Summary
Denne protokol beskriver etableringen af enteroider, en tredimensionel tarmmodel, fra føtal tarmvæv. Immunofluorescerende billeddannelse af epitelbiomarkører blev brugt til modelkarakterisering. Apikal eksponering af lipopolysaccharider, et bakterielt endotoksin, ved hjælp af mikroinjektionsteknik induceret epitelpermeabilitet på en dosisafhængig måde målt ved lækage af fluorescerende dextran.
Abstract
Humane fostervævsafledte enteroider fremstår som en lovende in vitro-model til undersøgelse af tarmskader hos for tidligt fødte spædbørn. Enteroider udviser polaritet, der består af et lumen med en apikal kant, stramme kryds og et basolateralt ydre lag udsat for vækstmedier. Konsekvenserne af tarmskader omfatter slimhindebetændelse og øget permeabilitet. Testning af tarmpermeabilitet hos sårbare for tidligt fødte forsøgspersoner er ofte ikke mulig. Således er en in vitro føtal vævsafledt tarmmodel nødvendig for at studere tarmskader hos for tidligt fødte spædbørn. Enteroider kan bruges til at teste ændringer i epitelpermeabilitet reguleret af tætte krydsproteiner. I enteroider differentierer tarmstamceller sig til alle epitelcelletyper og danner en tredimensionel struktur på en kældermembranmatrix udskilt af musesarkomceller. I denne artikel beskriver vi de metoder, der anvendes til at etablere enteroider fra føtalt tarmvæv, karakterisere de enteroidtætte krydsproteiner med immunfluorescerende billeddannelse og teste epitelpermeabilitet. Da gramnegativ dominerende bakteriel dysbiose er en kendt risikofaktor for tarmskade, brugte vi lipopolysaccharid (LPS), et endotoksin produceret af gramnegative bakterier, til at inducere permeabilitet i enteroiderne. Fluorescein-mærket dextran blev mikroinjiceret i enteroid lumen, og serielle dextrankoncentrationer lækket ind i kulturmediet blev målt for at kvantificere ændringerne i paracellulær permeabilitet. Eksperimentet viste, at apikal eksponering for LPS inducerer epitelpermeabilitet på en koncentrationsafhængig måde. Disse resultater understøtter hypotesen om, at gram-negativ dominerende dysbiose bidrager til mekanismen for tarmskade hos for tidligt fødte spædbørn.
Introduction
For tidligt fødte spædbørn udsættes for hyppig og langvarig betændelse, der sætter dem i øget risiko for tarmskader, der resulterer i langvarig invaliditet eller død1. Forskningen på området er udfordret af den begrænsede evne til at udføre forsøg på sårbare for tidligt fødte børn. Desuden har mangel på egnede modeller hæmmet den omfattende undersøgelse af det for tidlige tarmmiljø2. Eksisterende in vitro- og in vivo-modeller har ikke i tilstrækkelig grad repræsenteret det for tidlige menneskelige tarmmiljø. Specifikt kan enkeltepitelføtale cellelinjer muligvis ikke danne stramme kryds, og dyremodeller udviser forskellige inflammatoriske og immunologiske reaktioner end menneskelige for tidligt fødte spædbørn. Med opdagelsen af Wnt-signalering som en primær vej i spredning og differentiering af tarmkryptstamceller og de nye Lgr5+ vævsstamceller blev tarmvævsafledte organoider såsom enteroider og kolonoider etableret som in vitro-modeller 3,4,5. Ved hjælp af denne teknologi er det muligt at oprette og udnytte tredimensionelle (3D) enteroidmodeller, der er udviklet fra hele væv eller biopsi af en tarm for at studere epitelresponser på tarmmiljøet 6,7.
I modsætning til typiske tarmcellelinjer dyrket i kultur udviser enteroider polaritet med et lumen forbundet med tætte krydsproteiner8. Dette giver mulighed for eksponering for den basolaterale grænse i vækstmedierne samt luminal mikroinjektion for at vurdere den apikale grænse. Endvidere viser enteroider lignende genetiske, fysiologiske og immunologiske egenskaber som det humane epitel 9,10. Fostervævsafledte enteroider giver mulighed for undersøgelse af præmaturitetens rolle på epitelfunktionen. De unikke egenskaber ved enteroider kan ligne det for tidlige tarmmiljø nærmere9. Vævsafledte enteroider kan bruges til at teste for tæt krydsintegritet som en monolagsform eller som 3D-strukturer indlejret i en størknet kældermembranproteinblanding. En mikroinjektionsteknik er nødvendig for sidstnævnte form, hvis der ønskes en apikal eksponering. Måling af epitelresponser i enteroidmodeller inkluderer genekspression ved RNA-sekventering, biomarkører ved enzymbundet immunoassay (ELISA) eller avancerede billeddannelsesteknikker. Den teknik, der præsenteres her, giver en anden mulig mulighed for at måle bruttopermeabilitet med fluorometri.
