Summary
Burada, fare dokularının geliştirilmesinde sitomem adı verilen özel sinyal filopodiasını tespit etmek için embriyoların fiksasyonu, immün boyama ve bölümlenmesi için optimize edilmiş bir adım adım protokol sağlanmaktadır.
Abstract
Gelişimsel doku paternlemesi ve postgelişimsel doku homeostazı, morfojenler adı verilen hücresel sinyallerin kontrollü olarak iletilmesine bağlıdır. Morfojenler, hücre kaderini öğreten ve güçlendiren farklı transkripsiyonel programları belirtmek için konsantrasyon ve zamana bağlı bir şekilde hareket eder. Uygun morfojen sinyal eşiklerinin sağlandığı bir mekanizma, sinyal proteinlerinin sitomem adı verilen özel filopodia tarafından verilmesidir. Sitonomlar çok incedir (çapı ≤200 nm) ve birkaç yüz mikron uzunluğa kadar büyüyebilir, bu da sabit görüntü analizi için korunmalarını zorlaştırır. Bu yazıda, standart konfokal mikroskopi kullanılarak sitonemlerin görüntülenmesine izin vermek için fiksasyon, immün boyama ve kalın kesitleme için fare embriyolarının hassas kullanımı için rafine bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, fare nöral tüp gelişimi sırasında farklı hücresel sinyal bölmelerini birbirine bağlayan sitonomları görselleştirmek için başarıyla kullanılmıştır. Bu teknik ayrıca, gelişimsel sinyallemenin benzeri görülmemiş bir çözünürlükte sorgulanmasını kolaylaştırmak için doku tipleri arasında sitonomları tespit etmek için uyarlanabilir.
Introduction
Embriyonik gelişim, morfojen sinyal yolaklarının koordineli aktivasyonu ile düzenlenir. Morfojenler, Sonic Hedgehog (SHH), büyüme faktörü β (TGF-β) / kemik morfojenik proteini (BMP), Kanatsız ilişkili entegrasyon bölgesi (WNT) ve fibroblast ve epidermal büyüme faktörü (FGF / EGF) ailelerine dönüştüren küçük, salgılanan proteinlerdir. Morfojenler, doku gelişimi sırasında hücresel organizasyon merkezlerinden üretilir ve salınır ve doku morfogenezi 1,2,3,4,5'i bilgilendirmek için hücrelerin organize alanları boyunca sinyal gradyanları oluşturur. Morfojen gradyanlarının bir temsili, varsayımsal merkezi sinir sisteminin morfojen yol aktivasyonu yoluyla desenlendiği gelişmekte olan sinir sisteminde bulunur. Nöral tüp olarak adlandırılan bu doku, ventral-en notokord ve zemin plakası tarafından salgılanan SHH'nin karşıt gradyanlarından ve dorsal çatı plakasından salgılanan WNT'lerden / BMP'lerdenoluşur. Nöral tüp, gelişimsel araştırmalarda morfojen gradyan bütünlüğünü sorgulamak için yaygın olarak kullanılır.
Morfojen gradyan oluşumu, sinyal dağılımı7'nin sıkı bir şekilde düzenlenmesine dayanır. Bunun gerçekleştiği hücresel mekanizmalardan biri, morfojenlerin sinyal üreten hücrelerden spesifik hedef hücre popülasyonlarına doğrudan iletilmesini kolaylaştıran sitonemler adı verilen uzun sinyal filopodiasının oluşumudur. Sitonomların, sinyal alan hücre zarları üzerinde morfojenleri biriktirmek için yüzlerce mikrometreyi uzattığı gözlenmiştir 8,9. Sitonem aracılı morfojen transportunun bozulması hem sineklerde hem de omurgalılarda gelişimsel anomalilere yol açarak, doku paternlemesi sırasında önemini vurgulamaktadır10,11,12,13,14.
Bugüne kadar, Drosophila, civciv ve zebra balığı modellerinde sitonomlar belgelenmiştir, ancak gelişmekte olan memeli embriyolarındaki yapıların görüntülenmesi zorlu olmaya devam etmektedir 8,9,15. Kompleks memeli dokularındaki sitonemleri in situ olarak etkili bir şekilde görüntülemenin önündeki bir engel, ince ve kırılgan doğalarıdır, bu da onları geleneksel fiksasyon yöntemleriyle hasara duyarlı hale getirir8. Daha önce, kültürlenmiş hücrelerdeki sitonemleri korumak ve konfokal mikroskopi16,17 kullanarak çalışmalarını sağlamak için modifiye elektron mikroskobu fiksatif (MEM-fix) için protokoller geliştirmiş ve optimize etmiştik.
