Summary
هنا ، يتم توفير بروتوكول محسن خطوة بخطوة للتثبيت ، والتلطيخ المناعي ، وتقسيم الأجنة للكشف عن الفيلوبوديا ذات الإشارات المتخصصة التي تسمى cytonemes في تطوير أنسجة الفئران.
Abstract
يعتمد نمط الأنسجة التنموية وتوازن الأنسجة بعد النمو على التسليم المتحكم فيه للإشارات الخلوية التي تسمى المورفوجينات. تعمل المورفوجينات بطريقة تعتمد على التركيز والوقت لتحديد برامج النسخ المتميزة التي توجه وتعزز مصير الخلية. إحدى الآليات التي يتم من خلالها ضمان عتبات الإشارات المورفوجينية المناسبة هي من خلال توصيل بروتينات الإشارات بواسطة فيلوبوديا متخصصة تسمى السيتونيم. السيتونيمات رقيقة جدا (قطرها ≤200 نانومتر) ويمكن أن تنمو إلى أطوال عدة مئات من الميكرون ، مما يجعل الحفاظ عليها لتحليل الصور الثابتة أمرا صعبا. تصف هذه الورقة طريقة محسنة للتعامل الدقيق مع أجنة الفئران من أجل التثبيت والتلطيخ المناعي والتقسيم السميك للسماح بتصور السيتونيمات باستخدام المجهر البؤري القياسي. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لتصور السيتونيمات التي تربط مقصورات الإشارات الخلوية المتميزة أثناء تطوير الأنبوب العصبي للماوس. يمكن أيضا تكييف هذه التقنية للكشف عن السيتونيمات عبر أنواع الأنسجة لتسهيل استجواب الإشارات التنموية بدقة غير مسبوقة.
Introduction
يتم تنسيق التطور الجنيني من خلال التنشيط المنسق لمسارات الإشارات المورفوجينية. المورفوجينات هي بروتينات صغيرة مفرزة يتم تصنيفها إلى القنفذ الصوتي (SHH) ، وتحويل عامل النمو β (TGF-β) / البروتين المورفوجيني العظمي (BMP) ، وموقع التكامل المرتبط بدون أجنحة (WNT) ، والخلايا الليفية وعامل نمو البشرة (FGF / EGF). يتم إنتاج المورفوجينات وإطلاقها من مراكز التنظيم الخلوي أثناء تطوير الأنسجة وإنشاء تدرجات إشارات عبر المجالات المنظمة للخلايا لإبلاغ تكوين الأنسجة1،2،3،4،5. تم العثور على تمثيل واحد للتدرجات المورفوجينية في الجهاز العصبي النامي ، حيث يتم نقش الجهاز العصبي المركزي المفترض من خلال تنشيط مسار المورفوجين. يتكون هذا النسيج ، الذي يشار إليه باسم الأنبوب العصبي ، من تدرجات متعارضة من SHH تفرزها الصفيحة البطنية والأرضية ، و WNTs / BMPs المفرزة من صفيحة السقف الظهرية ، لنمط مناطق السلف العصبية المتميزة6. يستخدم الأنبوب العصبي عادة للاستجواب في سلامة التدرج المورفوجيني في البحوث التنموية.
يعتمد تكوين التدرج المورفوجيني على التنظيم الصارم لتشتت الإشارة7. إحدى الآليات الخلوية التي يحدث بها ذلك هي من خلال تكوين فيلوبوديا طويلة الإشارات تسمى cytonemes التي تسهل التوصيل المباشر للمورفوجينات من الخلايا المنتجة للإشارة إلى مجموعات الخلايا المستهدفة المحددة. وقد لوحظ أن السيتونيمات تمتد مئات الميكرومترات لإيداع المورفوجينات على أغشية الخلايا المستقبلة للإشارة 8,9. يؤدي تعطيل نقل الموروجين بوساطة السيتونيم إلى شذوذ في النمو في كل من الذباب والفقاريات ، مما يسلط الضوء على أهميتها أثناء نمط الأنسجة10،11،12،13،14.
حتى الآن ، تم توثيق السيتونيمات في نماذج ذبابة الفاكهة والفرخ والزرد ، ولكن تصوير الهياكل في تطوير أجنة الثدييات لا يزال يمثل تحديا8،9،15. تتمثل إحدى العقبات التي تحول دون تصوير السيتونيمات بفعالية في أنسجة الثدييات المعقدة في الموقع في طبيعتها الرقيقة والهشة ، مما يجعلها عرضة للتلف بطرق التثبيت التقليدية8. لقد قمنا سابقا بتطوير وتحسين بروتوكولات لتثبيت المجهر الإلكتروني المعدل (MEM-fix) للحفاظ على السيتونيمات في الخلايا المستزرعة وتمكين دراستها باستخدام المجهر البؤري16,17.
