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Developmental Biology

साइटोनेम विश्लेषण के लिए भ्रूण माउस ऊतक का निर्धारण

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64100
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Department of Cell and Molecular Biology, St. Jude Children’s Research Hospital, 2St. Jude Graduate School of Biomedical Sciences

Summary

यहां, माउस ऊतकों के विकास में साइटोनेम्स नामक विशेष सिग्नलिंग फिलोपोडिया का पता लगाने के लिए भ्रूण के निर्धारण, इम्यूनोस्टेनिंग और सेक्शनिंग के लिए एक अनुकूलित चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है।

Abstract

विकासात्मक ऊतक पैटर्निंग और पोस्टडेवलपमेंटल ऊतक होमियोस्टेसिस मॉर्फोजेन नामक सेलुलर संकेतों के नियंत्रित वितरण पर निर्भर करते हैं। मॉर्फोजेन अलग-अलग ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रमों को निर्दिष्ट करने के लिए एक एकाग्रता- और समय-निर्भर तरीके से कार्य करते हैं जो सेल भाग्य को निर्देश और सुदृढ़ करते हैं। एक तंत्र जिसके द्वारा उपयुक्त मॉर्फोजेन सिग्नलिंग थ्रेसहोल्ड सुनिश्चित किया जाता है, साइटोनेम्स नामक विशेष फिलोपोडिया द्वारा सिग्नलिंग प्रोटीन के वितरण के माध्यम से होता है। साइटोनेम बहुत पतले होते हैं (व्यास में ≤200 एनएम) और कई सौ माइक्रोन की लंबाई तक बढ़ सकते हैं, जो निश्चित छवि विश्लेषण के लिए उनके संरक्षण को चुनौतीपूर्ण बनाता है। यह पेपर मानक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके साइटोनेम्स के दृश्य की अनुमति देने के लिए निर्धारण, इम्यूनोस्टेनिंग और मोटी सेक्शनिंग के लिए माउस भ्रूण के नाजुक हैंडलिंग के लिए एक परिष्कृत विधि का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग माउस तंत्रिका ट्यूब विकास के दौरान अलग-अलग सेलुलर सिग्नलिंग डिब्बों को जोड़ने वाले साइटोनेम्स की कल्पना करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। तकनीक को अभूतपूर्व संकल्प पर विकासात्मक सिग्नलिंग की पूछताछ की सुविधा के लिए ऊतक प्रकारों में साइटोनेम का पता लगाने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

भ्रूण के विकास को मॉर्फोजेन सिग्नलिंग मार्गों के समन्वित सक्रियण के माध्यम से ऑर्केस्ट्रेटेड किया जाता है। मॉर्फोजेन छोटे, स्रावित प्रोटीन होते हैं जिन्हें सोनिक हेजहोग (एसएचएच) में वर्गीकृत किया जाता है, जो विकास कारक β (टीजीएफ -β) / हड्डी मॉर्फोजेनिक प्रोटीन (बीएमपी), विंगलेस से संबंधित एकीकरण साइट (डब्ल्यूएनटी), और फाइब्रोब्लास्ट और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (एफजीएफ / मॉर्फोजेन का उत्पादन और ऊतक विकास के दौरान सेलुलर आयोजन केंद्रों से जारी किया जाता है और ऊतक मॉर्फोजेनेसिस 1,2,3,4,5 को सूचित करने के लिए कोशिकाओं के आयोजन क्षेत्रों में सिग्नलिंग ग्रेडिएंट स्थापित किया जाता है। मॉर्फोजेन ग्रेडिएंट्स का एक प्रतिनिधित्व विकासशील तंत्रिका तंत्र में पाया जाता है, जहां अनुमानित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को मॉर्फोजेन मार्ग सक्रियण के माध्यम से पैटर्न किया जाता है। यह ऊतक, जिसे तंत्रिका ट्यूब के रूप में जाना जाता है, में उदर-सबसे नोटोकॉर्ड और फर्श प्लेट द्वारा स्रावित एसएचएच के विरोधी ढाल शामिलहैं, और पृष्ठीय छतप्लेट से स्रावित डब्ल्यूएनटी / तंत्रिका ट्यूब का उपयोग आमतौर पर विकासात्मक अनुसंधान में मॉर्फोजेन ढाल अखंडता से पूछताछ करने के लिए किया जाता है।

मॉर्फोजेन ढाल गठन सिग्नल फैलाव7 के तंग विनियमन पर निर्भर करता है। एक सेलुलर तंत्र जिसके द्वारा ऐसा होता है, लंबे सिग्नलिंग फिलोपोडिया के गठन के माध्यम से होता है जिसे साइटोनेम्स कहा जाता है जो सिग्नल-उत्पादक कोशिकाओं से विशिष्ट लक्ष्य सेल आबादी तक मॉर्फोजेन के प्रत्यक्ष वितरण की सुविधा प्रदान करता है। साइटोनेम्स को सिग्नल प्राप्त करने वाले सेल झिल्ली 8,9 पर मॉर्फोजेन जमा करने के लिए सैकड़ों माइक्रोमीटर का विस्तार करनेके लिए देखा गया है। साइटोनेम-मध्यस्थता वाले मॉर्फोजेन परिवहन के विघटन से मक्खियों और कशेरुकियों दोनों में विकासात्मक विसंगतियां होती हैं, जो ऊतक पैटर्निंग10,11,12,13,14 के दौरान उनके महत्व को उजागर करती हैं।