MEM-fix tekniğinin kullanımı, SHH ile indüklenen sitonem oluşumunda ve fonksiyonunda rol oynayan bazı moleküllerin tanımlanmasına izin vermiştir11,16,17. Bununla birlikte, bu bulguların fizyolojik olarak ilgili nöral tüp modellemesi bağlamında doğrulanması, fare embriyonik dokusunu sabitlemek ve görüntülemek için yeni tekniklerin geliştirilmesini gerektirmiştir. Fare embriyolarını sitonem bütünlüğünü koruyacak ve immünoboyamaya ve konfokal analiz için embriyonik dokunun daha sonra bölümlenmesine izin verecek şekilde sabitlemek için bir protokol burada özetlenmiştir. Bu protokol, gelişmekte olan nöral tüpteki SHH üreten hücrelerden membran uzantılarını etiketlemek için membrana bağlı yeşil floresan proteini (GFP) kullanılarak geliştirilmiştir. Bu protokolün uygulanması, memeli sistemlerinin geliştirilmesinde sitonomların prevalansı ve önemi ile ilgili cevaplanmamış soruları ele alacaktır.
Protocol
Bu protokol, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ve St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi'nin onaylanmış hayvan bakım kılavuzlarını takip etmektedir. Tüm suşlar beş nesil boyunca C57BL/6J suşuna geri döndü.
1. Embriyo izolasyonu ve tüm montaj boyama
- 6 haftalık dişileri doğurun ve vajinal tıkaç varlığını izleyin.
- Bir CO2 odasında CO 2 inhalasyonu ile gebe barajını ötenazi hale getirin ve ardından AVMA kılavuzlarına göre servikal çıkık18. Diseksiyon makası ve forseps kullanarak periton boşluğuna bir Y-insizyonu yapın. E9.5 embriyolarını içeren uterusu onaylanmış kurumsal kılavuzlara göre tüketin.
- Embriyoları tam büyüme ortamında disseke edin (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı, esansiyel olmayan amino asitler, Na-piruvat, L-glutamin ve% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiştir). Yumurta sarısı kesesini, plasentayı ve çevresindeki zarları çıkarmak için forseps kullanın.
NOT: Gerektiğinde, embriyo genotiplemesi için her yumurta sarısı kesesini saklayın. - İzole edilmiş embriyoları, artık amniyotik doku ve kanı çıkarmak için Hank'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) durulayın.
- Fiksatif hazırlayın. % 4'lük PFA'lık bir son çalışma konsantrasyonu için HBSS'ye paraformaldehit (PFA) ekleyin.
DİKKAT: PFA toksik bir kimyasaldır, bu nedenle soluma veya doğrudan cilde maruz kalmaktan kaçınılmalıdır. Fiksatif çözeltinin hazırlanması, uygun kişisel koruyucu eldiven ekipmanı ve bir laboratuvar önlüğü ile bir duman başlığı altında gerçekleştirilir. - 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL fiksatif ekleyin ve her embriyoyu ayrı bir kuyuya yerleştirin. Embriyoları bir rocker üzerinde nazik ajitasyonla 45 dakika boyunca fiksatif olarak inkübe edin.
NOT: Kritik: Tüm yıkamalar ve inkübasyonlar, embriyoların ani kullanımı veya hareketi sabit sitomları tahrip edeceğinden, bir rocker veya dairesel çalkalayıcı üzerinde nazik ajitasyon (maksimum 20 RPM) ile yapılmalıdır. Tüm solüsyonları nazikçe çıkarmak için pipet kullanın. - Fiksatifi çıkarın ve embriyoları 3 x 30 dakika içinde Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içinde Ca 2 + ve Mg2 + ile% 0.1 Triton ilave edilerek yıkayın.
- Yıkadıktan sonra, embriyoları bloke edici çözeltide (Ca2 + ve Mg2 + ile PBS,% 0.1 Triton ve% 5 keçi serumu) nazik ajitasyonla inkübe edin. Blok 2 x 1 saat. İkinci blokaj inkübasyonundan sonra, taze bloke edici çözelti kullanarak embriyoların hızlı bir şekilde durulanması gerçekleştirilir.
- İkinci blokaj adımı sırasında, birincil antikor çözeltisi11'i hazırlayın. Antikorları PBS'deki optimize edilmiş konsantrasyona göre Ca 2 + ve Mg2 +,% 0.1 Ara-20 ve% 5 keçi serumu ile seyreltin.
