברגע שהם בריאה, הם הופכים ל-L4 ונודדים במעלה קנה הנשימה כדי להיבלע, לעבור דרך הקיבה ולהגיע למעיים כדי להפוך למבוגרים (L5) תוך 4-5 ימים. במעיים, תולעי L5 מטילות ביצים המופרשות בצואה כדי להפעיל מחדש את מחזור החיים של הטפיל2.

התגובה החיסונית הנגרמת על ידי N. brasiliensis מאופיינת על ידי עלייה במספר ציטוקינים מסוג 2, כולל IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 ו- IL-13, יחד עם אאוזינופיליה, בזופיליה, היפרפלזיה של גביע ותאי פיטום, וייצור מוגבר של IgG1 ו- IgE. רוב המחקרים המנסים לזהות ולהגדיר את התגובות החיסוניות המתעוררות על זיהום N. brasiliensis מתמקדים בתפקיד של IL-4 או IL-13 במודל זה3. עם זאת, הזיהוי והאפיון של תאים המבטאים IL-9 ותפקודו של ציטוקין זה התעלמו במידה רבה, עד שליקונה-לימון ועמיתיו פרסמו את המחקר הראשון שהוכיח תפקיד קריטי עבור IL-9 בתגובה החיסונית נגד N. brasiliensis. באמצעות עכברי דיווח, מחקר זה תיאר תאי T (בעיקר T עוזר 9) ותאי לימפה מולדים מסוג 2 (ILC2s) כתת-קבוצות התאיות העיקריות המבטאות IL-9 בעת זיהום4.

בידוד ואפיון של תאי מערכת החיסון מריאות נגועות בהלמינת'ס הוא אפשרי, ודווח בהרחבה 3,4. עם זאת, בגלל שיפוץ הרקמה האינהרנטית וייצור הריר, לעשות זאת במעיים הנגועים התגלה כאתגר טכני, עד לפרסום האחרון של Ferrer-Font et al.5. הקבוצה התוותה פרוטוקול לבידוד וניתוח תרחיפים חד-תאיים של תת-קבוצות חיסוניות ממעי מורין נגועים בפוליגירוס Heligmosomoides. בהתבסס על זה, יש לנו עכשיו סטנדרטיזציה פרוטוקול לבידוד וניתוח ציטוטומטרי של תאי לימפה המבטאים IL-9 מן המעי נגוע N. brasiliensis. בנוסף, ביססנו קינטיקה IL-9 ממקורות תאיים שונים וממיקומים אנטומיים שונים במהלך הזיהום.

אפיון אוכלוסיות התאים השונות המעורבות בזיהום זה חיוני להבנה רחבה יותר של התגובה החיסונית לטפיל והאינטראקציה שלו עם הפונדקאי. פרוטוקול מקיף זה מספק מסלול ברור לבידוד וניתוח תאים מייצרי IL-9 מאיברים רצויים בשלבי מחלה, ומאפשר שיפור חד של הידע על תפקידם של תאים אלה בזיהום N. brasiliensis ובזיהומים טפילים בכלל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה הפנימית לטיפול בבעלי חיים (CICUAL) של המכון לפיזיולוגיה תאית, האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של מקסיקו.

הערה: תרשים זרימה של הפרוטוקול כולו מוצג באיור 1.

1. דיור של עכברים

  1. השתמשו בקבוצות עכברים בנות 8-10 שבועות, נקבות או זכרים, השוכנים במתקני בעלי חיים עם טמפרטורה ולחות קבועות במחזורי אור/חושך של 12 שעות , עם גישה למים ולמזון.
    הערה: פרוטוקול זה משתמש בזן עכבר מדווח IL-9 ברקע C57BL/6, כמתוארלעיל 4; עם זאת, זנים אחרים של כתב IL-9 יכולים לשמש 6,7,8, כמו גם צביעת IL-9 תוך תאית, עם תוצאות משתנות 9.

2. זיהום של עכברים

  1. יש לגלח את גב העכברים ממרכז הגוף ועד סמוך לבסיס הזנב יום אחד לפני ההדבקה. השימוש בחומרי הרדמה אינו חיוני.
  2. לחסן כל עכבר ב-200 זחלי N. brasiliensis (L3) בשלב השלישי ב-100 μL של מלח חוצץ פוספט (PBS)10 בגב התחתון, כפי שתואר קודם לכן2,11, או להזריק 100 μL של PBS בלבד כבקרה. הקריבו את בעלי החיים ביום 4, יום 7 או יום 10 לאחר ההדבקה.