سمح استخدام تقنية MEM-fix بتحديد بعض الجزيئات المشاركة في تكوين السيتونيم الناجم عن SHH ووظيفته11،16،17. ومع ذلك ، فإن تأكيد هذه النتائج في السياق ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية لنمط الأنبوب العصبي استلزم تطوير تقنيات جديدة لإصلاح وتصوير الأنسجة الجنينية للفئران. يتم توضيح بروتوكول لإصلاح أجنة الفئران بطريقة تحافظ على سلامة السيتونيم وتسمح بالتلطيخ المناعي والتقسيم اللاحق للأنسجة الجنينية للتحليل البؤري هنا. تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام بروتين فلورسنت أخضر مربوط بالغشاء (GFP) لتسمية امتدادات الغشاء من الخلايا المنتجة ل SHH في الأنبوب العصبي النامي. وسيعالج تنفيذ هذا البروتوكول الأسئلة التي لم تتم الإجابة عليها والمتعلقة بانتشار السيتونيمات وأهميتها في تطوير نظم الثدييات.
Protocol
يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية المعتمدة لرعاية الحيوانات للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) ومستشفى سانت جود لأبحاث الأطفال. تم إرجاع جميع السلالات خمسة أجيال إلى سلالة C57BL/6J.
1. عزل الجنين وتلطيخ جبل كامل
- تولد الإناث البالغة من العمر 6 أسابيع ومراقبة وجود قابس المهبل.
- القتل الرحيم للسد الحامل عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون 2 في غرفة CO2 تليها خلع عنق الرحم وفقا لإرشادات AVMA18. قم بعمل شق Y في التجويف البريتوني باستخدام مقص تشريح وملقط. استئصال الرحم الذي يحتوي على أجنة E9.5 وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية المعتمدة.
- تشريح الأجنة في وسط نمو كامل (وسط النسر المعدل من دولبيكو ، مع استكمال الأحماض الأمينية غير الأساسية ، Na-pyruvate ، L-glutamine ، و 10٪ مصل البقر الجنيني). استخدم الملقط لإزالة كيس الصفار والمشيمة والأغشية المحيطة.
ملاحظة: عند الحاجة، احفظ كل كيس صفار للتنميط الجيني للجنين. - شطف الأجنة المعزولة في محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) لإزالة أي أنسجة ودم أمنيوسية متبقية.
- إعداد المثبت. أضف بارافورمالدهيد (PFA) إلى HBSS للحصول على تركيز عمل نهائي بنسبة 4٪ PFA.
تحذير: PFA هو مادة كيميائية سامة ، لذلك يجب تجنب الاستنشاق أو التعرض المباشر للجلد. يتم إعداد الحل المثبت تحت غطاء الدخان مع معدات الحماية الشخصية المناسبة من القفازات ومعطف المختبر. - أضف 1 مل من المثبت على كل بئر من صفيحة 24 بئرا وضع كل جنين في بئر فردي. احتضن الأجنة في تثبيت لمدة 45 دقيقة مع إثارة لطيفة على الروك.
ملاحظة: حرج: يجب أن تتم جميع عمليات الغسيل والحضانة بإثارة لطيفة (بحد أقصى 20 دورة في الدقيقة) على الروك أو الاهتزاز الدائري ، لأن التعامل المفاجئ أو حركة الأجنة سيدمر السيتونيمات الثابتة. استخدم ماصة لإزالة جميع المحاليل برفق. - قم بإزالة المثبت واغسل الأجنة 3 × 30 دقيقة في محلول ملحي مخزنة مؤقتا بالفوسفات (PBS) مع Ca 2+ و Mg2+ مع إضافة 0.1٪ Triton.
- بعد الغسيل ، احتضن الأجنة في محلول مانع (PBS مع Ca 2+ و Mg2+ و 0.1٪ Triton و 5٪ مصل الماعز) مع إثارة لطيفة. كتلة 2 × 1 ساعة. بعد حضانة الحجب الثانية ، قم بإجراء شطف سريع واحد للأجنة باستخدام محلول حجب جديد.
- خلال خطوة الحجب الثانية ، قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الأساسي11. تمييع الأجسام المضادة إلى التركيز الأمثل في PBS مع Ca 2+ و Mg2+ و 0.1٪ Tween-20 و 5٪ مصل الماعز.