Tarmskade hos for tidligt fødte spædbørn har en multifaktoriel patogenese, der omfatter ubalancen i tarmmikrobielle samfund. Enteroider kan give fremragende modeller til at studere visse aspekter af for tidlige tarmsygdomme, såsom nekrotiserende enterocolitis, der involverer epitelfunktioner11. Enteroider viser lignende egenskaber som den menneskelige føtal tarm10. Udsættelse af enteroider for lipopolysaccharid (LPS), et endotoksin produceret af gramnegative bakterier, i kulturmediet, da en basolateral eksponering inducerer genekspression, der kan føre til øget inflammation og tarmpermeabilitet7. Denne undersøgelse har til formål at evaluere ændringerne i bruttoepitelpermeabilitet efter apikal eksponering for bakterielle produkter såsom LPS. Resultaterne kan give indsigt i de mikrobe-epitelinteraktioner, der er involveret i patogenesen af tarmskade. Metoden designet til at teste bruttopermeabilitet kræver mikroinjektionsopsætning og dygtighed.
Protocol
Den humane vævsindsamling blev godkendt af University of Washington Institutional Review Board (studie-id: STUDY380 og CR ID: CR3603) og udført af Birth Defects Research Laboratory. Birth Defects Research Laboratory blev støttet af NIH-tildelingsnummer 5R24HD000836 fra Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development. Prøverne blev indsamlet fra samtykkende deltagere og sendt som afidentificerede og uden nogen sundhedsoplysninger. Tyndtarmsprøverne blev opbevaret i iskold Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) og sendt natten over til det modtagende laboratorium.
1. Forberedelse af reagens
BEMÆRK: Se materialetabellen for en liste over reagenser og katalognumre; de anbefalede volumener er til en 6-brønds plade, medmindre andet er nævnt.
- Forbered 0,1% bovin serumalbumin (BSA) ved at opløse 50 mg BSA-pulver i 50 ml fosfatbufferet saltvand (PBS) med 100 μg / ml af et bredspektret antibiotikum primocin for at belægge alle plastvarer og tip, der kommer i kontakt med væv eller enteroider.
- For at belægge med BSA skal du placere ikke-filtrerede pipetspidser i et 50 ml konisk rør med nok BSA til at dække spidserne, tilføje 1-2 ml BSA for at dække petriskålens overflade eller fylde 15 ml koniske rør med BSA i mindst 20-30 minutter ved stuetemperatur inden brug.
- Forbered DPBS-medier ved at blande 50 ml DPBS med 100 μg / ml primocin og 50 μg / ml gentamicin. Forbered dette medie med og uden 2,5 μg/ml amfotericin.
- Forbered enteroid vækstmedie ved at blande 2 ml organoidvækstmedium, 100 μg / ml primocin, 10 μM Y27632 og 2,5 μM CHIR99021. Lav friske medier dagligt og varm det i en cellekulturinkubator ved 37 ° C.
BEMÆRK: Fortyndingsfaktoren for Y27632 er 1:250. For CHIR99021 fortyndes CHIR-stamopløsningen til 1:100 i varme medier og derefter til 1:40 i enteroidvækstmedier for at opnå en fortynding på 1:4000. - Forbered kældermembranmatrixblanding ved at tilføje til lagerkældermembranmatrixen 10 μM Y27632 og 2,5 μM CHIR99021. Der fremstilles i alt 285 μL af den endelige kældermembranmatrixblanding i en proteinkoncentration på 8 mg/ml for en brønd af en 6-brøndsplade.
BEMÆRK: Kældermembranmatrix skal være iskold for at forblive i flydende form og vil størkne ved varmere temperaturer. Proteinkoncentrationen i lagermembranmatrixen bestemmer det volumen, der kræves for at fremstille en 8 mg / ml endelig proteinkoncentration ved hjælp af ligningen:
Bind 1 × koncentration 1 = volumen 2 × koncentration 2 - Der fremstilles 4% paraformaldehyd (PFA) ved at fortynde 32% PFA i PBS med 1:8, og opbevares ved stuetemperatur. Lav 0,5 ml for hver brønd af enteroider, der skal fastgøres.
- Forbered blokeringsbuffer ved at tilsætte 5% gedeserum og 0,5% Triton X-100 i PBS. Forbered 1 ml til det første antistof pr. brønd og 0,5 ml til det ekstra antistof pr. brønd.
BEMÆRK: Brug serum fra samme art som værten for de sekundære antistoffer - Primære og sekundære antistoffer forberedes, fortyndet i blokerende buffer i den koncentration, som fabrikanten anbefaler for hvert antistof.
- Der fremstilles 5 μg/ml Dmidino-2-phenylindol (DAPI) ved fortynding til 1:200 fra 1 mg/ml stamopløsning i PBS. Lav 0,5 ml pr. Brønd farvede enteroider.
- Forbered 70% glycerol i PBS og lav 0,5 ml til montering af enteroiderne på mikroskopglas.
- Der fremstilles 5 mg/ml dextran-FITC (fluorescein-isothiocyanat) ved at fortynde stamopløsningen på 25 mg/ml i PBS i forholdet 1:5. Lav 20 μL til mikroinjektion.
- Der fremstilles lipopolysaccharider (LPS) og dextran-FITC ved at rekonstituere LPS-pulveret i PBS til en 5 mg/ml stamopløsning. Fortyndede stamopløsninger af LPS og dextran i PBS til 0,1 mg/ml og 0,5 mg/ml LPS og 5 mg/ml dextran-FITC. Lav 20 μL til mikroinjektion.
- Ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraeddikesyre (EGTA) fremstilles ved at fremstille en stamopløsning på 0,2 M ved at opløse EGTA-pulver i destilleret vand og justere pH-værdien til ca. 8 ved anvendelse af saltsyre (HCI). Forbered en testkoncentration på 2 mM i kulturmedier ved at udføre en 1:100 fortynding.
