Summary
Здесь предусмотрен оптимизированный пошаговый протокол для фиксации, иммуноокрашения и секционирования эмбрионов для обнаружения специализированных сигнальных филоподий, называемых цитонемами, в развивающихся тканях мыши.
Abstract
Паттерн ткани развития и гомеостаз ткани после развития зависят от контролируемой доставки клеточных сигналов, называемых морфогенами. Морфогены действуют в зависимости от концентрации и времени, чтобы определить различные транскрипционные программы, которые инструктируют и усиливают судьбу клеток. Одним из механизмов, с помощью которого обеспечиваются соответствующие пороги передачи сигналов морфогенами, является доставка сигнальных белков специализированными филоподиями, называемыми цитонемами. Цитонемы очень тонкие (диаметр ≤200 нм) и могут вырастать до длины в несколько сотен микрон, что затрудняет их сохранение для анализа фиксированных изображений. В этой статье описывается усовершенствованный метод деликатного обращения с эмбрионами мышей для фиксации, иммуноокрашения и толстого сечения, позволяющий визуализировать цитонемы с использованием стандартной конфокальной микроскопии. Этот протокол был успешно использован для визуализации цитонем, которые соединяют различные клеточные сигнальные отсеки во время развития нервной трубки мыши. Метод также может быть адаптирован для обнаружения цитонем в разных типах тканей, чтобы облегчить опрос сигналов развития с беспрецедентным разрешением.
Introduction
Эмбриональное развитие организуется посредством скоординированной активации сигнальных путей морфогена. Морфогены представляют собой небольшие, секретируемые белки, которые подразделяются на Sonic Hedgehog (SHH), трансформирующие фактор роста β (TGF-β) / костный морфогенный белок (BMP), сайт интеграции Wingless (WNT) и фибробласты и эпидермальный фактор роста (FGF / EGF). Морфогены производятся и высвобождаются из клеточных организующих центров во время развития тканей и устанавливают сигнальные градиенты через организующие поля клеток для информирования морфогенезатканей 1,2,3,4,5. Одно из представлений морфогенных градиентов обнаруживается в развивающейся нервной системе, где предполагаемая центральная нервная система формируется посредством активации морфогенного пути. Эта ткань, называемая нервной трубкой, состоит из противоположных градиентов SHH, секретируемых вентральным нотохордом и напольной пластиной, и WNT / BMP, выделяемых из дорсальной кровельной пластины, для формирования различных нейронных предшественниковобластей 6. Нервная трубка обычно используется для опроса целостности морфогенного градиента в исследованиях развития.
Формирование морфогенного градиента опирается на жесткую регуляцию дисперсии сигнала7. Одним из клеточных механизмов, с помощью которого это происходит, является образование длинных сигнальных филоподий, называемых цитонемами, которые облегчают прямую доставку морфогенов из сигнальных клеток в конкретные популяции клеток-мишеней. Было замечено, что цитонемы расширяют сотни микрометров для осаждения морфогенов на клеточных мембранах, принимающих сигнал 8,9. Нарушение опосредованного цитонемой транспорта морфогенов приводит к аномалиям развития как у мух, так и у позвоночных, подчеркивая их важность во время структурирования тканей 10,11,12,13,14.
На сегодняшний день цитонемы были задокументированы в моделях дрозофилы, цыплят и рыбок данио, но визуализация структур в развивающихся эмбрионах млекопитающих остается сложнойзадачей 8,9,15. Препятствием для эффективной визуализации цитонем в сложных тканях млекопитающих in situ является их тонкая и хрупкая природа, которая делает их восприимчивыми к повреждениям обычными методами фиксации8. Ранее мы разработали и оптимизировали протоколы для модифицированной электронной микроскопии фиксаторной (MEM-fix) для сохранения цитонем в культивируемых клетках и обеспечения возможности их изучения с использованием конфокальной микроскопии16,17.
Использование метода MEM-fix позволило идентифицировать некоторые молекулы, участвующие в образовании и функции цитонемы, индуцированной SHH, и функции 11,16,17. Однако подтверждение этих результатов в физиологически значимом контексте паттернов нервной трубки потребовало разработки новых методов фиксации и изображения эмбриональной ткани мыши. Здесь описан протокол фиксации эмбрионов мышей таким образом, чтобы поддерживать целостность цитонемы и допускать иммуноокрашивание и последующее секционирование эмбриональной ткани для конфокального анализа. Этот протокол был разработан с использованием мембранно-привязанного зеленого флуоресцентного белка (GFP) для маркировки расширений мембраны от SHH-продуцирующих клеток в развивающейся нервной трубке. Реализация этого протокола будет касаться оставшихся без ответа вопросов, касающихся распространенности и значения цитонем в развитии систем млекопитающих.