3. בידוד בלוטות לימפה ריאתיות, מעי דק, מדיאסטינליות ומזנטריות

  1. הרדימו את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם. הניחו את העכבר על גבו ורססו אותו באתנול 70%. בצע חתך קו אמצע באמצעות מספריים ופתח את העור כדי לחשוף את אזורי הבטן ובית החזה.
    הערה: ניתן להשתמש באיזופלורן כשיטת המתת חסד חלופית12. תאי פחמן דו חמצני אינם מומלצים, שכן CO2 מוביל לנזק לרקמת הריאה ודימום13.
  2. בידוד בלוטות הלימפה והריאות המדיאסטינליות
    1. בצע חתך בחזה וחתך בצורת "V" כדי להסיר את הצלעות ושרירי החזה. לאחר חשיפת חלל בית החזה, מקמו את בלוטות הלימפה המדיאסטינליות ליד הוושט, מתחת ללב (ראו איור משלים 1).
    2. חלצו את בלוטות הלימפה המדיאסטינליות ואספו אותן ב-1 מ"ל של מדיום R-10 (טבלה 1) בצלחת תרבית של 12 בארות. יש לשמור על קרח, מוגן מפני אור עד לעיבוד.
      הערה: הדגימות צריכות להיות מוגנות מפני אור, כדי למנוע הפחתת האות הפלואורסצנטי מהעכברים המדווחים המשמשים בניסויים אלה.
    3. לחלץ את הריאות ולאסוף אותם 1 מ"ל של מדיום R-10 בצלחת תרבית 12 בארות לכל עכבר. יש לשמור על קרח, מוגן מפני אור עד לעיבוד.
  3. בידוד שרשראות בלוטות לימפה מזנטריות ומעי דק
    1. חשוף את חלל הצפק, והזז בזהירות את המעי הדק ימינה כדי לחשוף את שרשרת בלוטות הלימפה המזנטריות (MLN) לאורך המעי הגס.
    2. בעזרת מלקחיים, להסיר את MLN, לגלגל אותו בעדינות על מגבת נייר, ולמשוך את השומן.
    3. העבר את MLN ל 1 מ"ל של מדיום R-10 בצלחת תרבית של 12 בארות. יש לשמור על קרח, מוגן מפני אור עד לעיבוד.
    4. חותכים את המעי הדק ממש מתחת לסוגר הפילורי ומעל הצקום. משוך את המעי החוצה לאט בעזרת מלקחיים, הסרת mesentery מחובר רקמת שומן.
    5. הניחו את המעי הדק על מגבת נייר והרטיבו אותו בנדיבות עם PBS. הסר את מדבקות פייר מהמעי הדק עם מספריים.
      הערה: כדי לשמור על כדאיות, להסיר את רקמת השומן הנותרת, ולשמור על המעי הדק לח עם PBS במהלך כל התהליך.
    6. חותכים את המעי הדק לאורכו באמצעות מספריים, ומחליקים בעדינות את המלקחיים על המעי הפתוח כדי להסיר את תוכן הצואה והריר.
    7. החזיקו את המעי הדק עם מלקחיים, ושטפו אותו ב 5 מ"ל של PBS על קרח על ידי טבילה בזהירות אותו כמה פעמים. חזור על הפעולה פעמיים.
    8. חותכים את המעי הדק לחתיכות קצרות (כ -5 מ"מ), ואוספים אותם בצינור חרוטי 50 מ"ל עם 10 מ"ל של HBSS14 עם 2% FBS (טבלה 1). מיד להמשיך לבודד תאים intraepithelial ו lamina propria.

4. הכנת תרחיפים חד-תאיים מהמעי הדק, הריאה ובלוטות הלימפה

הערה: חשוב מאוד לעבד עד שישה עכברים לאדם בעת הכנת תרחיפים חד-תאיים ממעי דק, מכיוון שיכולת הקיום של התאים פוחתת באופן משמעותי עם תקופות עיבוד ארוכות יותר. שיטה זו הותאמה ממודל5 של עכבר זיהום Heligmosomoides polygyrus.