2. Prøveindsamling
- Når prøverne er modtaget, udføres epitelcelleisolering og plettering inden for 24 timer efter prøveopsamlingen.
3. Tarmepitelcellebelægning i kældermembranmatrix fra hele prøver
BEMÆRK: Denne procedure følger modificerede protokoller fra Translational Tissue Modeling Laboratory ved University of Michigan12,13,14. Brug af vækstmedier med en høj Wnt-faktor giver ensartede resultater for enteroid etablering. Når enteroiderne er etableret, skal du bruge det samme medie med en høj Wnt-faktor til at drive enteroiderne til sfæriske former til mikroinjektion.
- Overfør tarmsegmenterne til en 60 mm x 15 mm petriskål med iskold DPBS med amphotericin og blød i 20 minutter på is. Mens vævet suger, skal du identificere regionerne (tolvfingertarmen, jejunum eller ileum) i tyndtarmen og fjerne bindevæv og blodkar med tang og saks. Vask lumenindholdet ud efter behov ved hjælp af en lille 23-25 G nål og en 3 ml sprøjte uden at forstyrre epitelet.
- Skær tarmsegmenterne i 3-5 mm stykker ved hjælp af en skalpel og læg 1-2 stykker (til plettering i en brønd af en 6-brøndsplade) i en 35 mm x 15 mm petriskål, der indeholder 0,5-1 ml organoidvækstmedium på is.
- Brug dissekering af mikrosaks og tang til at skære tarmrøret i længderetningen. Brug tangspidsen til at skrabe epitelcellerne fra fasciaen under et 10x stereomikroskop. Fjern fasciaen og hvirvl skålen for at bryde klumperne af celler op.
- Brug en 20 μL pipettespids til at overføre cellerne og medierne i trin på 5-10 μL til kældermembranmatrixblandingen for at fremstille en 285 μL opløsning ved en 8 mg / ml matrixproteinkoncentration. Pipet langsomt op og ned 20x for at blande celler i kældermembranmatrix på is ved hjælp af en 200 μL skærespids.
- Læg fem 50 μL strimler af cellekældermembranmatrixblandingen i en brønd af en forvarmet 6-brøndplade holdt på en varm skumsten. Inkuber pladen i cellekulturinkubatoren ved 37 °C og 5% CO2 i 10 minutter for at tillade kældermembranmatrixen at polymerisere og hærde.
- Tilsæt 2 ml af det enteroide vækstmedie i brønden i de størknede kældermembranmatrixstrimler og læg det tilbage inde i cellekulturinkubatoren. Skift medierne dagligt for at øge enteroid vækst. Kontroller for intestinal stamcelledifferentiering under et 10x omvendt mikroskop dagligt.
- Efter 10-14 dage føres enteroiderne ind i en brønd af en 12-brønd eller 6-brøndplade afhængigt af enteroidtætheden. Begynd at skifte medie hver anden dag og gå i et 1: 2-forhold hver 5-7 dag, da enteroiderne begynder at trives.
- Fjern cellerne, der ikke adskiller sig til enteroider med kældermembranmatrixlaget under passager. Opret en frossen bestand af enteroider med en lav passage ved at fryse dem i 80% vækstmedier, 10% føtalt bovint serum (FBS) og 10% dimethylsulfoxid (DMSO), hvis det er nødvendigt.
4. Immunofluorescerende farvning af enteroider
BEMÆRK: Processen med fastgørelse og farvning tager 3 dage. I denne protokol fikserede og farvede vi for kerner (DAPI), epitelmarkører (villin, CDX2), lysozym, mucin og tætte krydsproteiner (claudin 2, claudin 3, occludin, zonula occluden-1) ved hjælp af en modificeret protokol15. Fluorescerende billeder blev taget af et konfokalt mikroskop.
- Fastsættelse
BEMÆRK: Denne proces udføres normalt samtidig med enteroidpassagen eller frysningsproceduren.- Placer den enteroide plade på is. Fjern vækstmediet og vask forsigtigt 2x med kold DPBS.
- Identificer de enteroider, der skal fastgøres og farves. Overfør dem til en 12-brønds plade ved forsigtigt at pipettere dem med en 200 μL skærespids eller ved hjælp af en 1 μL podesløjfe. Placer enteroider i separate brønde, hvis farvning med forskellige antistoffer skal udføres.
- Fjern så meget væske med en 200 μL spids som muligt uden at forstyrre enteroiderne. Tilsæt 0,5 ml 4% PFA og inkuber i 30 min ved stuetemperatur. Hvirvl pladen lejlighedsvis for at lette løsrivelse af enteroiderne fra kældermembranmatrixen.
- Undersøg groft for at bestemme løsrivelsen af enteroiderne fra kældermembranmatrixen. Opsæt forsigtigt og kassér den flydende PFA uden at forstyrre enteroiderne. Vask med PBS 3x for at fjerne PFA og eventuel resterende kældermembranmatrix
BEMÆRK: Aspirering af væsken under et stereomikroskop kan være nyttigt for at undgå enteroiderne. Faste enteroider kan opbevares i PBS ved 4 °C i op til 1 måned.
- Blokering
- Residualer PBS fjernes forsigtigt med en pipette på 200 μL uden at forstyrre enteroiderne. Tilsæt 0,5 ml blokerende buffer og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur.