NOT: GFP membranının daha iyi görselleştirilmesi için tavuk anti-GFP (1:250) kullanılabilir. - Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve her bir oyuğa 1 mL birincil antikor çözeltisi ekleyin. 3 gün boyunca nazik bir dönüşle 4 ° C'de inkübe edin.
- Birincil antikor inkübasyonunu takiben, embriyoları PBS'deki bir rocker üzerinde 20 RPM'de 5 x 1 saat Ca 2 + ve Mg2 +,% 0.1 Ara-20 ve% 5 keçi serumu ile yıkayın.
- Sekonder antikor solüsyonunu F(ab')2 fragman sekonderlerini kullanarak PBS'de Ca 2+ ve Mg 2+,% 0.1 Tween-20 ve% 5 keçi serumu ile 1: 1.000 seyreltmede hazırlayın.
NOT: F(ab')2 fragmanlarının kullanımı, numuneye antikor penetrasyonunu büyük ölçüde artırır. - Her bir kuyucuğa 1 mL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. 3 gün boyunca karanlıkta 4 ° C'de hafifçe sallanarak inkübe edin.
NOT: Önemli: Bu noktadan itibaren, embriyonun doğrudan ışığa maruz kalmasını en aza indirin. İsteğe bağlı: Bakteri üremesini önlemek için, ikincil antikor çözeltisine% 0.2 sodyum azid ekleyin. - İkincil antikor çözeltisini çıkarın ve embriyoları PBS'de 3 x 30 dakika Ca 2 + ve Mg2 +,% 0.1 Ara-20 ve% 5 keçi serumu ile yıkayın. Phalloidin veya diğer aktin boyaları ile aktin boyama yapılmazsa, ilk yıkamadan sonra, PBS'ye Ca 2 + ve Mg 2+,% 0.1 Tween-20 ve% 5 keçi serumu ile 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyin ve 1 saat boyunca inkübe edin, ardından yukarıda açıklandığı gibi 3 x 30 dakikalık yıkamalar yapın.
NOT: Bu noktada, embriyolar ertesi gün gömme adımına kadar karanlıkta PBS veya HBSS'de 4 °C'de gece boyunca saklanabilir. Bununla birlikte, embriyoların derhal gömülmesi ve bölümlendirilmesi önerilir.
2. Embriyo gömme, bölümleme ve montaj
- HBSS veya PBS'de Ca 2 + ve Mg2 + ile çözünmüş% 4'lük bir w / v Düşük Erime Noktası (LMP) agaroz çözeltisini, embriyo başına ~ 3 mL'lik bir son hacme hazırlayın. LMP agarozu çözülene kadar uygun ağırlığı HBSS veya PBS'ye Ca 2+ ve Mg2+ ile ve mikrodalgaya ekleyin.
NOT: LMP agarozu çözüldükten sonra, LMP agaroz çözeltisinin katılaşmasını önlemek için çözeltiyi 55 ° C'ye ayarlanmış bir boncuk banyosunda, inkübatörde veya su banyosunda saklayın. - Embriyolar için gömme kalıbı olarak 12 kuyucuklu bir plaka kullanın. 12 delikli plakayı 55 °C boncuk banyosuna yerleştirin. Bir embriyoyu tutacak her bir kuyucuğa 2.5-3 mL% 4 LMP agarozu ekleyin.
NOT: Diğer kalıplar kullanılabilse de, 12 delikli plaka hacimleri, agaroz bloğunu daha sonraki aşamalarda bölümleme için hazırlamak için idealdir. - Delikli bir kaşık kullanarak, embriyoları% 4 LMP agaroz çözeltisi içeren ayrı kuyucuklara aktarın (Şekil 1A).
- 12 kuyulu plakayı boncuk banyosundan bir tezgaha aktarın. Embriyoyu çözelti içinde ortalanacak şekilde nazikçe gömmek ve yönlendirmek için pipet uçlarını kullanın. Embriyolar yönlendirildikten sonra, bloğun hızlı katılaşmasını sağlamak için plakayı 10 dakika boyunca -20 ° C'ye yerleştirin.
KRİT: Embriyonun bloğun ortasına yerleştirildiğinden emin olun. Dibe batan veya kalıbın kenarına çok yakın olan embriyolar, bölümleme sırasında agaroz bloğundan muhtemelen yerinden çıkacaktır.