ملاحظة: لتحسين تصور غشاء GFP ، يمكن استخدام الدجاج المضاد GFP (1:250). - قم بإزالة محلول الحجب وإضافة 1 مل من محلول الأجسام المضادة الأساسي إلى كل بئر. تحضن عند 4 درجات مئوية مع دوران لطيف لمدة 3 أيام.
- بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية ، اغسل الأجنة 5 × 1 ساعة عند 20 دورة في الدقيقة على الروك في PBS مع Ca 2+ و Mg 2+ و 0.1٪ Tween-20 و 5٪ مصل الماعز.
- قم بتحضير محلول الأجسام المضادة الثانوي باستخدام الأجزاء الثانوية F(ab')2 عند تخفيف 1: 1000 في PBS مع Ca 2+ و Mg2+ و 0.1٪ Tween-20 و 5٪ مصل الماعز.
ملاحظة: استخدام شظايا F(ab')2 يعزز بشكل كبير اختراق الأجسام المضادة في العينة. - أضف 1 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوي إلى كل بئر. احتضن مع هزاز لطيف في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 3 أيام.
ملاحظة: هام: من هذه النقطة فصاعدا، قلل من تعرض الجنين للضوء المباشر. اختياري: لمنع نمو البكتيريا ، أضف 0.2٪ من أزيد الصوديوم إلى محلول الأجسام المضادة الثانوي. - قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الثانوي واغسل الأجنة 3 × 30 دقيقة في PBS باستخدام Ca 2+ و Mg 2+ و 0.1٪ Tween-20 و 5٪ مصل الماعز. إذا لم تقم بإجراء تلطيخ الأكتين باستخدام الفيلويدين أو أصباغ الأكتين الأخرى ، بعد الغسيل الأول ، أضف 4 ′ و 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) إلى PBS مع Ca 2 + و Mg2 + و 0.1٪ Tween-20 و 5٪ مصل الماعز واحتضنه لمدة 1 ساعة ، متبوعا بغسل 3 × 30 دقيقة كما هو موضح أعلاه.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الأجنة بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في PBS أو HBSS في الظلام حتى خطوة التضمين في اليوم التالي. ومع ذلك ، فمن المستحسن أن يتم تضمين الأجنة وتقسيمها على الفور.
2. تضمين الجنين ، والتقسيم ، والتركيب
- تحضير محلول الأغاروز منخفض درجة الانصهار (LMP) بنسبة 4٪ w/v المذاب في HBSS أو PBS مع Ca 2+ و Mg2+ إلى حجم نهائي من ~ 3 مل لكل جنين. أضف الوزن المناسب من أغاروز LMP إلى HBSS أو PBS مع Ca 2+ و Mg2+ وقم بالميكروويف حتى يذوب أغاروز LMP.
ملاحظة: بمجرد إذابة الأغاروز LMP ، قم بتخزين المحلول في حمام خرز أو حاضنة أو حمام مائي مضبوط على 55 درجة مئوية لمنع محلول الأغاروز LMP من التصلب. - استخدم صفيحة من 12 بئرا كقالب تضمين للأجنة. ضع الصفيحة المكونة من 12 بئرا في حمام الخرز الذي تبلغ درجة حرارته 55 درجة مئوية. أضف 2.5-3 مل من 4٪ من الأغاروز LMP إلى كل بئر يحمل جنينا.
ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن استخدام قوالب أخرى ، إلا أن أحجام الألواح المكونة من 12 بئرا هي الأمثل لإعداد كتلة الأغاروز في مراحل لاحقة للتقسيم. - باستخدام ملعقة مثقوبة ، انقل الأجنة إلى آبار فردية تحتوي على محلول أغاروز LMP بنسبة 4٪ (الشكل 1A).
- انقل الطبق المكون من 12 بئرا من حمام الخرز إلى سطح الطاولة. استخدم أطراف الماصة لتضمين الجنين وتوجيهه بلطف حتى يتمركز داخل المحلول. بمجرد توجيه الأجنة ، ضع اللوحة عند -20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للسماح بالتصلب السريع للكتلة.
حرج: تأكد من وضع الجنين في وسط الكتلة. من المرجح أن يتم إزاحة الأجنة التي تغرق في القاع أو قريبة جدا من حافة القالب من كتلة الأغاروز أثناء التقسيم.
- انقل الطبق المكون من 12 بئرا من حمام الخرز إلى سطح الطاولة. استخدم أطراف الماصة لتضمين الجنين وتوجيهه بلطف حتى يتمركز داخل المحلول. بمجرد توجيه الأجنة ، ضع اللوحة عند -20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للسماح بالتصلب السريع للكتلة.