  1. חממו מראש את האינקובטור הרועד, R-20 medium, HBSS ו-HBSS-2 mM EDTA (טבלה 1) ב-37°C.
  2. הכינו 10 מ"ל של מדיום עיכול המעי הדק (טבלה 1) לדגימה.
  3. נערו את חתיכות המעי משלב 3.3.8 במרץ ביד.
  4. מסננים כל דגימה דרך רשת ניילון (כ-10X10 ס"מ) מעל משפך זכוכית. שטפו את הדגימה על ידי הוספת 10 מ"ל HBSS שחומם מראש על הרשת והשליכו את הזרימה. חזור על הפעולה פעם נוספת.
    הערה: השתמשו ברשת שינוי חדשה לכל דגימה ועשו בה שימוש חוזר לאורך כל ההליך.
  5. הסר את הרשת מהמשפך, ואסוף את הדגימה מהרשת בצינור חרוטי של 50 מ"ל עם 10 מ"ל של HBSS-2 mM EDTA חם (שלב 4.1). יש לדגור במשך 10 דקות ב-37°C, עם רעידות ב-200 סל"ד.
  6. מערבולות במשך 10 שניות במהירות מרבית (3,200 סל"ד) ומסננים את הדגימה עם הרשת מעל משפך זכוכית, ומשחזרים את הזרימה בצינור חרוטי של 50 מ"ל.
  7. חזור על שלבים 4.5 ו -4.6 פעמיים, לשחזר את הזרימה דרך באותו צינור חרוטי 50 מ"ל. התאים intraepithelial ממוקמים זה 30 מ"ל חלק. שמור את הרקמה הנותרת.
  8. הכנת תרחיף חד תאי מתאים תוך אפיתל
    1. צנטריפוגה 30 מ"ל של תרחיף התא, התאושש בשלב 4.7, ב 450 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השליכו את הסופרנטנט.
    2. הוסף 5 מ"ל PBS וצנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב RT. להשליך את supernatant.
    3. השהה מחדש את גלולת התא ב-3 מ"ל של RPMI 10% FBS-20 מיקרוגרם/מ"ל DNase (טבלה 1). יש לשמור על קרח, מוגן מפני אור עד להכתמת תאים.
  9. הכנת תרחיף חד תאי מתאי lamina propria
    1. שטפו את רקמת המעי הדק הנותרת משלב 4.7 על ידי שפיכת מעל 10 מ"ל HBSS חם דרך הרשת מעל המשפך. חזרו על הכביסה. לאסוף את הרקמה מן הרשת בצינור חרוטי 50 מ"ל עם 10 מ"ל של מדיום העיכול המעי הדק.
    2. יש לדגור במשך 30 דקות ב-37°C, עם רעידות ב-200 סל"ד. מערבולת במהירות מרבית למשך 10 שניות כל 5 דקות.
    3. הוסף 10 מ"ל של חיץ FACS-EDTA (טבלה 1) כדי לעצור את תגובת העיכול, והניחו אותו על קרח.
    4. מסננים כל דגימה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר באמצעות פיפטה סרולוגית, ומשחזרים את התרחיף בצינור חרוטי של 50 מ"ל המונח על קרח.
    5. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C.
    6. השליכו את הסופרנטנט. לשטוף את גלולת התא עם 5 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C.
    7. השליכו את הסופרנטנט והשהו מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של סל"ד 10% FBS-20 מיקרוגרם/מ"ל DNase. יש לשמור על קרח, מוגן מפני אור עד להכתמת תאים.
  10. הכנת תרחיף חד תאי מהריאה
    הערה: כל ריאה ומעי דק צריכים להיות מעובדים במקביל על ידי שני אנשים כדי למנוע זמני טיפול ארוכים, אשר גורמים לכדאיות תאים נמוכה.
    1. הכינו 4 מ"ל של מדיום עיכול ריאות (טבלה 1) לכל דגימה מעובדת.
    2. הסר את מדיום RPMI מהבאר המכילה את הריאות משלב 3.2.3. חותכים את הריאה לחתיכות קטנות עם מספריים עדינים.
    3. מעבירים את חתיכות הריאה לצינור חרוטי 15 מ"ל עם מרית. הוסף 4 מ"ל של מדיום עיכול ריאות (טבלה 1).
    4. יש לדגור במשך 30 דקות ב-37°C, עם רעידות ב-250 סל"ד. בסיום, יש לשמור על קרח עד שכל דגימה מעובדת.
    5. סנן כל דגימה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר, הממוקמת בבאר אחת של צלחת תרבית בת 6 בארות. לנתק את הרקמה עם בוכנה מזרק.
    6. שחזר כל דגימה בצינור חרוטי של 15 מ"ל, והוסף 4 מ"ל של מדיום R-2 (טבלה 1). שמור על קרח בזמן שהדגימות האחרות מעובדות.
    7. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של מדיום R-5 (טבלה 1).
    8. בזמן הצנטריפוגה, הכינו 4 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות של 27.5% (טבלה 1) לכל דגימה כדי להעשיר את מקטע התא ההמטופויטי15,16. אסטרטגיה זו להפרדת תא בודד יעילה יותר, חסכונית יותר ורעילה פחות בהשוואה למדיות שיפוע צפיפות דומות אחרות17.
    9. הוסף 4 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות של 27.5% ל- 1 מ"ל של תרחיף התא משלב 4.10.7, ונער במרץ.
    10. הוסף באיטיות 1 מ"ל של R-5 בינוני (טבלה 1) על גבי המתלה המעורב כדי ליצור שני שלבים.
    11. צנטריפוגה במהירות 1,500 x גרם למשך 20 דקות ב-RT, עם האצה נמוכה והבלם כבוי. שימו לב לטבעת שנוצרה בין שני השלבים.
    12. לשחזר את הטבעת שנוצרה בין שני השלבים עם micropipette 1 מ"ל, ו resuspend ב 4 מ"ל של מדיום R-2.
    13. צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט. השהה מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של חיץ ACK (טבלה 1), ודגר במשך דקה אחת ב-RT.
    14. הוסף 4 מ"ל של R-5 בינוני וצנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של מדיום R-10. יש לשמור על קרח, מוגן מפני אור עד להכתמה לצורך ציטומטריית זרימה.
  11. הכנת השעיה חד-תאית מבלוטות הלימפה
    1. מניחים את בלוטות הלימפה משלבים 3.2.2 או 3.3.3 בין שתי חתיכות רשת בבאר מצלחת תרבית של 6 בארות, ומתנתקים עם בוכנה מזרק.
    2. לשחזר את השעיית התא בצינור חרוטי 1.5 מ"ל צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    3. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיום R-10. יש לשמור על קרח, מוגן מפני אור עד להכתמה לצורך ציטומטריית זרימה.
      הערה: אם הגושים גלויים, סנן את הדגימה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר.

5. צביעת תאים עבור ציטומטריית זרימה (איור 2 ואיור 3)

הערה: צנטריפוגה של תאי בלוטות הלימפה מתרחפת משלב 4.11.3 ב- 450 x גרם למשך 5 דקות ב- 4 ° C, ומשהה מחדש את כדורית התא ב- 500 μL של מאגר FACS (טבלה 1).