- 12 kuyulu plakayı boncuk banyosundan bir tezgaha aktarın. Embriyoyu çözelti içinde ortalanacak şekilde nazikçe gömmek ve yönlendirmek için pipet uçlarını kullanın. Embriyolar yönlendirildikten sonra, bloğun hızlı katılaşmasını sağlamak için plakayı 10 dakika boyunca -20 ° C'ye yerleştirin.
- Bir neşter kullanarak tüm agaroz bloğunu kuyudan çıkarın ve embriyonun etrafında dikdörtgen bir blok kesin ve her iki tarafta ~ 0.3 cm blok bırakın. Embriyonun kaudal ucu boyunca ekstra uzunluğa izin verin. Vibratom üzerine monte edildiğinde, embriyoyu bloğun üst kısmında dik konumda yönlendirin (Şekil 1B).
- Vibratomun numune tutucusuna bir bant şeridi uygulayın ve agaroz bloğunu banda süper yapıştırın, böylece bıçak embriyonun eksenel bölümlerini anterior (kraniyal) ila posterior sekansta üretecektir.
- Numunenin tamamen daldırıldığından emin olmak için vibratom odasını soğuk HBSS ile doldurun ve ardından odayı buzla çevreleyin.
- Kesme kalınlığı 100 μm olarak ayarlanmış olarak vibratom hızını 0,2 mm / s'ye ve frekansı 5 ila 7 (50-70 Hz) arasında ayarlayın. Embriyonun seri eksenel kesitlemesini gerçekleştirin.
NOT: Bölümleme için yavaş bir hız kullanın. Kesim hızı 0.25 mm / s'nin üzerine çıkarsa, kesitleme embriyoyu yırtabilir veya embriyoyu bloktan çıkarabilir.- Bölümleme serisi sırasında, tek tek bölümleri HBSS ile doldurulmuş ayrı bir 60 mm'lik kaba nazikçe aktarmak için forseps kullanın. Doku hasarını ve sitomların tahrip olmasını önlemek için dokuyu değil, bloğu tutmak için forseps kullanın.
NOT: Doku kesitleri agaroz bloğu içinde kalmalıdır. Doku bloktan vibratom odasına düşerse, bölümü kaldırarak yavaşça aktarın. Dokuyu tutmayın veya sıkıştırmayın. KRİT: Doku kesitlerinin katlanması veya ani elleçleme, doku kesitlerindeki sabit sitonemleri yok edecektir.
- Bölümleme serisi sırasında, tek tek bölümleri HBSS ile doldurulmuş ayrı bir 60 mm'lik kaba nazikçe aktarmak için forseps kullanın. Doku hasarını ve sitomların tahrip olmasını önlemek için dokuyu değil, bloğu tutmak için forseps kullanın.
- F-aktin boyama yapmıyorsanız, adım 2.10'a geçin.
- F-aktin boyama işlemini gerçekleştirmek için, HBSS'yi çıkarın ve oda sıcaklığında Ca 2+ ve Mg 2+, %0.1 Tween-20 ve %5 keçi serumu ile PBS'de seyreltilmiş Aktin-Kırmızı ve DAPI çözeltisi ile 40 dakika boyunca bölümleri inkübe edin.
- Bölümleri PBS'de 3 x 20 dakika Ca 2+ ve Mg2+ ve% 0.1 Ara-20 ile yıkayın.
- Hidrofobik bir işaretleyici kalem kullanarak, yüklü bir mikroskop slaytının kenarlarına hidrofobik bir bariyer çizin ve alanı doldurmak için az miktarda HBSS ekleyin.
- Bölümleri slayda aktarmak için forseps veya delikli bir kaşık kullanın.
NOT: Agaroz içine alınmamış herhangi bir doku kesiti bir transfer pipeti ile aktarılabilir. - Forseps kullanarak fazla agaroz bloğunu çıkarın.
- Tüm bölümler slayda aktarıldıktan sonra, pipetleme yoluyla fazla sıvıyı ve emici bir havlunun köşesini temizleyin ve ardından slayta birkaç damla montaj ortamı ekleyin. Kürlendiğinde tüm kapak kayma alanını kaplamak için yeterli montaj ortamı kullanın. Kapak kaymasını yavaşça kızağın üzerine yerleştirerek monte edin.
NOT: Montaj ortamı sertleşene kadar basınç veya rahatsız edici kapak kayması uygulamaktan kaçının.