- قم بإزالة كتلة الأغاروز بأكملها من البئر باستخدام مشرط وقطع كتلة مستطيلة حول الجنين تاركا ~ 0.3 سم من الكتلة على كل جانب. اتركي طولا إضافيا على طول الطرف الذيلي للجنين. عند تركيبه على الاهتزاز ، قم بتوجيه الجنين في وضع مستقيم في القسم العلوي من الكتلة (الشكل 1B).
- ضع شريطا من الشريط على حامل العينة من الاهتزاز وقم بلصق كتلة الأغاروز على الشريط ، موجها بحيث تولد الشفرة مقاطع محورية من الجنين في تسلسل أمامي (جمجمي) إلى خلفي.
- املأ غرفة الاهتزاز ب HBSS البارد لضمان غمر العينة بالكامل ، ثم أحط الغرفة بالثلج.
- اضبط سرعة الاهتزاز على 0.2 مم / ثانية والتردد بين 5 و 7 (50-70 هرتز) مع ضبط سمك القطع على 100 ميكرومتر. إجراء التقسيم المحوري التسلسلي للجنين.
ملاحظة: استخدم سرعة بطيئة للتقسيم. إذا زادت سرعة القطع عن 0.25 مم / ثانية ، فقد يؤدي التقسيم إلى تمزيق الجنين أو إزاحة الجنين من الكتلة.- أثناء سلسلة التقسيم، استخدم الملقط لنقل المقاطع الفردية برفق إلى طبق منفصل بحجم 60 مم مملوء ب HBSS. استخدم الملقط للاستيلاء على الكتلة ، وليس الأنسجة ، لتجنب تلف الأنسجة وتدمير السيتونيم.
ملاحظة: يجب أن تبقى أقسام الأنسجة داخل كتلة الأغاروز. إذا سقط النسيج من الكتلة إلى غرفة الاهتزاز ، فقم بنقله بلطف عن طريق رفع القسم للخارج. لا تمسك أو تقرص الأنسجة. حرج: أي طي لأقسام الأنسجة أو التعامل المفاجئ سيؤدي إلى تدمير السيتونيمات الثابتة في أقسام الأنسجة.
- أثناء سلسلة التقسيم، استخدم الملقط لنقل المقاطع الفردية برفق إلى طبق منفصل بحجم 60 مم مملوء ب HBSS. استخدم الملقط للاستيلاء على الكتلة ، وليس الأنسجة ، لتجنب تلف الأنسجة وتدمير السيتونيم.
- إذا لم تقم بإجراء تلطيخ F-actin، فانتقل إلى الخطوة 2.10.
- لإجراء تلطيخ F-actin ، قم بإزالة HBSS واحتضان الأقسام لمدة 40 دقيقة باستخدام محلول Actin-Red و DAPI المخفف في PBS مع Ca 2+ و Mg2+ و 0.1٪ Tween-20 و 5٪ مصل الماعز في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الأقسام 3 × 20 دقيقة في PBS مع Ca 2+ و Mg 2+ و 0.1٪ Tween-20.
- باستخدام قلم تحديد مسعور ، ارسم حاجزا مسعورا حول حواف شريحة مجهر مشحونة وأضف حجما صغيرا من HBSS لملء المنطقة.
- استخدم ملقط أو ملعقة مثقوبة لنقل المقاطع إلى الشريحة.
ملاحظة: يمكن نقل أي أجزاء من الأنسجة غير المغلفة بالأغاروز عبر ماصة نقل. - إزالة كتلة الأغاروز الزائدة باستخدام ملقط.
- بمجرد نقل جميع الأقسام إلى الشريحة ، قم بإزالة السائل الزائد عن طريق السحب وزاوية منشفة ماصة ، ثم أضف عدة قطرات من وسط التركيب إلى الشريحة. استخدم ما يكفي من وسائط التركيب لتغطية منطقة الغطاء بالكامل عند الشفاء. قم بتركيب الغطاء عن طريق وضعه برفق على الشريحة.
ملاحظة: تجنب الضغط أو إزعاج الغطاء حتى يشفى وسط التركيب.
3. التصوير
- قم بإجراء تصوير لأقسام الأنسجة على أي مجهر بؤري أو أعلى دقة11. تحليل ما لا يقل عن ثلاثة أجنة لكل نمط وراثي.
ملاحظة: تم الحصول على صور لأقسام الأنسجة باستخدام المجهر البؤري TCS SP8 STED 3x ، متبوعا ب LIGHTNING deconvolution.