  1. צביעת תאים לזיהוי ILC2s (איור 3 ואיור משלים 2)
    הערה: הליך צביעה זה הוא ספציפי לזיהוי תאי ILC2 המבטאים IL-9.
    1. צלחת 150 μL לדגימת ריאה (כ 1.8 x 106 תאים) משלב 4.10.14, ו 50 μL לכל דגימת בלוטות לימפה משלב 4.11.3 (בערך 0.7 x 10 6 ו 2.2 x 106 תאים עבור דגימות בלוטות לימפה mediastinal ו mesenteric, בהתאמה) בלוח תרבית תחתית חרוטי 96 באר. הוסף 100 μL של מאגר FACS, וצנטריפוגה ב 450 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.
    2. צלחת 100 μL לכל דגימת מעי דק (כ 2.7 x 10 6 ו 0.6 x 106 תאים עבור דגימות intraepithelial ו lamina propria, בהתאמה) משלבים 4.8.3 ו 4.9.7 בצלחת תרבית תחתית חרוטי 96 באר. הוסף 150 μL של חיץ FACS וצנטריפוגה ב 450 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.
    3. השליכו את הסופרנטנט, והשהו מחדש כל גלולה ב-50 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים הביוטינילציה (טבלה 2) המדולל במאגר FAC. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C המוגנת מפני אור.
      הערה: השתמש במאגר FACS עם DNase של 20 מיקרוגרם/מ"ל עבור דגימות intraepithelial ו- lamina propria.
    4. הוסף 150 μL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    5. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטר של חיץ FACS. שוב צנטריפוגה והשליך את הסופרנטנט.
    6. יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-50 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים/הכתם (טבלה 2), ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C כשהיא מוגנת מפני אור.
    7. הוסף 150 μL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    8. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטר של חיץ FACS. שוב צנטריפוגה והשליך את הסופרנטנט. חזור על הכביסה (שלב 5.1.7), והשלך את supernatant.
    9. להשהות מחדש את גלולת התא ב 300 μL של מאגר FACS, ולנתח על ידי ציטומטריית זרימה.
    10. עבור דגימות המעי הדק והריאות, השתמשו באסטרטגיית הגאט: לימפוציטים, תאים בודדים, תאים חיים, תאים המטופויטיים, תאי CD90+שושלת, תאי ST2+ ותאי IL-9+ (איור 3A,B ואיור משלים 2A). עבור דגימות בלוטות הלימפה, השתמשו באסטרטגיית gating: תאים חיים, תאים בודדים, תאי שושלת CD90+, תאי ST2+ ותאי IL-9+ (איור משלים 2B,C).
  2. צביעת תאים לזיהוי לימפוציטים מייצרי IL-9 (איור 2 ואיור משלים 3)
    1. העבר 800 μL לכל דגימת ריאה משלב 4.10.14 לצינור 1.5 מ"ל (כ 14.6 x 106 תאים). צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט.
    2. עבור דגימות בלוטות לימפה, צלחת 400 μL של תרחיף התא משלב 4.11.3 (כ 5.6 x 10 6 ו 17.5 x 106 תאים עבור דגימות בלוטות לימפה mediastinal ו mesenteric, בהתאמה) בלוח תחתון חרוטי 96 היטב בשני שלבים.
      1. מעבירים 200 μL תחילה, צנטריפוגה ב 450 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C, ומשליכים את supernatant.
      2. מעבירים עוד 200 μL לבאר המתאימה. צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ולהשליך את supernatant.
    3. יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-50-400 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים/הכתם (טבלה 3), ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C כשהיא מוגנת מפני אור.
      הערה: דגימות ריאה צריכות להיות מושעות מחדש ב 400 μL, דגימות בלוטות לימפה mediastinal ב 50 μL, ודגימות בלוטות לימפה mesenteric ב 100 μL של קוקטייל מכתים.
    4. הוסף 150 μL של חיץ FACS לדגימות בלוטות הלימפה המדיאסטינליות ו- 100 μL לדגימות בלוטות הלימפה המזנטריות. צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ולהשליך את supernatant.
    5. לשטוף את דגימות הריאה ובלוטות הלימפה על ידי השעיה מחדש של הכדוריות ב 1 מ"ל ו 200 μL של חיץ FACS, בהתאמה. צנטריפוגה ב 450 xגרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט וחזרו על הכביסה.
    6. להשהות מחדש את דגימות הריאה ב 600 μL של מאגר FACS, ולנתח אותם על ידי ציטומטריית זרימה. השתמשו באסטרטגיית הגטינג: לימפוציטים, תאים בודדים, תאים חיים, תאים המטופויטיים, תאי CD4+TCRβ+ ותאי IL-9+ (איור 2A).
    7. להשהות מחדש את דגימות בלוטות הלימפה ב 300 μL של מאגר FACS, ולנתח על ידי ציטומטריית זרימה. השתמשו באסטרטגיית הגטינג: לימפוציטים, תאים בודדים, תאים חיים, תאי CD4+ TCRβ+ ותאי IL-9+ (איור 2B ואיור משלים 3A).

6. קביעת מספר מוחלט של תאים בתרחיפים חד-תאיים

  1. דללו את הדגימות משלבי בידוד 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 ו-4.11.3 עם PBS ביחס של 1:20 (10 μL של דגימה + 190 μL של PBS).
  2. יש לערבב 10 μL מכל דגימה מדוללת משלב 6.1 עם 10 μL של Trypan Blue. טען 10 μL לתוך hemocytometer ולספור את התאים החיים, בהתחשב בכל דילול.
  3. השג את המספרים האבסולוטיים של תאים על-ידי הכפלת אחוז האוכלוסייה המעניינת מתאים חיים שנקבע על-ידי ציטומטריית זרימה (כדאיות תאים שליליים) במספר הכולל של תאים חיים בתרחיף של תא בודד לאחר בידוד, וחלוקת מספר זה ב-100 (איור משלים 4, איור משלים 5 ואיור משלים 6).
    מספר מוחלט = (אחוז אוכלוסיית העניין מתאים חיים שנקבע על ידי ציטומטריית זרימה x המספר הכולל של תאים חיים בתרחיף של תא בודד)/100

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לעכברים הוזרקו תת עורית 200 זחלי L3 שלב N. brasiliensis , או PBS לבקרות דמה. מספר הזחלים המשמשים בפרוטוקול זה הותאם על מנת לבודד תאים בני קיימא מהריאות, מרקמת הלימפה ומהמעי הדק, בניגוד לדיווחים קודמים שבהם נעשה שימוש בעומסים גבוהים יותר של תולעים כדי לאתר תאים ברקמות הלימפה ובריאות, רק4. ריאות, בלוטות לימפה מדיאסטינליות, בלוטות לימפה מזנטריות והמעי הדק נקצרו בימים 0, 4, 7 ו-10 לאחר ההדבקה לצורך בידוד לימפוציטים ואפיון אוכלוסיות מייצרות IL-9. בסך הכל נעשה שימוש ב-27 עכברים בשני ניסויים עצמאיים או יותר, כולל תשע בקרות וארבעה עד שישה עכברים נגועים ב-N. brasiliensis בכל נקודת זמן שנותחו. בקרות נגועות בדמה נכללו בכל ניסוי כדי להשיג מספרים בסיסיים. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לבודד תאי CD4+ T מייצרי IL-9 (בעיקר תאי Th9 במודל זה) מבלוטות לימפה ריאתיות, מזנטריות ומדיאסטינליות לצורך כימות וניתוח נוסף.