- Fjern og kassér blokeringsbufferen med en 200 μL pipette, og pas på at undgå at forstyrre enteroiderne.
- Farve af antistoffer
- Tilsæt 500 μL primært antistof i blokerende buffer til hver brønd med enteroider. For primære antistoffer og for lysozym er fortyndingsfaktoren 1:100, for CDX2 er fortyndingsfaktoren 1:100, og for villin er fortyndingsfaktoren 1:50. Inkuberes ved 4 °C natten over.
- Den følgende dag fjernes antistofopløsningen og vaskes 3x med PBS. Tillad 10-15 minutters inkubationstid for hver vask.
- Trin 4.3.1.-4.3.2 gentages. for det sekundære antistof med en fortyndingsfaktor på 1:400.
- Der tilsættes 500 μL DAPI ved 5 μg/ml i PBS og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min. Efter inkubation vaskes 3x med PBS, og der tillades 10-15 minutters inkubationstid for hver vask
- Montering
- Fjern så meget PBS som muligt. Vask de farvede enteroider med 70% glycerol 1x.
- Løft enteroiderne ud af pladen ved hjælp af en 1 μL podesløjfe eller en skåret 200 μL spids og monter med 70% glycerol på et glasmikroskopglas.
- For at bevare enteroidernes 3D-struktur skal du sikre et mellemrum på 0,5-1 mm mellem bundglasglidet og dækslippen. Brug udskæringer af tynde siliciumgummiplader eller glasdæksler til at skabe et mellemrum mellem glasrutsjebanen og dækslippen. Enteroiderne kan nu afbildes med et konfokalt mikroskop.
5. Forberedelse til mikroinjektion af enteroider
BEMÆRK: Microinjection-protokollen er en modificeret protokol fra Hill et al.16 , så den passer til ressourcerne og indstillingen. Nogle af forberedelsestrinnene skal gennemføres et par dage i forvejen.
- Opsætning af mikroinjektionsopsætningen
- Opsæt mikroinjektorapparatet enten inde i et biosikkerhedsskab eller på en ren tæller, afhængigt af formålet med forsøgene, som følger: et stereomikroskop til visning, en mikromanipulator med X-, Y- og Z-akse kontrolknudepunkter monteret på et tungt stativ ved siden af mikroskopet, en mikropipetteholder monteret på mikromanipulatorarmen, en mikroinjektorslange, der forbinder mikropipetteholderen og en sprøjte med en trevejs stophane, derefter til en pneumatisk pumpe og en vægluftkilde forbundet til pumpen (figur 1).
- Desinficer mikroinjektionsapparatet med 70% ethanol inden eksperimentel brug og derefter. Test placeringen af mikroskopet og mikromanipulatoren, så den passer til de ønskede fysiske specifikationer, herunder bevægelse af akseknapperne for at sikre, at mikropipetten kan nå den målrettede prøve.
- Fremstilling af mikropipetten
BEMÆRK: Udfør disse trin på forhånd.- Brug en mikropipettetrækker til at trække glaskapillarrørene ind i mikropipetterne.
- Under stereomikroskopet skal du placere mikropipetten på en vandret mikropipetteholder (figur 2), fokusere på spidserne og klippe spidserne ved hjælp af en mikrosaks, mens du kigger gennem mikroskopets okularer. Forbered ca. 10-15 mikropipetter i en lignende spidsstørrelse til hvert eksperiment.
- Test spidsstørrelsen ved at trække 0,5-1 μL væske op, og tæl, hvor mange pumper der er nødvendige for at tømme volumenet. Test flere tipstørrelser for at finde den passende størrelse til eksperimentet. En passende spidsstørrelse udsender ca. 10-30 nL volumen pr. pumpe.
- Opbevar de skårne glasmikropipetter i en ren kasse eller et rent rør uden at beskadige spidserne.
BEMÆRK: Forskårne mikropipetter er tilgængelige kommercielt.
- Enteroid forberedelse
- Placer en plade med for det meste store og sfæriske enteroider på is. Udskift det gamle vækstmedium med frisk medium.
- Dissocier forsigtigt kældermembranmatrixprikkerne fra pladen med en celleløfter. Hvirvl gelprikkerne fra side til side på is for at bryde kældermembranmatrixen op uden at forstyrre enteroiderne.
- Vælg omkring 10-15 sfæriske enteroider med en skåret 20 μL pipettespids under et stereomikroskop, og tilføj til kældermembranmatrixen for at fremstille 285 μL 8 mg / ml proteinkoncentrationsblanding.
- Pift forsigtigt op og ned med en skåret 200 μL spids for at blande enteroiderne uden at bryde dem. Plade fem 50 μL gelprikker i midten af en rund 35 mm x 10 mm cellekultur petriskål eller en med lignende dimensioner.
- Inkuber enteroidgelprikkerne ved 37 °C i 10 minutter for at størkne. Tilsæt derefter 1 ml frisk vækstmedium til skålen. Inkuber enteroiderne i mindst 2-3 dage til stabilisering, og indtil enteroiderne når en passende størrelse på 0,5-1 μL.
BEMÆRK: Det er vigtigt at have en skål med en lav væg for lettere adgang til enteroiderne og en lille diameter for mindre volumen vækstmedium.
- Mikroinjektion af dextran-FITC og testet materiale
- Sluk for trevejs stophanen til den pneumatiske pumpe. Fyld mikropipetten med det injicerede materiale, i dette tilfælde dextran-FITC med eller uden LPS.