3. Görüntüleme
- Herhangi bir konfokal veya daha yüksek çözünürlüklü mikroskopta doku kesitlerinin görüntülenmesini gerçekleştirin11. Genotip başına en az üç embriyoyu analiz edin.
NOT: Doku kesitlerinin görüntüleri TCS SP8 STED 3x konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi ve bunu LIGHTNING dekonvolüsyonu izledi.
Representative Results
Kuyu başına 2.5-3 mL agaroz çözeltisi içeren 12 delikli bir plakanın daha büyük bir kalıbının kullanılması, birkaç embriyonun kısa bir süre içinde gömülmesi ve askıya alınması için idealdir (Şekil 1A). Fazla alan, kesitleme için agaroz bloğunu keserken doğru yönlendirmeye izin verir. Agaroz bloğunu keserken, nesne tutucu üzerindeki banda yapıştırılacağı bloğun tabanı boyunca fazla agarozun korunması önemlidir. Embriyo bloğun üst yarısında olmalıdır (Şekil 1B). Bununla birlikte, alt bölüm çok büyük olmamalıdır, çünkü fazla blok, kesitleme sırasında bıçak bloğa doğru iterken kesme açısını değiştirme şansını arttırır. Doğru yönlendirilmiş bölümlere örnekler gösterilmiştir (Şekil 1C,D).
Bu protokol geliştirilirken vibratom kesiti kriyostat kesitleme ile karşılaştırılmıştır. Dokunun kriyostat kesiti nadiren hücresel uzantıları korumuştur (Şekil 2 kriyostat ve Şekil 3A,B vibratomu). Kriyostat kesitleri, notokord ve nöral tüp hücreleri arasında (Şekil 2A ok ucu) ve bitişik nöral tüp hücreleri arasında (Şekil 2B, B' ok uçları) bazı GFP-pozitif membran parçalarının tespit edilmesine izin verdi. Bununla birlikte, nöral tüpü çevreleyen yüksek filamentli mezenkimal hücrelerdeki hücresel uzantıların F-aktin boyaması kriyostat kesitlerinde bozulmuştur (Şekil 2C, C' ok, vs Şekil 3C, D). Bu kriyostat sonuçları, bu yöntemi takiben kırık hücresel uzantıların sadece bazı izlerinin kaldığını göstermektedir. Bu nedenle, sonraki analizler için bu hassas uzantıları verimli bir şekilde korumak için vibratom kesitleme tercih edilir.
Tüm embriyonun ve bireysel doku kesitlerinin minimal bozulması, hücresel uzantıların yüksek kalitede görüntülenmesi için gereklidir. Herhangi bir katlanma veya burkulma geçirmiş doku kesitleri, notokordun yokluğu veya notokord ile nöral tüpün ventral taban plakası arasında büyük bir ayrım (>30 μm) ile belirgin olacaktır (Şekil 3B). Buna genellikle normalde nöral tüpü çevreleyen mezenkimal hücrelerin kaybı eşlik eder (Şekil 3A, ok). Hasarlı bölümler ayrıca epitel hücreleri arasında göç eden görünür hücresel membran uzantılarının kaybına neden olacaktır (Şekil 3B, Şekil 3A'ya kıyasla, ok uçları). Bölümlerdeki küçük bozulmalar bile, aktin bazlı uzantıların parçalanmasına ve hücreler arasında büyük boşlukların oluşmasına neden olabilir (Şekil 3D, ok uçları, iyi korunmuş Şekil 3C ile karşılaştırıldığında), tüm adımlarda hassas kullanım ihtiyacının altını çizer.
Resim 1: E9.5 Shh-Cre örneği; Rosa26 mTmG lekeli, gömülü ve kesitli embriyo. (A) 12 delikli bir plakada,% 4 LMP agarozuna gömülü tek bir embriyo. (B) Vibratom montajı için boyuta göre kesilmiş agaroz bloğu içinde doğru yönlendirilmiş bir embriyo örneği. Alt kısımda fazla agaroz bloğu bulunur. (C) LMP agarozuna gömülü 100 μm kalınlığında embriyo kesitinin parlak alan görüntüsü. (D) Agarozun çıkarılmasından sonra bir bölümün immünofloresan görüntülemesi. Anti-GFP boyalı mGFP (yeşil), dokudaki Shh eksprese eden hücreleri temsil ederken, diğer hücre soyları membran Domatesi (kırmızı), DAPI'yi mavi olarak ifade eder. Nöral tüp (braket) ve mGFP-pozitif notokord (ok) açıkça görülebilir. Ölçek çubukları = 1 cm (A), 5 mm (B) ve 100 μm (C,D). Kısaltmalar: LMP = düşük erime noktası; mGFP = membran yeşil floresan proteini; Shh = Sonik Kirpi; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kriyostat kesitli nöral tüp taban plakası ve parçalanmış membran uzantılı notokord örneği. (A) 20 μm kalınlığında E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG 19,20,21 kesit GFP (yeşil), F-aktin (kırmızı) ve DAPI (mavi) için boyanmıştır. mGFP puncta, nöral tüpün bitişik hücreleri arasında göç eden notochord ve zemin plakası (ok ucu) arasında ve (B, B') arasında görülebilir. (C,C') F-aktin boyama, nöral tüpü (ok) çevreleyen mezenkimal hücreler üzerinde herhangi bir net sitonom tespit edemez. Ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltmalar: mGFP = membran yeşil floresan proteini; Shh = Sonik Kirpi; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Optimal ve suboptimal vibratom doku kesitlerine ve nöral tüp taban plakasının, notokordun ve çevresindeki hücrelerin boyanmasına örnekler. (B) katlanmış bir doku kesiti ve (D) bir Shh-Cre'den kötü işlenmiş bir bölüm ile karşılaştırıldığında, hassas bir şekilde ele alınan bölümlerin (A, C) örnekleri; Rosa26 mTmG ve bir ShhGFP / + embriyo 19,20,21. Optimal olarak ele alınan kesitler, bitişik olarak lokalize taban plakası nöral epitel hücreleri (A, ok uçları) arasındaki sitonomların tespit edilmesini sağlar. Notochord (A, mGFP eksprese eden) ve mezenkimal hücrelere (A, ok) bitişik nöral tüp görünür olmalıdır. (C,D) F-aktin ve DAPI boyalı kesitler, nöral tüp ve notokord (C) çevreleyen mezenkimal hücrelerin ve F-aktin bazlı sitomenlerin (oklar) tutarlı aralıklarına sahip olmalıdır. Bölümlerin herhangi bir küçük katlanması veya bozulması boşluklara ve kırık F-aktin parçalarına (D, ok uçları) neden olabilir. Ölçek çubukları = 10 μm. Kısaltmalar: mGFP = membran yeşil floresan proteini; Shh = Sonik Kirpi; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu protokol, yüksek çözünürlüklü floresan mikroskopi için embriyonik doku kesitlerinde hassas sitomenlerin korunması için geliştirilmiştir. Bugüne kadar, çeşitli model organizmalar arasında dokudaki sitonomların görselleştirilmesi, büyük ölçüde canlı doku görüntülemeyi kullanarak floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin ektopik ekspresyonuna dayanıyordu. Ne yazık ki, floresan olarak etiketlenmiş canlı görüntülemenin kullanımı, endojen olarak eksprese edilen proteinlerin analizine nadiren elverişlidir, zaman kısıtlamaları getirebilir ve özel görüntüleme aşamaları ve mikroskoplar gerektirir. Burada tarif edilen boyama ve kesitleme yöntemi, endojen olarak eksprese edilen proteinlerin nihai tespiti için immünohistokimyaya izin vermek için sitonomları ve diğer hücresel uzantıları korur. Bu teknoloji, morfojenlerin in vivo olarak farklı dokular arasında nasıl taşındığına dair yeni anlayışları kolaylaştıracak ve sitonomların çalışılabileceği model sistemlerin kapsamını genişletecektir.
Bu protokol, gliserol gibi denge çözeltisinin veya sakkaroz gibi kriyoprotektan çözeltilerin kullanılmasını önleyen tam montajlı boyama ve vibratom kalın kesitleme kullanır. Hücresel uzantıların maksimum korunmasına izin vermek için kesitli doku kullanımını en aza indirmeyi amaçlamaktadır. Kesitlemeden sonra dokunun daha az işlenmesi, sitonomların genel korunmasında sürekli olarak daha iyi sonuçlar sağlamıştır. Bu nedenle, embriyonun bölümlenmesi, görüntülemeden önceki son adımlardan biridir.
Kültürlenmiş hücrelerin sitonemlerinin korunması için geliştirilen bir fiksasyon tekniği olan MEM-fix, doğuştan gelen hücre mimarisinin canlı boyutlarıyla karşılaştırılabilir 3D korunmasının iyileştirilmesini sağlayan glutaraldehit ve PFA'nın bir kombinasyonundan oluşur16,17. Ne yazık ki, MEM-fix, embriyo fiksasyonu için yararlı değildi, çünkü glutaraldehit otomatik floresan yapabilir ve yüksek protein çapraz bağlanma aktivitesi nedeniyle hücrelerde antikor penetrasyonunu ve epitop bağlanmasını ciddi şekilde sınırlar22,23. Bu nedenle, PFA fiksasyon koşulları sonrası kesitleme protokolleri, embriyonik dokudaki hücresel uzantıların korunmasına izin verecek şekilde optimize edilmiştir. PFA, embriyonik dokudaki sitonem benzeri uzantıları koruyabilse de, görüntü analizi dikkatle yapılmalıdır. PFA, bireysel hücrelerin ve dokuların kısmi dehidrasyonuna neden olabilir, bu da küçük hacim azalmasına ve sabit doku içinde küçük hücre dışı boşlukların oluşmasına neden olabilir.
Bu protokol, kriyoproteksiyon ve doku temizliği için sakkaroz yeniden doygunluğunun ekstra adımlarını önler, çünkü sakkaroz veya gliserol çözeltileri dokunun küçük bir yeniden doygunluğuna neden olabilir24. Ortaya çıkan küçük şişlik, hücreler arasında ve dokular arasında göç eden sabit hücresel uzantıları ve sitomları yok edebilir. Bu, kalın kesitli vibratomu kriyostat kesitleriyle karşılaştırırken belirgindi. Doku kalınlığının arttırılması sağlam sitonomların korunmasını iyileştirmiş olsa da, sakkarozla yeniden doymuş kriyostat kesitlerinde saptanabilir sitonamların görülme sıklığı sürekli olarak daha düşüktür.
Bu protokolün optimizasyonu, 100 μm kalınlığındaki kesitlerin bozulmamış sitonomların korunmasını sağlamak için en iyisi olduğunu ortaya koymuştur. Daha ince kesitler tipik olarak görüntüleme için kullanılır, çünkü çoğu konfokal mikroskop,hücresel uzantıları 25'i temizlemeden ~ 20-40 μm derinliğe kadar görselleştirmek için yalnızca yeterli çözünürlükte görüntüleme yapabilir. Bununla birlikte, ince kesitleri keserken bıçaktan embriyonik hücrelere uygulanan mekanik kuvvetler ve bozulma sitomları yok eder. Daha kalın kesitler, doku içindeki bozulmamış uzantıları korurken kesit içinde daha geniş bir derinlik alanı sağlar. Ek olarak, daha kalın bölümlerin kullanılması, doku bölümlerinin aşırı katlanmasını veya burkulmasını önlemek için kullanım kolaylığı sağlar.
Bu protokol, E8-10.5 fare embriyolarının dokusundaki sitonomların maksimum korunması için optimize edilmiştir. Kesitleme sonrası dokunun minimal manipülasyonu, sitomenlerin genel olarak korunmasını sürekli olarak iyileştirdi. Artan boyut ve doku karmaşıklığı nedeniyle tekniği daha sonraki gelişim aşamalarına ve yetişkin doku kesitlerine uyarlamak için daha fazla optimizasyonun gerekli olması muhtemeldir. Bu, kesitlemeyi ve ardından immünofloresan boyama gerektirecektir. Bu doku, sitonem benzeri uzantıları korumak için ek temizleme adımları ve kesitleme sırasında doku kullanımının adaptasyonunu gerektirebilir. Bu ek adımların, bu protokolün gelecekteki uygulamaları için dikkate alınması ve ele alınması gerekecektir.
Disclosures
Yazarların beyan etmek için rakip çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Görüntüler, St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi'ndeki Hücre ve Moleküler Biyoloji Görüntüleme Çekirdeği tarafından tutulan mikroskoplar kullanılarak elde edildi. JAX'ten fare suşları elde edildi. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R35GM122546 (SKO) ve St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi ALSAC tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated | Thermo Scientific | 150628 (Fisher Scientific 12-565-321) | |
| 24-Well Plate, Round Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 60 mm dish | Corning, Falcon | 353004 (Fisher Scientific 08772F) | |
| Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes) | Kimberly-Clark KIMTECH | 34155 (Fisher Scientific 06666A) | |
| Actin Red 555 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37112 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immunoresearch Lab Inc | 703-546-155 | 1:1,000 working concentration |
| Bead Bath 6L 230V | Lab Armor | Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706) | set to 55 °C |
| chicken anti-GFP | Aves Labs | SKU GFP-1020 | 1:250 working concentration |
| CO2 chamber | plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | model: Leica TCS SP8 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dissecting scissors (Vannas Scissors) | World Precision Instruments | 14003 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11960044 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 µL | Eppendorf | 3123000012 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 µL | Eppendorf | 3123000055 | |
| Feather Disposable Scalpel #10 | Fisher Scientific | Catalog No.NC9999403 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, United States | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 16000044 | |
| Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fisherbrand Labeling Tape | Fisher Scientific | 15-954 | |
| Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade | Polysciences | 18814-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14025 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen | Vector laboratories | H-4000 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING | Leica Microsystems | Microscope software | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25030081 | |
| Low Melting Point Agarose- UltraPure | Invitrogen | 16520 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11140050 | |
| Moria MC 17 BIS Perforated Spoon | Fine Science Tools | 1037018 | |
| Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | P36961 | |
| Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+) | The Jackson Laboratory | Strain #:008466 | |
| Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre) | The Jackson Laboratory | Strain #:005622 | |
| Mouse: C57BL/6J (B6) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG) | The Jackson Laboratory | Strain #:007576 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079) | |
| PBS + Ca2+ + Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14040133 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 µL | Denville Scientific | P1096-FR | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 µL | Denville Scientific | P1126 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 µL | Denville Scientific | P1121 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 µL | Denville Scientific | P1122 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11360070 | |
| Super Glue | Gorilla | ||
| SuperFrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91015 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91050 | |
| Transfer pipette, polyethylene | Millipore Sigma | Z135003 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher Scientific | 09-047-113Q | set to 20 RPM |
| Vibratome | Leica Biosytems | VT1000 S |
References
- Crick, F.
- Zeng, X., et al. A freely diffusible form of Sonic hedgehog mediates long-range signalling. Nature. 411 (6838), 716-720 (2001).
- Yu, S. R., et al. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461 (7263), 533-536 (2009).
- Zhou, S., et al. Free extracellular diffusion creates the Dpp morphogen gradient of the Drosophila wing disc. Current Biology. 22 (8), 668-675 (2012).
- Ribes, V., Briscoe, J. Establishing and interpreting graded Sonic Hedgehog signaling during vertebrate neural tube patterning: the role of negative feedback. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002014 (2009).
- Le Dréau, G., Martí, E. Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals. Developmental Neurobiology. 72 (12), 1471-1481 (2012).
- Kornberg, T. B., Guha, A. Understanding morphogen gradients: a problem of dispersion and containment. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (4), 264-271 (2007).
- Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs. Cell. 97 (5), 599-607 (1999).
- Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning. Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).
- Bischoff, M., et al. Cytonemes are required for the establishment of a normal Hedgehog morphogen gradient in Drosophila epithelia. Nature Cell Biology. 15 (11), 1269-1281 (2013).
- Hall, E. T., et al. Cytoneme delivery of sonic hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a dispatched-BOC/CDON co-receptor complex. eLife. 10, 61432 (2021).
- Huang, H., Kornberg, T. B. Cells must express components of the planar cell polarity system and extracellular matrix to support cytonemes. eLife. 5, 18979 (2016).
- Brunt, L., et al. Vangl2 promotes the formation of long cytonemes to enable distant Wnt/β-catenin signaling. Nature Communications. 12 (1), 2058 (2021).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Mattes, B., et al. Wnt/PCP controls spreading of Wnt/β-catenin signals by cytonemes in vertebrates. eLife. 7, 36953 (2018).
- Bodeen, W. J., Marada, S., Truong, A., Ogden, S. K. A fixation method to preserve cultured cell cytonemes facilitates mechanistic interrogation of morphogen transport. Development. 144 (19), 3612-3624 (2017).
- Hall, E. T., Ogden, S. K. Preserve cultured cell cytonemes through a modified electron microscopy fixation. Bio-protocol. 8 (13), (2018).
- American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals. American Veterinary Medical Association. , (2020).
- Harfe, B. D., et al. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-528 (2004).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Bacallao, R., Sohrab, S., Phillips, C. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 368-380 (2006).
- Tagliaferro, P., Tandler, C. J., Ramos, A. J., Pecci Saavedra, J., Brusco, A. Immunofluorescence and glutaraldehyde fixation. A new procedure based on the Schiff-quenching method. Journal of Neuroscience Methods. 77 (2), 191-197 (1997).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep tissue fluorescent imaging in scattering specimens using confocal microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17 (4), 614-617 (2011).