בעקבות המהלך הטבעי של הזיהום, הערכנו תחילה את התדרים של לימפוציטים מסוג CD4+ T (Th9) המייצרים IL-9 הנמצאים בריאות ובבלוטות הלימפה המדיאסטינליות (אסטרטגיית gating מוצגת באיור 2A ובאיור משלים 3A). בשני האיברים, תדרי Th9 עלו, החל מהיום הרביעי, והגיעו לשיא ביום 7 לאחר ההדבקה (איור 2C), תוספת שנצפתה גם במספרים מוחלטים של Th9 (איור משלים 4A,B). בבלוטות הלימפה המזנטריות (אסטרטגיית הגטינג שמוצגת באיור 2B), הייתה עלייה משמעותית הן בתדרים והן במספר האבסולוטי של תאי Th9 בימים 7 ו-10 לאחר ההדבקה (איור 2C ואיור משלים 4C), בהתאם לדיווחים קודמים4. נוכחותם של תאי T ו- ILC2s אושרה בדגימות intraepithelial ו lamina propria; אולם לא נצפו תאי Th9 בתאי המעי האלה לאורך כל הזיהום (איור משלים 3B,C).

לאחר מכן הערכנו תאי ILC2 המבטאים IL-9 ברקמות לימפואידיות ולא לימפואידיות של עכברים נגועים (אסטרטגיית gating מוצגת באיור 3A,B ובאיור משלים 2). ראינו עלייה משמעותית בתדרים של ST2+ IL-9- ו-ST2+ IL-9+ המבטאים ILC2s בריאות ביום השביעי לאחר ההדבקה (איור 3C). במקביל, ניתוח של מספרים מוחלטים גילה עלייה מובהקת סטטיסטית רק באוכלוסיית ST2+ IL-9+ ביום השביעי לאחר ההדבקה (תרשים משלים 5A). בבלוטות הלימפה המדיאסטינליות (אסטרטגיית gating המוצגת באיור משלים 2B), מספר תאי ILC2 המבטאים IL-9 (ST2+ IL-9+) עלה באופן משמעותי ביום ה-10 לאחר ההדבקה, בעוד שהמספרים האבסולוטיים של תאי ST2+ הראו מגמת עלייה, החל מהיום ה-7 ועד היום ה-10 לאחר ההדבקה (איור משלים 6A,C).

תאי IL-9+ ILC2 נמצאו גם בתאי lamina propria ובתאים תוך-אפיתליאליים של המעי הדק (אסטרטגיית gating מוצגת באיור 3B ובאיור משלים 2A). זיהום N. brasiliensis הביא לעלייה מובהקת סטטיסטית בתדרים של תאי ST2+ IL-9+ ביום 4, ואוכלוסיות ST2-IL-9+ בימים 7 ו -10 בלמינה פרופריה. בתא התוך-אפיתל נצפה שינוי משמעותי גם בתדרים של תאי ST2+ IL9+ ו-ST2-IL-9+ ביום ה-7 וביום ה-10 לאחר ההדבקה, בהתאמה (איור 3C). חשוב לציין, כי גם עם מספר נמוך יחסית של עומס הזחלים, זיהום בטפיל גרם נזק נרחב למעי הדק; לפיכך, ניתוח המספרים האבסולוטיים של ILC2 המבטאים IL-9 אינו ישים מבחינה טכנית, ומעכב את הכימות המדויק של אוכלוסייה זו בשל תפוקות נמוכות של תאים חיים (איור משלים 5B,C). מצד שני, ניתוח בלוטות לימפה מזנטריות (אסטרטגיית gating המוצגת באיור משלים 2C) חשף עלייה משמעותית במספר האבסולוטי של תאי ST2+ IL-9-, ST2+ IL-9+ ו-ST2-IL-9+ ILC2 ביום ה-10 לאחר ההדבקה (איור משלים 6D), כפי שדווח בעבר4. בינתיים לא נצפה הבדל בתדירויות של אוכלוסיות אלה לאורך כל ההדבקה (תרשים משלים 6B). תת-קבוצות מגוונות אלה של תאים המבטאים ST2 ו-IL-9 הן אוכלוסיות מסקרנות עם תפקידים דיפרנציאליים פוטנציאליים in vivo, ועשויות להתאים ל-ILC2s טבעיים לעומת דלקתיים כפי שתואר לאחרונה 18,19,20,21. עם זאת, יש להתייחס לכך במחקרים עתידיים.

לסיכום, התאמנו פרוטוקול זה להתאוששות של תאים המבטאים IL-9 ממעי נגוע ב- N. brasiliensis, תוך יכולת לזהות אותם ברקמת הריאה והלימפה. שליפת תאי חיסון ממעי נגוע בטפילים הוכחה כקשה מבחינה טכנית. כאן, מספר מותאם של זחלים המשמשים לזיהום הביא לשיפור שלמות רקמת המעי, שאפשרה התאוששות של אוכלוסיית IL-9+. למיטב ידיעתנו, זהו הפרוטוקול הראשון שפותח במיוחד לניתוח תאים המבטאים IL-9 במעיים במהלך זיהום N. brasiliensis. עם זאת, ניתן גם לבודד תאים חיסוניים אחרים בעקבות צעדים אלה. הנתונים המוצגים כאן מראים כי רוב התאים המבטאים IL-9 במעי הדק הם ILC2s.