- Forbered en petriskål dækket med en strimmel gennemsigtig film. Placer to til fire 1 μL prikker injiceret materiale på filmen.
- Brug mikromanipulatoren til at drive spidsen af mikropipetten til lige inde i væsken, men over filmen under visualiseringen af et stereomikroskop. Træk forsigtigt i sprøjten for at trække det injicerede materiale ind i mikropipetten.
- Fyld mikropipetten med 2-4 μL injiceret materiale, og tryk på sprøjten for at fjerne luft i spidsen af mikropipetten. Undersøg den injicerede materialesøjle i mikropipetten for at sikre, at der ikke er nogen luftlomme. Optag mængden af injiceret materiale, der trak sig tilbage inde i mikropipetten.
BEMÆRK: Væsken er synlig i en grønlig farve på grund af dextran-FITC. - Tænd for luftkilden, der er tilsluttet den pneumatiske pumpe, som giver et lufttryk på ca. 60 psi. Tænd pumpen og indstil pumpens varighed til 10-15 ms. Drej stophanen på sprøjten for at åbne ledningen fra pumpen til mikropipetten.
BEMÆRK: Den længere pumpevarighed gør det muligt at frigive mere materiale pr. pumpe. Det anbefales at bruge den samme pumpevarighed og mikropipetter med lignende spidsstørrelser til hele eksperimentet til estimering af det injicerede volumen. - Fjern enteroiderne fra cellekulturinkubatoren og læg opvasken oven på en varm skumsten i en overdækket beholder for at begrænse lyseksponeringen efter mikroinjektion.
- Placer petriskålen med enteroider under stereomikroskopet, og flyt mikromanipulatorknapperne for at placere spidsen af mikropipetten i en vinkel på ca. 35 ° -45 ° til den vandrette overflade (figur 3). Dette kræver en vis øvelse på forhånd.
- Visualiser og kortlæg enteroiderne i hver petriskål under mikroskopet for at lave en plan for injektion af omkring 3-5 sfæriske enteroider pr. Skål.
- Når spidsen af mikropipetten er tæt på væskeoverfladen, skal du kigge ind i mikroskopets okularer for at føre spidsen mod den målrettede enteroid.
- Punktere enteroiden med mikropipettespidsen ved at fremme z-akseknappen ved hjælp af en præcis langsom bevægelse. Den enteroide væg vil trykke ned og springe tilbage, når spidsen går gennem den enteroide overflade, hvorefter fremskridtet skal stoppe.
- Tryk på pumpepedalen med den ene fod, og fyld enteroiden med den grønlige dextran-FITC-opløsning, indtil den er let udvidet. Registrer antallet af pumper for at beregne det pumpede volumen og dextrankoncentrationen.
- Træk spidsen af mikropipetten tilbage efter afslutning af mikroinjektion og flyt til den næste enteroid. Med praksis kan processen gå glat.
- Hvis spidsen går i stykker, skal du udskifte den med en anden mikropipette med en lignende spidsstørrelse. Træk nok volumen injiceret materiale til alle enteroider i samme eksponeringsgruppe, og skift mikropipette mellem injicerede materialer for at undgå krydskontaminering.
- Placer den injicerede enteroidskål under dækning for at undgå lyseksponering.
- Dextran-FITC indsamling og måling
- Efter mikroinjektionsproceduren skal du straks fjerne kulturmediet. Vask med friske vækstmedier 2x for at fjerne eventuelle resterende dextran-FITC. Tilføj friske medier og registrer tiden som tid 0 efter mikroinjektion.
BEMÆRK: Du har muligvis brug for en anden person til at udføre dette trin uden at forstyrre mikroinjektionsprocessen. - Saml 200 μL kulturmedier i et uigennemsigtigt 0,5 ml mikrofugerør, og udskift derefter det fjernede kulturmedie med det samme volumen friske vækstmedier ved 1 time, 2 timer, 4 timer, 6 timer, 8 timer, 10 timer og 12 timer efter mikroinjektioner.
BEMÆRK: Tidsintervallet kan variere afhængigt af eksperimentet. Ved en basolateral eksponering skal erstatningsmediet indeholde eksponeringen i samme koncentration. - Det indsamlede kulturmedie opbevares ved 4 °C, og dextrankoncentrationen måles inden for 24 timer. Gem rester af medier ved -80 °C til andre analyser. I slutningen af kulturmediesamlingen høstes enteroiderne til RNA-ekstraktion eller billeddannelse, hvis det er nødvendigt.
- Mål dextran-FITC-koncentrationer med en fluorescensmikropladelæser. Der konstrueres en standardkurve for hver plade ved hjælp af seriefortyndinger og ved at montere en lineær regressionslinje som vist i figur 4.
- Korrekt absorbansen for det fjernede volumen af kulturmedier indeholdende dextran, der blev erstattet med friske vækstmedier uden dextran som følger: fjernelse af 200 μL ud af 2 ml kulturmedier er 10 volumenprocent.
Korrigeret absorbans ved 2 timer = (absorbans ved 1 time x 10%) + målt absorbans ved 2 timer
Absorbans af det første korrigerede medium behøver ikke korrektion. Beregn derefter dextrankoncentrationen fra den korrigerede absorbansværdi ved hjælp af standardkurveligningen. - For normalisering divideres dextrankoncentrationen med det samlede antal pumper for hver petriskål og multipliceres derefter med det største samlede antal pumper pr. Skål.
BEMÆRK: Alle eksponeringer udføres i tre eksemplarer (tre petriskåle pr. eksponering med 3-5 mikroinjicerede enteroider pr. Skål). Gennemsnitsværdierne for tredoblingerne sammenlignes mellem eksponeringer ved hjælp af en studerendes t-test.
- Efter mikroinjektionsproceduren skal du straks fjerne kulturmediet. Vask med friske vækstmedier 2x for at fjerne eventuelle resterende dextran-FITC. Tilføj friske medier og registrer tiden som tid 0 efter mikroinjektion.
Representative Results
Vi etablerede en enteroid cellelinje fra doneret ileumføtalvæv efter modificerede protokoller leveret af vores samarbejdspartnere ved University of Michigan Translational Tissue Modeling Laboratory12. Den enteroide cellelinje testede negativ for Mycoplasma-infektion . Enteroiderne farvede positivt for villin, CDX2, lysozym, mucin, claudin, occludin og zonula-occluden 1 (figur 5), hvilket bekræfter deres tyndtarms epiteloprindelse. Enteroiderne blev mikroinjiceret med 4 kDa dextran-FITC ved 5 mg/ml i PBS (figur 6). Testeksponeringerne var LPS i forskellige koncentrationer, 0,1 mg/ml og 0,5 mg/ml, blandet med dextran-FITC for apikal eksponering. Som en positiv kontrol brugte vi 2 mM EGTA og tilføjede det til kulturmediet ved 4 timer efter mikroinjektion af dextran. EGTA er en calciumchelator, der øger permeabiliteten af tætte kryds. De negative kontroller blev mikroinjiceret med dextran-FITC alene i PBS. For basolateral eksponering havde erstatningsmediet for seriel kulturmediesamling den samme koncentration af eksponeringen (dvs. 2 mM EGTA). Resultaterne viser en klar stigning i dextrankoncentrationen i kulturmedier efter tilsætning af EGTA sammenlignet med den negative kontrol, PBS. Apikal eksponering af LPS inducerede højere permeabilitet af dextran, der startede ca. 8 timer efter eksponering på en koncentrationsafhængig måde (figur 7).
Figur 1: Opsætning af mikroinjektor. Opsætningen inkluderer et stereomikroskop, mikromanipulator monteret på et magnetisk stativ på en tung stålplade, en mikropipetteholder forbundet til en sprøjte med en trevejs stophane og en pneumatisk pumpe. Væglufttilførslen giver lufttrykket, som reguleres af pumpen for at generere et ensartet pumpevolumen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vandret mikropipetteholder. Denne plastplatform er designet til at holde mikropipetten efter træk i glaskapillarrøret til skæring af spidsen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Placering af mikropipetter. En vinkel på 35°-45° er ideel til injektion af enteroider placeret midt i petriskålen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Dextran standardkurve. Kurven blev konstrueret med fluorescerende absorbans af 10 serielle fortyndinger af dextran i dubletter. En lineær regressionslinje blev monteret til at generere en regressionsligning. Fejlbjælkerne er SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Fluorescerende biomarkører for enteroider. DAPI for kerneplet er blå. Følgende biomarkører er vist: (A) villin, (B) CDX2, (C) lysozym, (D) mucin, (E) claudin, (F) okkludering og (G) zonula-occluden 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Enteroider på forskellige stadier . (A) En enteroid på 7-10 dage gammel er lille og med en tyk mur. (B) En enteroid, der er klar til mikroinjektion med en stor størrelse, et lumen og en tænkevæg og (C) fluorescerende dextran-FITC inde i en enteroid 2 dage efter mikroinjektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Permeabilitet af dextran-FITC efter mikroinjektion . (A) Målte dextranniveauer i medierne var højere efter tilsætning af EGTA sammenlignet med PBS. (B) Mikroinjiceret 0,5 mg/ml LPS inducerede større lækage af dextran fra enteroid lumen i mediet, end mikroinjiceret 0,1 mg/ml LPS gjorde begyndende ved 8 timer efter injektionen. *p-værdi < 0,05, fejllinjer er SEM, n = 3, en studerendes t-test blev brugt til at beregne signifikans. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Denne protokol beskriver etableringen af enteroider fra føtal tarmvæv samt modelkarakterisering med immunfluorescerende farvning og epitelpermeabilitetstest. Enteroidernes permeabilitet blev testet ved hjælp af en mikroinjektionsteknik og serielle tidsbanemålinger af lækket dextran-FITC-koncentration i kulturmediet. Det nye ved denne protokol er den apikale eksponering, der mere ligner menneskets tarmfysiologi sammenlignet med basolateral eksponering i kulturmedierne7. I tidligere undersøgelser anvendte Hill et al. seriel billeddannelse og beregning af fluorescensintensiteten over tid16. Ares et al. udsatte den basolaterale membran i en epitelmodel for LPS og sammenlignede derefter det cellulære genekspressionsmønster7. Til sammenligning bruger vi apikal eksponering af de testede reagenser og undersøger derefter potentielle ændringer i bruttopermeabilitet ved at måle serielle koncentrationer af lækket dextran i kulturmedierne. Vores metode giver også mulighed for seriel sammenlignende analyse af cytokiner produceret af epitelceller i kulturmedier og genekspression ved at indsamle cellulært mRNA. LPS har været almindeligt anvendt til at studere tarmskader i dyre- og in vitro-modeller på grund af dets evne til at inducere permeabilitet og betændelse 7,17. Da LPS blev testet i denne model, blev epitelpermeabilitet differentieret efter eksponeringskoncentration. Denne protokol kan udvides til at studere andre sygdomspatologier ved hjælp af forskellige mikroinjicerede materialer og resultatmålinger.
Kritiske trin i denne protokol omfatter etablering af enteroider fra føtal tarmvæv, enteroid karakterisering og mikroinjektionsteknikken. Integriteten af denne undersøgelse afhænger af nøjagtig celleprøvetagning. Brug af anatomiske landemærker og blodkar er nyttigt for at sikre udvælgelsen af små tarmceller. På grund af den robuste vækst og differentiering af fostrets tarmstamceller er en omfattende procedure til isolering af stamcellerne fra andre epitelceller ikke nødvendig. Efter at enteroiderne er etableret, er det vigtigt at bekræfte modellens egenskaber ved farvning for proteiner og cellemarkører. I denne protokol blev enteroiderne farvet for enterocytter ved anvendelse af villin og CDX2, Paneth-celler ved hjælp af lysozym og bægerceller ved hjælp af mucin, alle de celler, der findes i tyndtarmsepitelet18,19,20. I modsætning til traditionelle enkeltcellelinjer, der viser en celletype, etablerer enteroider alle celletyper fra tarmstamcellerne8. Farvningsdelen af denne protokol kan ændres til de specifikke cellulære markører af interesse. Afgørende for pålideligheden af denne protokol er mikroinjektionsteknikken. Mikropipettespidsernes konsistens kan verificeres ved at måle volumen pr. pumpe ved hjælp af dextran-FITC-opløsning og visualisere diameteren af spidserne under mikroskopet. På grund af risikoen for kontaminering kan den samme mikropipette ikke bruges til mere end én eksponering. Derudover kan formen og væksten af enteroiderne påvirkes af indholdet af deres vækstmedier. Vi fandt ud af, at de sfæriske snarere end blomkålformede enteroider gav bedre modeller til mikroinjektion. Den sfæriske form kan induceres af en større Wnt-faktor i medierne21.
Denne protokol afhænger i vid udstrækning af udøverens evne til mikroinjektion for at reducere variationer, især i tidsfølsomme målinger. Variationer kan minimeres ved at have den samme erfarne performer med konsistente teknikker, bruge den samme celleoprindelse for at undgå genetisk variation, teste ved samme passage for at fjerne modenhedsbias og dyrke cellerne i samme type medie til lignende celledifferentiering. Vækstmediets komponenter kan fremkalde varierende differentiering af stamceller in vitro snarere end i et in vivo-miljø . For eksempel udtrykkes lysozym in vivo ikke før uge 22-24 af svangerskabsudvikling, når Paneth-celler dannes og bliver funktionelle22. Vi var imidlertid i stand til at opdage lysozym i vores enteroider etableret fra 10-ugers føtale tarme. Denne metode kan begrænse antallet af testede eksponeringer ad gangen på grund af den høje tekniske færdighed, der kræves til mikroinjektion. Dextranlækagen fra mikroinjektionspunktionshullet kan påvirke vurderingen af permeabilitet. For at eliminere denne effekt anbefales tredobbelt vask umiddelbart efter mikroinjektionen for at fjerne resterende dextran fra proceduren. Dextrankoncentrationen i mediet skal måles hver time i 4-6 timer efter mikroinjektion. Forsøg med en signifikant stigning i dextrankoncentrationen inden for 2-4 timer efter injektion bør udelukkes fra den endelige analyse.
Denne metode har flere fordele. Det kræver lavere omkostninger og færre ressourcer i forhold til enteroidafledte monolag på transwell. Derudover kan det udvides til andre eksponeringer såsom levende bakterier eller vira for at studere den indledende interaktion mellem tarmmikrober og epitelet. Enteroidens lukkede lumen kan opretholde en stabil vækst af mikroinjicerede levende bakterier uden forurening af vækstmediet13. I modsætning til monolaget, der udsættes for vækstmedier og inkubationsoxygen, er det lukkede lumen et stramt, isoleret rum. Et lukket lumen giver mulighed for ingen kommunikation til vækstmedierne og et luminalt iltindhold, der er lavere over tid med levende bakterievækst13.
Brugen af føtalt tarmvæv skildrer mere præcist tarmepitelet hos for tidligt fødte spædbørn sammenlignet med voksne tarmstamceller eller dyremodeller7. Endvidere tillader polariteten af enteroider både apikale og basolaterale eksponeringer og målinger23. Enteroiderne danner et lukket lumen med lavere iltningskoncentration, som nærmere efterligner tarmens iltkoncentration24. I modsætning til mere teknologisk avancerede protokoller16 giver brugen af bruttomediemålinger mulighed for større tilgængelighed af denne teknik. Eksperimentet viste, at epitellækage kan induceres ved apikal eksponering for LPS og er koncentrationsafhængig. Da denne metode undersøger ændringerne i lækket koncentration af dextran, er den nyttig til at detektere grove funktionelle ændringer i tætte kryds. Messenger RNA-indsamling og sekventering af de eksponerede enteroider og western blot-analyse kan supplere analysen af de grove funktionelle ændringer. Denne model studerer tarmepitelintegritet i et system, der meget ligner det for tidlige miljø og dermed kan bruges til at få en bedre forståelse af for tidlige tarmskader og andre sygdomspatologier.
Disclosures
Alle forfattere erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Ian Glass og personalet ved Birth Defects Research Laboratory ved University of Washington for at dele fostervævet. Vi takker også Dr. Michael Dame og Dr. Jason Spence ved Translational Tissue Modeling Laboratory ved University of Michigan for deres endeløse støtte og vejledning gennem hele processen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin 250 uL/mL | Gibco | 15-290-026 | |
| Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal | Biogenex | MU392A-5UC | |
| Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) | abcam | ab53032 | |
| Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) | abcam | ab15102 | |
| Anti-LYZ antibody produced in rabbit | Millipore Sigma | HPA066182-100UL | |
| Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 | Santa Cruz | sc-515032 | |
| Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal | Biogenex | NUA42-5UC | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Millipore Sigma | A8806 | |
| Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1395 | |
| Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1560 | |
| Centrifuge with 15 mL tube buckets | Eppendorf | 05-413-110 | |
| CHIR 99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Confocal microscope | Olympus FV1200 | N/A | Or a similar microscope |
| Conical centrifuge tubes, 15 ml | Falcon | 05-527-90 | |
| Cover glass for microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-DP | |
| Disposable scalpels | Mopec | 22-444-272 | |
| Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | 62248 | |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) | Fisher Scientific | AAJ67802K2 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) | Millipore Sigma | E8145-10G | |
| Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa | Millipore Sigma | 46944 | |
| Fuorescence microplate reader | Agilent BioTek | Synergy HTX | |
| Gentamicin 50 mg/mL | Gibco | 15-750-060 | |
| Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1x0.5mm, 6" (cut in half before pulling) | A-M systems | 626500 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | Fisher Scientific | A32742 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Fisher Scientific | A32731 | |
| Goat Serum | Fisher Scientific | 16210064 | |
| ImageJ software | NIH | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 06010 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Millipore Sigma | L4391-1MG | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | protein concentration > 9 mg/mL preferably |
| Micro forceps | Fisher Scientific | 13-820-078 | |
| Micro scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | Or a similar equipment |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-034486 | |
| Occludin Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 71-1500 | |
| Paraformaldehyde 32% aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | RT 15714 | |
| Petri Dishes, 35x10 mm | Fisher Scientific | 150318 | |
| Petri Dishes, 60x15 mm | Fisher Scientific | 12-565-94 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 10010031 | |
| PicoPump foot switch | World Precision Instruments | 3260 | |
| Pipette tips, non-filtered, 1000 uL | Fisher Scientific | 21-402-47 | |
| Pipette tips, non-filtered, 20 uL | Fisher Scientific | 21-402-41 | |
| Pipette tips, non-filtered, 200 uL | Fisher Scientific | 21-236-54 | |
| Pneumatic PicoPump system | World Precision Instruments | SYS-PV820 | or a similar picopump system |
| Primocin 50 mg/mL, 10x1 ml vial | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Steel base plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereo microscope | Zeiss stemi 350 | Or a similar microscope | |
| ThermoSafe PolarPack Foam Bricks | Sonoco | 03-531-53 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Wall air supply | N/A | N/A | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 61-7300 |
References
- Humberg, A., et al. Preterm birth and sustained inflammation: Consequences for the neonate. Seminars in Immunopathology. 42 (4), 451-468 (2020).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes & Development. 17 (14), 1709-1713 (2003).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), e52483 (2015).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
- Finkbeiner, S. R., et al. Transcriptome-wide analysis reveals hallmarks of human intestine development and maturation in vitro and in vivo. Stem Cell Reports. 4 (6), 1140-1155 (2015).
- Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
- Alganabi, M., Lee, C., Bindi, E., Li, B., Pierro, A. Recent advances in understanding necrotizing enterocolitis. F1000 Research. 8, (2019).
- Dame, M. K., et al. Human colonic crypts in culture: Segregation of immunochemical markers in normal versus adenoma-derived. Laboratory Investigation. 94 (2), 222-234 (2014).
- Hill, D. R., et al. Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium. eLife. 6, 29132 (2017).
- Tsai, Y. H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
- Su, K., Asbrock, N., Chu, V., Hoffmann, S., Hewitt, P. In Vitro Differentiation of Human iPS Cells Into Colon Organoids in Serum-Free Cell Culture Conditions. Technology Networks. , https://www.technologynetworks.com/cell-science/white-papers/in-vitro-differentiation-of-human-ips-cells-into-colon-organoids-in-serum-free-cell-culture-328450 (2019).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Schoultz, I., Keita, A. V. The Intestinal Barrier and Current Techniques for the Assessment of Gut Permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).
- Walker, R. W., Clemente, J. C., Peter, I., Loos, R. J. F. The prenatal gut microbiome: Are we colonized with bacteria in utero. Pediatric Obesity. 12, Suppl 1 3-17 (2017).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
- Lueschow, S. R., McElroy, S. J. The Paneth cell: The curator and defender of the immature small intestine. Frontiers in Immunology. 11, 587 (2020).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).
- Dheer, R., Young, V. B. Stem-cell-derived models: Tools for studying role of microbiota in intestinal homeostasis and disease. Current Opinion in Gastroenterology. 37 (1), 15-22 (2021).