Protocol
Этот протокол следует утвержденным руководящим принципам по уходу за животными Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) и Детской исследовательской больницы Святого Иуды. Все штаммы были пересечены на пять поколений до штамма C57BL/6J.
1. Изоляция эмбрионов и окрашивание всего крепления
- Разводите 6-недельных самок и следите за наличием влагалищной пробки.
- Усыплите беременную плотину путем вдыхания CO2 в камере CO2 с последующим вывихом шейки матки в соответствии с руководящими принципами AVMA18. Сделайте Y-образный разрез к брюшной полости с помощью рассеченных ножниц и щипцов. Иссечение матки, содержащей эмбрионы E9.5, в соответствии с утвержденными институциональными руководящими принципами.
- Рассекайте эмбрионы в полной питательной среде (модифицированная орлиная среда Dulbecco, дополненная заменимыми аминокислотами, Na-пируватом, L-глутамином и 10% фетальной бычьей сывороткой). Используйте щипцы для удаления желточного мешка, плаценты и окружающих мембран.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости сохраните каждый желточный мешок для генотипирования эмбриона. - Промыть изолированные эмбрионы сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS), чтобы удалить остаточную амниотическую ткань и кровь.
- Приготовьте фиксатор. Добавьте параформальдегид (PFA) в HBSS для конечной рабочей концентрации 4% PFA.
ВНИМАНИЕ: ПФА является токсичным химическим веществом, поэтому следует избегать вдыхания или прямого воздействия на кожу. Приготовление фиксирующего раствора осуществляется под вытяжным капюшоном с соответствующими средствами индивидуальной защиты из перчаток и лабораторного халата. - Добавьте 1 мл фиксатора в каждую лунку 24-луночной пластины и поместите каждый эмбрион в отдельную лунку. Инкубировать эмбрионы в фиксаторе в течение 45 мин с легким перемешиванием на коромысле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Критический: Все промывки и инкубации должны проводиться с мягким перемешиванием (максимум 20 оборотов в минуту) на коромысле или круглом шейкере, так как резкое обращение или движение эмбрионов разрушит фиксированные цитонемы. Используйте пипетку, чтобы аккуратно удалить все растворы. - Удалите фиксатор и промойте эмбрионы 3 х 30 мин в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) с Ca2+ и Mg2+ с добавлением 0,1% тритона.
- После промывки инкубируют эмбрионы в блокирующем растворе (PBS с Ca2+ и Mg2+, 0,1% тритоном и 5% козьей сывороткой) с мягким перемешиванием. Блок 2 x 1 ч. После второй блокирующей инкубации выполните одно быстрое промывание эмбрионов с использованием свежего блокирующего раствора.
- Во время второй стадии блокировки готовят раствор первичногоантитела 11. Разводят антитела до оптимальной концентрации в PBS с Ca2+ и Mg2+, 0,1% Tween-20 и 5% козьей сывороткой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшенной визуализации мембранного GFP можно использовать куриный анти-GFP (1:250). - Удалить блокирующий раствор и добавить в каждую лунку по 1 мл раствора первичного антитела. Инкубировать при 4 °C с мягким вращением в течение 3 дней.
- После первичной инкубации антител промыть эмбрионы 5 х 1 ч при 20 об/мин на коромысле в PBS с Ca2+ и Mg2+, 0,1% Tween-20 и 5% козьей сывороткой.
- Готовят раствор вторичного антитела с использованием вторичного фрагмента F(ab')2 в разведении 1:1000 в PBS с Ca2+ и Mg2+, 0,1% Tween-20 и 5% козьей сывороткой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование фрагментов F(ab')2 значительно усиливает проникновение антител в образец. - Добавляют 1 мл раствора вторичных антител в каждую лунку. Инкубировать с легким раскачиванием при 4 °C в темноте в течение 3 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно: С этого момента минимизируйте воздействие прямого света на эмбрион. Необязательно: Для предотвращения роста бактерий добавьте 0,2% азид натрия в раствор вторичных антител. - Удалить раствор вторичных антител и промыть эмбрионы 3 х 30 мин в PBS с Ca2+ и Mg2+, 0,1% Tween-20 и 5% козьей сывороткой. Если не выполнено окрашивание актином фаллоидином или другими актиновыми красителями, после первой промывки добавляют 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в PBS с Ca2+ и Mg2+, 0,1% Tween-20 и 5% козьей сыворотки и инкубируют в течение 1 ч, а затем 3 x 30 мин промывки, как описано выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе эмбрионы могут храниться на ночь при 4 °C в PBS или HBSS в темноте до этапа встраивания на следующий день. Тем не менее, рекомендуется, чтобы эмбрионы были внедрены и разделены немедленно.