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה של הפרוטוקול המתואר. דיאגרמה סכמטית עם השלבים העיקריים המשמשים לעיבוד איברים שונים ותת-קבוצות התאים הצפויות המבטאות IL-9 המתקבלות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תאי Th9 נמצאים בריאות, בבלוטות הלימפה המדיאסטינליות והמזנטריות במהלך זיהום N. brasiliensis. ניתוח ציטומטריית זרימה מייצגת ואסטרטגיית gating המשמשים לזיהוי תאי Th9 מ-(A) ריאות ו-(B) בלוטות לימפה מזנטריות. תרחיפים חד-תאיים מכל איבר הוכתמו בצבע בר-קיימא הניתן לתיקון, שסומן באופן פלואורסצנטי כאנטי-CD45 לזיהוי תאים המטופויטיים, וקולטן אנטי-תאי T (TCR) β ואנטי-CD4 לזיהוי לימפוציטים מסוג CD4+ T. אות GFP+ מציין את אחוז תאי Th9 הנוכחים. השער הראשון מראה תכונות פיזור צדדי (SSC)-A/פיזור קדמי (FSC)-A עם המורפולוגיה הקלאסית של תאי הלימפה. נבחרו אירועים חד-תאיים, אחריהם תאים חיים ולאחר מכן תאי CD45+. בתוך אוכלוסייה זו, התמקדנו בתאים חיוביים כפולים TCR-β ו-CD4, שמהם זוהו תאי GFP+ כתאי Th9. הצביעה של בלוטות הלימפה לא כללה את הנוגדן נגד CD45, שכן כל האוכלוסייה צפויה להיות חיובית. (C) תדרים של תאי Th9 הנמצאים בריאות, בבלוטות הלימפה המדיאסטינליות והמזנטריות בזמנים שצוינו לאחר ההדבקה. הנתונים מייצגים את ממוצע ± SEM של עכבר אחד או שניים שנותחו בכל קבוצה, משלושה ניסויים בלתי תלויים, לכל נקודת זמן; מבחן T לא מזווג; *p≤ 0.05, **p≤ 0.001, ***p≤ 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תאי ILC2 מייצרי IL-9 נמצאים באיברים שאינם לימפה. ניתוח ציטומטריית זרימה מייצגת ואסטרטגיית gating המשמשים לזיהוי תאי IL-9+ ILC2 מ-(A) ריאות ו-(B) Lamina propria במעי הדק. תרחיפים חד-תאיים מכל איבר סומנו בנוגדנים ביוטיניליים לזיהוי תאי שושלת (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 ו-anti-Ter119) ו-Fc-Block. לאחר מכן הוכתמו מתלי התאים בצבע בר-קיימא הניתן לתיקון, סטרפטווידין עם תווית פלואורוכרום, אנטי-CD45 לזיהוי תאים המטופויטיים, ואנטי-CD90 לזיהוי תאי ILC2. השער הראשון מראה תכונות פיזור (SSC)-A/פיזור צדדי (FSC)-A עם המורפולוגיה הקלאסית של תאי הלימפה. נבחרו אירועים חד-תאיים, אחריהם תאים חיים ולאחר מכן תאי CD45+. בתוך אוכלוסייה זו, התמקדנו בתאי פשתן CD90+; מקבוצה זו, הערכנו ביטוי ST2 ו- GFP כדי לזהות תאי IL-9+ ILC2. (C) תדרים של תאי ILC2 הנמצאים בריאות, בלמינה פרופריה ובתא תא תוך אפיתל בנקודות הזמן שצוינו לאחר ההדבקה. הנתונים מייצגים את ממוצע ± SEM של עכבר אחד או שניים שנותחו בכל קבוצה, משלושה ניסויים בלתי תלויים, לכל נקודת זמן; מבחן T לא מזווג; *P ≤ 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: רשימת תמיסות כימיות והרכבן. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: קוקטייל נוגדנים לזיהוי תאי ILC2 מייצרי IL-9. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: קוקטייל נוגדנים לזיהוי לימפוציטים מסוג T המייצרים IL-9. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