आज तक, साइटोनेम्स को ड्रोसोफिला, चिक और ज़ेब्राफिश मॉडल में प्रलेखित किया गया है, लेकिन स्तनधारी भ्रूण के विकास में संरचनाओं की इमेजिंग 8,9,15 को चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। सीटू में जटिल स्तनधारी ऊतकों में साइटोनेम्स को प्रभावी ढंग से इमेजिंग करने के लिए एक बाधा उनकी पतली और नाजुक प्रकृति है, जो उन्हें पारंपरिक निर्धारण विधियों द्वारा नुकसान के लिए अतिसंवेदनशील बनाती है8. हमने पहले सुसंस्कृत कोशिकाओं में साइटोनेम्स को संरक्षित करने और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी16,17 का उपयोग करके उनके अध्ययन को सक्षम करने के लिए संशोधित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी फिक्सेटिव (एमईएम-फिक्स) के लिए प्रोटोकॉल विकसित और अनुकूलित किया था।

एमईएम-फिक्स तकनीक के उपयोग ने एसएचएच-प्रेरित साइटोनीम गठन और फ़ंक्शन 11,16,17 में शामिल कुछ अणुओं की पहचान की अनुमति दी है। हालांकि, तंत्रिका ट्यूब पैटर्निंग के शारीरिक रूप से प्रासंगिक संदर्भ में इन निष्कर्षों की पुष्टि ने माउस भ्रूण के ऊतकों को ठीक करने और छवि बनाने के लिए उपन्यास तकनीकों के विकास की आवश्यकता की। माउस भ्रूण को इस तरह से ठीक करने के लिए एक प्रोटोकॉल जो साइटोनेम अखंडता को बनाए रखता है और कन्फोकल विश्लेषण के लिए भ्रूण के ऊतकों के इम्यूनोस्टेनिंग और बाद के सेक्शनिंग की अनुमति देता है, यहां उल्लिखित है। यह प्रोटोकॉल विकासशील तंत्रिका ट्यूब में एसएचएच-उत्पादक कोशिकाओं से झिल्ली एक्सटेंशन को लेबल करने के लिए झिल्ली-टेथर्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) का उपयोग करके विकसित किया गया था। इस प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन से स्तनधारी प्रणालियों के विकास में साइटोनेम्स के प्रसार और महत्व से संबंधित अनुत्तरित प्रश्नों को संबोधित किया जाएगा।

Protocol

यह प्रोटोकॉल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) और सेंट जूड चिल्ड्रन रिसर्च हॉस्पिटल के अनुमोदित पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करता है। सभी उपभेदों को सी 57 बीएल / 6 जे तनाव के लिए पांच पीढ़ियों को पीछे छोड़ दिया गया था।

1. भ्रूण अलगाव और पूरे माउंट धुंधला

  1. 6 सप्ताह की मादाओं को नस्ल दें और योनि प्लग की उपस्थिति के लिए निगरानी करें।
  2. एवीएमएदिशानिर्देशों 18 के अनुसार गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ 2 कक्ष में सीओ2 साँस लेना द्वारा गर्भवती बांध को इच्छामृत्यु दें। विदारक कैंची और संदंश का उपयोग कर पेरिटोनियल गुहा के लिए एक वाई चीरा बनाओ। अनुमोदित संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार ई 9.5 भ्रूण युक्त गर्भाशय का उत्पाद शुल्क।
  3. पूर्ण विकास माध्यम में भ्रूण को विच्छेदित करें (डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम, गैर-आवश्यक अमीनो-एसिड, ना-पाइरूवेट, एल-ग्लूटामाइन और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक)। जर्दी थैली, नाल, और आसपास झिल्ली को हटाने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
    नोट: जब आवश्यक हो, भ्रूण जीनोटाइपिंग के लिए प्रत्येक जर्दी थैली को बचाने के लिए।
  4. किसी भी अवशिष्ट एमनियोटिक ऊतक और रक्त को हटाने के लिए हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) में पृथक भ्रूण कुल्ला।
  5. फिक्सेटिव तैयार करें। 4% पीएफए की अंतिम कामकाजी एकाग्रता के लिए एचबीएसएस में पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) जोड़ें।
    सावधानी: पीएफए एक जहरीला रसायन है, इसलिए साँस लेना या प्रत्यक्ष त्वचा के संपर्क से बचा जाना चाहिए। फिक्सेटिव समाधान की तैयारी दस्ताने के उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और एक प्रयोगशाला कोट के साथ एक धूआं हुड के तहत की जाती है।
  6. एक 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में फिक्सेटिव के 1 मिलीलीटर जोड़ें और प्रत्येक भ्रूण को एक व्यक्ति को अच्छी तरह से रखें। एक घुमाव पर कोमल आंदोलन के साथ 45 मिनट के लिए फिक्सेटिव में भ्रूण सेते हैं।
    नोट: महत्वपूर्ण: सभी वॉश और ऊष्मायन एक घुमाव या परिपत्र शेकर पर कोमल आंदोलन (अधिकतम 20 आरपीएम) के साथ किया जाना चाहिए, क्योंकि भ्रूण की अचानक हैंडलिंग या आंदोलन निश्चित साइटोनेम को नष्ट कर देगा। धीरे सभी समाधानों को हटाने के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें।
  7. फिक्सेटिव निकालें और जोड़ा 0.1% ट्राइटन के साथ सीए 2 +और मिलीग्राम 2 + के साथ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में भ्रूण 3 x 30 मिनट धो लें।
  8. धोने के बाद, कोमल आंदोलन के साथ अवरुद्ध समाधान (सीए2 + और मिलीग्राम 2+, 0.1% ट्राइटन और 5% बकरी सीरम के साथ पीबीएस) में भ्रूण सेते हैं। ब्लॉक 2 x 1 घंटे। दूसरे अवरुद्ध इनक्यूबेशन के बाद, ताजा अवरुद्ध समाधान का उपयोग करके भ्रूण का एक त्वरित कुल्ला करें।
  9. दूसरे अवरुद्ध चरण के दौरान, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान11 तैयार करें। सीए2 + और एमजी 2 + , 0.1% ट्वीन -20, और 5% बकरी सीरम के साथ पीबीएस में अनुकूलित एकाग्रता के लिए एंटीबॉडी को पतला करें।
    नोट: झिल्ली जीएफपी के बढ़ाया दृश्य के लिए, चिकन विरोधी जीएफपी (1: 250) का उपयोग किया जा सकता है।
  10. अवरुद्ध समाधान निकालें और प्रत्येक कुएं में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 1 एमएल जोड़ें। 3 दिनों के लिए कोमल रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  11. प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद, सीए 2 + और एमजी 2+, 0.1% ट्वीन -20 और 5% बकरी सीरम के साथ पीबीएस में घुमाव पर 20 आरपीएम पर भ्रूण 5 x 1 घंटे धो लें।
  12. सीए 2+ और एमजी 2+, 0.1% ट्वीन -20 और 5% बकरी सीरम के साथ पीबीएस में 1: 1,000 कमजोर पड़ने पर एफ (एबी ') 2 टुकड़ा सेकेंडरी का उपयोग करके माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
    नोट: एफ (एबी') 2 टुकड़ों का उपयोग नमूने में एंटीबॉडी प्रवेश को बहुत बढ़ाता है।
  13. प्रत्येक कुएं में माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 3 दिनों के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल कमाल के साथ सेते हैं।
    नोट: महत्वपूर्ण: इस बिंदु से, प्रत्यक्ष प्रकाश के लिए भ्रूण के संपर्क को कम करें। वैकल्पिक: बैक्टीरिया के विकास को रोकने के लिए, माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में 0.2% सोडियम एजाइड जोड़ें।
  14. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और सीए 2 + और मिलीग्राम2 +, 0.1% ट्वीन -20, और 5% बकरी सीरम के साथ पीबीएस में भ्रूण 3 x 30 मिनट धो लें। यदि पहले धोने के बाद, फालोइडिन या अन्य एक्टिन रंगों के साथ एक्टिन धुंधला नहीं कर रहे हैं, तो सीए 2 +और एमजी 2 +, 0.1% ट्वीन -20, और 5% बकरी सीरम के साथ पीबीएस में 4', 6-डायमिडिनो-2-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) जोड़ें और 1 घंटे के लिए सेते हैं, इसके बाद ऊपर वर्णित 3 एक्स 30 मिनट धोते हैं।
    नोट: इस बिंदु पर, भ्रूण को अगले दिन एम्बेडिंग चरण तक अंधेरे में पीबीएस या एचबीएसएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संग्रहीत किया जा सकता है। हालांकि, यह अनुशंसा की जाती है कि भ्रूण को तुरंत एम्बेडेड और खंडित किया जाए।

2. भ्रूण एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और बढ़ते

  1. वी कम पिघलने बिंदु (एलएमपी) एगरोज समाधान सीए 2 +और मिलीग्राम 2 + के साथ एचबीएसएस या पीबीएस में भंग भ्रूण ~ 3 एमएल की अंतिम मात्रा के लिए तैयार करें। सीए 2 +और एमजी 2 + के साथ एचबीएसएस या पीबीएस में एलएमपी एगरोज़ का उचित वजन जोड़ें और एलएमपी एगरोज़ भंग होने तक माइक्रोवेव करें।
    नोट: एक बार एलएमपी एगरोज़ भंग हो जाने के बाद, एलएमपी एगरोज़ समाधान को जमने से रोकने के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर सेट मनका स्नान, इनक्यूबेटर, या पानी के स्नान में समाधान स्टोर करें।
  2. भ्रूण के लिए एम्बेडिंग मोल्ड के रूप में 12-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करें। 55 डिग्री सेल्सियस मनका स्नान में 12 अच्छी तरह से थाली रखें। प्रत्येक कुएं में 4% एलएमपी एगरोज़ के 2.5-3 एमएल जोड़ें जो भ्रूण को पकड़ लेगा।
    नोट: यद्यपि अन्य मोल्डों का उपयोग किया जा सकता है, 12-अच्छी तरह से प्लेट वॉल्यूम सेक्शनिंग के लिए बाद के चरणों में एगरोज़ ब्लॉक तैयार करने के लिए इष्टतम हैं।
  3. एक छिद्रित चम्मच का उपयोग करके, भ्रूण को 4% एलएमपी एगरोज़ समाधान (चित्रा 1 ए) युक्त व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरित करें।
    1. मनका स्नान से एक बेंचटॉप करने के लिए 12 अच्छी तरह से थाली स्थानांतरण। धीरे एम्बेड और भ्रूण उन्मुख तो यह समाधान के भीतर केंद्रित है करने के लिए विंदुक युक्तियों का प्रयोग करें। एक बार भ्रूण उन्मुख होने के बाद, ब्लॉक के त्वरित जमने की अनुमति देने के लिए प्लेट को 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      महत्वपूर्ण: सुनिश्चित करें कि भ्रूण ब्लॉक के केंद्र में स्थित है। भ्रूण जो नीचे डूबते हैं या मोल्ड के किनारे के बहुत करीब होते हैं, संभवतः सेक्शनिंग करते समय एगरोज़ ब्लॉक से हटा दिए जाएंगे।
  4. स्केलपेल का उपयोग करके कुएं से पूरे एगरोज़ ब्लॉक को हटा दें और प्रत्येक तरफ ~ 0.3 सेमी ब्लॉक छोड़कर भ्रूण के चारों ओर एक आयताकार ब्लॉक काट लें। भ्रूण के पुच्छल अंत के साथ अतिरिक्त लंबाई की अनुमति दें। जब वाइब्रेटोम पर घुड़सवार, ब्लॉक (चित्रा 1 बी) के ऊपरी भाग में एक ईमानदार स्थिति में भ्रूण उन्मुख।
  5. वाइब्रेटोम के नमूना धारक के लिए टेप की एक पट्टी लागू करें और टेप के लिए एगरोज़ ब्लॉक को सुपरग्लू करें, उन्मुख ताकि ब्लेड भ्रूण के अक्षीय वर्गों को पूर्वकाल (कपाल) में पीछे के अनुक्रम में उत्पन्न करेगा।
  6. नमूना पूरी तरह से डूबा हुआ है यह सुनिश्चित करने के लिए ठंडे एचबीएसएस के साथ वाइब्रेटोम कक्ष भरें, और फिर बर्फ के साथ कक्ष को घेर लें।
  7. सेकंड और 5 और 7 (50-70 हर्ट्ज) के बीच आवृत्ति 100 μm करने के लिए सेट की गई कट मोटाई के साथ आवृत्ति सेट करें। भ्रूण के धारावाहिक अक्षीय सेक्शनिंग का प्रदर्शन करें।
    नोट: सेक्शनिंग के लिए धीमी गति का उपयोग करें। यदि कट गति 0.25 मिमी / सेकंड से ऊपर बढ़ जाती है, तो सेक्शनिंग भ्रूण को फाड़ सकती है या ब्लॉक से भ्रूण को हटा सकती है।
    1. सेक्शनिंग श्रृंखला के दौरान, एचबीएसएस से भरे एक अलग 60 मिमी पकवान के लिए धीरे-धीरे व्यक्तिगत वर्गों को स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें। ऊतक क्षति और साइटोनेम के विनाश से बचने के लिए ब्लॉक, ऊतक नहीं हड़पने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
      नोट: ऊतक वर्गों को एगरोज़ ब्लॉक के भीतर रहना चाहिए। यदि ऊतक ब्लॉक से वाइब्रेटोम कक्ष में गिर जाता है, तो धीरे-धीरे अनुभाग को उठाकर स्थानांतरित करें। ऊतक को पकड़ो या चुटकी न लें। महत्वपूर्ण: ऊतक वर्गों या अचानक हैंडलिंग की कोई तह ऊतक वर्गों में निश्चित साइटोनेम को नष्ट कर देगी।
  8. यदि एफ-एक्टिन धुंधला प्रदर्शन नहीं कर रहे हैं, तो चरण 2.10 पर आगे बढ़ें।
    1. एफ-एक्टिन धुंधला करने के लिए, एचबीएसएस को हटा दें और कमरे के तापमान पर सीए 2 + और एमजी 2+, 0.1% ट्वीन -20, और 5% बकरी सीरम के साथ पीबीएस में पतला एक्टिन-रेड और डीएपीआई समाधान के साथ 40 मिनट के लिए अनुभागों को सेते हैं।
  9. सीए 2 + और मिलीग्राम 2+ और 0.1% ट्वीन -20 के साथ पीबीएस में अनुभाग 3 x 20 मिनट धो लें।
  10. हाइड्रोफोबिक मार्कर पेन का उपयोग करके, चार्ज किए गए माइक्रोस्कोप स्लाइड के किनारों के चारों ओर एक हाइड्रोफोबिक बाधा खींचें और क्षेत्र को भरने के लिए एचबीएसएस की एक छोटी मात्रा जोड़ें।
  11. स्लाइड करने के लिए वर्गों हस्तांतरण करने के लिए संदंश या एक छिद्रित चम्मच का प्रयोग करें।
    नोट: किसी भी ऊतक वर्गों है कि एगरोज़ में संलग्न नहीं कर रहे हैं एक हस्तांतरण विंदुक के माध्यम से स्थानांतरित किया जा सकता है।
  12. संदंश का उपयोग कर अतिरिक्त अगरोज़ ब्लॉक निकालें।
  13. एक बार जब सभी वर्गों को स्लाइड में स्थानांतरित कर दिया जाता है, तो पाइपिंग और एक शोषक तौलिया के कोने के माध्यम से अतिरिक्त तरल निकालें, और फिर स्लाइड में बढ़ते माध्यम की कई बूंदें जोड़ें। ठीक होने पर पूरे कवरस्लिप क्षेत्र को कवर करने के लिए पर्याप्त बढ़ते माध्यम का उपयोग करें। धीरे-धीरे स्लाइड पर रखकर कवरस्लिप माउंट करें।
    नोट: बढ़ते माध्यम के ठीक होने तक दबाव या परेशान कवरस्लिप को लागू करने से बचें।

3. इमेजिंग

  1. किसी भी कॉन्फोकल या उच्च रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप11 पर ऊतक वर्गों की इमेजिंग करें। जीनोटाइप प्रति कम से कम तीन भ्रूणों का विश्लेषण करें।
    नोट: ऊतक वर्गों की छवियों को टीसीएस एसपी 8 एसटीईडी 3 एक्स कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था, इसके बाद लाइटनिंग डिकोन्वोल्यूशन किया गया था।

Representative Results

प्रति अच्छी तरह से अगारोज समाधान के 2.5-3 एमएल के साथ 12-अच्छी तरह से प्लेट के एक बड़े मोल्ड का उपयोग थोड़े समय में कई भ्रूणों को एम्बेड करने और निलंबित करने के लिए आदर्श था (चित्रा 1 ए)। सेक्शनिंग के लिए एगरोज़ ब्लॉक को काटते समय अतिरिक्त क्षेत्र सही अभिविन्यास की अनुमति देता है। अगारोज ब्लॉक को काटते समय, ब्लॉक के तल के साथ अतिरिक्त एगरोज़ को बनाए रखना महत्वपूर्ण है जहां इसे ऑब्जेक्ट धारक पर टेप से चिपकाया जाएगा। भ्रूण ब्लॉक (चित्रा 1 बी) के ऊपरी आधे हिस्से में होना चाहिए। हालांकि, निचला खंड बहुत बड़ा नहीं होना चाहिए क्योंकि अतिरिक्त ब्लॉक कट कोण को बदलने की संभावना को बढ़ाता है क्योंकि ब्लेड सेक्शनिंग करते समय ब्लॉक में धक्का देता है। सही ढंग से उन्मुख वर्गों के उदाहरण दिखाए गए हैं (चित्रा 1 सी, डी)।

इस प्रोटोकॉल को विकसित करते समय, वाइब्रेटोम सेक्शनिंग की तुलना क्रायोस्टैट सेक्शनिंग से की गई थी। ऊतक के क्रायोस्टैट सेक्शनिंग शायद ही कभी सेलुलर एक्सटेंशन (चित्रा 2 क्रायोस्टैट और चित्रा 3ए, बी वाइब्रेटोम) संरक्षित करते हैं। क्रायोस्टैट वर्गों नोटोकॉर्ड और तंत्रिका ट्यूब (चित्रा 2 ए तीरहेड) की कोशिकाओं के बीच और आसन्न तंत्रिका ट्यूब कोशिकाओं (चित्रा 2 बी, बी 'तीरहेड्स) के बीच कुछ जीएफपी-पॉजिटिव झिल्ली टुकड़ों का पता लगाने के लिए अनुमति दी। हालांकि, तंत्रिका ट्यूब के आसपास अत्यधिक फिलामेंटस मेसेनकाइमल कोशिकाओं में सेलुलर एक्सटेंशन के एफ-एक्टिन धुंधला क्रायोस्टैट वर्गों (चित्रा 2 सी, सी ' तीर, बनाम चित्रा 3 सी, डी) में बिगड़ा हुआ था। ये क्रायोस्टैट परिणाम इंगित करते हैं कि टूटे हुए सेलुलर एक्सटेंशन के केवल कुछ निशान इस विधि का पालन करते हैं। इस प्रकार, वाइब्रेटोम सेक्शनिंग को बाद के विश्लेषण के लिए इन नाजुक एक्सटेंशन को कुशलतापूर्वक संरक्षित करने के लिए पसंद किया जाता है।

सेलुलर एक्सटेंशन की उच्च गुणवत्ता वाली इमेजिंग के लिए पूरे भ्रूण और व्यक्तिगत ऊतक वर्गों का न्यूनतम विघटन आवश्यक है। ऊतक वर्गों कि किसी भी तह या बकलिंग से गुजरना नोटोकॉर्ड की अनुपस्थिति या नोटोकॉर्ड और तंत्रिका ट्यूब (चित्रा 3 बी) के उदर मंजिल प्लेट के बीच एक बड़ा पृथक्करण (>30 μm) से स्पष्ट हो जाएगा। यह आमतौर पर मेसेनकाइमल कोशिकाओं के नुकसान के साथ होता है जो सामान्य रूप से तंत्रिका ट्यूब (चित्रा 3 ए, तीर) को घेरते हैं। क्षतिग्रस्त वर्गों के परिणामस्वरूप उपकला कोशिकाओं (चित्रा 3 ए, एरोहेड्स की तुलना में चित्रा 3 बी) के बीच पलायन करने वाले दृश्यमान सेलुलर झिल्ली एक्सटेंशन का नुकसान भी होगा। यहां तक कि वर्गों के लिए मामूली विकृतियां कोशिकाओं (चित्रा 3 डी, एरोहेड्स, अच्छी तरह से संरक्षित चित्रा 3 सी की तुलना में) के बीच बनने के लिए एक्टिन-आधारित एक्सटेंशन और बड़े अंतराल के विखंडन का कारण बन सकती हैं, जो सभी चरणों में नाजुक हैंडलिंग की आवश्यकता को रेखांकित करती हैं।

Figure 1
चित्र 1: ई 9.5 श-क्रे का उदाहरण; रोजा 26 एमटीएमजी दाग, एम्बेडेड और खंडित भ्रूण। (ए) 12-अच्छी तरह से प्लेट में एक एकल भ्रूण, 4% एलएमपी एगरोज़ में एम्बेडेड। (बी) एगरोज़ ब्लॉक के भीतर एक सही ढंग से उन्मुख भ्रूण का उदाहरण वाइब्रेटोम बढ़ते के लिए आकार में कटौती करता है। अतिरिक्त एगरोज़ ब्लॉक तल के साथ मौजूद है। (सी) एलएमपी एगरोज़ में एम्बेडेड 100 μm मोटी भ्रूण अनुभाग की उज्ज्वल क्षेत्र छवि। (डी) एगरोज को हटाने के बाद एक खंड की इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग। एंटी-जीएफपी-दाग एमजीएफपी (हरा) ऊतक में एसएचएच-व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है, अन्य सेल वंशावली झिल्ली टमाटर (लाल), नीले रंग में डीएपीआई व्यक्त करती है। तंत्रिका ट्यूब (ब्रैकेट) और एमजीएफपी-पॉजिटिव नोटोकॉर्ड (तीर) स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं। स्केल बार = 1 सेमी (ए), 5 मिमी (बी), और 100 μm (सी, डी)। संक्षिप्त नाम: एलएमपी = कम पिघलने बिंदु; एमजीएफपी = झिल्ली हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; शह = सोनिक हेजहोग; डीएपीआई = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: खंडित झिल्ली एक्सटेंशन के साथ क्रायोस्टैट-सेक्शनेड न्यूरल ट्यूब फ्लोर प्लेट और नोटोकॉर्ड का उदाहरण। रोजा 26 एमटीएमजी 19,20,21 खंड जीएफपी (हरा), एफ-एक्टिन (लाल), और डीएपीआई (नीला) के लिए दाग। एमजीएफपी पंक्टा न्यूरल ट्यूब की आसन्न कोशिकाओं के बीच माइग्रेटिंग नोटोकॉर्ड और फ्लोरप्लेट (एरोहेड) और (बी, बी ') के बीच दिखाई देता है। (सी, सी') एफ-एक्टिन धुंधला तंत्रिका ट्यूब (तीर) के आसपास मेसेनकाइमल कोशिकाओं पर किसी भी स्पष्ट साइटोनेम का पता लगाने में विफल रहता है। स्केल सलाखों = 20 μm. संक्षिप्त नाम: एमजीएफपी = झिल्ली हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; शह = सोनिक हेजहोग; डीएपीआई = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: इष्टतम और सबऑप्टिमल वाइब्रेटोम ऊतक वर्गों और तंत्रिका ट्यूब फर्श प्लेट, नोटोकॉर्ड और आसपास की कोशिकाओं के धुंधला होने के उदाहरण। नाजुक रूप से संभाले गए वर्गों (ए, सी) के उदाहरण, (बी) एक मुड़ा हुआ ऊतक अनुभाग और (डी) एक श-क्रे से खराब ढंग से संभाला गया अनुभाग; रोजा 26 एमटीएमजी और एक एसएचएचजीएफपी / + भ्रूण 19,20,21। इष्टतम रूप से संभाले गए अनुभाग आसन्न स्थानीयकृत फर्श प्लेट तंत्रिका उपकला कोशिकाओं (ए, एरोहेड्स) के बीच साइटोनेम्स का पता लगाने की अनुमति देते हैं। तंत्रिका ट्यूब आसन्न नोटोकॉर्ड (ए, एमजीएफपी-एक्सप्रेसिंग) और मेसेनकाइमल कोशिकाओं (ए, तीर) को दिखाई देना चाहिए। (सी, डी) एफ-एक्टिन- और डीएपीआई-दाग वाले वर्गों में तंत्रिका ट्यूब और नोटोकॉर्ड (सी) के आसपास मेसेनकाइमल कोशिकाओं और एफ-एक्टिन-आधारित साइटोनेम्स (तीर) की लगातार रिक्ति होनी चाहिए। अनुभागों के किसी भी मामूली तह या व्यवधान से अंतराल और टूटे हुए एफ-एक्टिन टुकड़े (डी, एरोहेड्स) हो सकते हैं। स्केल सलाखों = 10 μm. संक्षिप्त नाम: एमजीएफपी = झिल्ली हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; शह = सोनिक हेजहोग; डीएपीआई = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इस प्रोटोकॉल उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए भ्रूण ऊतक वर्गों में नाजुक साइटोनेम के संरक्षण के लिए विकसित किया गया था। आज तक, विभिन्न मॉडल जीवों में ऊतक में साइटोनेम्स का दृश्य काफी हद तक लाइव-टिशू इमेजिंग का उपयोग करके फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन की एक्टोपिक अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। दुर्भाग्य से, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले लाइव-इमेजिंग का उपयोग अंतर्जात रूप से व्यक्त प्रोटीन के विश्लेषण के लिए शायद ही कभी अनुकूल होता है, समय की कमी का परिचय दे सकता है, और विशेष इमेजिंग चरणों और माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित धुंधला और सेक्शनिंग विधि अंतर्जात रूप से व्यक्त प्रोटीन के अंतिम पता लगाने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री की अनुमति देने के लिए साइटोनेम्स और अन्य सेलुलर एक्सटेंशन को संरक्षित करती है। यह तकनीक विवो में विभिन्न ऊतकों में मॉर्फोजेन को कैसे ले जाया जाता है, इस बारे में नई अंतर्दृष्टि की सुविधा प्रदान करेगी और मॉडल सिस्टम के दायरे का विस्तार करेगी जहां साइटोनेम्स का अध्ययन किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल पूरे माउंट धुंधला और वाइब्रेटोम मोटी-सेक्शनिंग का उपयोग करता है, जो सुक्रोज जैसे ग्लिसरॉल या क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान जैसे संतुलन समाधान के उपयोग से बचता है। इसका उद्देश्य सेलुलर एक्सटेंशन के अधिकतम संरक्षण की अनुमति देने के लिए खंडित ऊतक हैंडलिंग को कम करना है। सेक्शनिंग के बाद ऊतक की कम हैंडलिंग साइटोनेम्स के समग्र संरक्षण में लगातार बेहतर परिणाम प्रदान करती है। इस प्रकार, भ्रूण का सेक्शनिंग इमेजिंग से पहले अंतिम चरणों में से एक है।

एमईएम-फिक्स, सुसंस्कृत कोशिकाओं के साइटोनेम के संरक्षण के लिए विकसित एक निर्धारण तकनीक, ग्लूटाराल्डिहाइड और पीएफए का एक संयोजन होता है जो उनके जीवित आयामों16,17 की तुलना में जन्मजात सेल वास्तुकला के बेहतर 3 डी संरक्षण की अनुमति देता है। दुर्भाग्य से, एमईएम-फिक्स भ्रूण निर्धारण के लिए उपयोगी नहीं था क्योंकि ग्लूटाराल्डिहाइड ऑटो-फ्लोरोसिस कर सकता है और उच्च प्रोटीन क्रॉस-लिंकिंग गतिविधि22,23 के कारण कोशिकाओं में एंटीबॉडी प्रवेश और एपिटोप बाइंडिंग को गंभीर रूप से सीमित कर सकता है। इस प्रकार, भ्रूण के ऊतकों में सेलुलर एक्सटेंशन के संरक्षण की अनुमति देने के लिए पीएफए निर्धारण स्थितियों के बाद सेक्शनिंग प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था। यद्यपि पीएफए भ्रूण के ऊतकों में साइटोनेम जैसे एक्सटेंशन को संरक्षित कर सकता है, छवि विश्लेषण सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। पीएफए व्यक्तिगत कोशिकाओं और ऊतकों के आंशिक निर्जलीकरण का कारण बन सकता है, जिससे मामूली मात्रा में कमी और निश्चित ऊतक के भीतर छोटे बाह्य रिक्त स्थान का गठन हो सकता है।

सुक्रोज या ग्लिसरॉल समाधान ऊतक24 की एक मामूली पुनरावृत्ति का कारण बन सकता है क्योंकि इस प्रोटोकॉल क्रायोप्रोटेक्शन और ऊतक समाशोधन के लिए सुक्रोज पुनर्संतृप्ति के अतिरिक्त चरणों से बचा जाता है। परिणामस्वरूप मामूली सूजन कोशिकाओं के बीच और ऊतकों में पलायन करने वाले निश्चित सेलुलर एक्सटेंशन और साइटोनेम को नष्ट कर सकती है। क्रायोस्टैट वर्गों के लिए मोटी-खंडित वाइब्रेटोम की तुलना करते समय यह स्पष्ट था। यद्यपि ऊतक की मोटाई बढ़ने से बरकरार साइटोनेम के संरक्षण में सुधार हुआ, सुक्रोज-पुनर्संतृप्त क्रायोस्टैट वर्गों में लगातार पता लगाने योग्य साइटोनेम की कम घटनाएं थीं।

इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन से पता चला है कि बरकरार साइटोनेम के संरक्षण को सुनिश्चित करने के लिए 100 μm मोटी वर्गों सबसे अच्छा थे। पतले वर्गों का उपयोग आमतौर पर इमेजिंग के लिए किया जाता है क्योंकि अधिकांश कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप केवल25 समाशोधन के बिना ~ 20-40 μm की गहराई तक सेलुलर एक्सटेंशन की कल्पना करने के लिए पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन पर इमेजिंग करने में सक्षम होते हैं। हालांकि, पतले वर्गों को काटते समय ब्लेड से भ्रूण कोशिकाओं पर लागू यांत्रिक बल और विरूपण साइटोनेम को नष्ट कर देता है। मोटे वर्ग ऊतक के भीतर बरकरार एक्सटेंशन को संरक्षित करते हुए अनुभाग के भीतर गहराई के एक बड़े क्षेत्र की अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, मोटे वर्गों का उपयोग ऊतक वर्गों के अत्यधिक तह या बकलिंग को रोकने के लिए हैंडलिंग में आसानी की अनुमति देता है।

इस प्रोटोकॉल ई 8-10.5 माउस भ्रूण के ऊतक में साइटोनेम्स के अधिकतम संरक्षण के लिए अनुकूलित किया गया था। सेक्शनिंग के बाद ऊतक के न्यूनतम हेरफेर ने साइटोनेम्स के लगातार बेहतर समग्र संरक्षण में सुधार किया। यह संभावना है कि आकार और ऊतक जटिलता में वृद्धि के कारण बाद के विकास चरणों और वयस्क ऊतक वर्गों के लिए तकनीक को अनुकूलित करने के लिए आगे अनुकूलन की आवश्यकता होगी। इसके बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के बाद सेक्शनिंग की आवश्यकता होगी। इस तरह के ऊतकों को साइटोनेम जैसे एक्सटेंशन को संरक्षित करने के लिए सेक्शनिंग के दौरान अतिरिक्त समाशोधन चरणों और ऊतक हैंडलिंग के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। इन अतिरिक्त चरणों पर विचार करने और इस प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए संबोधित करने की आवश्यकता होगी।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

Acknowledgments

सेंट जूड चिल्ड्रन रिसर्च हॉस्पिटल में सेल और आणविक जीवविज्ञान इमेजिंग कोर द्वारा बनाए गए माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों का अधिग्रहण किया गया था। माउस उपभेदों को जैक्स से प्राप्त किया गया था। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट आर 35 जीएम 122546 (एसकेओ) और सेंट जूड चिल्ड्रन रिसर्च हॉस्पिटल के एएलएसएसी द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated  Thermo Scientific  150628 (Fisher Scientific 12-565-321)
24-Well Plate, Round Nunc Thermo Fisher Scientific 142475
60 mm dish  Corning, Falcon 353004 (Fisher Scientific 08772F)
Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes) Kimberly-Clark KIMTECH 34155 (Fisher Scientific 06666A)
Actin Red 555 ReadyProbes Reagent  Invitrogen  R37112
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) Jackson Immunoresearch Lab Inc 703-546-155 1:1,000 working concentration
Bead Bath 6L 230V Lab Armor Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706) set to 55 °C
chicken anti-GFP Aves Labs SKU GFP-1020 1:250 working concentration
CO2 chamber plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line. 
Confocal laser-scanning microscope Leica Microsystems model: Leica TCS SP8
DAPI Solution (1 mg/mL) Thermo Fisher Scientific 62248
Dissecting scissors (Vannas Scissors) World Precision Instruments 14003
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine Thermo Fisher Scientific, Gibco 11960044
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 µL Eppendorf 3123000012
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 µL Eppendorf 3123000020
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 µL Eppendorf 3123000063
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 µL Eppendorf 3123000055
Feather Disposable Scalpel #10 Fisher Scientific  Catalog No.NC9999403
Fetal Bovine Serum, certified, United States Thermo Fisher Scientific, Gibco 16000044
Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps Fisher Scientific  22-327379
Fisherbrand Labeling Tape Fisher Scientific  15-954
Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade Polysciences 18814-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific, Gibco 14025
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen  Vector laboratories H-4000
Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING Leica Microsystems Microscope software
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific, Gibco 25030081
Low Melting Point Agarose- UltraPure Invitrogen  16520
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific, Gibco 11140050
Moria MC 17 BIS Perforated Spoon Fine Science Tools  1037018
Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant)  Thermo Fisher Scientific, Invitrogen P36961 
Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+) The Jackson Laboratory Strain #:008466
Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre) The Jackson Laboratory Strain #:005622
Mouse: C57BL/6J (B6) The Jackson Laboratory Strain #:000664
Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG) The Jackson Laboratory Strain #:007576
Normal Goat Serum  Jackson ImmunoResearch 005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079)
PBS + Ca2+ + Mg2+  Thermo Fisher Scientific, Gibco 14040133
Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific  05-408-129
SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 µL Denville Scientific P1096-FR
SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 µL Denville Scientific P1126
SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 µL Denville Scientific P1121
SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 µL Denville Scientific P1122
Sodium Azide Sigma-Aldrich S8032
Sodium Pyruvate (100 mM) (100x) Thermo Fisher Scientific, Gibco 11360070
Super Glue Gorilla
SuperFrost Plus microscope slides  Fisher Scientific  12-550-15
TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene TPP Techno Plastic Products 91015
TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene TPP Techno Plastic Products 91050
Transfer pipette, polyethylene Millipore Sigma Z135003
Triton X-100  Sigma-Aldrich T9284
Tween-20  Sigma-Aldrich P1379
Vari-Mix Platform Rocker Thermo Fisher Scientific 09-047-113Q set to 20 RPM
Vibratome Leica Biosytems VT1000 S

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 184
साइटोनेम विश्लेषण के लिए भ्रूण माउस ऊतक का निर्धारण
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Hall, E. T., Daly, C. A., Zhang, Y., Dillard, M. E., Ogden, S. K. Fixation of Embryonic Mouse Tissue for Cytoneme Analysis. J. Vis. Exp. (184), e64100, doi:10.3791/64100 (2022).

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