Representative Results
كان استخدام قالب أكبر من صفيحة من 12 بئرا مع 2.5-3 مل من محلول الأغاروز لكل بئر مثاليا لتضمين وتعليق العديد من الأجنة خلال فترة زمنية قصيرة (الشكل 1 أ). تسمح المساحة الزائدة بالاتجاه الصحيح عند قطع كتلة الأغاروز للتقسيم. عند قطع كتلة الأغاروز ، من المهم الحفاظ على الأغاروز الزائد على طول الجزء السفلي من الكتلة حيث سيتم لصقه على الشريط الموجود على حامل الكائن. يجب أن يكون الجنين في النصف العلوي من الكتلة (الشكل 1B). ومع ذلك ، يجب ألا يكون القسم السفلي كبيرا جدا لأن الكتلة الزائدة تزيد من فرص تغيير زاوية القطع حيث تدفع الشفرة إلى الكتلة أثناء التقسيم. يتم عرض أمثلة على الأقسام الموجهة بشكل صحيح (الشكل 1C ، D).
أثناء تطوير هذا البروتوكول ، تمت مقارنة تقسيم الاهتزاز بتقسيم cryostat. نادرا ما يتم الحفاظ على الامتداد الخلوي للأنسجة (الشكل 2 cryostat والشكل 3A ، B vibratome). سمحت أقسام Cryostat بالكشف عن بعض شظايا الغشاء الإيجابية GFP بين خلايا notochord والأنبوب العصبي (الشكل 2A رأس السهم) وبين خلايا الأنبوب العصبي المجاورة (الشكل 2B ، B' رؤوس السهم). ومع ذلك ، فإن تلطيخ F-actin للامتدادات الخلوية في الخلايا الوسيطة شديدة الخيطية المحيطة بالأنبوب العصبي قد ضعف في أقسام cryostat (الشكل 2C ، C ' السهم ، مقابل الشكل 3C ، D). تشير نتائج cryostat هذه إلى أن بعض آثار الامتدادات الخلوية المكسورة فقط هي التي تتبع هذه الطريقة. وبالتالي ، يفضل تقسيم الاهتزاز للحفاظ على هذه الامتدادات الحساسة بكفاءة للتحليل اللاحق.
يعد الحد الأدنى من تعطيل أقسام الجنين والأنسجة الفردية بأكملها أمرا ضروريا للتصوير عالي الجودة للامتدادات الخلوية. ستكون أقسام الأنسجة التي خضعت لأي طي أو التواء واضحة من خلال عدم وجود notochord أو فصل كبير (>30 ميكرومتر) بين notochord ولوحة الأرضية البطنية للأنبوب العصبي (الشكل 3B). وعادة ما يكون هذا مصحوبا بفقدان الخلايا الوسيطة التي تحيط عادة بالأنبوب العصبي (الشكل 3A ، السهم). ستؤدي الأقسام التالفة أيضا إلى فقدان امتدادات الأغشية الخلوية المرئية التي تهاجر بين الخلايا الظهارية (الشكل 3B مقارنة بالشكل 3A ، رؤوس الأسهم). حتى التشوهات الطفيفة للأقسام قد تتسبب في تفتيت الامتدادات القائمة على الأكتين وتشكيل فجوات كبيرة بين الخلايا (الشكل 3D ، رؤوس الأسهم ، مقارنة بالشكل 3C المحفوظ جيدا) ، مما يؤكد الحاجة إلى معالجة دقيقة في جميع الخطوات.
الشكل 1: مثال على E9.5 Shh-Cre؛ Rosa26 mTmG ملطخة ، مضمنة ، وجنين مجزأ. (أ) جنين واحد في صفيحة من 12 بئرا ، مضمن في 4٪ من أغاروز LMP. (ب) مثال على جنين موجه بشكل صحيح داخل كتلة الأغاروز مقطوع إلى الحجم لتركيب الاهتزاز. كتلة الأغاروز الزائدة موجودة على طول القاع. (ج) صورة حقل ساطع لمقطع جنين بسمك 100 ميكرومتر مضمن في أغاروز LMP. (د) تصوير التألق المناعي لمقطع ما بعد إزالة الأغاروس. يمثل mGFP المضاد ل GFP (الأخضر) الخلايا المعبرة عن Shh في الأنسجة ، مع سلالات الخلايا الأخرى التي تعبر عن الطماطم الغشائية (الحمراء) ، DAPI باللون الأزرق. الأنبوب العصبي (قوس) و notochord إيجابي mGFP (السهم) مرئية بوضوح. أشرطة المقياس = 1 سم (A) و 5 مم (B) و 100 ميكرومتر (C ، D). الاختصارات: LMP = نقطة انصهار منخفضة; mGFP = بروتين الفلورسنت الأخضر الغشائي. Shh = القنفذ الصوتي; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مثال على صفيحة أرضية الأنبوب العصبي المجزأة بالتبريد و notochord مع امتدادات غشاء مجزأة. (A) 20 ميكرومتر سميكة E9.5 Shh-Cre; قسم Rosa26 mTmG 19,20,21 ملطخ ل GFP (أخضر) و F-actin (أحمر) و DAPI (أزرق). تظهر بونكتا mGFP بين النوتوتشورد والصفيحة الأرضية (رأس السهم) و (B,B') المهاجرة بين الخلايا المجاورة للأنبوب العصبي. (C,C') فشل تلطيخ F-actin في اكتشاف أي سيتونيمات واضحة على الخلايا الوسيطة المحيطة بالأنبوب العصبي (السهم). أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: mGFP = بروتين الفلورسنت الأخضر الغشائي. Shh = القنفذ الصوتي; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: أمثلة على أقسام الأنسجة الاهتزازية المثلى ودون المثلى وتلطيخ صفيحة أرضية الأنبوب العصبي ، و notochord ، والخلايا المحيطة بها. أمثلة على الأقسام التي يتم التعامل معها بدقة (A ، C) ، مقارنة ب (B) قسم الأنسجة المطوية و (D) قسم التعامل السيئ من Shh-Cre ؛ Rosa26 mTmG وجنين ShhGFP / + 19,20,21. تسمح الأقسام التي يتم التعامل معها على النحو الأمثل بالكشف عن السيتونيمات بين الخلايا الظهارية العصبية ذات الصفيحة الأرضية الموضعية المجاورة (A ، رؤوس الأسهم). يجب أن يكون الأنبوب العصبي المجاور notochord (A ، mGFP-expressing) والخلايا الوسيطة (A ، السهم) مرئيا. (ج، د) يجب أن يكون للأقسام الملطخة بالأكتين F-actin و DAPI تباعد ثابت بين الخلايا الوسيطة والسيتونيمات (الأسهم) القائمة على F-actin المحيطة بالأنبوب العصبي و notochord (C). أي طي بسيط أو تعطيل للأقسام يمكن أن يسبب فجوات وشظايا F-actin مكسورة (D ، رؤوس الأسهم). أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: mGFP = بروتين الفلورسنت الأخضر الغشائي. Shh = القنفذ الصوتي; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
تم تطوير هذا البروتوكول للحفاظ على السيتونيمات الحساسة في أقسام الأنسجة الجنينية للفحص المجهري الفلوري عالي الدقة. حتى الآن ، اعتمد تصور السيتونيمات في الأنسجة عبر الكائنات الحية النموذجية المختلفة إلى حد كبير على التعبير خارج الرحم عن البروتينات ذات العلامات الفلورية باستخدام تصوير الأنسجة الحية. لسوء الحظ ، نادرا ما يؤدي استخدام التصوير الحي الموسوم بالفلورسنت إلى تحليل البروتينات المعبر عنها داخليا ، ويمكن أن يؤدي إلى قيود زمنية ، ويتطلب مراحل تصوير ومجاهر متخصصة. تحافظ طريقة التلطيخ والتقسيم الموصوفة هنا على السيتونيمات وغيرها من الامتدادات الخلوية للسماح بالكيمياء النسيجية المناعية للكشف النهائي عن البروتينات المعبر عنها داخليا. ستسهل هذه التقنية رؤى جديدة حول كيفية نقل المورفوجينات عبر الأنسجة المختلفة في الجسم الحي وتوسع نطاق أنظمة النماذج حيث يمكن دراسة السيتونيم.
يستخدم هذا البروتوكول تلطيخا كاملا وتقسيما سميكا للاهتزاز ، مما يتجنب استخدام محلول التوازن مثل الجلسرين أو المحاليل المبردة مثل السكروز. ويهدف إلى تقليل التعامل مع الأنسجة المجزأة للسماح بالحفاظ على أقصى قدر من الامتدادات الخلوية. أدى تقليل التعامل مع الأنسجة بعد التقسيم إلى توفير نتائج أفضل باستمرار في الحفاظ على السيتونيم بشكل عام. وبالتالي ، فإن تقسيم الجنين هو أحد الخطوات النهائية قبل التصوير.
MEM-fix، وهي تقنية تثبيت تم تطويرها للحفاظ على السيتونيمات من الخلايا المستزرعة، يتكون من مزيج من الجلوتارالدهيد وPFA الذي يسمح بتحسين الحفاظ على بنية الخلايا الفطرية ثلاثية الأبعاد مقارنة بأبعادها الحية16,17. لسوء الحظ ، لم يكن MEM-fix مفيدا لتثبيت الجنين لأن glutaraldehyde يمكن أن يتوهج تلقائيا ويحد بشدة من اختراق الأجسام المضادة وربط epitope في الخلايا بسبب نشاط الربط المتبادل عالي البروتين22,23. وهكذا ، تم تحسين بروتوكولات التقسيم بعد ظروف تثبيت PFA للسماح بالحفاظ على الامتدادات الخلوية في الأنسجة الجنينية. على الرغم من أن PFA يمكن أن يحافظ على امتدادات تشبه السيتونيم في الأنسجة الجنينية ، إلا أنه يجب إجراء تحليل الصور بحذر. يمكن أن يسبب PFA جفافا جزئيا للخلايا والأنسجة الفردية ، مما يؤدي إلى تقليل طفيف في الحجم وتشكيل مساحات صغيرة خارج الخلية داخل الأنسجة الثابتة.
يتجنب هذا البروتوكول الخطوات الإضافية لإعادة تشبع السكروز للحماية من التبريد وإزالة الأنسجة لأن محاليل السكروز أو الجلسرين يمكن أن تسبب تشبعا طفيفا للأنسجة24. يمكن أن يؤدي التورم الطفيف الناتج إلى تدمير الامتدادات الخلوية الثابتة والسيتونيمات المهاجرة بين الخلايا وعبر الأنسجة. كان هذا واضحا عند مقارنة الاهتزاز السميك المقسم بأقسام cryostat. على الرغم من أن زيادة سمك الأنسجة حسنت من الحفاظ على السيتونيمات السليمة ، إلا أن أقسام cryostat المشبعة بالسكروز كانت باستمرار أقل في حدوث السيتونيمات التي يمكن اكتشافها.
كشف تحسين هذا البروتوكول أن المقاطع التي يبلغ سمكها 100 ميكرومتر كانت الأفضل لضمان الحفاظ على السيتونيمات السليمة. عادة ما تستخدم المقاطع الأرق للتصوير لأن معظم المجاهر البؤرية قادرة فقط على التصوير بدقة كافية لتصور الامتدادات الخلوية على عمق ~ 20-40 ميكرومتر دون مسح25. ومع ذلك ، فإن القوى الميكانيكية والتشويه المطبق على الخلايا الجنينية من الشفرة أثناء قطع الأقسام الرقيقة يدمر السيتونيم. تسمح الأقسام الأكثر سمكا بمساحة أكبر من العمق داخل القسم مع الحفاظ على الامتدادات السليمة داخل الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام أقسام أكثر سمكا يسمح بسهولة التعامل معها لمنع الطي المفرط أو التواء أقسام الأنسجة.
تم تحسين هذا البروتوكول لتحقيق أقصى قدر من الحفاظ على السيتونيمات في أنسجة أجنة الفئران E8-10.5. الحد الأدنى من التلاعب بالأنسجة بعد التقسيم وفر باستمرار تحسين الحفظ العام للسيتونيم. من المحتمل أن تكون هناك حاجة إلى مزيد من التحسين لتكييف التقنية مع مراحل النمو اللاحقة وأقسام الأنسجة البالغة بسبب زيادة الحجم وتعقيد الأنسجة. سيتطلب ذلك تقسيما متبوعا بتلطيخ التألق المناعي. قد تتطلب هذه الأنسجة خطوات إزالة إضافية وتكييف التعامل مع الأنسجة أثناء التقسيم للحفاظ على الامتدادات الشبيهة بالسيتونيم. وسيلزم النظر في هذه الخطوات الإضافية ومعالجتها من أجل التطبيقات المستقبلية لهذا البروتوكول.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للإعلان.
Acknowledgments
تم الحصول على الصور باستخدام المجاهر التي يحتفظ بها مركز التصوير الخلوي والجزيئي في مستشفى سانت جود لأبحاث الأطفال. تم الحصول على سلالات الماوس من JAX. تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R35GM122546 (SKO) ومن قبل ALSAC من مستشفى سانت جود لأبحاث الأطفال.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated | Thermo Scientific | 150628 (Fisher Scientific 12-565-321) | |
| 24-Well Plate, Round Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 60 mm dish | Corning, Falcon | 353004 (Fisher Scientific 08772F) | |
| Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes) | Kimberly-Clark KIMTECH | 34155 (Fisher Scientific 06666A) | |
| Actin Red 555 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37112 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immunoresearch Lab Inc | 703-546-155 | 1:1,000 working concentration |
| Bead Bath 6L 230V | Lab Armor | Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706) | set to 55 °C |
| chicken anti-GFP | Aves Labs | SKU GFP-1020 | 1:250 working concentration |
| CO2 chamber | plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | model: Leica TCS SP8 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dissecting scissors (Vannas Scissors) | World Precision Instruments | 14003 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11960044 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 µL | Eppendorf | 3123000012 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 µL | Eppendorf | 3123000055 | |
| Feather Disposable Scalpel #10 | Fisher Scientific | Catalog No.NC9999403 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, United States | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 16000044 | |
| Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fisherbrand Labeling Tape | Fisher Scientific | 15-954 | |
| Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade | Polysciences | 18814-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14025 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen | Vector laboratories | H-4000 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING | Leica Microsystems | Microscope software | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25030081 | |
| Low Melting Point Agarose- UltraPure | Invitrogen | 16520 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11140050 | |
| Moria MC 17 BIS Perforated Spoon | Fine Science Tools | 1037018 | |
| Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | P36961 | |
| Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+) | The Jackson Laboratory | Strain #:008466 | |
| Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre) | The Jackson Laboratory | Strain #:005622 | |
| Mouse: C57BL/6J (B6) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG) | The Jackson Laboratory | Strain #:007576 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079) | |
| PBS + Ca2+ + Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14040133 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 µL | Denville Scientific | P1096-FR | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 µL | Denville Scientific | P1126 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 µL | Denville Scientific | P1121 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 µL | Denville Scientific | P1122 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11360070 | |
| Super Glue | Gorilla | ||
| SuperFrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91015 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91050 | |
| Transfer pipette, polyethylene | Millipore Sigma | Z135003 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher Scientific | 09-047-113Q | set to 20 RPM |
| Vibratome | Leica Biosytems | VT1000 S |
References
- Crick, F.
- Zeng, X., et al. A freely diffusible form of Sonic hedgehog mediates long-range signalling. Nature. 411 (6838), 716-720 (2001).
- Yu, S. R., et al. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461 (7263), 533-536 (2009).
- Zhou, S., et al. Free extracellular diffusion creates the Dpp morphogen gradient of the Drosophila wing disc. Current Biology. 22 (8), 668-675 (2012).
- Ribes, V., Briscoe, J. Establishing and interpreting graded Sonic Hedgehog signaling during vertebrate neural tube patterning: the role of negative feedback. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002014 (2009).
- Le Dréau, G., Martí, E. Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals. Developmental Neurobiology. 72 (12), 1471-1481 (2012).
- Kornberg, T. B., Guha, A. Understanding morphogen gradients: a problem of dispersion and containment. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (4), 264-271 (2007).
- Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs. Cell. 97 (5), 599-607 (1999).
- Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning. Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).
- Bischoff, M., et al. Cytonemes are required for the establishment of a normal Hedgehog morphogen gradient in Drosophila epithelia. Nature Cell Biology. 15 (11), 1269-1281 (2013).
- Hall, E. T., et al. Cytoneme delivery of sonic hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a dispatched-BOC/CDON co-receptor complex. eLife. 10, 61432 (2021).
- Huang, H., Kornberg, T. B. Cells must express components of the planar cell polarity system and extracellular matrix to support cytonemes. eLife. 5, 18979 (2016).
- Brunt, L., et al. Vangl2 promotes the formation of long cytonemes to enable distant Wnt/β-catenin signaling. Nature Communications. 12 (1), 2058 (2021).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Mattes, B., et al. Wnt/PCP controls spreading of Wnt/β-catenin signals by cytonemes in vertebrates. eLife. 7, 36953 (2018).
- Bodeen, W. J., Marada, S., Truong, A., Ogden, S. K. A fixation method to preserve cultured cell cytonemes facilitates mechanistic interrogation of morphogen transport. Development. 144 (19), 3612-3624 (2017).
- Hall, E. T., Ogden, S. K. Preserve cultured cell cytonemes through a modified electron microscopy fixation. Bio-protocol. 8 (13), (2018).
- American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals. American Veterinary Medical Association. , (2020).
- Harfe, B. D., et al. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-528 (2004).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Bacallao, R., Sohrab, S., Phillips, C. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 368-380 (2006).
- Tagliaferro, P., Tandler, C. J., Ramos, A. J., Pecci Saavedra, J., Brusco, A. Immunofluorescence and glutaraldehyde fixation. A new procedure based on the Schiff-quenching method. Journal of Neuroscience Methods. 77 (2), 191-197 (1997).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep tissue fluorescent imaging in scattering specimens using confocal microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17 (4), 614-617 (2011).