תרשים משלים 1: ייצוג סכמטי של מיקום בלוטות הלימפה המדיאסטינליות. נוצר ב- BioRender.com אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 2: ציטומטריית זרימה מייצגת ואסטרטגיית gating המשמשות לזיהוי IL-9+ ILC2s בתוך תאים תוך-אפיתליאליים מהמעי הדק ומבלוטות הלימפה. (A) תרחיפים חד-תאיים מתוך-אפיתל של המעי הדק הודגרו לראשונה עם נוגדנים המסומנים בביוטין לבחירת תאי שושלת (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 ו-anti-Ter119) ו-Fc-Block. לאחר מכן הכתימו בצבע בר-קיימא הניתן לתיקון, סטרפטווידין עם תווית פלואורוכרום, אנטי-CD45 לזיהוי תאים המטופויטיים, ואנטי-CD90 לזיהוי תאי ILC2. השער הראשון מראה תכונות פיזור צדדי (SSC)-A/פיזור קדמי (FSC)-A עם המורפולוגיה הקלאסית של תאי הלימפה. נבחרו אירועים חד-תאיים, אחריהם תאים חיים ולאחר מכן תאי CD45+. בתוך אוכלוסייה זו, התמקדנו בתאי פשתן CD90+; מקבוצה זו, תאי GFP+ זוהו כתאי IL-9+ ILC2. (ב,ג) ציטומטריית זרימה מייצגת ואסטרטגיית gating עבור (B) בלוטות לימפה מדיאסטינליות ו-(C) בלוטות לימפה מזנטריות לזיהוי תאי IL-9+ ILC2. צביעת בלוטות הלימפה לא כללה נוגדן נגד CD45, שכן כל האוכלוסייה הייתה צפויה להיות חיובית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: ניתוח ציטומטריית זרימה מייצגת ואסטרטגיית gating המשמשים לזיהוי תאי Th9 בבלוטות הלימפה המדיאסטינליות ובמעי הדק. תרחיפים חד-תאיים מבלוטות הלימפה המדיאסטינליות (A) הוכתמו בצבע כדאיות הניתן לקיבוע ותויגו באופן פלואורסצנטי נוגדנים נגד TCR-β ונגד CD4. השער הראשון מראה תכונות פיזור צדדי (SSC)-A/פיזור קדמי (FSC)-A עם המורפולוגיה הקלאסית של תאי הלימפה. נבחרו אירועים חד-תאיים, אחריהם תאים חיים ולאחר מכן תאים חיוביים כפולים TCR-β ו-CD4; מקבוצה זו, תאי GFP+ זוהו כתאי Th9. אסטרטגיית ציטומטריית זרימה דומה שימשה עבור (B) lamina propria ו-(C) תאים תוך-אפיתליאליים מהמעי הדק, פרט לכך שתאי CD45+ נבחרו לאחר התאים החיים, ואחריהם תאי TCR-β ו-CD4 חיוביים כפולים, מהם זוהו תאי GFP+ כתאי Th9. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 4: מספרים מוחלטים של תאי Th9 משתנים באופן משמעותי במהלך הזיהום. מספר מוחלט של תאי IL-9+ מתאים TCR-β ו-CD4 חיוביים פעמיים נקבע בימים 0, 4, 7 ו-10 לאחר ההדבקה בריאה, (B) בלוטות לימפה מדיאסטינליות ו-(C) בלוטות לימפה מזנטריות. הנתונים מייצגים את ממוצע ± SEM של עכבר אחד או שניים שנותחו בכל קבוצה, משלושה ניסויים בלתי תלויים, לכל נקודת זמן; מבחן T לא מזווג *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.001, ***P ≤ 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 5: מספרים מוחלטים של תאי IL-9+ ILC2 שונים לאורך כל הזיהום. מספרים מוחלטים של תאי IL-9+ ILC2 מאוכלוסיית +CD90 בימים 0, 4, 7 ו-10 לאחר ההדבקה נקבעו ב-(A) ריאה, (B) lamina propria, ו-(C) תאים תוך-אפיתליאליים מהמעי הדק. הנתונים מייצגים את ממוצע ± SEM של עכבר אחד או שניים שנותחו בכל קבוצה, משלושה ניסויים בלתי תלויים, לכל נקודת זמן; מבחן T לא מזווג *p ≤ 0.05. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 6: התדרים והמספרים האבסולוטיים של תאי IL-9+ ILC2 בבלוטות הלימפה עולים משמעותית במהלך ההדבקה. (A) תדירות ו-(C) מספרים מוחלטים של תאי IL-9+ ILC2 מבלוטות לימפה מדיאסטינליות. (B) תדירות ו-(D) מספרים מוחלטים של תאי IL-9+ ILC2 מבלוטות לימפה מזנטריות. הערכים נקבעו כתאי IL-9+ ILC2 באוכלוסיית +lin- CD90 בימים 0, 4, 7 ו-10 לאחר ההדבקה. הנתונים מייצגים את ממוצע ± SEM של עכבר אחד או שניים שנותחו לכל קבוצה, משלושה ניסויים בלתי תלויים, לכל נקודת זמן;מבחן T לא מזווג *p ≤ 0.05, ***p ≤ 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 7: ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי IL-9 המבטאים תאי ILC2 ממעי נגוע ב-N. brasiliensis. חלקות מייצגות של תאי ILC2 שבודדו מהמעי של עכברי IL-9-reporter ביום 7 לאחר ההדבקה. ביטוי IL-9 הוערך בתאי ILC2 שבודדו זה עתה ממדורי התוך-אפיתל או lamina propria של עכברי דיווח נגועים (IL-9 REP) לעומת פרוטוקול הצביעה התוך-תאי IL-9 שתואר קודם לכן (IL-9 AB, תוך שימוש בשיבוט נוגדניםIL-9 RM9A4, BioLegend). כדי לזהות IL-9 המבטא ILC2s, הודגרו תחילה תרחיפים של תאים בודדים עם נוגדנים המסומנים בביוטין לבחירת תאי שושלת (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 ו-anti-Ter119) ו-Fc-Block, ולאחר מכן צביעה בצבע גמיש, סטרפטווידין עם תווית פלואורוכרום, אנטי-CD45 ואנטי-CD90. החלקות מראות תאי ILC2 המבטאים IL-9 מגודרים על אוכלוסיית lin-CD45+CD90+ הנמצאת בתאים התוך-אפיתליאליים (A,B) ולמינה פרופריה (C,D), שזוהו באמצעות אות הכתב מתאים שבודדו לאחרונה (A,C) או בעקבות צביעה תוך-תאית של IL-9 (B,D). עכברי ביקורת הוזרקו עם PBS. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הבנה מלאה של אינטראקציות טפיל-מארח במעי ותגובות חיסוניות לזיהום הלמינת'ס דורשת זיהוי וניתוח של אוכלוסיות התאים השונות ומולקולות ההשפעה שהן המפתח להשראת עיצוב מחדש של רקמות וסילוק תולעים. זיהומי הלמינת'ס המועברים בקרקע מהווים בעיה גדולה במדינות מתפתחות ברחבי העולם. עם זאת, עד לאחרונה, פרוטוקול שאיפשר ניתוח של אוכלוסיות תאים נדירים הנמצאים במעי הדק, האיבר העיקרי המושפע מזיהום זה, לא היה זמין5. פרוטוקול זה מכסה שיטות שתוארו בעבר המאפשרות ניתוח ציטומטרי זרימה של תאי לימפה המבטאים IL-9 בריאה, בבלוטות הלימפה המדיאסטינליות והמזנטריות במהלך זיהום N. brasiliensis , עם יתרון נוסף של זיהוי אוכלוסייה זו לראשונה במעי הדק.