2. Встраивание, сечение и монтаж эмбрионов
- Приготовьте 4% мас./об.раствор агарозы с низкой температурой плавления (LMP), растворенный в HBSS или PBS с Ca2+ и Mg2+ , до конечного объема ~3 мл на эмбрион. Добавьте соответствующий вес агарозы LMP к HBSS или PBS с Ca2+ и Mg2+ и микроволновую печь до тех пор, пока агароза LMP не растворится.
ПРИМЕЧАНИЕ: После растворения агарозы LMP храните раствор в бисерной ванне, инкубаторе или водяной бане, установленной на 55 °C, чтобы предотвратить затвердевание раствора агарозы LMP. - Используйте 12-луночную пластину в качестве формы для встраивания эмбрионов. Поместите плиту с 12 лунками в бисерную ванну с температурой 55 °C. Добавьте 2,5-3 мл 4% агарозы LMP в каждую лунку, которая будет содержать эмбрион.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя могут использоваться и другие формы, объемы пластин из 12 скважин являются оптимальными для подготовки блока агарозы на более поздних стадиях к секционированию. - С помощью перфорированной ложки перенесите эмбрионы в отдельные лунки, содержащие 4% раствор агарозы LMP (рисунок 1А).
- Перенесите 12-луночную тарелку из бисерной ванны на столешницу. Используйте наконечники пипеток, чтобы аккуратно встроить и сориентировать эмбрион так, чтобы он был центрирован внутри раствора. Как только эмбрионы будут ориентированы, поместите пластину при -20 °C в течение 10 минут, чтобы обеспечить быстрое затвердевание блока.
КРИТИЧЕСКИЙ: Убедитесь, что эмбрион расположен в центре блока. Эмбрионы, которые опускаются на дно или находятся слишком близко к краю плесени, скорее всего, будут вытеснены из блока агарозы во время секционирования.
- Перенесите 12-луночную тарелку из бисерной ванны на столешницу. Используйте наконечники пипеток, чтобы аккуратно встроить и сориентировать эмбрион так, чтобы он был центрирован внутри раствора. Как только эмбрионы будут ориентированы, поместите пластину при -20 °C в течение 10 минут, чтобы обеспечить быстрое затвердевание блока.
- Извлеките весь блок агарозы из лунки скальпелем и вырежьте прямоугольный блок вокруг эмбриона, оставив ~ 0,3 см блока с каждой стороны. Позвольте увеличить длину вдоль каудального конца эмбриона. При установке на вибратоме ориентируйте эмбрион в вертикальном положении в верхней части блока (рисунок 1B).
- Приложите полоску ленты к образцу держателя вибратома и суперклею блока агарозы к ленте, ориентированной таким образом, чтобы лезвие генерировало осевые участки эмбриона в передней (черепной) к задней последовательности.
- Заполните камеру вибратома холодным HBSS, чтобы убедиться, что образец полностью погружен, а затем окружите камеру льдом.
- Установите скорость вибратома на 0,2 мм/с и частоту от 5 до 7 (50-70 Гц) с толщиной реза 100 мкм. Выполните последовательное осевое сечение эмбриона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте медленную скорость для секционирования. Если скорость разреза увеличена выше 0,25 мм/с, сечение может разорвать эмбрион или выбить эмбрион из блока.- Во время серии секционирования используйте щипцы, чтобы аккуратно перенести отдельные секции в отдельную 60-миллиметровую тарелку, заполненную HBSS. Используйте щипцы, чтобы захватить блок, а не ткань, чтобы избежать повреждения тканей и разрушения цитонем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Участки ткани должны оставаться в пределах блока агарозы. Если ткань выпадает из блока в камеру вибратома, осторожно перенесите, подняв срез наружу. Не хватайте и не зажимайте ткань. КРИТИЧЕСКИЙ: Любое сворачивание участков ткани или резкая обработка разрушают фиксированные цитонемы в тканевых срезах.
- Во время серии секционирования используйте щипцы, чтобы аккуратно перенести отдельные секции в отдельную 60-миллиметровую тарелку, заполненную HBSS. Используйте щипцы, чтобы захватить блок, а не ткань, чтобы избежать повреждения тканей и разрушения цитонем.
- Если окрашивание F-актином не выполняется, перейдите к шагу 2.10.
- Для выполнения окрашивания F-актином удаляют HBSS и инкубируют срезы в течение 40 мин раствором Actin-Red и DAPI, разведенным в PBS с Ca2+ и Mg2+, 0,1% Tween-20 и 5% козьей сывороткой при комнатной температуре.
- Промывайте секции 3 х 20 мин в PBS с Ca2+ и Mg2+ и 0,1% Tween-20.
- Используя гидрофобную маркерную ручку, нарисуйте гидрофобный барьер по краям слайда заряженного микроскопа и добавьте небольшой объем HBSS, чтобы заполнить область.
- Используйте щипцы или перфорированную ложку для переноса секций на горку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любые участки ткани, которые не заключены в агарозу, могут быть перенесены с помощью переносной пипетки. - Удалите излишки блока агарозы с помощью щипцов.
- После того, как все секции будут перенесены на слайд, удалите лишнюю жидкость с помощью пипетки и угол абсорбирующей салфетки, а затем добавьте несколько капель монтажной среды на слайд. Используйте достаточно монтажной среды, чтобы покрыть всю площадь крышки при отверждении. Установите крышку, аккуратно поместив ее на затвор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте применения давления или нарушения обтекания до тех пор, пока монтажная среда не затвердеет.
3. Визуализация
- Выполняют визуализацию участков тканей на любом конфокальном или более высоком разрешениимикроскопа 11. Анализируйте минимум три эмбриона на генотип.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения участков тканей были получены с помощью конфокального микроскопа TCS SP8 STED 3x с последующей деконволюцией LIGHTNING.
Representative Results
Использование более крупной формы 12-луночной пластины с 2,5-3 мл раствора агарозы на лунку было идеальным для встраивания и суспендирования нескольких эмбрионов в течение короткого периода времени (рисунок 1А). Избыточная площадь позволяет обеспечить правильную ориентацию при резке блока агарозы для секционирования. При резке блока агарозы важно поддерживать избыток агарозы вдоль дна блока, где он будет приклеен к ленте на держателе объекта. Эмбрион должен находиться в верхней половине блока (рисунок 1В). Тем не менее, нижняя секция не должна быть слишком большой, так как избыточный блок увеличивает шансы изменения угла среза, поскольку лезвие вдавливается в блок во время секционирования. Показаны примеры правильно ориентированных секций (рисунок 1С,D).
При разработке этого протокола сечение вибратома сравнивалось с криостатным сечением. Криостатное сечение ткани редко сохраняет клеточные расширения (Рисунок 2 криостат и Рисунок 3А,В вибратом). Криостатные секции позволили обнаружить некоторые GFP-положительные фрагменты мембраны между клетками нотохорды и нервной трубки (рисунок 2A наконечник стрелы) и между соседними клетками нервной трубки (рисунок 2B, B' наконечники стрел). Однако окрашивание F-актином клеточных расширений в высоконитчатых мезенхимальных клетках, окружающих нервную трубку, было нарушено в криостатных секциях (рисунок 2C, стрелка C' против рисунка 3C, D). Эти результаты криостата показывают, что после этого метода остаются только некоторые следы сломанных клеточных расширений. Таким образом, вибратомное сечение предпочтительно для эффективного сохранения этих деликатных расширений для последующего анализа.
Минимальное разрушение всего эмбриона и отдельных участков ткани имеет важное значение для высококачественной визуализации клеточных расширений. Участки тканей, подвергшиеся какому-либо сворачиванию или изгибу, будут проявляться по отсутствию нотохорды или большому разделению (>30 мкм) между нотохордой и вентральной пластиной пола нервной трубки (рисунок 3B). Обычно это сопровождается потерей мезенхимальных клеток, которые обычно окружают нервную трубку (рисунок 3А, стрелка). Поврежденные участки также приведут к потере видимых расширений клеточной мембраны, мигрирующих между эпителиальными клетками (рисунок 3B по сравнению с рисунком 3A, наконечники стрел). Даже незначительные искажения секций могут привести к фрагментации расширений на основе актина и образованию больших зазоров между ячейками (рисунок 3D, наконечники стрелок, по сравнению с хорошо сохранившимся рисунком 3C), подчеркивая необходимость деликатного обращения на всех этапах.
Рисунок 1: Пример E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG окрашенный, внедренный и разрезанный эмбрион. (A) Один эмбрион в 12-луночной пластине, встроенный в 4% агарозу LMP. (B) Пример правильно ориентированного эмбриона внутри блока агарозы, уменьшенного до размера для установки вибратома. Избыток блока агарозы присутствует вдоль дна. (C) Яркое полевое изображение эмбрионального сечения толщиной 100 мкм, встроенного в агарозу LMP. (D) Иммунофлуоресцентная визуализация участка после удаления агарозы. Анти-GFP-окрашенный mGFP (зеленый) представляет собой Shh-экспрессирующие клетки в ткани, с другими клеточными линиями, экспрессирующими мембрану Tomato (красный), DAPI синим. Хорошо видны нейронная трубка (кронштейн) и mGFP-положительный нотохорд (стрелка). Шкала стержней = 1 см (A), 5 мм (B) и 100 мкм (C,D). Сокращения: LMP = низкая температура плавления; mGFP = мембранный зеленый флуоресцентный белок; Shh = Соник Ежик; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пример криостатного сечения плиты пола нервной трубки и нотохорды с фрагментированными расширениями мембраны. (A) толщиной 20 мкм E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG 19,20,21 секция окрашена для GFP (зеленый), F-актин (красный) и DAPI (синий). mGFP puncta видны между нотохордой и напольной пластиной (наконечник стрелы) и (B,B'), мигрирующими между соседними клетками нервной трубки. (С,С') Окрашивание F-актином не может обнаружить какие-либо прозрачные цитонемы на мезенхимальных клетках, окружающих нервную трубку (стрелка). Шкала стержней = 20 мкм. Сокращения: mGFP = мембранный зеленый флуоресцентный белок; Shh = Соник Ежик; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Примеры оптимальных и неоптимальных участков вибратомной ткани и окрашивания пластины пола нервной трубки, нотохорды и окружающих клеток. Примеры деликатно обработанных срезов (A,C) по сравнению с (B) сложенным участком ткани и (D) плохо обработанным участком из Shh-Cre; Rosa26 mTmG и эмбрион ShhGFP/+ 19,20,21. Оптимально обработанные участки позволяют обнаруживать цитонемы между соседними локализованными напольными пластинами нервных эпителиальных клеток (А, наконечники стрел). Должны быть видны соседние с нервной трубкой нотохордные (А, mGFP-экспрессирующие) и мезенхимальные клетки (А, стрелка). (С,Г) F-актин- и DAPI-окрашенные участки должны иметь последовательное расстояние между мезенхимальными клетками и F-актиновыми цитонемами (стрелками), окружающими нервную трубку и нотохорду (C). Любое незначительное складывание или разрушение секций может привести к зазорам и поломкам F-актиновых фрагментов (D, наконечники стрел). Шкала стержней = 10 мкм. Сокращения: mGFP = мембранный зеленый флуоресцентный белок; Shh = Соник Ежик; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Этот протокол был разработан для сохранения тонких цитонем в эмбриональных участках тканей для флуоресцентной микроскопии высокого разрешения. На сегодняшний день визуализация цитонем в тканях различных модельных организмов в значительной степени опирается на эктопическую экспрессию флуоресцентно меченых белков с использованием визуализации живой ткани. К сожалению, использование флуоресцентно меченой живой визуализации редко способствует анализу эндогенно экспрессированных белков, может вводить временные ограничения и требует специализированных стадий визуализации и микроскопов. Описанный здесь способ окрашивания и секционирования сохраняет цитонемы и другие клеточные расширения, чтобы обеспечить иммуногистохимию для возможного обнаружения эндогенно экспрессированных белков. Эта технология облегчит новое понимание того, как морфогены транспортируются через различные ткани in vivo , и расширит область модельных систем, где можно изучать цитонемы.
Этот протокол использует окрашивание цельным креплением и толстое сечение вибратома, что позволяет избежать использования раствора равновесия, такого как глицерин, или криопротекторных растворов, таких как сахароза. Он направлен на минимизацию обработки разрезанных тканей, чтобы обеспечить максимальное сохранение клеточных расширений. Снижение обработки ткани после разрезания обеспечило неизменно лучшие результаты в общем сохранении цитонем. Таким образом, сечение эмбриона является одним из заключительных этапов перед визуализацией.
MEM-fix, метод фиксации, разработанный для сохранения цитонем культивируемых клеток, состоит из комбинации глутаральдегида и PFA, что позволяет улучшить 3D-сохранение врожденной клеточной архитектуры, сопоставимой с их живыми размерами16,17. К сожалению, MEM-fix не был полезен для фиксации эмбриона, потому что глутаральный альдегид может аутофлуоресцировать и серьезно ограничивает проникновение антител и связывание эпитопов в клетках из-за высокой активности сшивания белка22,23. Таким образом, протоколы секционирования после фиксации PFA были оптимизированы, чтобы обеспечить сохранение клеточных расширений в эмбриональной ткани. Хотя PFA может сохранять цитонемоподобные расширения в эмбриональной ткани, анализ изображений следует выполнять с осторожностью. PFA может вызвать частичное обезвоживание отдельных клеток и тканей, что приводит к незначительному уменьшению объема и образованию небольших внеклеточных пространств внутри фиксированной ткани.
Этот протокол позволяет избежать дополнительных этапов ресатурации сахарозы для криопротекции и очистки тканей, поскольку растворы сахарозы или глицерина могут вызвать незначительное насыщение ткани24. Возникающий незначительный отек может разрушить фиксированные клеточные расширения и цитонемы, мигрирующие между клетками и через ткани. Это было очевидно при сравнении толстосекционных вибратомов с криостатными секциями. Хотя увеличение толщины ткани улучшало сохранение интактных цитонем, насыщенные сахарозой криостатные участки последовательно имели более низкую частоту обнаруживаемых цитонем.
Оптимизация этого протокола показала, что участки толщиной 100 мкм являются лучшими для обеспечения сохранности интактных цитонем. Более тонкие участки обычно используются для визуализации, потому что большинство конфокальных микроскопов способны визуализировать только с достаточным разрешением для визуализации клеточных расширений на глубину ~ 20-40 мкм без очистки25. Однако механические силы и искажения, приложенные к эмбриональным клеткам от лезвия при разрезании тонких срезов, разрушают цитонемы. Более толстые участки обеспечивают большую площадь глубины внутри сечения, сохраняя при этом неповрежденные расширения внутри ткани. Кроме того, использование более толстых секций позволяет легко обращаться, чтобы предотвратить чрезмерное складывание или изгиб срезов ткани.
Этот протокол был оптимизирован для максимального сохранения цитонем в ткани эмбрионов мышей Е8-10,5. Минимальные манипуляции с тканями после разреза обеспечили последовательное улучшение общей сохранности цитонем. Вполне вероятно, что потребуется дальнейшая оптимизация для адаптации методики к более поздним стадиям развития и участкам тканей взрослого человека из-за увеличения размера и сложности тканей. Это потребует секционирования с последующим иммунофлуоресцентным окрашиванием. Такая ткань может потребовать дополнительных этапов очистки и адаптации обработки тканей во время сечения для сохранения цитонемоподобных расширений. Эти дополнительные шаги необходимо будет рассмотреть и рассмотреть для будущего применения этого протокола.
Disclosures
У авторов нет конкурирующих интересов, которые можно было бы декларировать.
Acknowledgments
Изображения были получены с помощью микроскопов, поддерживаемых Cell and Molecular Biology Imaging Core в Детской исследовательской больнице Святого Иуды. Мышиные штаммы были получены из JAX. Эта работа была поддержана грантом Национальных институтов здравоохранения R35GM122546 (SKO) и ALSAC Детской исследовательской больницы Святого Иуды.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated | Thermo Scientific | 150628 (Fisher Scientific 12-565-321) | |
| 24-Well Plate, Round Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 60 mm dish | Corning, Falcon | 353004 (Fisher Scientific 08772F) | |
| Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes) | Kimberly-Clark KIMTECH | 34155 (Fisher Scientific 06666A) | |
| Actin Red 555 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37112 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immunoresearch Lab Inc | 703-546-155 | 1:1,000 working concentration |
| Bead Bath 6L 230V | Lab Armor | Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706) | set to 55 °C |
| chicken anti-GFP | Aves Labs | SKU GFP-1020 | 1:250 working concentration |
| CO2 chamber | plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | model: Leica TCS SP8 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dissecting scissors (Vannas Scissors) | World Precision Instruments | 14003 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11960044 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 µL | Eppendorf | 3123000012 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 µL | Eppendorf | 3123000055 | |
| Feather Disposable Scalpel #10 | Fisher Scientific | Catalog No.NC9999403 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, United States | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 16000044 | |
| Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fisherbrand Labeling Tape | Fisher Scientific | 15-954 | |
| Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade | Polysciences | 18814-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14025 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen | Vector laboratories | H-4000 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING | Leica Microsystems | Microscope software | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25030081 | |
| Low Melting Point Agarose- UltraPure | Invitrogen | 16520 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11140050 | |
| Moria MC 17 BIS Perforated Spoon | Fine Science Tools | 1037018 | |
| Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | P36961 | |
| Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+) | The Jackson Laboratory | Strain #:008466 | |
| Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre) | The Jackson Laboratory | Strain #:005622 | |
| Mouse: C57BL/6J (B6) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG) | The Jackson Laboratory | Strain #:007576 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079) | |
| PBS + Ca2+ + Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14040133 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 µL | Denville Scientific | P1096-FR | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 µL | Denville Scientific | P1126 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 µL | Denville Scientific | P1121 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 µL | Denville Scientific | P1122 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11360070 | |
| Super Glue | Gorilla | ||
| SuperFrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91015 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91050 | |
| Transfer pipette, polyethylene | Millipore Sigma | Z135003 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher Scientific | 09-047-113Q | set to 20 RPM |
| Vibratome | Leica Biosytems | VT1000 S |
References
- Crick, F.
- Zeng, X., et al. A freely diffusible form of Sonic hedgehog mediates long-range signalling. Nature. 411 (6838), 716-720 (2001).
- Yu, S. R., et al. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461 (7263), 533-536 (2009).
- Zhou, S., et al. Free extracellular diffusion creates the Dpp morphogen gradient of the Drosophila wing disc. Current Biology. 22 (8), 668-675 (2012).
- Ribes, V., Briscoe, J. Establishing and interpreting graded Sonic Hedgehog signaling during vertebrate neural tube patterning: the role of negative feedback. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002014 (2009).
- Le Dréau, G., Martí, E. Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals. Developmental Neurobiology. 72 (12), 1471-1481 (2012).
- Kornberg, T. B., Guha, A. Understanding morphogen gradients: a problem of dispersion and containment. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (4), 264-271 (2007).
- Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs. Cell. 97 (5), 599-607 (1999).
- Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning. Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).
- Bischoff, M., et al. Cytonemes are required for the establishment of a normal Hedgehog morphogen gradient in Drosophila epithelia. Nature Cell Biology. 15 (11), 1269-1281 (2013).
- Hall, E. T., et al. Cytoneme delivery of sonic hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a dispatched-BOC/CDON co-receptor complex. eLife. 10, 61432 (2021).
- Huang, H., Kornberg, T. B. Cells must express components of the planar cell polarity system and extracellular matrix to support cytonemes. eLife. 5, 18979 (2016).
- Brunt, L., et al. Vangl2 promotes the formation of long cytonemes to enable distant Wnt/β-catenin signaling. Nature Communications. 12 (1), 2058 (2021).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Mattes, B., et al. Wnt/PCP controls spreading of Wnt/β-catenin signals by cytonemes in vertebrates. eLife. 7, 36953 (2018).
- Bodeen, W. J., Marada, S., Truong, A., Ogden, S. K. A fixation method to preserve cultured cell cytonemes facilitates mechanistic interrogation of morphogen transport. Development. 144 (19), 3612-3624 (2017).
- Hall, E. T., Ogden, S. K. Preserve cultured cell cytonemes through a modified electron microscopy fixation. Bio-protocol. 8 (13), (2018).
- American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals. American Veterinary Medical Association. , (2020).
- Harfe, B. D., et al. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-528 (2004).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Bacallao, R., Sohrab, S., Phillips, C. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 368-380 (2006).
- Tagliaferro, P., Tandler, C. J., Ramos, A. J., Pecci Saavedra, J., Brusco, A. Immunofluorescence and glutaraldehyde fixation. A new procedure based on the Schiff-quenching method. Journal of Neuroscience Methods. 77 (2), 191-197 (1997).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep tissue fluorescent imaging in scattering specimens using confocal microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17 (4), 614-617 (2011).