הצלחתו של פרוטוקול זה תלויה מאוד בזמני עיבוד הרקמות. זה הכרחי לעבד מקסימום של שש דגימות המעי הדק, לאדם, בבת אחת. אם רוצים לעבד איברים שונים, אנו ממליצים לעשות זאת במקביל על ידי אדם אחר. על ידי שימוש בעומס טפיל נמוך יחסית (200 זחלי L3), פרוטוקול זה מאפשר בידוד של תאי לימפה מהמעי הנגוע ב- N. brasiliensis, תוך שמירה על היכולת לבודד תאים אלה מאיברים אחרים. השימוש בעומסי טפילים גבוהים יותר מסכן את האיכות והכמות של התאים המבודדים מהמעי הדק (הנתונים אינם מוצגים); עם זאת, זה יכול לגרום לעלייה משמעותית של תאי לימפה המבטאים IL-9 באיברים אחרים4. בעת עיבוד המעי ובלוטות הלימפה המזנטריות, חיוני להסיר את רקמת השומן הדבוקה, שכן כישלון בכך גורם למוות מוגבר של תאים. הנתונים תומכים בתצפית כי מהלך הזיהום הטבעי משפיע לרעה על המספר האבסולוטי של תאי הלימפה שהתאוששו מהמעי הדק. במחקרים המתוארים כאן, התדרים של תאי IL-9+ ILC2 נשארים עקביים, בעוד מספרים מוחלטים מראים שונות גבוהה בכל ניסוי עצמאי. לפיכך, מסקנות הנובעות ממספרים מוחלטים עלולות להיות לא מדויקות ויש להימנע מהן. בנוסף, בהתחשב בתדירות הנמוכה של תאי T המבטאים IL-9 ברקמות, מומלץ לרכוש ולהכתים את מספר התאים הגבוה ביותר האפשרי.

מגבלה של ניתוח ILC2 זה היא השימוש בשילוב בדיד של סמנים כדי להגדיר אוכלוסייה זו. בהתאם לרקמת העניין ולשלב הזיהום, סמנים נוספים, כגון CD25, Klrg1 ו- ST2 בין היתר, יכולים לשמש לאפיון פנוטיפי מפורט יותר של תאי ILC222. אנו מכירים בכך שהפרוטוקול המוצג כאן מבוסס על זן העכברINFER reporter 4, ועשוי להוות יתרון לזיהוי תאים המבטאים IL-9. עם זאת, אנו מצפים כי התוצאות שנמצאו כאן ניתן להשיג באמצעות אסטרטגיות חלופיות, כולל שימוש בזנים אחרים של עכבר מדווח וצביעת IL-9 תוך תאית 6,7,8,9. חשוב לציין ששימוש בעכברים רגילים וביצוע צביעה תוך-תאית של IL-9 בתאים תוך-אפיתליאליים ולמינה פרופריה עלולים לגרום לאיבוד כל אות שניתן לזיהוי ולסכן את הנתונים המתקבלים (איור משלים 7). זה יכול להיות בגלל מניפולציה ארוכת טווח הנדרשת כדי להכתים תת-קבוצה שכבר קשה לבודד ולשמור על ex vivo. לכן, אנו ממליצים על שימוש בזני עכברים מדווחים כדי לקצר את זמני העיבוד ולהבטיח ניתוח אמין של ביטוי IL-9 in vivo. אנו גם מכירים בעובדה שתאי Th9 אינם תאי T היחידים המבטאים IL-923; עם זאת, במודל טפילי זה, לא היינו מצפים מתתי-קבוצות אחרות לבטא אותו. עם זאת, כדי לשלול את נוכחותן של תת-קבוצות אחרות המבטאות IL-9 בהקשר המתואר, אפיון מלא של ציטוקינים מסוג 2 יחד עם שימוש בסמני שעתוק אפשרי.

בעבר דווח על כימות תאי לימפה המבטאים IL-9 לפני היום החמישי שלאחר ההדבקה; עם זאת, התוצאה היא תדרי תאים נמוכים מאוד4. הפרוטוקול במחקר זה מכסה חלק גדול מהקינטיקה של זיהום N. brasiliensis עד תחילת פינוי הטפיל2. עם זאת, שמנו לב שחלק מאוכלוסיות התאים במחקר זה לא חזרו לרמות הבסיס במסגרת הזמן שנותחה, מה שמרמז על כך שהמחקר יכול להפיק תועלת מנקודות זמן ממושכות כדי לקבל פרספקטיבה מלאה על ההתנהגות של תאים אלה בשלב מתקדם יותר של זיהום in vivo. בכל מקרה, אנו מאמינים כי העבודה המוצגת כאן יכולה לשמש מדריך עזר לחוקרים המעוניינים לחקור תאי לימפה המבטאים IL-9 במודלים של זיהום טפילים, ולאפשר להם לבחור את השלב האידיאלי של זיהום לזיהוי סוגי תאים ספציפיים מרקמות מעניינות. בסך הכל, השיטות המתוארות כאן יהיו שימושיות כדי להעריך את הפנוטיפ והתפקוד של לימפוציטים מסוג T ותאי ILC2 המבטאים IL-9 במהלך מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של זיהום טפילים, מה שמרחיב את הידע שלנו על תאים אלה ועשוי לשפר את הבנתנו אותם במצבים פתולוגיים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לחוסה לואיס ראמוס-בלדראס על תמיכתו הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי המענק הבא ל- PLL מ- CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P ו-EO-M קיבלו מלגה מ-CONACYT (736162 ו-481437, בהתאמה). MCM-M קיבל מלגה מ- CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
  5. Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
  6. Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
  7. Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
  8. Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
  9. Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
  10. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  11. Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
  12. Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
  13. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
  14. old Spring Harbor Protocols. Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  15. Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
  16. Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
  17. Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
  18. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  19. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  20. Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
  21. Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
  22. Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 193 IL-9 Th9 ILC2 תאי לימפה IL-9 טפיל מעי דק N. brasiliensis
אסטרטגיה לחקר תאי לימפה מייצרי IL-9 במודל זיהום <em>Nippostrongylus brasiliensis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muñoz-Paleta, O.,… More

Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter